Summary
Das Ziel dieses Protokolls ist es, zu zeigen, wie serielle Kristallographieproben für die Datenerfassung auf einem hochviskosen Injektor, Lipidico, vorbereitet werden, das kürzlich im australischen Synchrotron in Auftrag gegeben wurde.
Abstract
Am australischen Synchrotron wurde eine Anlage zur Durchführung serieller Kristallographiemessungen entwickelt. Diese Anlage verfügt über einen speziell gebauten hochviskosen Injektor, Lipidico, als Teil der makromolekularen Kristallographie (MX2) Strahllinie, um eine große Anzahl von kleinen Kristallen bei Raumtemperatur zu messen. Ziel dieser Technik ist es, den Anbau/Transfer von Kristallen in Glasspritzen zu ermöglichen, die direkt im Injektor zur seriellen Kristallographiedatenerfassung verwendet werden können. Zu den Vorteilen dieses Injektors gehört die Fähigkeit, schnell auf Veränderungen der Durchflussrate ohne Unterbrechung des Stroms zu reagieren. Für diesen Hochviskositätsinjektor (HVI) bestehen mehrere Einschränkungen, die eine Beschränkung der zulässigen Probenviskosität auf >10 Pa.s beinhalten. Die Streamstabilität kann je nach den spezifischen Eigenschaften der Stichprobe möglicherweise auch ein Problem darstellen. Ein detailliertes Protokoll zur Einrichtung von Proben und zum Betrieb des Injektors für serielle Kristallographiemessungen am australischen Synchrotron wird hier vorgestellt. Das Verfahren demonstriert die Vorbereitung der Probe, einschließlich der Übertragung von Lysozymkristallen in ein hochviskoses Medium (Silikonfett) und den Betrieb des Injektors zur Datenerfassung bei MX2.
Introduction
Serielle Kristallographie (SX) ist eine Technik, die ursprünglich im Kontext von Röntgen-Freie-Elektronen-Laser (XFELs)1,2,3,4entwickelt wurde. Obwohl feste Zielansätze für SX5,6,7, in der Regel verwendet werden, um Kristalle in einem kontinuierlichen Strom an den Röntgenstrahl zu liefern. Da es Daten aus einer großen Anzahl von Kristallen kombiniert, vermeidet SX die Notwendigkeit einer Kristallausrichtung während des Experiments und ermöglicht die Erfassung von Daten bei Raumtemperatur8,9. Mit Hilfe eines geeigneten Injektors werden die Kristalle nacheinander in den Röntgen-Interaktionsbereich geströmt und die resultierenden Beugungsdaten auf einem Flächendetektor9,10gesammelt. Bis heute ist es SX gelungen, eine Reihe von Proteinstrukturen1,11,12,13 einschließlich Kristallen zu lösen, die zu klein sind, um sie mit konventioneller Kristallographie zu messen. Es hat auch neue Einblicke in die zeitaufgelöste molekulare Dynamik gegeben, indem es die Femtosekundenpulsdauer des XFEL ausnutzt. Durch die Initiierung von Pump-Sonden-Reaktionen mit optischen Laserquellen wurden eingehende Studien am Photosystem II14,15, photoaktivem gelben Protein16,17, Cytochrom C Oxidase18sowie Bakteriorhodopsin19,20,21durchgeführt. Diese Studien haben die Elektronentransferdynamik untersucht, die nach der Lichtaktivierung auftritt und das signifikante Potenzial der seriellen Kristallographie für das Verständnis zeitaufgelöster biologischer Prozesse demonstriert.
Die Entwicklung der seriellen Kristallographie wird auch an Synchrotronquellenimmerhäufiger 9,12,20,22,23,24. Synchrotron-basiertes SX ermöglicht es, eine große Anzahl einzelner Kristalle effizient bei Raumtemperatur mit einem geeigneten Injektorsystem zu messen. Dieser Ansatz eignet sich daher für kleinere Kristalle und erfordert nicht nur einen schnellen Framerate-Detektor, um die Daten zu erfassen, sondern auch einen mikrofokussierten Strahl. Im Vergleich zur konventionellen Kristallographie beinhaltet SX nicht die Montage und Ausrichtung einzelner Kristalle im Röntgenstrahl. Da Daten aus einer großen Anzahl einzelner Kristalle zusammengeführt werden, kann die von jedem Kristall empfangene Strahlendosis im Vergleich zur herkömmlichen Kristallographie erheblich reduziert werden. Synchrotron SX kann auch auf die Untersuchung von zeitaufgelösten Reaktionen angewendet werden, sogar bis zum Millisekundenregime, sofern ein Detektor mit einer ausreichend hohen Bildrate verfügbar ist (z. B. 100 Hz oder mehr). Mehrere serielle Kristallographie-Experimente wurden am Synchrotron mit Injektoren durchgeführt, die ursprünglich an XFEL-Quellen20,22,23entwickelt wurden. Die beiden häufigsten Arten von Injektoren sind die Gas Dynamic Virtual Nozzle (GDVN)25 und High Viscous Injector (HVI)9,24,26,27,28. Der GDVN ist ideal für die Injektion von Flüssigkeitsproben mit niedriger Viskosität, erfordert jedoch hohe Durchflussraten, um stabile Ströme zu erzielen, was wiederum zu hohen Abtastraten führt. Im Gegensatz dazu eignen sich DIE HVI für Proben mit hoher Viskosität, die die Erzeugung eines stabilen Stroms bei wesentlich niedrigeren Durchflussraten ermöglichen, was zu einem wesentlich geringeren Probenverbrauch führt. Der HVI-Injektor bevorzugt daher die Abgabe von Proben, bei denen ein viskoser Träger vorzuziehen ist (z. B. Lipidbasis für Membranproteine) und/oder große Probenmengen nicht verfügbar sind. SX-Injektoren sind in der Regel eine Herausforderung zu bedienen und erfordern umfangreiche Schulungen, um zu arbeiten. Sie beinhalten auch langwierige Probenübertragungsprotokolle, da die Probe in ein spezielles Reservoir geladen werden muss, was im Allgemeinen ein hohes Risiko mit sich bringt, dass probenentweder im "toten Volumen" oder durch Leckagen in den Anschlüssen verloren gehen. Daher ist es wünschenswert, das Injektor-Design zu optimieren, um Verluste zu verringern, bevor die Probe den Röntgenstrahl erreicht.
