Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

ऑस्ट्रेलियाई सिंक्रोट्रॉन में धारावाहिक क्रिस्टलोग्राफी मापन के लिए लिपिडिको इंजेक्शन प्रोटोकॉल

Published: September 23, 2020 doi: 10.3791/61650
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1
1Australian Research Council Centre of Excellence in Advanced Molecular Imaging, Department of Chemistry and Physics, La Trobe Institute for Molecular Science, La Trobe University, Melbourne, Australia, 3086, 2Kusel Design, Niddrie, Melbourne, Australia, 3042

Summary

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य यह प्रदर्शित करना है कि हाल ही में ऑस्ट्रेलियाई सिंक्रोट्रॉन में कमीशन किए गए उच्च चिपचिपा इंजेक्टर, लिपिडिको पर डेटा संग्रह के लिए धारावाहिक क्रिस्टलोग्राफी नमूने कैसे तैयार किए जाएं।

Abstract

ऑस्ट्रेलियाई सिंक्रोट्रॉन में धारावाहिक क्रिस्टलोग्राफी मापन करने के लिए एक सुविधा विकसित की गई है। इस सुविधा में कमरे के तापमान पर बड़ी संख्या में छोटे क्रिस्टल को मापने के लिए मैक्रोमॉलिकुलर क्रिस्टलोग्राफी (एमएक्स2) बीमलाइन के हिस्से के रूप में उच्च चिपचिपा इंजेक्टर, लिपिडिको का निर्माण किया गया उद्देश्य शामिल है। इस तकनीक का लक्ष्य क्रिस्टल को ग्लास सीरिंज में उगाया/स्थानांतरित करने में सक्षम बनाना है ताकि सीरियल क्रिस्टलोग्राफी डेटा संग्रह के लिए इंजेक्टर में सीधे इस्तेमाल किया जा सके । इस इंजेक्टर के फायदों में स्ट्रीम के बिना प्रवाह दर में परिवर्तन के लिए तेजी से प्रतिक्रिया करने की क्षमता शामिल है। इस उच्च चिपचिपाहट इंजेक्टर (एचवीआई) के लिए कई सीमाएं मौजूद हैं जिनमें अनुमति दी गई नमूना चिपचिपाहट पर प्रतिबंध शामिल है । स्ट्रीम स्थिरता भी संभावित रूप से नमूने के विशिष्ट गुणों के आधार पर एक मुद्दा हो सकता है। कैसे नमूने स्थापित करने के लिए और ऑस्ट्रेलियाई सिंक्रोट्रॉन में धारावाहिक क्रिस्टलोग्राफी माप के लिए इंजेक्टर संचालित करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत किया जाता है । विधि नमूने की तैयारी को दर्शाती है, जिसमें एक उच्च चिपचिपा मीडिया (सिलिकॉन तेल) में lysozyme क्रिस्टल का हस्तांतरण और एमएक्स 2 में डेटा संग्रह के लिए इंजेक्टर का संचालन शामिल है।

Introduction

धारावाहिक क्रिस्टलोग्राफी (एसएक्स) एक तकनीक है जिसे शुरू में एक्स-रे फ्री इलेक्ट्रॉन लेजर्स(एक्सएफईएलएस)1, 2,3,4के संदर्भ में विकसित किया गया था। हालांकि निश्चित लक्ष्य दृष्टिकोण एसएक्स5,6,7के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, आमतौर पर, एक्स-रे बीम के लिए एक सतत धारा में क्रिस्टल देने के लिए इंजेक्टर सिस्टम नियोजित किए जाते हैं। क्योंकि यह बड़ी संख्या में क्रिस्टल से डेटा को जोड़ती है, एसएक्स प्रयोग के दौरान किसी भी क्रिस्टल संरेखण की आवश्यकता से बचता है, और डेटा को कमरे के तापमान8,9पर एकत्र करने में सक्षम बनाता है। एक उपयुक्त इंजेक्टर की सहायता से, क्रिस्टल को एक्स-रे इंटरैक्शन क्षेत्र में एक-एक करके स्ट्रीम किया जाता है और परिणामस्वरूप विवर्तन डेटा एक क्षेत्र डिटेक्टर9,10पर एकत्र किया जाता है। आज तक, एसएक्स पारंपरिक क्रिस्टलोग्राफी का उपयोग करके मापने के लिए क्रिस्टल सहित कई प्रोटीनसंरचनाओं 1,11, 12,13 को हल करने में सफल रहा है। इसने XFEL की फेम्टोसेकंड पल्स अवधि का शोषण करके समय-हल आणविक गतिशीलता में नई अंतर्दृष्टि भी प्रदान की है। ऑप्टिकल लेजर स्रोतों के साथ पंप-प्रोब प्रतिक्रियाओं की शुरुआत करके, फोटोसिस्टम II14, 15,फोटोएक्टिव येलो प्रोटीन16,17,साइटोक्रोम सी ऑक्सीडेस18,साथ ही जीवाणु जदोडोप्सिन19,20,21पर गहराई से अध्ययन किए गए हैं। इन अध्ययनों ने इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण गतिशीलता की जांच की है जो प्रकाश सक्रियण के बाद होती है जो समय-हल जैविक प्रक्रियाओं को समझने के लिए धारावाहिक क्रिस्टलोग्राफी की महत्वपूर्ण क्षमता का प्रदर्शन करती है।

धारावाहिक क्रिस्टलोग्राफी का विकास भी सिंक्रोट्रॉन स्रोतों में तेजी से प्रचलित हो रहा है9,12, 20,22,23,24. सिंक्रोट्रॉन आधारित एसएक्स बड़ी संख्या में व्यक्तिगत क्रिस्टल को उचित इंजेक्टर सिस्टम का उपयोग करके कमरे के तापमान पर कुशलतापूर्वक मापा जा सकता है। यह दृष्टिकोण छोटे क्रिस्टल के लिए उपयुक्त है, इसलिए डेटा एकत्र करने के लिए एक तेज फ्रेम-रेट डिटेक्टर की आवश्यकता के अलावा, एक माइक्रो-केंद्रित बीम की भी आवश्यकता होती है। पारंपरिक क्रिस्टलोग्राफी की तुलना में, एसएक्स एक्स-रे बीम में व्यक्तिगत क्रिस्टल के बढ़ते और संरेखण को शामिल नहीं करता है। क्योंकि बड़ी संख्या में व्यक्तिगत क्रिस्टल से डेटा मिला दिया जाता है, प्रत्येक क्रिस्टल द्वारा प्राप्त विकिरण खुराक को पारंपरिक क्रिस्टलोग्राफी की तुलना में काफी कम किया जा सकता है। सिंक्रोट्रॉन एसएक्स को समय-हल की गई प्रतिक्रियाओं के अध्ययन के लिए भी लागू किया जा सकता है, यहां तक कि मिलीसेकंड शासन के नीचे भी, बशर्ते पर्याप्त रूप से उच्च फ्रेम दर वाला डिटेक्टर उपलब्ध हो (उदाहरण के लिए, 100 हर्ट्ज या उससे अधिक)। 20 ,22 , 23,23, XFEL स्रोतों में शुरू में विकसित किए गए इंजेक्टरों का उपयोग करके सिंक्रोट्रॉन में कई धारावाहिक क्रिस्टलोग्राफी प्रयोग किए गए हैं । इंजेक्टर के दो सबसे आम प्रकार गैस डायनामिक वर्चुअल नोजल (जीडीवीएन)25 और उच्च चिपचिपा इंजेक्टर (एचवीआई)9, 24,26,27,28हैं। जीडीवीएन कम चिपचिपाहट, तरल नमूनों को इंजेक्ट करने के लिए आदर्श है, लेकिन स्थिर धाराओं को प्राप्त करने के लिए उच्च प्रवाह दरों की आवश्यकता होती है, जो बदले में उच्च नमूना खपत दरों की ओर जाता है। इसके विपरीत, एचवीआई उच्च चिपचिपाहट नमूनों के लिए उपयुक्त हैं जो बहुत कम प्रवाह दरों पर एक स्थिर धारा के उत्पादन की अनुमति देता है, जिससे नमूना खपत बहुत कम होती है। इसलिए, एचवीआई इंजेक्टर उन नमूनों की डिलीवरी का पक्ष लेता है जहां एक चिपचिपा वाहक बेहतर है (उदाहरण के लिए, लिपिड-झिल्ली प्रोटीन के लिए आधारित) और/या बड़ी मात्रा में नमूना उपलब्ध नहीं है । एसएक्स इंजेक्टर आम तौर पर उपयोग करने के लिए चुनौतीपूर्ण होते हैं और उन्हें संचालित करने के लिए व्यापक प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है। वे भी लंबा नमूना हस्तांतरण प्रोटोकॉल शामिल है, के रूप में नमूना एक विशेष जलाशय में लोड करने की जरूरत है, यह आम तौर पर एक उच्च नमूना के साथ जुड़े जोखिम है या तो ' मृत मात्रा ' में या कनेक्शन में लीकेज के माध्यम से खो दिया जा रहा है । इसलिए, एक्स-रे बीम तक पहुंचने वाले नमूने से पहले किसी भी नुकसान को कम करने के लिए इंजेक्टर डिजाइन को अनुकूलित करना वांछनीय है।