Kürzlich wurden die ersten SX-Ergebnisse mit Lipidico23 mit einem Lysozym-Ziel mit einem Eiger 16M-Detektor veröffentlicht. Dieses Injektordesign begrenzt die Probenverschwendung, indem die Anzahl der Schritte minimiert wird, die mit der ersten Kristallisation zum Transfer von Kristallen in den Injektor verbunden sind, gefolgt von der Abgabe der Probe an den Röntgenstrahl. Dieses Manuskript beschreibt und demonstriert das Probentransferverfahren, beginnend mit der Probenvorbereitung, dem Übergang zum Injektionsprozess und schließlich der Datenerfassung unter Verwendung desselben Kristallisationsgefäßes. Die Funktionsweise des Injektors wird ebenfalls beschrieben.
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Protocol
1. Herstellung von Kristallen in einem hochviskosen Medium mit Glasspritzen
- Zentrifugieren Sie die Kristalllösung vorsichtig (ca. 1.000 x g, 10 min bei 22 °C), um ein weiches Kristallpellet zu bilden und den überschüssigen Puffer zu entfernen. Dies führt zu einer hohen Kristallkonzentration im Pellet, die für die Datenerfassung verwendet werden kann.
HINWEIS: Um eine Verdünnung der viskosen Medien zu verhindern, erhöhen Sie die Kristallkonzentration in diesem Schritt. Optimieren Sie das Verhältnis von viskosen Medien zu Kristallvolumen für jede Probe, um eine hohe Kristallkonzentration zu erhalten und gleichzeitig eine hohe Viskosität für die Medien zu erhalten. Zentrifugieren Sie die Kristalllösung, um ein Pellet zu bilden und überschüssigepuffer zu entfernen, um die Kristallkonzentration in der Lösung zu erhöhen, wie in Darmanin et beschrieben. 29. - Richten Sie zwei 100-L-Spritzen mit einem Koppler ein.
- Befestigen Sie den Koppler am Ende der ersten Spritze und fügen Sie der Oberseite der Spritze eine Kristalllösung mit 28 l. L hinzu. Legen Sie den Kolben langsam in die Oberseite der Spritze ein und drücken Sie die Lösung vorsichtig bis zum Ende der Kupplungsspitze, wodurch sich alle sich bildenden Luftblasen entfernen. Gehen Sie folgen Sie einer der beiden unten beschriebenen Methoden.
HINWEIS: Das Volumen der Kristalle, die dem hochviskosen Medium zugesetzt werden sollen, kann variiert werden, wenn es die Viskosität der Gesamtprobe nicht wesentlich verändert.- Erste Methode: Verwenden Sie schnelle Druckänderungen, um die Luftblasen zu platzen.
- Legen Sie vorsichtig einen Handfinger auf die Oberseite des stumpfen Kupplungsnadelpunkts und (sehr sanft) Druck ausüben, um eine Dichtung zu erzeugen. Wenden Sie nicht zu viel Druck auf, da dies zu einer Nadelstichverletzung führen kann.
- Ziehen Sie nun den Kolben zurück, um die Lösung vom Nadelpunkt wegzuziehen, dies erzeugt eine Anhäufung von Druck in der Spritze.
- Lösen Sie den Druck an der Oberseite der Spritze schnell, indem Sie den Gehandicapfinger von der abgestumpften Nadelspitze entfernen. Seien Sie vorsichtig, wenn die Probe zu nah an der Spitze ist, wenn der Finger entfernt wird, kann es sprayout, was zu einem Verlust der Probe. Die schnelle Druckänderung innerhalb der Spritze wird die Luftblasen platzen lassen. Wiederholen Sie dies, bis alle Blasen entfernt wurden.
- Zweite Methode: Verwendung der "menschlichen Zentrifuge" zur Entfernung von Luftblasen.
- Legen Sie die Spritze in eine Hand mit der Nachoben zeigenden Nadel und dem Kolben zwischen zwei Fingern, so dass sie sich nicht bewegen kann.
- Drehen Sie den Arm, der die Spritze in eine Richtung hält, 2-3 Mal schnell, die resultierende Zentrifugalkraft auf der Probe zwingt alle Luftblasen aus der Spritze. Seien Sie vorsichtig, wenn zu langsam durchgeführt Probe verloren gehen kann.
- Prüfen Sie die Spritze auf Luftblasen, wenn Blasen übrig bleiben, wiederholen Sie die Schritte 1.3.2.1 – 1.3.2.2, bis alle Luftblasen entfernt sind.
- Erste Methode: Verwenden Sie schnelle Druckänderungen, um die Luftblasen zu platzen.
- Mit einem feinen Spachtel geben Sie 42 L Hochvakuum-Silikonfett direkt an die Oberseite der zweiten Spritze. Drücken Sie den Kolben bis zum Ende, entfernen Sie alle Luftblasen und stellen Sie sicher, dass sich am Ende der Spritze kein Luftspalt befindet.
HINWEIS: Die genaue Zusammensetzung des Silikonfetts ist nicht entscheidend, da es als inerter Träger wirkt. Ein Viskositätswert von >10 Pa.s oder ein Verhältnis von ca. 60:40 Silikonfett zu Kristalllösung ist optimal für die Injektion, es ist jedoch möglich, dass dies je nach den genauen Eigenschaften der Probe variieren kann. Passen Sie das Volumen der Kristalllösung, die dem Silikonfett zugesetzt wird, an, um die Kristallkonzentration in der Mischung zu optimieren, wie in der Diskussion beschrieben. Hochviskose Medien außer Silikonfett können verwendet werden, solange sie mit der Probe30,31,32,33kompatibel sind. - Stellen Sie sicher, dass sich in einer der beiden Spritzen keine Luftblasen befinden, und befestigen Sie die Spritzen mit dem Koppler. Halten Sie die Spritzen vertikal, indem Sie nur das Ende der Spritze greifen, da das Aufwärmen der Spritze aufgrund der von den Fingern erzeugten Wärme die Probe beeinflussen kann.
- Mischen Sie die Probe, indem Sie den Kolben auf der Kristalllösungsseite sanft deprimieren, so dass er sich in das Silikonfett mischt, und dann den Kolben auf die Silikonfettseite drücken, so dass er die Probe zurück zur Kristalllösungsseite schiebt. Wiederholen Sie diesen Vorgang 50 bis 100 Mal, so dass die Probe gründlich gemischt wird und homogenaussieht.
HINWEIS: Wenn die Kristalle direkt in hochviskosen Medien (z. B. lipidische kubische Phase, LCP) angebaut werden, sind die Schritte 1.1–1.6 nicht erforderlich. Protokolle für den Anbau von Kristallen in den Spritzen finden sie in Liu et.al. 34,35. Folgen Sie diesem Protokoll bis zur Probenkonsolidierung, Schritt 10, wo die gesamte Probe nun in einer Spritze enthalten ist und der Kristallisationspuffer entfernt wird. Die Hinzufügung von 7.9MAG ist für dieses Protokoll nicht erforderlich. Entfernen Sie stattdessen alle überschüssigen Flüssigkeiten aus der Spritze, indem Sie den Kolben in der Probe vorsichtig nach unten drücken, bis keine Flüssigkeit mehr in der Spritze verbleibt. - Visualisieren Sie die Kristalle unter einem optischen Mikroskop entweder durch die Spritze oder extrahieren Sie, um optimale Ergebnisse zu erzielen, eine kleine Menge (ca. 1 L) auf ein Glasschlitten und legen Sie einen Deckelzettel auf die Oberseite.
- Überprüfen Sie die Kristallkonzentration.
- Bestimmen Sie die Kristallkonzentration im Silikonfett, indem Sie die Anzahl der Kristalle in einem bestimmten Bereich mithilfe der optischen Mikroskopbilder zählen. Für beste Ergebnisse ist eine hohe Dichte von Kristallen, die gleichmäßig in den Medien verteilt werden, ideal (>106 Kristalle/ml), um eine hohe Kristalltrefferrate zu erhalten.
- Passen Sie die Kristallkonzentration in der Spritze an, indem Sie das Verhältnis von Kristallen zu viskosen Medien in den Schritten 1.3 und 1.4 ändern.
- Um die Kristallkonzentration zu verringern, verdünnen Sie die Kristalle in der Spritze, indem Sie die Menge an Silikonfett/HV-Medien bei Schritt 1.4 erhöhen oder indem Sie das Kristallpellet in Lösung mit dem Kristallisationspuffer verdünnen, bevor sie die Spritzen in Schritt 1.1 aufstellen.
- Um die Kristallkonzentration zu erhöhen, verringern Sie die Menge an Silikonfett in Schritt 1.4, aber achten Sie darauf, die Viskosität nicht unter 10 Pa.s zu reduzieren.
HINWEIS: Die hier gemeldete Kristallkonzentration wurde für diese spezifische Probe und Kristallgröße optimiert. Die ideale Kristallkonzentration hängt jedoch von der Kristallgröße, der Strahlgröße, dem Nadelinnendurchmesser (I.D.) und dem einfallenden Röntgenfluss ab. Dies kann anhand der Trefferquote mit einer optimalen Trefferquote von 30 % als "gut" ermittelt werden. In der Praxis muss die Kristallkonzentration für verschiedene Proben während der Strahlzeit optimiert werden, um die gewünschte Trefferrate zu erhalten. Beginnen Sie mit einer hohen Kristallkonzentration, 109 Kristallen/ml. Das Verfahren zur Einstellung der Kristallkonzentration ist in Liu et.al angegeben. 35.