हाल ही में, पहले एसएक्स परिणाम एक लाइसोज़ीम लक्ष्य के साथ लिपिडिको23 का उपयोग करके प्रकाशित किए गए थे, जो एक Eiger 16M डिटेक्टर का उपयोग करके प्रकाशित किया गया था। यह इंजेक्टर डिजाइन प्रारंभिक क्रिस्टलीकरण से इंजेक्टर में क्रिस्टल के हस्तांतरण के लिए जाने में शामिल चरणों की संख्या को कम करके नमूना बर्बादी को सीमित करता है और इसके बाद एक्स-रे बीम में नमूना वितरण होता है। यह पांडुलिपि नमूना तैयारी से शुरू होने वाली नमूना हस्तांतरण प्रक्रिया का वर्णन करती है और दर्शाती है, इंजेक्शन प्रक्रिया पर चलती है, और अंत में डेटा संग्रह, एक ही क्रिस्टलीकरण पोत का उपयोग करके। इंजेक्टर का ऑपरेशन भी बताया गया है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. कांच की सीरिंज का उपयोग कर एक उच्च चिपचिपा मीडिया में क्रिस्टल की तैयारी

  1. एक नरम क्रिस्टल गोली बनाने और अतिरिक्त बफर को हटाने के लिए क्रिस्टल समाधान धीरे (~ 1,000 x ग्राम,~ 10 मिनट 22 डिग्री सेल्सियस) को अपकेंद्रित्र करें। इसके परिणामस्वरूप गोली में क्रिस्टल की उच्च एकाग्रता होगी जिसका उपयोग डेटा संग्रह के लिए किया जा सकता है।
    नोट: चिपचिपा मीडिया के कमजोर पड़ने को रोकने के लिए इस कदम पर क्रिस्टल एकाग्रता में वृद्धि । मीडिया के लिए एक उच्च चिपचिपाहट बनाए रखते हुए क्रिस्टल की उच्च एकाग्रता प्राप्त करने के लिए प्रत्येक नमूने के लिए क्रिस्टल वॉल्यूम में चिपचिपा मीडिया के अनुपात को अनुकूलित करें। एक गोली बनाने के लिए क्रिस्टल समाधान को सेंट्रलाइज करें और समाधान में क्रिस्टल एकाग्रता बढ़ाने के लिए अतिरिक्त बफर को हटा दें, जैसा कि डार्मिन एट में वर्णित है। अल.29.
  2. एक कपलर के साथ दो 100 माइक्रोन सीरिंज सेट करें।
  3. पहली सिरिंज के अंत में कपलर को जकड़ें और सिरिंज के शीर्ष पर क्रिस्टल समाधान के 28 माइक्रोन जोड़ें। धीरे-धीरे, सिरिंज के शीर्ष में प्लंजर डालें और धीरे-धीरे समाधान को दोवर टिप के अंत तक धकेल दें, किसी भी हवा के बुलबुले को हटा दें। नीचे चर्चा की गई दो विधियों में से एक का पालन करके ऐसा करें।
    नोट: उच्च चिपचिपा मीडिया में जोड़े जाने वाले क्रिस्टल की मात्रा को अलग किया जा सकता है यदि यह समग्र नमूने की चिपचिपाहट को काफी नहीं बदलता है।
    1. पहली विधि: हवा के बुलबुले फट करने के लिए तेजी से दबाव परिवर्तन का उपयोग करें।
      1. ध्यान से कुंद कपलर सुई बिंदु के शीर्ष पर एक दस्ताने उंगली जगह है और (बहुत धीरे) एक सील बनाने के लिए दबाव लागू होते हैं । बहुत अधिक दबाव न लगाएं क्योंकि इसके परिणामस्वरूप सुई स्टिक चोट लग सकती है।
      2. अब सुई बिंदु से दूर समाधान आकर्षित करने के लिए प्लंजर वापस खींचो, यह सिरिंज में दबाव का एक buildup उत्पन्न करेगा।
      3. कुंद सुई टिप से दस्ताने उंगली को हटाकर सिरिंज के शीर्ष पर दबाव जल्दी से छोड़ दें। सावधान रहें, यदि नमूना उंगली को हटा दिया जाता है तो टिप के बहुत करीब होता है, तो यह नमूना के नुकसान के परिणामस्वरूप स्प्रे कर सकता है। सिरिंज के भीतर दबाव में तेजी से बदलाव से हवा के बुलबुले फट जाएंगे। तब तक दोहराएं जब तक कि सभी बुलबुले हटा नहीं दिए गए हैं।
    2. दूसरी विधि: हवा के बुलबुले को हटाने के लिए 'मानव अपकेंद्रित्र' का उपयोग करना।
      1. सिरिंज को एक हाथ में सुई के साथ ऊपर की ओर रखें और प्लंजर दो उंगलियों के बीच अंकित हो जाए, ताकि यह हिल न सके।
      2. सिरिंज को 2-3 बार जल्दी से घुमाएं, नमूने पर परिणामी अपकेंद्रित्र बल सिरिंज से किसी भी हवा के बुलबुले को मजबूर करेगा। सावधान रहें, यदि बहुत धीरे-धीरे किया जाता है तो नमूना खो सकता है।
      3. हवा के बुलबुले के लिए सिरिंज का निरीक्षण करें, यदि बुलबुले रहते हैं, तो सभी हवा के बुलबुले हटाने तक चरण 1.3.2.1 - 1.3.2.2 दोहराएं।
  4. एक ठीक स्पैटुला का उपयोग करके, दूसरी सिरिंज के शीर्ष पर सीधे उच्च वैक्यूम सिलिकॉन तेल के ~ 42 माइक्रोन जोड़ें। सभी हवा के बुलबुले को हटाने और यह सुनिश्चित करना है कि सिरिंज के अंत में कोई हवा का अंतर नहीं है, सभी तरह से नीचे प्लंजर पुश करें।
    नोट: सिलिकॉन तेल की सटीक संरचना महत्वपूर्ण नहीं है क्योंकि यह एक निष्क्रिय वाहक के रूप में कार्य कर रहा है। क्रिस्टल समाधान के लिए लगभग 60:40 सिलिकॉन तेल का एक चिपचिपाहट मूल्य और लगभग 60:40 सिलिकॉन तेल का अनुपात इंजेक्शन के लिए इष्टतम है, हालांकि, यह संभव है कि यह नमूने की सटीक विशेषताओं के आधार पर भिन्न हो सकता है। चर्चा में उल्लिखित मिश्रण में क्रिस्टल एकाग्रता को अनुकूलित करने के लिए सिलिकॉन तेल में जोड़े गए क्रिस्टल समाधान की मात्रा को समायोजित करें। सिलिकॉन तेल के अलावा अन्य उच्च चिपचिपा मीडिया का उपयोग तब तक किया जा सकता है जब तक वे नमूने30 , 31,32,33के साथ संगत हों।
  5. सुनिश्चित करें कि दोनों सीरिंज में से किसी में भी हवा के बुलबुले नहीं हैं और कपलर का उपयोग करके सीरिंज को एक साथ संलग्न करते हैं। सिरिंज के अंत को पकड़कर सिरिंज को खड़ी पकड़ें क्योंकि उंगलियों से उत्पन्न गर्मी के कारण सिरिंज को गर्म करने से नमूने पर असर पड़ सकता है।