- Das Protokoll kann hier angehalten werden, bis der Injektor für die Datenerfassung bereit ist.
- Wenn die Kristalle in LCP angebaut werden, dann versiegeln Sie sie und lassen Sie sie in Spritzen für bis zu ein paar Tage bei Raumtemperatur bleiben.
- Wenn die Kristalle auf ein anderes hochviskoses Medium (z. B. Silikonfett) übertragen wurden, sollte vor der Messung ein Stabilitätstest der Kristalle im Laufe der Zeit durchgeführt werden. Dadurch wird bestimmt, wie lange die Kristalle in den inerten Medien stabil sind (idealerweise > 8 h) und das Zeitlimit für die Datenerfassung. Hier waren Lysozymkristalle tagelang stabil in Silikonfett und zeigten bei der Inspektion mit einem optischen Mikroskop keine Anzeichen einer Auflösung.
- Bewegen Sie die gesamte Probe in eine Spritze, bevor Sie den Koppler trennen. Trennen Sie den Koppler von der Spritze und befestigen Sie die Injektionsnadel. Schrauben Sie die Nadel fest in die Basis der Spritze und stellen Sie sicher, dass sie fest befestigt ist, um Leckagen zu vermeiden. Für dieses Experiment wurde eine Nadel aus 108 m I.D. (Nadellänge 13 mm, Punktstil 3) verwendet. Befestigen Sie je nach Kristallgröße und Strahlgröße entweder eine 51-m- oder eine 108-m-I.D.-Nadel.
HINWEIS: Eine Vorprüfung des Probenstroms vor dem Abstrahlen ist erforderlich, um die richtige Injektornadelgröße auswählen zu können. Abhängig von den Probeneigenschaften (d. h. Viskosität, Aufladung, Pufferzusammensetzung) und der Nadel I.D. fließen die Proben unterschiedlich. Daher wird empfohlen, eine Vielzahl von Nadelgrößen zu testen, um den stabilsten Strom mit der kleinstmöglichen I.D.-Nadel zu erzeugen, um das Signal-Rausch-Verhältnis während der Datenerfassung zu maximieren. - Wenn der Injektor bereits montiert und an der Strahllinie ausgerichtet ist, bewegen Sie sich zu Abschnitt 3 und montieren Sie die Probenspritze direkt auf den Injektor.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.
2. Injektormontage und -steuerung
- Montieren Sie den Injektor auf die Beamline. Entfernen Sie die kryogene Düse an der MX2-Beamline und ersetzen Sie sie durch den Injektor. Lösen Sie die Spannschraube, die die kryogene Düse hält, und befestigen Sie sie an der Halterung neben der motorisierten Stufe.
- Heben Sie den Injektor aus seinem Wagen, indem Sie den schwarzen Griff halten und auf die motorisierte Bühne stellen.
- Zur Befestigung des Injektors an der motorisierten Stufe; Hand den schwarzen Spannschraubenknopf anziehen.
- Montieren Sie eine leere Spritze auf den Injektor
- Wählen Sie in der Injektor-Computersteuerungsschnittstelle (d.h. EPOS-Positionssteuerungssoftware) im Softwaremenü homing Mode unter Extras aus. Wählen Sie dann Negative Endschalter und Starten Sie Homing, lassen Sie die Software laufen, bis die Schraube ausreichend eingefahren ist, damit die Spritze unter die Schraube passt. Wenn der Endschalter unbeaufsichtigt läuft, stoppt er die Schraube automatisch.
- Montieren Sie eine leere ('dummy') Spritze auf den Injektor, indem Sie die Nadel durch den Schlitz in den Spritzenhalter einlegen. Richten Sie die Spritze gegen die Halterung aus.
- Befestigen Sie die Spritze mit zwei O-Ringen.
- Wickeln Sie den ersten O-Ring über den mittleren Teil der Spritze, der ihn an den Haken auf beiden Seiten der Spritze befestigt.
- Schleifen Sie den zweiten O-Ring um die Haken am oberen Teil der Spritze und legen Sie dann einen Teil des O-Rings auf die Oberseite der Glasspritze, wie in der Demonstration und Abbildung 1Bgezeigt.
- Ausrichten des Injektors an Röntgenstrahl
- Bewegen Sie die motorisierte Bühne mit dem Injektor über die Beamline-Steuerungssoftware zum Röntgen-Interaktionspunkt. Dies kann mit der Inline-Kamera visualisiert werden. Die Größe und Position des Trägers wird durch ein rotes Kreuz auf dem Bildschirm bezeichnet und die motorisierte Bühne kann bewegt werden, um die Nadel am Röntgen-Interaktionsbereich auszurichten.
- Passen Sie die x- und y-Position der Bühne an, um die Nadel am roten Kreuz auszurichten.
- Passen Sie die z-Position an, bis die Nadelspitze in den Fokus rückt.
- Überprüfen Sie die Ausrichtung der Nadelspitze und des Röntgenstrahls visuell, indem Sie überprüfen, ob die Spritzenspitze den Fadenkreuzen entspricht, die in dem optischen Mikroskopbild der Beamline-Kamera sichtbar sind.
- Sobald die Nadelspitze ausgerichtet ist, bewegen Sie die Spitze über den Querhaaren von 100 m. Dadurch entfällt die Röntgenstreuung von der Nadelspitze.