  6. नमूना को क्रिस्टल समाधान पक्ष पर प्लंजर को धीरे-धीरे निराशाजनक बनाकर एक साथ मिलाएं ताकि यह सिलिकॉन तेल में घोला जा सके और फिर सिलिकॉन तेल की ओर प्लंजर को धक्का दे, ताकि यह नमूना को क्रिस्टल समाधान पक्ष की ओर वापस धकेल दे। धीरे-धीरे, इस प्रक्रिया को 50 से 100 बार दोहराएं ताकि नमूना अच्छी तरह से मिलाया जा सके और सजातीय दिखताहो।
    नोट: यदि क्रिस्टल सीधे अत्यधिक चिपचिपा मीडिया (जैसे, लिपिडिक घन चरण, एलसीपी) में उगाए जाते हैं, तो चरण 1.1-1.6 की आवश्यकता नहीं है। सीरिंज के भीतर क्रिस्टल उगाने के लिए प्रोटोकॉल लियू et.al में पाया जा सकता है । 34,35. नमूना समेकन, चरण 10 तक इस प्रोटोकॉल का पालन करें, जहां सभी नमूने अब एक सिरिंज में निहित हैं और क्रिस्टलीकरण बफर हटा दिया जाता है। इस प्रोटोकॉल के लिए 7.9MAG के अलावा की आवश्यकता नहीं है। इसके बजाय, सिरिंज से सभी अतिरिक्त तरल को धीरे से नमूने में नीचे प्लंजर धक्का जब तक कोई और अधिक तरल सिरिंज में रहता है हटा दें ।
  7. सिरिंज के माध्यम से या तो एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत क्रिस्टल की कल्पना करें या, सर्वोत्तम परिणामों के लिए, एक छोटी राशि (~ 1 माइक्रोएल) को ग्लास स्लाइड पर निकालें और शीर्ष पर एक कवर स्लिप रखें।
  8. क्रिस्टल एकाग्रता की जांच करें।
    1. ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप छवियों का उपयोग कर एक विशिष्ट क्षेत्र में क्रिस्टल की संख्या की गिनती करके सिलिकॉन तेल में क्रिस्टल एकाग्रता का निर्धारण करें। सर्वोत्तम परिणामों के लिए, उच्च क्रिस्टल-हिट दर प्राप्त करने के लिए पूरे मीडिया में समान रूप से तिरस्कृत क्रिस्टल का एक उच्च घनत्व आदर्श (>106 क्रिस्टल/एमएल) है।
    2. चरण 1.3 और 1.4 में चिपचिपा मीडिया के लिए क्रिस्टल के अनुपात को बदलकर सिरिंज में क्रिस्टल एकाग्रता को समायोजित करें।
      1. क्रिस्टल एकाग्रता को कम करने के लिए, चरण 1.4 पर सिलिकॉन तेल/एचवी मीडिया की मात्रा में वृद्धि करके या चरण 1.1 में सिरिंज स्थापित करने से पहले क्रिस्टलीकरण बफर के साथ समाधान में क्रिस्टल गोली को कमजोर करके सिरिंज में क्रिस्टल को पतला करें।
      2. क्रिस्टल एकाग्रता बढ़ाने के लिए, चरण 1.4 में सिलिकॉन तेल की मात्रा को कम करें लेकिन ध्यान रखें कि 10 पा श्च से नीचे चिपचिपाहट को कम न करें।
        नोट: यहां रिपोर्ट की गई क्रिस्टल एकाग्रता को इस विशिष्ट नमूने और क्रिस्टल आकार के लिए अनुकूलित किया गया था। हालांकि, आदर्श क्रिस्टल एकाग्रता क्रिस्टल आकार, बीम आकार, सुई आंतरिक व्यास (मैंने) और घटना एक्स-रे प्रवाह पर निर्भर करेगी। इसे हिट दर से निर्धारित किया जा सकता है जिसमें ~30% की इष्टतम हिट दर को 'अच्छा' माना जाता है। व्यवहार में, वांछित हिट दर प्राप्त करने के लिए बीम समय के दौरान विभिन्न नमूनों के लिए क्रिस्टल एकाग्रता को अनुकूलित किया जाना चाहिए। क्रिस्टल, 109 क्रिस्टल/ क्रिस्टल एकाग्रता को समायोजित करने की प्रक्रिया लियू et.al में दी गई है । 35.
    3. जब तक इंजेक्टर डेटा कलेक्शन के लिए तैयार नहीं हो जाता तब तक प्रोटोकॉल को यहां रोका जा सकता है।
      1. यदि क्रिस्टल एलसीपी में उगाए जाते हैं, तो उन्हें सील करें और उन्हें कमरे के तापमान पर कुछ दिनों तक सीरिंज में रहने दें।
      2. यदि क्रिस्टल को एक अलग उच्च चिपचिपा मीडिया (जैसे सिलिकॉन तेल) में स्थानांतरित कर दिया गया है, तो माप से पहले समय के साथ क्रिस्टल का स्थिरता परीक्षण किया जाना चाहिए। इससे यह तय होगा कि निष्क्रिय मीडिया (आदर्श रूप से और 8 एच) में क्रिस्टल कितने समय तक स्थिर हैं और डेटा संग्रह की समय सीमा। यहां, lysozyme क्रिस्टल सिलिकॉन तेल में दिनों के लिए स्थिर थे और एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर निरीक्षण करते समय भंग होने के लक्षण नहीं दिखाई दिए।
  9. कपलर को डिस्कनेक्ट करने से पहले सभी नमूने को एक सिरिंज में ले जाएं। सिरिंज से कपलर को डिस्कनेक्ट करें और इंजेक्शन सुई संलग्न करें। सिरिंज के आधार में सुई को मजबूती से पेंच करें और यह सुनिश्चित करें कि इसे किसी भी लीकेज को रोकने के लिए कसकर बांधा जाए। इस प्रयोग के लिए 108 माइक्रोन आईएम सुई (सुई की लंबाई 13 मिमी, पॉइंट स्टाइल 3) का उपयोग किया गया था। क्रिस्टल आकार और बीम आकार के आधार पर या तो एक 51 माइक्रोन या 108 माइक्रोन आईएम 20 सुई देते हैं।
    नोट: बीम समय से पहले नमूना स्ट्रीम की पूर्व-परीक्षण सही इंजेक्टर सुई आकार का चयन करने में सक्षम होने के लिए आवश्यक है। नमूना विशेषताओं (यानी, चिपचिपाहट, चार्जिंग, बफर संरचना) और सुई यानी इसके आधार पर नमूने अलग-अलग प्रवाहित होंगे। इसलिए, डेटा संग्रह के दौरान सिग्नल-टू-शोर अनुपात को अधिकतम करने के लिए सबसे छोटी संभव आईएमई सुई के साथ सबसे स्थिर धारा का उत्पादन करने के लिए विभिन्न प्रकार के सुई आकारों का परीक्षण करने की सिफारिश की जाती है।
  10. इंजेक्टर पहले से ही घुड़सवार और धारा 3 के लिए बीम लाइन चाल पर गठबंधन किया है और इंजेक्शन पर सीधे नमूना सिरिंज माउंट है।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है ।

2. इंजेक्टर बढ़ते और नियंत्रण

  1. बीमलाइन पर इंजेक्टर माउंट करें। एमएक्स2 बीमलाइन पर क्रायोजेनिक नोजल निकालें और इसे इंजेक्टर से बदल दें। क्लैंपिंग स्क्रू को ढीला करें जो क्रायोजेनिक नोजल रखता है और इसे मोटराइज्ड चरण के बगल में स्थित ब्रैकेट से जोड़ता है।
  2. इंजेक्टर को अपनी ट्रॉली से ऊपर उठाएं ब्लैक हैंडल पकड़कर मोटराइज्ड स्टेज पर रखें।
    1. इंजेक्टर को मोटराइज्ड स्टेज पर जकड़ना; हाथ काले क्लैंपिंग पेंच घुंडी कस।
  3. इंजेक्टर पर एक खाली सिरिंज माउंट
    1. इंजेक्टर कंप्यूटर कंट्रोल इंटरफेस (यानी ईपीओएस पोजिशन कंट्रोल सॉफ्टवेयर) में सॉफ्टवेयर मेन्यू में टूल्स के तहत होमिंग मोड का चयन करें। फिर नकारात्मक सीमा स्विच का चयन करें, और होमिंग शुरू करें,सॉफ्टवेयर को तब तक चलने दें जब तक कि स्क्रू स्क्रू के नीचे फिट होने के लिए सिरिंज के लिए पर्याप्त रूप से मुकर न जाए। यदि अपर्यवेक्षित चलाने के लिए छोड़ दिया जाता है तो सीमा स्विच अपने आप पेंच बंद कर देता है।
    2. सिरिंज धारक में भट्ठा के माध्यम से सुई डालने के द्वारा इंजेक्टर पर एक खाली ('डमी') सिरिंज माउंट। ब्रैकेट के खिलाफ सिरिंज को लाइन करें।
    3. दो ओ-छल्ले के साथ सिरिंज जकड़ें।
      1. सिरिंज के मध्य खंड में पहले ओ-रिंग को लपेटें जो इसे सिरिंज के दोनों तरफ हुक से जोड़ते हैं।
      2. सिरिंज के ऊपरी भाग पर हुक के चारों ओर दूसरा ओ-रिंग लूप करें और फिर प्रदर्शन और चित्रा 1Bमें दिखाए गए ग्लास सिरिंज के शीर्ष पर ओ-रिंग का एक हिस्सा डालें।
  4. इंजेक्टर को एक्स-रे बीम में संरेखित करें
    1. बीमलाइन नियंत्रण सॉफ्टवेयर के माध्यम से एक्स-रे इंटरैक्शन पॉइंट की ओर इंजेक्टर के साथ मोटराइज्ड स्टेज को मूव करें। इनलाइन कैमरे का उपयोग करके इसकी कल्पना की जा सकती है। बीम का आकार और स्थिति स्क्रीन पर एक रेड क्रॉस द्वारा दर्शाया गया है और मोटरचालित चरण को एक्स-रे इंटरैक्शन क्षेत्र के साथ सुई को संरेखित करने के लिए स्थानांतरित किया जा सकता है।
    2. रेड क्रॉस के साथ सुई को संरेखित करने के लिए मंच की एक्स और वाई स्थिति को समायोजित करें।
    3. जब तक सुई टिप ध्यान में आता है जेड स्थिति को समायोजित करें।
    4. सुई टिप और एक्स-रे बीम के संरेखण को यह जांचकर सत्यापित करें कि सिरिंज टिप क्रॉसहेयर को पूरा करती है जो बीमलाइन कैमरे द्वारा उत्पन्न ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप छवि में दिखाई देती है।
    5. एक बार सुई टिप गठबंधन किया है पार बाल ~ 100 μm ऊपर टिप ले जाएँ। यह सुई टिप से एक्स-रे तितर-बितर समाप्त करता है।
      नोट: सिंक्रोट्रॉन पर एमएक्स 2 बीमलाइन पर इंजेक्टर को बढ़ते और संरेखित करना बीमलाइन वैज्ञानिकों द्वारा किया जाना चाहिए और 30 मिनट से भी कम समय में पूरा किया जा सकता है।

3. नमूना सिरिंज बढ़ते

  1. चरण 2.3 का पालन करके नमूना सिरिंज के साथ खाली सिरिंज को बदलें।
  2. नमूना सिरिंज प्लंजर सिर पर इंजेक्टर कैप रखें।
  3. टोपी के शीर्ष करने के लिए ड्राइव पेंच ले जाएँ।
  4. इंजेक्टर कंट्रोल सॉफ्टवेयर में वेग मोड काचयन करें।
  5. सेटिंग वैल्यू के रूप में इनपुट 3000 आरपीएम (~ 115 nL/s) और प्रेस लागू सेटिंग वैल्यू के रूप में।
  6. जब ड्राइव पेंच सिरिंज प्लंजर सिर पर टोपी को छूता है, मोटर बंद करो।
    1. सेटिंग वैल्यू को बदलकर इंजेक्टर कंट्रोल सॉफ्टवेयर में आरपीएम वैल्यू को शून्य पर सेट करें क्योंकि स्क्रू कैप के पास जाता है।
    2. एक बार संपर्क होने के बाद, स्क्रू को तुरंत रोकने के लिए लागू सेटिंग वैल्यू दबाकर प्रीसेट वैल्यू को सक्रिय करें।
  7. धीरे से टोपी wiggle सुनिश्चित करें कि यह दृढ़ता से जगह में आयोजित किया जाता है बनाने के लिए ।
    नोट: जब भी नियंत्रण सॉफ्टवेयर में सेटिंग वैल्यू बॉक्स में कोई नया सेट वैल्यू दर्ज किया जाता है तो इसे लागू सेटिंग वैल्यूदबाने के बाद ही सक्रिय किया जाता है ।