HINWEIS: Das Anbringen und Ausrichten des Injektors an der MX2-Beamline am Synchrotron muss von den Beamline-Wissenschaftlern durchgeführt werden und kann in weniger als 30 min abgeschlossen werden.
3. Montage der Probenspritze
- Ersetzen Sie die leere Spritze durch die Probenspritze, indem Sie Schritt 2.3 folgen.
- Legen Sie die Injektorkappe auf den Probenspritzenkolbenkopf.
- Bewegen Sie die Antriebsschraube an die Oberseite der Kappe.
- Wählen Sie in der Injektorsteuerungssoftware Velocity Modeaus.
- Geben Sie 3000 rpm (ca. 115 nL/s) als Einstellungswert ein und drücken Sie Einstellungswert anwenden.
- Wenn die Antriebsschraube die Kappe am Spritzenkolbenkopf berührt, stoppen Sie den Motor.
- Legen Sie den Drehzahlwert in der Injektorsteuerungssoftware auf Null fest, indem Sie den Einstellungswert auf '0' ändern, wenn sich die Schraube der Kappe nähert.
- Sobald der Kontakt hergestellt ist, aktivieren Sie den voreingestellten Wert, indem Sie den Einstellungswert anwenden drücken, um die Schraube sofort zu stoppen.
- Wackeln Sie vorsichtig die Kappe, um sicherzustellen, dass sie fest an Ort und Stelle gehalten wird.
HINWEIS: Wenn ein neuer Sollwert in das Feld Einstellungswert in der Steuerungssoftware eingegeben wird, wird er erst aktiviert, nachdem Sie den Einstellungswert anwendengedrückt haben.
4. Ausführen des Injektors
- Nachdem die Kappenantriebsschraube festen Kontakt mit der Oberseite des Kolbens hergestellt hat, ändern Sie den Drehzahlwert auf 100. Dies entspricht 4 nL/s.
- Überprüfen Sie die Nadelspitze visuell, wenn die Probe zum ersten Mal herauskommt, oder betrachten Sie das Strahllinienkamerabild der Nadel, um zu beobachten, wann die Probe beginnt, von der Nadelspitze zu extrudieren.
- Führen Sie eine Suche nach der Hütte durch, schließen Sie die Hüttentür und schalten Sie den Röntgenstrahl ein. Von diesem Punkt aus muss der Injektor fernvon außerhalb der Hütte betrieben werden.
- Tune die Drehzahl, bis ein stabiler Stream generiert wird.
- Verringern Sie den Drehzahlwert auf 90.
- Wiederholen Sie Schritt 4.4.1, indem Sie den Drehzahlwert in Schritten von 10 verringern, um den Stream zu verlangsamen, aber dennoch einen stabilen Stream beizubehalten. Für Silikonfett wurde ein Wert von 30 Umdrehungen pro Minute verwendet.
HINWEIS: Der typische Drehzahlbereich variiert je nach Probenmerkmalen und Röntgenbelichtungszeit zwischen 30 – 100 Rprossen (1 – 4 nL/s). Im Allgemeinen sollte die Drehzahl so abgestimmt werden, dass die langsamste Durchflussmenge erzeugt wird (um den Probenverbrauch zu minimieren) und gleichzeitig einen stabilen Strom aufrecht erhält.
- Verwalten eines Beispielstreams, der nicht gut fließt.
- Erhöhen Sie den Drehzahlwert in Schritten von 10, bis der Stream geradlinig wird. Wenn sich der Stream nicht stabilisiert, versuchen Sie auch nach der Erhöhung des Drehzahlwerts auf den maximal enthoben Wert von 100 U/min, die Stabilität zu verbessern, indem Sie eine der beiden unten beschriebenen Methoden implementieren.
- Erste Methode: Fügen Sie einen Polystyrol-Probenfänger unter den Probenstrom ein, um die Probe zu führen. Diese Methode eignet sich gut für hoch geladene Sample-Streams.
- Zweite Methode: Legen Sie einen Venturi-Saugtrichter in den Probenfänger ein. Um den Trichter mit Luft zu versorgen, schließen Sie ihn an das Luftaustrittsrohr in der Hütte an. Diese Methode kann bei der Direktenundenstabilisierung des Probenflusses unabhängig von der Ladung des Stroms helfen.
- Erhöhen Sie den Drehzahlwert in Schritten von 10, bis der Stream geradlinig wird. Wenn sich der Stream nicht stabilisiert, versuchen Sie auch nach der Erhöhung des Drehzahlwerts auf den maximal enthoben Wert von 100 U/min, die Stabilität zu verbessern, indem Sie eine der beiden unten beschriebenen Methoden implementieren.
- Sobald ein konstanter und stetiger Strom erreicht ist, starten Sie die Datenerfassung und optimieren Sie den Detektorabstand gemäß einem normalen Röntgenkristallographieexperiment.
HINWEIS: Die Drehzahl wird mithilfe der mitgelieferten Konvertierungstabelle in der Zusatzinformation "Lipidico Device Calculator" in die Durchflussrate konvertiert. Geben Sie den Drehzahlwert, die Nadeldurchmesser und das Spritzenvolumen ein, um den Durchfluss mit diesem Rechner zu berechnen.
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Representative Results
Lipidico ist ein HVI, das als alternatives Liefersystem für den Einsatz auf MX2 gebaut wurde (Abbildung 1). Es ist ideal für SX geeignet, wo Kristalle entweder in lipidischer kubischer Phase angebaut oder auf ein hochviskoses inertes Medium übertragen werden.