4. इंजेक्टर रनिंग

  1. कैप ड्राइव स्क्रू के बाद प्लंजर के शीर्ष के साथ फर्म संपर्क बना दिया है आरपीएम सेटिंग मूल्य १०० को बदल दें । यह ~ 4 एनएल/एस के बराबर है।
  2. नेत्रहीन सुई टिप का निरीक्षण करें जब नमूना पहली बार बाहर आता है या सुई के बीमलाइन कैमरे की छवि को देखने के लिए निरीक्षण जब नमूना सुई टिप से बाहर निकलना शुरू होता है ।
  3. हच की खोज करें, हच दरवाजा बंद करें, और एक्स-रे बीम चालू करें। इस बिंदु से इंजेक्टर को हच के बाहर से दूर से संचालित किया जाना चाहिए।
  4. एक स्थिर धारा उत्पन्न होने तक आरपीएम ट्यून करें।
    1. आरपीएम सेटिंग वैल्यू को घटाकर 90 करें।
    2. धारा को धीमा करने के लिए, 10 की वेतन वृद्धि में आरपीएम सेटिंग मूल्य को कम करने के लिए, चरण 4.4.1 दोहराएं। सिलिकॉन तेल के लिए 30 आरपीएम का मूल्य इस्तेमाल किया गया था।
      नोट: नमूना विशेषताओं और एक्स-रे एक्सपोजर समय के आधार पर विशिष्ट आरपीएम रेंज 30-100 आरपीएम (1- 4 एन एल/एस) के बीच भिन्न होती है। सामान्य तौर पर, आरपीएम को स्थिर धारा को बनाए रखते हुए सबसे धीमी प्रवाह दर (नमूना खपत को कम करने के लिए) का उत्पादन करने के लिए ट्यून किया जाना चाहिए।
  5. एक नमूना धारा का प्रबंधन करना जो अच्छी तरह से प्रवाहित नहीं होता है।
    1. 10 की वेतन वृद्धि में आरपीएम सेटिंग मूल्य में वृद्धि रखें जब तक धारा सीधे हो जाती है । यदि स्ट्रीम स्थिर नहीं होती है, तो आरपीएम सेटिंग वैल्यू को अधिकतम मूल्य 100 आरपीएम तक बढ़ाने के बाद भी नीचे वर्णित दो तरीकों में से एक को लागू करके स्थिरता में सुधार करने की कोशिश करें।
      1. पहली विधि: नमूना गाइड में मदद करने के लिए नमूना स्ट्रीम के नीचे एक पॉलीस्टीरिन नमूना पकड़ने डालें। यह विधि अत्यधिक आवेशित नमूना धाराओं के लिए अच्छी तरह से काम करती है।
      2. दूसरी विधि: नमूना पकड़ने के लिए एक वेंटुरी सक्शन फ़नल डालें। कीप को हवा की आपूर्ति करने के लिए, इसे हच में स्थित एयर आउटलेट ट्यूब से कनेक्ट करें। यह विधि स्ट्रीम के प्रभार से स्वतंत्र नमूना प्रवाह को निर्देशित और स्थिर करने में सहायता कर सकती है।
  6. एक बार एक निरंतर और स्थिर स्ट्रीम हासिल हो जाने के बाद, डेटा संग्रह शुरू करें, और एक सामान्य एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी प्रयोग के अनुसार डिटेक्टर दूरी को अनुकूलित करें।
    नोट: आरपीएम को अनुपूरक सूचना, 'लिपिडिको डिवाइस कैलकुलेटर' में आपूर्ति की गई रूपांतरण तालिका का उपयोग करके प्रवाह दर में परिवर्तित किया जाता है। इस कैलकुलेटर का उपयोग करके प्रवाह दर की गणना करने के लिए आरपीएम मूल्य, सुई व्यास और सिरिंज वॉल्यूम दर्ज करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

लिपिडिको एक एचवीआई है जिसे एमएक्स 2(चित्रा 1)पर उपयोग के लिए वैकल्पिक वितरण प्रणाली के रूप में बनाया गया है। यह आदर्श रूप से एसएक्स के लिए अनुकूल है जहां क्रिस्टल या तो लिपिडिक क्यूबिक चरण में उगाए जाते हैं या उच्च चिपचिपा निष्क्रिय मीडिया में स्थानांतरित हो जाते हैं।

इंजेक्टर एप्लिकेशन को प्रदर्शित करने के लिए lysozyme क्रिस्टल के साथ मिश्रित सिलिकॉन तेल का उपयोग ऑस्ट्रेलियाई सिंक्रोट्रॉन में एमएक्स 2 बीमलाइन पर एसएक्स डेटा एकत्र करने के लिए किया गया था। एमएक्स2 बीमलाइन पर इंजेक्टर को माउंट करने के लिए क्रायोजेनिक नोजल को हटा दिया जाता है और उसकी जगह इंजेक्टर को चित्र 1में दिखाया गया है । सिरिंज के नमूनों को सीधे इंजेक्टर पर रखा जाता है और ओ-रिंग्स(चित्रा 1B)का उपयोग करके बांधा जाता है। नमूना परिवर्तन के बाद मिनटों के भीतर डेटा संग्रह शुरू किया जा सकता है। इंजेक्टर को एक साधारण सेटअप के साथ तेजी से नमूना नियंत्रण के लिए डिज़ाइन किया गया है जो उन उपयोगकर्ताओं के लिए काम करना आसान है जो एसएक्स से अपरिचित हैं।

Figure 1
चित्रा 1: लिपिडिको की छवियां, एसएक्स प्रयोगों के लिए ऑस्ट्रेलियाई सिंक्रोट्रॉन में उपयोग किया जाने वाला एक चिपचिपा इंजेक्टर। (A)MX2 में शामिल Lipidico की एक तस्वीर से पता चलता है । लाल तीर एक्स-रे बीम की दिशा को इंगित करता है। (ख)लिपिडिको पर नमूना धारक क्षेत्र का बारीकी से दृश्य । सिरिंज को दो ओ-रिंग्स द्वारा जगह में रखा जाता है और नमूना पकड़ने में एकत्र किया जाता है। (घ)इंजेक्टर सुई और नमूना अपशिष्ट पकड़ने वाले को दर्शाने वाले नमूना धारा का एक क्लोज-अप दृश्य जिसे सुई के नीचे देखा गया पॉलीस्टीरिन/वेंटुरी सक्शन पकड़ने वाले(ए)को शामिल करने के लिए बदला जा सकता है । यह आंकड़ा बर्नत्सेन एट से अनुकूलित किया गया है । AIP प्रकाशन की अनुमति से23 2019 2019। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

इंजेक्टर विभिन्न प्रकार के अत्यधिक चिपचिपा वाहकों के साथ संगत है। इंजेक्टर के लिए इष्टतम नमूना चल गति धारा स्थिरता के लिए महत्वपूर्ण है, बहुत धीमी गति से एक कर्लिंग प्रभाव/ इष्टतम गति का उपयोग किए गए वाहक प्रणाली के आधार पर भिन्न होगा। चित्रा 2 और चित्रा 3 विभिन्न इंजेक्टर गति से परीक्षण किए गए सिलिकॉन तेल दिखाते हैं और दर्शाता है कि स्ट्रीम व्यवहार कैसे भिन्न हो सकता है। धीमी प्रवाह दर(चित्रा 2 ए,2.3 एनएल/एस) के परिणामस्वरूप इंजेक्टर से निकाले गए सिलिकॉन तेल का विस्तार होता है जबकि तेज प्रवाह दर(चित्रा 2C,6.6 एनएल/एस) एक पतली धारा पैदा करती है। चिपचिपा मीडिया स्ट्रीम का कर्लिंग नियमित रूप से देखा गया है(चित्रा 3A)। इस मुद्दे को दूर करने के लिए दो अभिनव समाधानों का परीक्षण किया गया: सुई के नीचे एक पॉलीस्टीरिन पकड़ने वाला और एक वेंटुरी सक्शन फ़नल। पॉलीस्टीरिन पकड़ने वाला एक कमजोर इलेक्ट्रोस्टैटिक बल का परिचय देता है और सिलिकॉन तेल(चित्रा 3B)के मामले में अत्यधिक चार्ज किए गए नमूनों पर सबसे अच्छा काम करता है, जबकि वेंटुरी सक्शन कीप स्ट्रीम को पकड़ने के लिए नीचे की ओर लंबवत मार्गदर्शन करने में सहायक होता है, नमूना चार्जिंग से स्वतंत्र। नमूना की विशेषताओं के आधार पर या तो विकल्प सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया जा सकता है।