Um die Injektoranwendung zu demonstrieren, wurde Silikonfett, das mit Lysozymkristallen gemischt wurde, verwendet, um SX-Daten an der MX2-Beamline am australischen Synchrotron zu sammeln. Um den Injektor an der MX2-Beamline zu montieren, wird die kryogene Düse entfernt und durch den Injektor ersetzt, wie in Abbildung 1dargestellt. Die Spritzenproben werden direkt am Injektor montiert und mit O-Ringen befestigt (Abbildung 1B). Die Datenerfassung kann innerhalb von Minuten nach einer Beispieländerung initiiert werden. Der Injektor ist für die schnelle Probensteuerung mit einem einfachen Setup konzipiert, das für Benutzer, die mit SX nicht vertraut sind, einfach zu bedienen ist.
Abbildung 1: Bilder von Lipidico, einem viskosen Injektor, das am australischen Synchrotron für SX-Experimente verwendet wird. (A) Zeigt ein Foto von Lipidico, das in MX2 integriert ist. Der rote Pfeil zeigt die Richtung des Röntgenstrahls an. (B) Ein genauerer Blick auf den Probenhalterbereich auf Lipidico. Die Spritze wird von zwei O-Ringen an Ort und Stelle gehalten und die Probe wird im Fänger gesammelt. (D) Eine Nahansicht des Probenstroms mit der Injektornadel und dem Probenabfallfänger, der so verändert werden kann, dass er einen Polystyrol-/Venturi-Saugfänger enthält, der unter der Nadel in (A )zu sehen ist. Die Figur wurde von Berntsen et adaptiert. 201923 mit Genehmigung von AIP Publishing. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Der Injektor ist mit verschiedenen Arten von hochviskosen Trägern kompatibel. Die optimale Probenlaufgeschwindigkeit für den Injektor ist entscheidend für die Strömungsstabilität, zu langsam führt zu einem Curling-Effekt/Stream-Erweiterung und zu schnell führt zum Stream-Abbruch. Die optimale Geschwindigkeit variiert je nach verwendetm Trägersystem. Abbildung 2 und Abbildung 3 zeigen Silikonfett, das mit unterschiedlichen Injektorgeschwindigkeiten getestet wurde, und zeigen, wie das Streamverhalten variieren kann. Eine langsame Durchflussrate(Abbildung 2A, 2,3 nL/s) führt zur Ausdehnung des aus dem Injektor extrudierten Silikonfetts, während eine schnellere Durchflussrate(Abbildung 2C, 6,6 nL/s) einen dünneren Strom erzeugt. Das Curling des viskosen Medienstroms wurde regelmäßig beobachtet (Abbildung 3A). Um dieses Problem zu lösen, wurden zwei innovative Lösungen getestet: ein Polystyrolfänger und ein Venturi-Saugtrichter unter der Nadel. Der Polystyrolfänger führt eine schwache elektrostatische Kraft ein und eignet sich am besten bei hoch geladenen Proben, wie im Fall von Silikonfett (Abbildung 3B), während der Venturi-Saugtrichter hilft, den Strom unabhängig von der Probenladung vertikal zum Catcher nach unten zu führen. Je nach den Merkmalen der Probe kann jede Option erfolgreich verwendet werden.
Abbildung 2: Die Wirkung eines hohen viskosen Trägerstroms mit unterschiedlichen Injektorgeschwindigkeiten. 100% Silikonfett wurde mit unterschiedlichen Probengeschwindigkeiten getestet, um seine Fließeigenschaften zu bewerten. (A) . 2,3 nL/s (30 Rpm), (B) 3,5 nl/s (90 Rpm) und (C) 6,6 k/s (170 Rpm). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Streamverhalten von 100% Silikonfett, das das Curling der viskosen Medien demonstriert. (A) Curling-Effekt bei 2,3 nl/s (30 U/min) (B) Der Effekt der Zugabe des Polystyrolfängers zum Probenabfallhalter mit der Injektorgeschwindigkeit von 2,3 nL/s (30 U/min). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Es wurde eine Inglasspritze verwendet, die 26 L Lysozymkristalle (Kristallgröße 10 x 10 x 20 m) enthält, die in Silikonfett aufgehängt sind (Abbildung 4A). Lipidico erzeugte einen konstanten Probenstrom mit der 108-m-Nadel I.D., mit einer durchschnittlichen Durchflussrate von 1,14 nL/s (wobei der Motor auf 30 Rpm eingestellt ist). Ein Peak-Finding-Algorithmus36 wurde verwendet, um die Trefferrate zu bewerten, und eine ausreichende Datenmenge (insgesamt 224.200 Bilder) wurde innerhalb von 38 Minuten Datenerfassungszeit gesammelt, was den Aufbau von Strukturen ermöglichte (PDB-Code 6MQV). Tabelle 1 enthält eine Zusammenfassung der Datenerhebungsstatistiken und Abbildung 4B zeigt ein repräsentatives Bild der Elektronendichtekarte, die eine der Disulfidbindungen in der Lysozymstruktur20umgibt.
Abbildung 4: Lysozyme-Bilder. (A) Optische Bilder der Lysozymkristalle in Silikonfett. Ein kreuzpolarisiertes (40-faches Vergrößerungsbild) von Lysozymkristallen gemischt mit einem hochviskosen Medium, Silikonfett, abgebildet mit einem sichtbaren Lichtmikroskop. Die Größe der Kristalle liegt zwischen 15 und 20 m und (B) Ein repräsentatives Bild der Elektronendichtekarte (2Fo-Fc, 1" um die Disulfidbindungen von Lysozym. Die Figur wurde von Berntsen et adaptiert. 201923 mit Genehmigung von AIP Publishing. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Informationen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Tabelle 1: Zusammenfassungstabelle mit SX-Datenstatistiken von Lipidico. Lysozymkristalle wurden mit einem hochviskosen Medium, Silikonfett gemischt und durch den Röntgen-Interaktionsbereich der MX2-Beamline gestreamt. Dies ist eine Zusammenfassung der vollständigen Tabelle der Ergebnisse, die in Berntsen et veröffentlicht wurden. 23. Die Tabelle wird hier mit Genehmigung von AIP Publishing angepasst.
| Datenstatistik | Lipidico, MX2-Beamline |
| Detektor | Dectris EIGER X 16M, |
| Bildrate | 100hz |
| Probendetektorabstand (mm) | 300 |
| Röntgenenergie (KeV) | 13 |
| Strahlgröße (WxH) | 12x22 |
| Nein. von Rahmen | 224200 |
| Trefferquote (%) | 2.95 |
| Nein. von indizierten Rahmen | 4852 |
| Entschließung (B) | 17.74-1.83 |
| Vollständigkeit | 99.44 |
| Weltraumgruppe | P43212 |
| Einheitszelle | |
| a, b, c () | 78.68, 78.68, 34.48 |
| α, β, γ (°) | 90, 90, 90 |
| I/σ(I) | 5.08 |
| Redundanz | 73.97 |
| CC1/2 | 0.96 |
| RArbeit/Rfrei | 0.18/0.26 |
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Discussion
Es wurde eine alternative HVI entwickelt, ideal für die Durchführung von SX-Experimenten an Synchrotronquellen. Es hat zwei wesentliche Vorteile gegenüber bestehenden HVIs. Erstens ist es einfach, auf der Beamline zu installieren, so dass schnelles Umschalten zwischen konventioneller Kristallographie und SX ermöglicht wird, nur 30 Minuten sind für die Installation und Ausrichtung auf MX2 erforderlich. Zweitens können die Probenspritzen, die zum Anbau von Kristallen verwendet werden, direkt als Injektionsreservoirs verwendet werden, wodurch die Verschwendung während des Probentransfers begrenzt wird. Das Protokoll zum Ändern von Proben wurde beschrieben und demonstriert. Das Design macht einen komplizierten Gasstrom überflüssig, um den Jet im Vergleich zu anderen HVIs zu steuern. Es wurde ein einfacher Prozess zur Änderung der Durchflussmenge des Injektors demonstriert, der ohne verzögerte Reaktion eingestellt werden kann.
Die wichtigsten Schritte für eine erfolgreiche SX-Datenerfassung sind die Optimierung der Kristallkonzentration, die Erzielung einer homogenen Mischung aus hochviskosen Medien und die Erzeugung eines stabilen Datenstroms. Die optimale Kristallkonzentration und Homogenität kann erreicht werden, indem die Kristalle auf ein Pellet zentrifugiert und den Trägermedien eine höhere Kristallkonzentration hinzugefügt werden, wodurch sichergestellt wird, dass die Probe im Kupplungssystem gründlich gemischt wird. Sobald die Kristallkonzentration optimiert ist, kann die Injektordurchflussrate während der Strahlzeit leicht eingestellt werden, um einen stabilen Strom zu erhalten. Das Curling des viskosen Stroms wird häufig bei hochviskosen Proben beobachtet. Zwei Lösungen werden vorgestellt: die Verwendung eines Polystyrol-Probenfängers für geladene Proben oder die Zugabe eines Venturi-Saugtrichters, der als Catcher fungiert. Dies war bei der Kontrolle des Stroms in den ersten Tests erfolgreich, aber unter verschiedenen Probenbedingungen kann das Curling des Stroms dazu führen, dass die Probe an den Nadelpunkt klebt. Es ist möglich, dass dies durch Veränderung der Oberflächenladungseigenschaften der Nadel durch Hinzufügen spezieller Beschichtungen überwunden werden könnte. Mit verschiedenen Chemikalien beschichtete Nadeln (z.B. Silikon) wurden bisher erfolgreich für den Einsatz mit Flüssigkeitshandhabungsrobotern adaptiert und können kundenspezifisch nach Derinze37bestellt werden.