Figure 2
चित्रा 2: विभिन्न इंजेक्टर गति का उपयोग करके एक उच्च चिपचिपा वाहक धारा का प्रभाव। इसके प्रवाह विशेषताओं का आकलन करने के लिए विभिन्न नमूना वेग पर 100% सिलिकॉन तेल का परीक्षण किया गया था। (A) . 2.3 nL/s (30 आरपीएम),(B)3.5 एनएल/एस (90 आरपीएम) और(सी)6.6 एन/एस (170 आरपीएम) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: चिपचिपा मीडिया के कर्लिंग का प्रदर्शन 100% सिलिकॉन तेल का स्ट्रीम व्यवहार। (A)23 एनएल/एस (30 आरपीएम)(बी)पर कर्लिंग प्रभाव 23 एनएल/एस (30 आरपीएम) पर संचालित इंजेक्टर स्पीड के साथ नमूना अपशिष्ट धारक को पॉलीस्टीरिन पकड़ने वाले को जोड़ने का प्रभाव। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

सिलिकॉन तेल में निलंबित lysozyme क्रिस्टल (क्रिस्टल आकार 10 μm x 10 μm x 20 μm) के 26 μL युक्त एक ग्लास सिरिंज का उपयोग किया गया था(चित्रा 4A)। Lipidico एक निरंतर नमूना स्ट्रीम उत्पन्न, १०८ μm सुई I.D. का उपयोग कर, १.१४ nL/s की औसत प्रवाह दर के साथ (मोटर सेट के साथ 30 आरपीएम) । हिट दर का आकलन करने के लिए एक चोटी खोजने वाले एल्गोरिदम36 का उपयोग किया गया था और डेटा संग्रह समय के 38 मिनट के भीतर पर्याप्त मात्रा में डेटा (कुल 224,200 छवियां) एकत्र किए गए थे, जिससे संरचना पुनर्प्राप्ति (पीडीबी कोड 6एमक्यूवी) को सक्षम किया गया था। तालिका 1 डेटा संग्रह के आंकड़ों का सारांश प्रदान करता है और चित्रा 4B lysozyme संरचना20में डि-सल्फाइड बांड में से एक के आसपास इलेक्ट्रॉन घनत्व मानचित्र की एक प्रतिनिधि छवि दिखाता है।

Figure 4
चित्रा 4: Lysozyme छवियां। (A)सिलिकॉन तेल में lysozyme क्रिस्टल की ऑप्टिकल छवियां । एक क्रॉस पोलरस (40x आवर्धन) एक उच्च चिपचिपा मीडिया, सिलिकॉन तेल के साथ मिश्रित lysozyme क्रिस्टल की छवि, एक दृश्यमान प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवि। क्रिस्टल का आकार 15 और 20 माइक्रोन और(बी)इलेक्ट्रॉन घनत्व मानचित्र (2Fo-fc, 1σ) के एक प्रतिनिधि छवि के बीच है जो lysozyme के डिसल्फाइड बांड के आसपास है। यह आंकड़ा बर्नत्सेन एट से अनुकूलित किया गया है । AIP प्रकाशन की अनुमति से23 2019 2019। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक सूचना। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें। 

तालिका 1: लिपिडिको से एसएक्स डेटा आंकड़े दिखाने वाली सारांश तालिका। Lysozyme क्रिस्टल एक उच्च चिपचिपा मीडिया, सिलिकॉन तेल के साथ मिलाया गया था, और MX2 बीमलाइन के एक्स-रे बातचीत क्षेत्र के माध्यम से स्ट्रीम । यह बर्नत्सेन एट में प्रकाशित परिणामों की पूरी तालिका का सारांश है। अल.23. एआईपी प्रकाशन की अनुमति से तालिका को यहां अनुकूलित किया गया है।

डेटा आंकड़े लिपिडिको, एमएक्स 2 बीमलाइन
वेक्षक डेट्रास ईईगर एक्स 16एम,
फ्रेम दर 100Hz
नमूना डिटेक्टर दूरी (मिमी) 300
एक्स-रे ऊर्जा (केवी) 13
बीम आकार (WxH) (μm) 12x22
नहीं। फ्रेम की 224200
हिट दर (%) 2.95
नहीं। अनुक्रमित फ्रेमों की 4852
संकल्प (Å) 17.74-1.83
पूर्णता 99.44
अंतरिक्ष समूह पी 43212
यूनिट सेल
ए, बी, सी (Å) 78.68, 78.68, 34.48
α, β, γ (°) 90, 90, 90
I/σ (I) 5.08
अतिरेक 73.97
सीसी1/2 0.96
आरकाम/आरमुक्त 0.18/0.26

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

सिंक्रोट्रॉन स्रोतों पर एसएक्स प्रयोगों को करने के लिए आदर्श, एक वैकल्पिक एचवीआई विकसित किया गया है। मौजूदा एचवीआई पर इसके दो प्रमुख फायदे हैं । सबसे पहले, पारंपरिक क्रिस्टलोग्राफी और एसएक्स के बीच तेजी से स्विचिंग की अनुमति देने वाली बीमलाइन पर स्थापित करना आसान है, एमएक्स 2 पर स्थापना और संरेखण के लिए सिर्फ ~ 30 मिनट की आवश्यकता होती है। दूसरा, क्रिस्टल उगाने के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले सैंपल सीरिंज को सीधे इंजेक्शन के लिए जलाशयों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, नमूना हस्तांतरण के दौरान बर्बादी को सीमित किया जा सकता है । नमूनों को बदलने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन और प्रदर्शन किया गया है । डिजाइन अन्य एचवीआई की तुलना में जेट को नियंत्रित करने के लिए एक जटिल गैस स्ट्रीम की आवश्यकता को समाप्त करता है। इंजेक्टर की प्रवाह दर को बदलने के लिए एक सरल प्रक्रिया का प्रदर्शन किया गया था जिसे विलंबित प्रतिक्रिया के बिना समायोजित किया जा सकता है।

सफल एसएक्स डेटा संग्रह के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम क्रिस्टल एकाग्रता का अनुकूलन कर रहे हैं, उच्च चिपचिपा मीडिया का एक सजातीय मिश्रण प्राप्त कर रहे हैं, और डेटा संग्रह के लिए एक स्थिर धारा का उत्पादन कर रहे हैं। इष्टतम क्रिस्टल एकाग्रता और एकरूपता क्रिस्टल को एक गोली के नीचे अपकेंद्री करके और वाहक मीडिया में क्रिस्टल की उच्च एकाग्रता जोड़कर प्राप्त की जा सकती है, यह सुनिश्चित करते हुए कि नमूना कपलर सिस्टम में अच्छी तरह से मिश्रित है। एक बार क्रिस्टल एकाग्रता अनुकूलित होने के बाद, एक स्थिर धारा प्राप्त करने के लिए बीमटाइम के दौरान इंजेक्टर प्रवाह दर को आसानी से समायोजित किया जा सकता है। चिपचिपा धारा का कर्लिंग आमतौर पर उच्च चिपचिपा नमूनों के साथ मनाया जाता है। दो समाधान प्रस्तुत किए जाते हैं: चार्ज नमूनों के लिए पॉलीस्टीरिन नमूना पकड़ने का उपयोग या पकड़ने वाले के रूप में कार्य करने वाले वेंटुरी सक्शन फ़नल के अलावा। यह प्रारंभिक परीक्षणों में स्ट्रीम को नियंत्रित करने में सफल रहा है, लेकिन विभिन्न नमूना स्थितियों के तहत स्ट्रीम के कर्लिंग के परिणामस्वरूप नमूना सुई बिंदु पर चिपका हो सकता है। यह संभव है कि विशेष कोटिंग्स जोड़कर सुई के सतह प्रभारी गुणों को बदलकर इसे दूर किया जा सकता है। विभिन्न रसायनों (यानी सिलिकॉन) के साथ लेपित सुइयों को पहले तरल हैंडलिंग रोबोटों के साथ उपयोग के लिए सफलतापूर्वक अनुकूलित किया गया है और सिरिंज37के अनुरूप विनिर्माण से कस्टम ऑर्डर किया जा सकता है।