Der Injektor ist nicht auf Silikonfett beschränkt und kann mit anderen hochviskosen Flüssigkeiten verwendet werden. Es wurden mehrere verschiedene Alternativen gezeigt23, die erfolgreich für die Kristallinjektion verwendet werden können und in einer Reihe von anderen Publikationen22,30,33beschrieben werden. Die obere Grenze für die Probenviskosität mit diesem HVI wird noch untersucht, jedoch haben Probenviskositäten von bis zu 25 Pa.s (mit 100 % Silikonfett) zu einem stabilen Strom geführt. Wenn jedoch die Probenviskosität auf <10 Pa.s (mit 70 % Silikonfettprobe) reduziert wurde, konnte kein zuverlässiger Strom erzeugt werden. Daher stellt 10 Pa.s die aktuelle Untergrenze für die Probenviskosität für die Injektion mit diesem HVI dar. Die Nadel I.D. ist auch eine wichtige Überlegung. Obwohl 51 m I.D. erfolgreich getestet wurden, während verschiedene Träger ohne Kristalle injiziert wurden, stört die Einführung von Kristallen den Probenfluss. Daher besteht je nach Größe, bei Kristallen, die in die Matrix eingeführt werden, eine viel höhere Wahrscheinlichkeit einer Verstopfung bei Verwendung der 51-m-I.D.-Nadel im Vergleich zur größeren Nadelgröße. Wenn eine Blockade auftritt, kann es zu einer kritischen Druckanhäufung kommen, bei anderen Injektoren kann dies zu Spritzenbrüchen führen. Das Design dieses HVI beinhaltet jedoch einen Sicherheitsmechanismus, bei dem die Antriebsmechanik vom Spritzenkolben abzieht, wenn der Druck zu hoch wird, bis ein Deaktivierungsschalter aktiviert ist. Dies führt dazu, dass der Antrieb angehalten wird und verhindert, dass die Glasspritze zerbrach.
Für diesen Injektor gibt es mehrere Einschränkungen. Der Injektor ist speziell für hochviskose Proben konzipiert, daher können flüssigkeitsähnliche Proben nicht direkt für die Probenabgabe verwendet werden. Um diese Einschränkung zu überwinden, können Kristalle, die in Puffersystemen angebaut werden, mit einem geeigneten inerten Medium gemischt werden, wie in Schritt 1 beschrieben, es besteht jedoch die Möglichkeit, dass der Kristall instabil wird. Daher sollte zunächst das Screening einer Vielzahl von inerten Medien26,27,28,29 untersucht werden, um sicherzustellen, dass die Probenstabilität erhalten bleibt. Zweitens wirken sich die Größe des Kristalls und die Qualität der Kristallverpackung auf die Beugungsqualität aus. Die MX2-Beamline arbeitet mit einer optimalen Strahlgröße von 22 x 12 m (H x B) und einem Fluss von 1012 Photonen/s. Die optimale Kristallgröße für die Durchführung von SX bei MX2 beträgt 10 m und hat gezeigt, dass sie ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis liefert. Es ist jedoch möglich, Daten über kleinere Kristalle zu sammeln, wenn sie gut geordnet sind und auf hochauflösende Auflösung streuen. Es gibt eine Option, um die Strahlgröße an dieser Strahllinie auf 7,5 m zu verkleinern, jedoch hat dies seinen Preis, da es den Einfallsfluss reduziert, der während des Experiments berücksichtigt werden muss.
Die Entwicklung dieses Injektors macht SX für Mainstream-Kristallographen leicht zugänglich. Der erfolgreiche Betrieb von Lipidico öffnet die Tür zu einer schnellen und einfachen Methode für die SX-Datenerfassung an einer Vielzahl von Synchrotronquellen. Es ermöglicht die Raumtemperaturdatenerfassung von Kristallen, die bei MX2 10 m oder weniger sind, und begrenzt die Strahlungsschäden für einzelne Kristalle. Es bietet auch eine neue Gelegenheit in Australien, Millisekunden-Zeit gelöst SX durchzuführen, die der aktuelle Stand der Technik für Kristallographen ist. Zukünftige Anwendungen dieses Injektorsystems erstrecken sich auf die Röntgencharakterisierung hochviskoser Materialien mit Small Angle X-ray Scattering (SAXS), so dass der Injektor am australischen Synchrotron problemlos an andere Strahllinien angepasst werden kann.
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Disclosures
MK arbeitet für Kusel Designs. Kusel Design, ein kundenspezifischer Laborgeräteentwickler, wurde von Dr. Peter Bentsen von der La Trobe University und Dr. Tom Caradoc-Davies von ANSTO engagiert und entwickelte ein kostengünstiges Gerät, um hochviskose Studien in der MX2-Strahllinie am australischen Synchrotron zu ermöglichen. Das Gerät wurde in enger Abstimmung mit Dr. Caradoc-Davies entwickelt. Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom Australian Research Council Centre of Excellence in Advanced Molecular Imaging (CE140100011) (http://www.imagingcoe.org/) unterstützt. Diese Forschung wurde teilweise mit der MX2-Beamline am Australian Synchrotron, einem Teil von ANSTO, durchgeführt und verwendet den Detektor der Australian Cancer Research Foundation (ACRF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hen eggwhite lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | Used to grow crystals for testing the injector and the crystals are transferred into silicon grease. https://www.sigmaaldrich.com/ |
| High vacuum silicon grease | Dow Corning | Z273554-1EA | Used for testing of injector. https://www.sigmaaldrich.com/ |
| Injector needle (108 µm ID) | Hamilton | part No: 7803-05 | www.hamiltoncompany.com |
| Glass gas-tight syringes, 100 µl | Hamilton | part no: 7656-01 | Syringes used for sample injection. www.hamiltoncompany.com |
| LCP syringe coupler | Formulatrix | 209526 | Syringe coupler to mix the samples |
| Lipidico injector | La Trobe Univerity/ANSTO | This is a specific piece of equipment that can be accessed through La Trobe University / ANSTO Australian Synchrotron Facility |
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