इंजेक्टर सिलिकॉन तेल तक ही सीमित नहीं है और अन्य अत्यधिक चिपचिपा तरल पदार्थ के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है। 23 ऐसे कई अलग - अलग - अलगविकल्पों का प्रदर्शन किया गया है जिनका उपयोग क्रिस्टल इंजेक्शन के लिए सफलतापूर्वक किया जा सकता है और इसका वर्णन कई अन्य प्रकाशनों22,30,33में कियागयाहै . इस एचवीआई का उपयोग करके नमूना चिपचिपाहट पर ऊपरी सीमा अभी भी जांच के अधीन है, हालांकि 25 पीए (100% सिलिकॉन तेल का उपयोग करके) के नमूना चिपचिपाहट के परिणामस्वरूप एक स्थिर धारा हुई है। हालांकि, जब नमूना चिपचिपाहट को कम कर दिया गया था & 10 Pa.s (७०% सिलिकॉन तेल नमूना का उपयोग कर) एक विश्वसनीय धारा का उत्पादन नहीं किया जा सकता है । इसलिए, 10 पीए इस एचवीआई का उपयोग करके इंजेक्शन के लिए नमूना चिपचिपाहट पर वर्तमान निचली सीमा का प्रतिनिधित्व करता है। सुई मैंने भी एक महत्वपूर्ण विचार है। यद्यपि 51 माइक्रोन आईएमई का बिना किसी क्रिस्टल के विभिन्न वाहकों को इंजेक्शन देते हुए सफलतापूर्वक परीक्षण किया गया था, क्रिस्टल की शुरूआत नमूना प्रवाह को बाधित करती है। इसलिए, उनके आकार के आधार पर, मैट्रिक्स में पेश किए गए क्रिस्टल के साथ, बड़े सुई आकार की तुलना में 51 माइक्रोन आईआईड सुई का उपयोग करते समय रुकावट की बहुत अधिक संभावना होती है। जब एक रुकावट होती है तो दबाव का एक महत्वपूर्ण बिल्डअप हो सकता है, अन्य इंजेक्टर में इसके परिणामस्वरूप सिरिंज टूटना हो सकता है। हालांकि, इस एचवीआई के डिजाइन में एक सुरक्षा तंत्र शामिल है जहां ड्राइव यांत्रिकी सिरिंज प्लंजर से दूर खींच लेगी यदि दबाव बहुत अधिक हो जाता है जब तक कि निष्क्रियता स्विच सक्षम न हो जाए। यह ड्राइव बंद कर दिया जा रहा है और कांच सिरिंज टूटना से रोकता है में परिणाम है।

इस इंजेक्टर के लिए कई सीमाएं मौजूद हैं। इंजेक्टर विशेष रूप से अत्यधिक चिपचिपा नमूनों के लिए डिज़ाइन किया गया है, इसलिए, नमूनों की तरह तरल सीधे नमूना वितरण के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है। इस सीमा को दूर करने के लिए, बफर सिस्टम में उगाए गए क्रिस्टल को एक उपयुक्त निष्क्रिय मीडिया के साथ मिलाया जा सकता है जैसा कि चरण 1 में वर्णित है, हालांकि, एक संभावना है कि क्रिस्टल अस्थिर हो सकता है। इसलिए, विभिन्न प्रकार के निष्क्रिय मीडिया26, 27,28,29की जांच की जानी चाहिए ताकि नमूनास्थिरता सुनिश्चित की जा सके। दूसरा, क्रिस्टल पैकिंग के क्रिस्टल के आकार और गुणवत्ता से विवर्तन गुणवत्ता प्रभावित होगी। एमएक्स2 बीमलाइन 22 x 12 माइक्रोन (एच एक्स डब्ल्यू) और फ्लक्स ~ 1012 फोटॉन/एस के इष्टतम बीम आकार पर संचालित होती है । एमएक्स 2 पर एसएक्स को पूरा करने के लिए इष्टतम क्रिस्टल आकार ~ 10 माइक्रोन है और इसे उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात प्राप्त करने के लिए दिखाया गया है। हालांकि, छोटे आकार के क्रिस्टल पर डेटा एकत्र करना संभव है यदि वे अच्छी तरह से ऑर्डर किए जाते हैं और उच्च-रिज़ॉल्यूशन के लिए विवर्तन करते हैं। इस बीम लाइन पर बीम आकार को ~ 7.5 माइक्रोन तक काटने का विकल्प है, हालांकि, यह एक लागत पर आता है क्योंकि यह घटना प्रवाह को कम करता है जिसे प्रयोग के दौरान विचार करने की आवश्यकता होती है।

इस इंजेक्टर का विकास एसएक्स को मुख्यधारा के क्रिस्टलोग्राफर के लिए आसानी से सुलभ बनाता है। लिपिडिको का सफल संचालन, विभिन्न प्रकार के सिंक्रोट्रॉन स्रोतों पर एसएक्स डेटा संग्रह के लिए एक तेज और आसान विधि का दरवाजा खोलता है। यह क्रिस्टल पर कमरे के तापमान डेटा संग्रह को सक्षम बनाता है जो एमएक्स 2 पर 10 माइक्रोन या उससे कम हैं, जो व्यक्तिगत क्रिस्टल के लिए विकिरण क्षति प्रभाव को सीमित करते हैं। यह ऑस्ट्रेलिया में एक नया अवसर भी प्रदान करता है जो मिलीसेकंड समय को हल करने के लिए एसएक्स का समाधान करता है जो क्रिस्टलोग्राफर के लिए वर्तमान अत्याधुनिक है। इस इंजेक्टर सिस्टम के भविष्य के अनुप्रयोग छोटे कोण एक्स-रे स्कैटरिंग (एसएएक्सएस) का उपयोग करके अत्यधिक चिपचिपा सामग्रियों के एक्स-रे लक्षण वर्णन तक विस्तारित होते हैं, जिससे इंजेक्टर को ऑस्ट्रेलियाई सिंक्रोट्रॉन में अन्य बीमलाइन के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

एमके कुसल डिजाइन के लिए काम करता है। कुसेल डिजाइन, एक कस्टम प्रयोगशाला डिवाइस डेवलपर, ला ट्रोब विश्वविद्यालय के डॉ पीटर बेंटसेन और ANSTO के डॉ टॉम कैराडोक-डेविस द्वारा लगाया गया था और ऑस्ट्रेलियाई सिंक्रोट्रॉन में एमएक्स 2 बीम लाइन में उच्च चिपचिपा अध्ययन को सक्षम करने के लिए एक कम लागत वाला उपकरण विकसित करने के लिए। इस उपकरण को डॉ कैराडोक-डेविस के साथ गहन परामर्श से विकसित किया गया था । लेखकों के पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं हैं ।

Acknowledgments

इस काम को ऑस्ट्रेलियन रिसर्च काउंसिल सेंटर ऑफ एक्सीलेंस इन एडवांस्ड मॉलिक्यूलर इमेजिंग (CE140100011) (http://www.imagingcoe.org/) ने सपोर्ट किया । यह शोध एएनएसओ के हिस्से ऑस्ट्रेलियन सिंक्रोट्रॉन में एमएक्स 2 बीमलाइन का उपयोग करके भाग में किया गया था, और ऑस्ट्रेलियाई कैंसर रिसर्च फाउंडेशन (एसीआरएफ) डिटेक्टर का उपयोग किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hen eggwhite lysozyme Sigma-Aldrich L6876 Used to grow crystals for testing the injector and the crystals are transferred into silicon grease. https://www.sigmaaldrich.com/
High vacuum silicon grease Dow Corning Z273554-1EA Used for testing of injector. https://www.sigmaaldrich.com/
Injector needle (108 µm ID) Hamilton part No: 7803-05 www.hamiltoncompany.com
Glass gas-tight syringes, 100 µl Hamilton part no: 7656-01 Syringes used for sample injection. www.hamiltoncompany.com
LCP syringe coupler Formulatrix 209526 Syringe coupler to mix the samples
Lipidico injector La Trobe Univerity/ANSTO This is a specific piece of equipment that can be accessed through La Trobe University / ANSTO Australian Synchrotron Facility

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boutet, S., et al. High-resolution protein structure determination by serial femtosecond crystallography. Science. 337 (6092), 362-364 (2012).
  2. Spence, J. C. H., Weierstall, U., Chapman, H. N. X-ray lasers for structural and dynamic biology. Reports on Progress in Physics. 75 (10), 102601 (2012).
  3. Aquila, A., et al. Time-resolved protein nanocrystallography using an X-ray free-electron laser. Optics Express. 20 (3), 2706-2716 (2012).
  4. Schlichting, I. Serial femtosecond crystallography: the first five years. International Union of Crystallography. 2, 246-255 (2015).
  5. Lee, D., et al. Nylon mesh-based sample holder for fixed-target serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 9, 6971 (2019).
  6. Martin, A. V., et al. Fluctuation X-ray diffraction reveals three-dimensional nanostructure and disorder in self-assembled lipid phases. Communications Materials. 1 (1), 1-8 (2020).
  7. Roedig, P., et al. High-speed fixed-target serial virus crystallography. Nature Methods. 14 (8), 805 (2017).
  8. Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-81 (2011).
  9. Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nature Communications. 5, 3309 (2014).
  10. Weierstall, U. Liquid sample delivery techniques for serial femtosecond crystallography. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 369 (1647), 20130337 (2014).
  11. Gati, C., et al. Atomic structure of granulin determined from native nanocrystalline granulovirus using an X-ray free-electron laser. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2247-2252 (2017).
  12. Nam, K. H. Sample delivery media for serial crystallography. International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1094 (2019).
  13. Batyuk, A., et al. Native phasing of x-ray free-electron laser data for a G protein-coupled receptor. Science Advances. 2 (9), 1600292 (2016).
  14. Kern, J., et al. Structures of the intermediates of Kok's photosynthetic water oxidation clock. Nature. 563 (7731), 421 (2018).
  15. Suga, M., et al. An oxyl/oxo mechanism for oxygen-oxygen coupling in PSII revealed by an x-ray free-electron laser. Science. 366 (6463), 334-338 (2019).
  16. Tenboer, J., et al. Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein. Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).
  17. Pande, K., et al. Femtosecond structural dynamics drives the trans/cis isomerization in photoactive yellow protein. Science. 352 (6286), 725-729 (2016).
  18. Ishigami, I., et al. Snapshot of an oxygen intermediate in the catalytic reaction of cytochrome c oxidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3572-3577 (2019).
  19. Nango, E., et al. A three-dimensional movie of structural changes in bacteriorhodopsin. Science. 354 (6319), 1552-1557 (2016).
  20. Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation. International Union of Crystallography. 2, 168-176 (2015).
  21. Nogly, P., et al. Retinal isomerization in bacteriorhodopsin captured by a femtosecond x-ray laser. Science. 361 (6398), (2018).
  22. Martin-Garcia, J. M., et al. Serial millisecond crystallography of membrane and soluble protein microcrystals using synchrotron radiation. International Union of Crystallography. 4, 439-454 (2017).
  23. Berntsen, P., et al. The serial millisecond crystallography instrument at the Australian Synchrotron incorporating the "Lipidico" injector. Review of Scientific Instruments. 90 (8), 085110 (2019).
  24. Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallographica Section D-Structural Biology. 71, 387-397 (2015).
  25. DePonte, D. P., Nass, K., Stellato, F., Liang, M., Chapman, H. N. Sample injection for pulsed X-ray sources. Advances in X-Ray Free-Electron Lasers: Radiation Schemes, X-Ray Optics, and Instrumentation: Proceedings of Society of Photo-Optical Instrumentation Engineers. Tschentscher, T., Cocco, D. , Prague, Czech Republic. 8078 (2011).
  26. Park, S. Y., Nam, K. H. Sample delivery using viscous media, a syringe andasyringe pump for serial crystallography. Journal of Synchrotron Radiation. 26, 1815-1819 (2019).
  27. Shimazu, Y., et al. High-viscosity sample-injection device for serial femtosecond crystallography at atmospheric pressure. Journal of Applied Crystallography. 52, 1280-1288 (2019).
  28. Kovacsova, G., et al. Viscous hydrophilic injection matrices for serial crystallography. International Union of Crystallography. 4, 400-410 (2017).
  29. Darmanin, C., et al. Protein crystal screening and characterization for serial femtosecond nanocrystallography. Scientific Reports. 6, 25345 (2016).
  30. Conrad, C. E., et al. A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography. International Union of Crystallography. 2, 421-430 (2015).
  31. Sugahara, M., et al. Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography. Nature Methods. 12 (1), 61-63 (2015).
  32. Sugahara, M., et al. Oil-free hyaluronic acid matrix for serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 6, 24484 (2016).
  33. Fromme, R., et al. Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase. International Union of Crystallography. 2, 545-551 (2015).
  34. Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography. Journal of Visualized Experiments. (115), e54463 (2016).
  35. Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography. Nature Protocols. 9 (9), 2123-2134 (2014).
  36. Hadian-Jazi, M., et al. A peak-finding algorithm based on robust statistical analysis in serial crystallography. Journal of Applied Crystallography. 50, 1705-1715 (2017).
  37. Kong, F. W., Yuan, L., Zheng, Y. F., Chen, W. D. Automatic Liquid Handling for Life Science: A critical review of the current state of the art. Journal of Laboratory Automation. 17 (3), 169-185 (2012).

Tags

बायोइंजीनियरिंग अंक 163 धारावाहिक क्रिस्टलोग्राफी उच्च चिपचिपा इंजेक्टर लिपिडिक घन चरण छोटे क्रिस्टल एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी सिंक्रोट्रॉन
ऑस्ट्रेलियाई सिंक्रोट्रॉन में धारावाहिक क्रिस्टलोग्राफी मापन के लिए लिपिडिको इंजेक्शन प्रोटोकॉल
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Berntsen, P., Sharma, R., Kusel, M., … More

Berntsen, P., Sharma, R., Kusel, M., Abbey, B., Darmanin, C. Lipidico Injection Protocol for Serial Crystallography Measurements at the Australian Synchrotron. J. Vis. Exp. (163), e61650, doi:10.3791/61650 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter