Bioengineering

פרוטוקול הזרקת ליפידיקו למדידות קריסטלוגרפיה סדרתיות בסנכרון האוסטרלי

Published: September 23, 2020 doi: 10.3791/61650

Peter Berntsen¹, Rama Sharma¹, Michael Kusel², Brian Abbey¹, Connie Darmanin¹

¹Australian Research Council Centre of Excellence in Advanced Molecular Imaging, Department of Chemistry and Physics, La Trobe Institute for Molecular Science, La Trobe University, Melbourne, Australia, 3086, ²Kusel Design, Niddrie, Melbourne, Australia, 3042

Summary

מטרת פרוטוקול זה היא להדגים כיצד להכין דגימות קריסטלוגרפיה סדרתיות לאיסוף נתונים על מזרק צמיג גבוה, Lipidico, שהוזמן לאחרונה בסנכרון האוסטרלי.

Abstract

מתקן לביצוע מדידות קריסטלוגרפיה סדרתיות פותח בסנכרון האוסטרלי. מתקן זה משלב מזרק צמיג גבוה שנבנה למטרה, Lipidico, כחלק מקו הקריסטלוגרפיה המקרומולקולרית (MX2) למדידת מספר גדול של גבישים קטנים בטמפרטורת החדר. מטרת טכניקה זו היא לאפשר גידול/העברה של גבישים למזרקי זכוכית ישירות במזרק לאיסוף נתונים קריסטלוגרפיה סדרתית. היתרונות של מזרק זה כוללים את היכולת להגיב במהירות לשינויים בקצב הזרימה ללא הפרעה של הזרם. קיימות מספר מגבלות עבור מזרק צמיגות גבוה זה (HVI) הכוללות הגבלה על צמיגות הדגימה המותרת ל- >10 Pa.s. יציבות זרם יכולה גם להיות בעיה בהתאם למאפיינים הספציפיים של המדגם. פרוטוקול מפורט כיצד להגדיר דגימות ולהפעיל את המזרק למדידות קריסטלוגרפיה סדרתיות בסנכרון האוסטרלי מוצג כאן. השיטה מדגימה הכנת המדגם, כולל העברת גבישי lysozyme לתוך מדיה צמיגה גבוהה (גריז סיליקון), ואת הפעולה של המזרק לאיסוף נתונים ב MX2.

Introduction

קריסטלוגרפיה סדרתית (SX) היא טכניקה שפותחה בתחילה בהקשר של לייזרים אלקטרונים ללא קרני רנטגן (XFELs)¹^,²^,³^,⁴. למרות גישות היעד קבוע יכול לשמש SX⁵^,⁶^,⁷, בדרך כלל, מערכות מזרק משמשים כדי לספק גבישים בזרם רציף לקרן הרנטגן. מכיוון שהוא משלב נתונים ממספר רב של גבישים, SX נמנע מהצורך ביישור גביש במהלך הניסוי, ומאפשר איסוף נתונים בטמפרטורת החדר⁸^,⁹. בעזרת מזרק מתאים, הגבישים מוזרמים בזה אחר זה לאזור האינטראקציה של קרני הרנטגן ונתוני עקיפה וכתוצאה מכך נאספים על גלאי אזור⁹^,¹⁰. עד כה, SX הצליחה לפתור מספר מבני חלבון¹^,¹¹^,¹²^,¹³ כולל גבישים קטנים מכדי למדוד באמצעות קריסטלוגרפיה קונבנציונלית. היא גם סיפקה תובנות חדשות על הדינמיקה המולקולרית שנפתרה בזמן על ידי ניצול משך הדופק femtosecond של XFEL. על ידי ייזום תגובות משאבה בדיקה עם מקורות לייזר אופטיים, מחקרים מעמיקים בוצעו על פוטוסיסטם II¹⁴^,¹⁵, חלבון צהוב פוטואקטיבי¹⁶^,¹⁷, ציטוכרום C אוקסידאז¹⁸, כמו גם בקטריאורהודופסין¹⁹^,²⁰^,²¹. מחקרים אלה בדקו את הדינמיקה של העברת אלקטרונים המתרחשת בעקבות הפעלת אור המדגימה את הפוטנציאל המשמעותי של קריסטלוגרפיה סדרתית להבנת תהליכים ביולוגיים שנפתרו בזמן.

פיתוח של קריסטלוגרפיה סדרתית הוא גם הופך נפוץ יותר ויותר במקורות synchrotron⁹^,¹²^,²⁰^,²²^,²³^,²⁴. SX מבוסס Synchrotron מאפשר למספר גדול של גבישים בודדים להימדד ביעילות בטמפרטורת החדר באמצעות מערכת מזרק מתאימה. גישה זו מתאימה גבישים קטנים יותר ומכאן, בנוסף לדרוש גלאי קצב מסגרות מהיר כדי לאסוף את הנתונים, קרן מיקרו ממוקדת נדרשת גם. בהשוואה לקריסטלוגרפיה קונבנציונלית, SX אינו כרוך בהרכבה ויישור של גבישים בודדים בקרן הרנטגן. מכיוון שנתונים ממספר רב של גבישים בודדים ממוזגים, ניתן להפחית באופן משמעותי את מינון הקרינה המתקבל על ידי כל גביש בהשוואה לקריסטלוגרפיה קונבנציונלית. ניתן להחיל את Synchrotron SX גם על חקר התגובות שנפתרו בזמן, אפילו עד למשטר אלפיות השניה, בתנאי שגלאי עם קצב מסגרות גבוה מספיק זמין (למשל, 100 הרץ או יותר). מספר ניסויים קריסטלוגרפיים סדרתיים בוצעו בסנכרון באמצעות מזרקים שפותחו בתחילה במקורות XFEL²⁰^,²²^,²³. שני הסוגים הנפוצים ביותר של מזרק הם זרבובית וירטואלית דינמי גז (GDVN)²⁵ מזרק צמיג גבוה (HVI)⁹^,²⁴^,²⁶^,²⁷^,²⁸. GDVN הוא אידיאלי להזרקת צמיגות נמוכה, דגימות נוזליות, אבל דורש שיעורי זרימה גבוהים כדי להשיג זרמים יציבים, אשר בתורו מוביל לשיעורי צריכת מדגם גבוהים. לעומת זאת, HVI's מתאימים לדגימות צמיגות גבוהות המאפשרות יצירת זרם יציב בקצב זרימה נמוך בהרבה, מה שמוביל לצריכת מדגם נמוכה בהרבה. מזרק HVI, אם כן, מעדיף משלוח של דגימות שבו נשא צמיג עדיף (למשל, שומנים מבוססי חלבונים קרום) ו / או כמויות גדולות של מדגם אינם זמינים. מזרקי SX הם בדרך כלל מאתגרים לשימוש ודורשים הכשרה נרחבת כדי לפעול. הם כוללים גם פרוטוקולי העברה מדגם ארוכים, כמו המדגם צריך להיות טעון לתוך מאגר מיוחד, זה בדרך כלל יש סיכון גבוה הקשורים אליו של מדגם הולך לאיבוד או "נפח מת" או באמצעות דליפות בחיבורים. לכן, רצוי לייעל את עיצוב המזרק כדי למתן את כל ההפסדים לפני המדגם להגיע קרן רנטגן.

לאחרונה, תוצאות SX הראשון פורסמו באמצעות Lipidico²³ עם יעד lysozyme, באמצעות גלאי Eiger 16M. עיצוב מזרק זה מגביל את בזבוז הדגימה על ידי מזעור מספר השלבים המעורבים במעבר מהתגבשות ראשונית להעברת גבישים למזרק ואחריו מסירת דגימה לקרן הרנטגן. כתב יד זה מתאר ומדגים את הליך ההעברה לדוגמה החל מהכנת מדגם, מעבר לתהליך ההזרקה, ולבסוף איסוף נתונים, באמצעות אותו כלי התגבשות. הפעולה של המזרק מתוארת גם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת גבישים במדיה צמיגה גבוהה באמצעות מזרקי זכוכית

צנטריפוגה פתרון גביש בעדינות (~ 1,000 x גרם, ~ 10 דקות ב 22 מעלות צלזיוס) כדי ליצור גלולת גביש רך ולהסיר את החיץ עודף. זה יגרום ריכוז גבוה של גבישים גלולה אשר ניתן להשתמש בהם לאיסוף נתונים.
הערה: כדי למנוע דילול של התקשורת הצמיגת להגדיל את ריכוז הגביש בשלב זה. לייעל את היחס בין מדיה צמיגה לנפח גביש עבור כל מדגם כדי לקבל ריכוז גבוה של גבישים תוך שמירה על צמיגות גבוהה עבור התקשורת. צנטריפוגה פתרון גביש כדי ליצור גלולה ולהסיר חיץ עודף כדי להגדיל את ריכוז הגביש בתמיסה, כמתואר Darmanin et. אל.^29.
הגדר שני מזרקים 100 μL עם מצמד.
הדקו את המצמד לסוף המזרק הראשון והוסיפו 28 μL של תמיסת גביש לחלק העליון של המזרק. לאט, להכניס את הוכנה לתוך החלק העליון של המזרק בעדינות לדחוף את הפתרון עד הסוף של קצה מצמד, הסרת כל בועות אוויר היוצרים. עשה זאת על-ידי ביצוע אחת משתי השיטות הנדונים להלן.
הערה: נפח הגבישים שיש להוסיף למדיה הצמיגית הגבוהה יכול להיות מגוון אם זה לא משנה באופן משמעותי את הצמיגות של המדגם הכולל.
1. שיטה ראשונה: השתמש בשינויי לחץ מהירים כדי לפוצץ את בועות האוויר.
  1. מניחים בזהירות אצבע כפפה אחת על החלק העליון של נקודת מחט מצמד קהה (בעדינות רבה) להפעיל לחץ כדי ליצור חותם. אין להפעיל יותר מדי לחץ שכן הדבר עלול לגרום לפציעה במקל המחט.
  2. עכשיו למשוך את הבוכנה בחזרה כדי למשוך את הפתרון הרחק מנקודת המחט, זה ייצור הצטברות של לחץ במזרק.
  3. שחררו במהירות את הלחץ בחלק העליון של המזרק על ידי הסרת האצבע הכפפות מקצה המחט הקהה. היזהר, אם המדגם קרוב מדי לקצה כאשר האצבע מוסרת זה עלול לרסס החוצה וכתוצאה מכך אובדן מדגם. השינוי המהיר בלחץ בתוך המזרק יפוצץ את בועות האוויר. חזור על הפעולה עד להסרת כל הבועות.
2. שיטה שנייה: שימוש ב'צנטריפוגה האנושית' להסרת בועות אוויר.
  1. מניחים את המזרק ביד אחת עם המחט פונה כלפי מעלה ואת הבוכנה תקוע בין שתי אצבעות, כך שהוא לא יכול לזוז.
  2. לסובב במהירות את הזרוע מחזיקה את המזרק בכיוון אחד 2-3 פעמים, הכוח הצנטריפוגלי וכתוצאה מכך על המדגם יאלץ את כל בועות האוויר מתוך המזרק. היזהר, אם נעשה מדגם לאט מדי יכול ללכת לאיבוד.
  3. בדוק את המזרק עבור בועות אוויר, אם בועות להישאר, לחזור על שלבים 1.3.2.1 – 1.3.2.2 עד שכל בועות האוויר יוסרו.
באמצעות מרית בסדר, להוסיף ~ 42 μL של שומן סיליקון ואקום גבוה ישירות לחלק העליון של המזרק השני. לדחוף את הוכנה כל הדרך עד הסוף, הסרת כל בועות האוויר ולהבטיח כי אין פער אוויר בסוף המזרק.
הערה: ההרכב המדויק של גריז הסיליקון אינו קריטי כפי שהוא פועל כמוביל אינרטי. ערך צמיגות של >10 Pa.s או יחס של כ 60:40 גריז סיליקון לתמיסת גביש הוא אופטימלי להזרקה, עם זאת, זה אפשרי זה עשוי להשתנות בהתאם למאפיינים המדויקים של המדגם. כוונן את נפח תמיסת הגביש שנוספה לשמן הסיליקון כדי לייעל את ריכוז הגביש בתערובת, כמתואר בדיון. מדיה צמיגה גבוהה מלבד גריז סיליקון יכול לשמש כל עוד הם תואמים את המדגם³⁰^,³¹^,³²^,³³.
ודא שאין בועות אוויר באחד משני המזרקים ולחבר את המזרקים יחד באמצעות המצמד. החזק את המזרקים אנכית על ידי אחיזה רק את סוף המזרק כמו חימום המזרק בשל החום שנוצר מאצבעות יכול להשפיע על המדגם.
מערבבים את המדגם יחד על ידי מדכא בעדינות את הבוכנה בצד תמיסת הגביש, כך שהוא מתערבב לתוך גריז סיליקון ולאחר מכן לדחוף את הבוכנה בצד גריז סיליקון, כך שהוא דוחף את המדגם בחזרה לכיוון הצד פתרון גביש. בעדינות, לחזור על תהליך זה 50 עד 100 פעמים, כך המדגם מעורבב ביסודיות ונראה הומוגני.
הערה: אם הגבישים גדלים ישירות במדיה צמיגה מאוד (למשל, שלב מעוקב שומני, LCP), שלבים 1.1–1.6 אינם נדרשים. פרוטוקולים לגידול גבישים בתוך המזרקים ניתן למצוא בליו et.al. ^34,^35. בצע פרוטוקול זה כדי לדגום איחוד, שלב 10, שבו כל המדגם כלול כעת במזרק אחד ומאגר ההתגבשות מוסר. התוספת של 7.9MAG אינה נדרשת עבור פרוטוקול זה. במקום זאת, להסיר את כל הנוזלים העודפים מן המזרק על ידי בעדינות דוחף את הוכנה למטה במדגם עד נוזל לא נשאר יותר במזרק.
דמיינו את הגבישים תחת מיקרוסקופ אופטי או דרך המזרק או, לקבלת התוצאות הטובות ביותר, לחלץ כמות קטנה (~ 1 μL) על מגלשת זכוכית ומניחים תלוש כיסוי על החלק העליון.
בדוק ריכוז גביש.
1. לקבוע את ריכוז הגביש בשמן הסיליקון על ידי ספירת מספר הגבישים באזור מסוים באמצעות תמונות מיקרוסקופ אופטי. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, צפיפות גבוהה של גבישים מחולקת באופן אחיד בכל המדיה היא אידיאלית (>10⁶ גבישים / מ"ל) על מנת להשיג שיעור פגיעת גביש גבוה.
2. התאם את ריכוז הגביש במזרק על-ידי שינוי היחס בין גבישים למדיה צמיגה בשלבים 1.3 ו- 1.4.
  1. כדי להקטין את ריכוז הגבישים, לדלל את הגבישים במזרק על ידי הגדלת כמות גריז סיליקון / HV מדיה בשלב 1.4 או על ידי דילול גלולת הגביש בתמיסה עם חיץ התגבשות לפני הגדרת המזרקים בשלב 1.1.
  2. כדי להגדיל את ריכוז הגביש, להקטין את כמות גריז סיליקון בשלב 1.4 אבל להיות זהיר לא להפחית את הצמיגות מתחת 10 Pa.s.
    הערה: ריכוז הגביש שדווח כאן היה מותאם עבור מדגם ספציפי זה וגודל גביש. עם זאת, ריכוז הגביש האידיאלי יהיה תלוי בגודל הגביש, גודל הקרן, המחט קוטר פנימי (I.D.), ואת שטף רנטגן האירוע. זה יכול להיקבע משיעור הלהיט עם שיעור פגיעה אופטימלי של ~ 30% נחשב 'טוב'. בפועל, ריכוז הגביש חייב להיות מותאם לדגימות שונות במהלך זמן הקרן כדי להשיג את קצב הפגיעה הרצוי. התחל עם ריכוז גבוה של גבישים, 10⁹ גבישים / מ"ל. ההליך להתאמת ריכוז הגביש ניתן בליו et.al. ^{שלושים ו-35.}
3. ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן עד שהמזרק יהיה מוכן לאיסוף נתונים.
  1. אם הגבישים גדלים LCP, ואז לאטום אותם ולתת להם להישאר במזרקים עד כמה ימים בטמפרטורת החדר.
  2. אם הגבישים הועברו למדיה צמיגה גבוהה אחרת (למשל, גריז סיליקון), אז בדיקת יציבות של הגבישים לאורך זמן צריך להתבצע לפני המדידה. פעולה זו תקבע כמה זמן הקריסטלים יציבים במדיה האינרטית (באופן אידיאלי > 8 שעות) ואת מגבלת הזמן לאיסוף נתונים. כאן, גבישי lysozyme היו יציבים במשך ימים בשומן סיליקון ולא הראו סימנים של המסה כאשר נבדק באמצעות מיקרוסקופ אופטי.
מעבירים את כל הדגימה למזרק אחד לפני ניתוק המצמד. נתק את המצמד מהמזרק וחבר את מחט ההזרקה. בורג המחט בחוזקה לתוך הבסיס של המזרק ולהבטיח כי הוא מהודק בחוזקה כדי למנוע דליפות. 108 מיקרומטר I.D. מחט (אורך מחט 13 מ"מ, סגנון נקודה 3) שימש לניסוי זה. בהתאם לגודל הגביש וגודל הקרן לצרף גם 51 מיקרומטר או 108 μm I.D. מחט.
הערה: בדיקה מוקדמת של זרם המדגם לפני זמן הקרן נדרשת כדי להיות מסוגל לבחור את גודל מחט המזרק הנכון. בהתאם למאפייני המדגם (כלומר, צמיגות, טעינה, הרכב חיץ) ותודעת המחט, הדגימות יזרמו באופן שונה. לכן, מומלץ לבדוק מגוון גדלי מחטים כדי לייצר את הזרם היציב ביותר עם המחט הקטנה ביותר האפשרית לתקליטור כדי למקסם את יחס האות לרעש במהלך איסוף הנתונים.
אם המזרק כבר נטען ומיושר על קו הקרן לעבור לסעיף 3 ולהרכיב את המזרק מדגם ישירות על המזרק.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.

2. הרכבה ובקרה של מזרק

תרכיב את המזרק על קו הקורה. הסר את הזרבובית הקריוגנית על קו הקורה MX2 והחליף אותו במזרק. שחררו את בורג ההידוק שמחזיק את הזרבובית הקריוגנית וחברו אותה למסגרת הממוקמת בסמוך לשלב הממונע.
הרם את המזרק מהעגלה שלו על ידי החזקת הידית השחורה והנח אותו על הבמה הממונעת.
1. כדי להדק את המזרק לשלב הממונע; היד להדק את ידית בורג הידוק שחור.
הר מזרק ריק על המזרק
1. בממשק בקרת המחשב מזרק (כלומר, תוכנת בקרת מיקום EPOS), בחר מצב ביות תחת כלים בתפריט התוכנה. לאחר מכן בחרו 'מתג הגבלה שלילית' והתחילו להתביית, תנו לתוכנה לפעול עד שהבורג יתבטל מספיק כדי שהמזרק יתאים מתחת לבורג. אם נותר להפעיל ללא השגחה מתג המגבלה עוצר את הבורג באופן אוטומטי.
2. הר מזרק ריק ('דמה') על המזרק על ידי החדרת המחט דרך החריץ במחזיק המזרק. תיישר את המזרק כנגד הסוגר.
3. הדק את המזרק עם שתי אורינגים.
  1. לעטוף את O-ring הראשון על פני החלק האמצעי של המזרק חיבור אותו ווים משני צדי המזרק.
  2. לולאה O-ring השני סביב הקרסים בחלק העליון של המזרק ולאחר מכן לשים חלק אחד של O-ring על החלק העליון של מזרק זכוכית כפי שמוצג בהדגמה איור 1B.
יישור המזרק לקרן רנטגן
1. הזז את השלב הממונע עם המזרק לכיוון נקודת האינטראקציה של קרני הרנטגן באמצעות תוכנת הבקרה של קו הקרן. ניתן לדמיין זאת באמצעות המצלמה בתוך השורה. הגודל והמיקום של הקרן מסומנים על ידי צלב אדום על המסך ואת השלב הממונע ניתן להזיז כדי ליישר את המחט עם אזור אינטראקציית רנטגן.
2. להתאים את המיקום x ו- y של הבמה כדי ליישר את המחט עם הצלב האדום.
3. כוונן את תנוחת z עד קצה המחט נכנס לפוקוס.
4. ודא יישור של קצה המחט וקרן רנטגן חזותית על ידי בדיקה כי קצה המזרק פוגש את הכוונת אשר גלויים בתמונה מיקרוסקופ אופטי שנוצר על ידי המצלמה קרן.
5. לאחר קצה המחט מיושר להזיז את הקצה מעל שערות הצלב ~ 100 מיקרומטר. זה מבטל פיזור רנטגן מקצה המחט.
  הערה: הרכבה ויישור של המזרק על קו הקורה MX2 בסנכרון חייב להתבצע על ידי מדעני קו הקרן וניתן להשלים אותו תוך פחות מ-30 דקות.

3. הרכבה של מזרק המדגם

החלף את המזרק הריק במזרק לדוגמה על-ידי ביצוע שלב 2.3.
מניחים את מכסה המזרק על ראש בוכנה מזרק מדגם.
הזז את בורג הכונן לחלק העליון של המכסה.
בתוכנת בקרת המזרק בחר מצב מהירות.
קלט 3000 סל"ד (~ 115 nL/s) כערך ההגדרה והקשה על החל ערך הגדרה.
כאשר בורג הכונן נוגע בכובע על ראש הכועסה המזרק, לעצור את המנוע.
1. הגדר את ערך הסל"ד לאפס בתוכנת בקרת המזרק על-ידי שינוי ערך ההגדרה ל- '0' כאשר הבורג מתקרב למכסה.
2. לאחר יצירת מגע, הפעל את הערך המוגדר מראש על-ידי הקשה על החל הגדרת ערך כדי לעצור את הבורג באופן מיידי.
בעדינות לנענע את הכובע כדי לוודא שהוא מוחזק בחוזקה במקום.
הערה: בכל פעם שמוזנים ערך ערכה חדש בתיבה הגדרת ערך בתוכנת הבקרה הוא מופעל רק לאחר הקשה על החל ערך הגדרה.

4. הפעלת המזרק

לאחר בורג כונן כובע יצר קשר איתן עם החלק העליון של הכוכנה לשנות את סל"ד הגדרת ערך ל 100. זה שווה ערך ~ 4 nL / s.
ויזואלית לבדוק את קצה המחט כאשר המדגם הראשון יוצא או להסתכל על תמונת המצלמה beamline של המחט להתבונן כאשר המדגם מתחיל להבליט מקצה המחט.
לבצע חיפוש של האץ', לסגור את דלת האץ', ולהדליק את קרן הרנטגן. מנקודה זו יש להפעיל את המזרק מרחוק מחוץ לאצרף.
כוונן את הסל"ד עד להיווצרות זרם יציב.
1. הקטן את ערך הגדרת הסל"ד ל- 90.
2. חזור על שלב 4.4.1, הפחתת ערך הגדרת סל"ד במרווחים של 10, כדי להאט את הזרם אך עדיין לשמור על זרם יציב. עבור גריז סיליקון נעשה שימוש בערך של 30 סל"ד.
  הערה: טווח הסל"ד הטיפוסי נע בין 30 ל-100 סל"ד (1 - 4 nL/s) בהתאם למאפייני הדגימה ולזמן החשיפה לרנטגן. באופן כללי, יש לכוונן את הסל"ד כדי לייצר את קצב הזרימה האיטי ביותר (כדי למזער את צריכת הדגימה) תוך שמירה על זרם יציב.
ניהול זרם לדוגמה שאינו זורם היטב.
1. המשך להגדיל את ערך הגדרת הסל"ד במרווחים של 10 עד שהזרם יתיישר. אם הזרם אינו מתייצב, גם לאחר הגדלת ערך הגדרת הסל"ד לערך המרבי של 100 סל"ד נסה לשפר את היציבות על-ידי יישום אחת משתי השיטות המתוארות להלן.
  1. שיטה ראשונה: הוסף לוכד מדגם פוליסטירן מתחת לזרם לדוגמה כדי לסייע בהנחיית הדגימה. שיטה זו פועלת היטב עבור זרמי מדגם טעונים מאוד.
  2. שיטה שנייה: הכנס משפך יניקה venturi לתופס מדגם. כדי לספק אוויר למשפך, חבר אותו לצינור שקע האוויר הממוקם בצריף. שיטה זו יכולה לסייע בהכוונה ובייצוב זרימת הדגימה ללא תלות במטען הנחל.
לאחר שיושג זרם קבוע ויציב, התחל איסוף נתונים ומטב את מרחק הגלאי לפי ניסוי קריסטלוגרפיה רגיל של קרני רנטגן.
הערה: הסל"ד מומר לקצב זרימה באמצעות טבלת ההמרות שסופקה במידע המשלים, 'מחשבון ההתקנים של Lipidico'. הזן את ערך הסל"ד, קטרי המחט ונפחי המזרק כדי לחשב את קצב הזרימה באמצעות מחשבון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ליפידיקו היא HVI שנבנתה כמערכת משלוחים חלופית לשימוש ב-MX2 (איור 1). הוא מתאים באופן אידיאלי עבור SX שבו גבישים גדלים או בשלב מעוקב השומנים או מועברים למדיה אינרטית צמיג גבוהה.

כדי להדגים את יישום מזרק גריז סיליקון מעורבב עם גבישי lysozyme שימש כדי לאסוף נתוני SX בקו הקורה MX2 ב synchrotron האוסטרלי. כדי להרכיב את המזרק על קו ה-MX2, הזרבובית הקריוגנית מוסרת ומוחלפת במזרק כפי שמוצג באיור 1. דגימות המזרק מותקנות ישירות על המזרק ומהודקות באמצעות אורינגים(איור 1B). ניתן לאתחל איסוף נתונים תוך דקות לאחר שינוי לדוגמה. המזרק מיועד לבקרת הדגימה המהירה עם התקנה פשוטה שקל לתפעול עבור משתמשים שאינם מכירים את SX.

איור 1: תמונות של ליפידיקו, מזרק צמיג המשמש בסנכרוטרון האוסטרלי לניסויי SX. (A) מציג תמונה של ליפידיקו משולב MX2. החץ האדום מציין את כיוון קרן הרנטגן. (B) תצוגה קרובה יותר של אזור מחזיק המדגם על Lipidico. המזרק מוחזק במקום על ידי שתי אורינגים והדגימה נאספת בתופס. (ד)מבט מקרוב על זרם המדגם המציג את מחט המזרק ואת לוכד הפסולת לדוגמה אשר ניתן לשנות כדי לשלב לוכד יניקה פוליסטירן / ונטורי לראות מתחת למחט ב (A). הדמות הותאמה מברנסן et. אל. 2019²³ באישור הוצאת AIP. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

המזרק תואם לסוגים שונים של נשאים צמיגים מאוד. מהירות הריצה האופטימלית של המדגם עבור המזרק חיונית ליציבות הזרם, איטית מדי תגרום להשפעה מסלסלת/ התפשטות זרם ומהירה מדי תגרום לפירוק הזרם. המהירות האופטימלית תשתנה בהתאם למערכת המוביל המשמשת. איור 2 ואיור 3 מציגים גריז סיליקון שנבדק במהירויות מזרק שונות ומדגים כיצד התנהגות הזרם יכולה להשתנות. קצב זרימה איטי(איור 2A, 2.3 nL/s) גורם להרחבת גריז הסיליקון המובלט מהמזרק בעוד שקצב זרימה מהיר יותר(איור 2C, 6.6 nL/s) מייצר זרם דק יותר. קרלינג של זרם התקשורת הצמיג נצפתה באופן קבוע (איור 3A). כדי להתגבר על בעיה זו נבדקו שני פתרונות חדשניים: לוכד פוליסטירן ומשפך יניקה ונטורי מתחת למחט. לוכד הפוליסטירן מציג כוח אלקטרוסטטי חלש ועובד בצורה הטובה ביותר על דגימות טעונות מאוד, כמו במקרה של גריז סיליקון(איור 3B),בעוד משפך היניקה venturi מסייע בהנחיית הזרם אנכית כלפי מטה אל התופס, ללא תלות בטעינה מדגם. בהתאם למאפייני המדגם ניתן להשתמש בכל אחת מהאפשרויות בהצלחה.

איור 2: ההשפעה של זרם נשאים צמיג גבוה באמצעות מהירויות מזרק שונות. 100% גריז סיליקון נבדק במהירות מדגם שונות כדי להעריך את מאפייני הזרימה שלה. ( א) אני לא יכוללעשות את זה. . 2.3 nL/s (30 סל"ד),(B)3.5 nl/s (90 סל"ד) ו-(C)6.6 n/s (170 סל"ד). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: התנהגות זרם של 100% גריז סיליקון המדגים קרלינג של התקשורת הצמיגת. (A)אפקט קרלינג ב 2.3 nl/s (30 סל"ד)(B)ההשפעה של הוספת לוכד פוליסטירן למחזיק פסולת מדגם עם מהירות המזרק פועל ב 2.3 nL /s (30 סל"ד). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

מזרק זכוכית המכיל 26 μL של גבישי lysozyme (גודל גביש 10 מיקרומטר x 10 מיקרומטר x 20 מיקרומטר) תלוי בשומן סיליקון שימש (איור 4A). Lipidico יצר זרם מדגם קבוע, באמצעות 108 μm מחט תעודת זהות, עם קצב זרימה ממוצע של 1.14 nL / s (עם המנוע מוגדר 30 סל"ד). אלגוריתם איתור שיא³⁶ שימש להערכת קצב הפגיעה וכמות מספקת של נתונים (סה"כ 224,200 תמונות) נאספה תוך 38 דקות מזמן איסוף הנתונים, מה שמאפשר אחזור מבנה (קוד PDB 6MQV). טבלה 1 מספקת סיכום של נתוני איסוף הנתונים ואיור 4B מציג תמונה מייצגת של מפת צפיפות האלקטרונים המקיפה את אחד מכבלי הדי-סולפיד במבנה הליזוזים²⁰.

איור 4: תמונות Lysozyme. (A)תמונות אופטיות של גבישי lysozyme בשומן סיליקון. תמונה מקוטבת (הגדלה של פי 40) של גבישי lysozyme מעורבבת עם מדיה צמיגה גבוהה, גריז סיליקון, בתמונה באמצעות מיקרוסקופ אור גלוי. גודל הגבישים נע בין 15 ל -20 מיקרומטר ו -( B) תמונה מייצגת של מפת צפיפות האלקטרונים (2Fo-Fc, 1σ) המקיפה את הקשרים הדיסולפידיים של lysozyme. הדמות הותאמה מברנסן et. אל. 2019²³ באישור הוצאת AIP. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

מידע משלים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה 1: טבלת סיכום המציגה סטטיסטיקות נתוני SX ליפידיקו. גבישי Lysozyme היו מעורבבים עם מדיה צמיגה גבוהה, גריז סיליקון, מוזרם דרך אזור אינטראקציית רנטגן של קרן MX2. זהו סיכום של טבלת התוצאות המלאה שפורסמה בברנסן et. אל.^23. הטבלה מותאמת כאן באישור הוצאת AIP.

סטטיסטיקת נתונים	ליפידיקו, קו קרן MX2
גלאי	דקטריז אייגר X 16M,
קצב מסגרות	100 הרץ
מרחק גלאי לדוגמה (מ"מ)	300
אנרגיית רנטגן (KeV)	13
גודל קרן (WxH) (מיקרומטר)	12x22
לא. של מסגרות	224200
שיעור כניסות (%)	2.95
לא. של מסגרות הכלולות באינדקס	4852
רזולוציה (Å)	17.74-1.83
השלמות	99.44
קבוצת חלל	P4₃2₁2
תא יחידה
a, b, c (Å)	78.68, 78.68, 34.48
α, β, γ (°)	90, 90, 90
קלט/σ(I)	5.08
יתירות	73.97
עותק_1/2	0.96
_{R עבודה}/R_{ללא תשלום}	0.18/0.26

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

HVI חלופי פותח, אידיאלי לביצוע ניסויי SX במקורות synchrotron. יש לו שני יתרונות מרכזיים על פני HVIs קיימים. ראשית, קל להתקין על קו הקרן המאפשר מעבר מהיר בין קריסטלוגרפיה קונבנציונלית SX, רק ~ 30 דקות נדרש להתקנה ויישור על MX2. שנית, מזרקי המדגם המשמשים לגידול גבישים יכולים לשמש ישירות כמאגרים להזרקה, הגבלת בזבוז במהלך העברת מדגם. הפרוטוקול לשינוי דוגמאות תואר והוכח. העיצוב מבטל את הצורך בזרם גז מסובך כדי לשלוט במטוס בהשוואה ל- HVIs אחרים. תהליך פשוט לשינוי קצב הזרימה של המזרק הודגם אשר ניתן להתאים ללא תגובה מאוחרת.

השלבים המכריעים ביותר לאיסוף נתוני SX מוצלחים הם אופטימיזציה של ריכוז הגבישים, קבלת תערובת הומוגנית של מדיה צמיגה גבוהה, והפקת זרם יציב לאיסוף נתונים. ריכוז הגבישים וההומוגניות האופטימליים יכולים להיות מושגים על ידי צנטריפוגת הגבישים עד גלולה והוספת ריכוז גבוה יותר של גבישים למדיית המוביל, להבטיח כי המדגם מעורבב ביסודיות במערכת המצמד. לאחר ריכוז הגביש הוא אופטימיזציה, קצב זרימת מזרק יכול בקלות להיות מותאם במהלך זמן הקרן כדי להשיג זרם יציב. קרלינג של הזרם הצמיג נצפתה בדרך כלל עם דגימות צמיג גבוהות. שני פתרונות מוצגים: שימוש לוכד מדגם פוליסטירן עבור דגימות טעונות או תוספת של משפך יניקה venturi מתנהג כמו לוכד. זה הצליח לשלוט על הזרם בבדיקות הראשוניות, אבל בתנאי מדגם שונים קרלינג של הזרם עלול לגרום דבק של המדגם לנקודת המחט. זה אפשרי כי זה יכול להיות להתגבר על ידי שינוי תכונות תשלום פני השטח של המחט על ידי הוספת ציפויים מיוחדים. מחטים מצופות כימיקלים שונים (כלומר סיליקון) הותאמו בעבר בהצלחה לשימוש עם רובוטים לטיפול בנוזלים וניתן להזמין בהתאמה אישית מייצורים שיתאימו למזרק³⁷.

המזרק אינו מוגבל לשמן סיליקון וניתן להשתמש בו עם נוזלים צמיגים אחרים. מספר חלופות שונות הוכחו²³ אשר ניתן להשתמש בהצלחה להזרקת גביש ומתוארים במספר פרסומים אחרים²²^,³⁰^,³³. הגבול העליון על צמיגות מדגם באמצעות HVI זה עדיין תחת חקירה, אולם צמיגות מדגם של עד 25 Pa.s (באמצעות 100 % גריז סיליקון) הביאו זרם יציב. עם זאת, כאשר צמיגות המדגם הופחתה ל - <10 Pa.s (באמצעות 70 % דגימת שומן סיליקון) לא היתה אפשרות לייצר זרם אמין. לפיכך, 10 Pa.s מייצג את הגבול התחתון הנוכחי על צמיגות המדגם להזרקה באמצעות HVI זה. גם תעודת הזהות של המחט היא שיקול חשוב. למרות ש-51 מיקרומטר תעודת זהות נבדקה בהצלחה תוך הזרקת נשאים שונים ללא גבישים, כניסת הגבישים משבשת את זרימת הדגימה. לפיכך, בהתאם לגודל שלהם, עם גבישים הציג לתוך המטריצה, יש סבירות גבוהה בהרבה של חסימה בעת שימוש במחט 51 מיקרומטר תעודת זהות לעומת גודל המחט גדול יותר. כאשר חסימה מתרחשת הצטברות קריטית של לחץ יכול להתרחש, במזרקים אחרים זה יכול לגרום שבירה מזרק. עם זאת, העיצוב של HVI זה כולל מנגנון בטיחות שבו מכניקת הכונן יתרחק בוכנה מזרק אם הלחץ הופך גבוה מדי עד מתג השבתה מופעלת. התוצאה היא שהכונן נעצר ומונע את קרע מזרק הזכוכית.

קיימות מספר מגבלות עבור מזרק זה. המזרק תוכנן במיוחד עבור דגימות צמיג מאוד, ולכן, נוזל כמו דגימות לא ניתן להשתמש ישירות למסירה מדגם. כדי להתגבר על מגבלה זו, גבישים הגדלים במערכות חיץ יכולים להיות מעורבבים עם מדיה אינרטית מתאימה כמתואר בשלב 1, עם זאת, קיימת אפשרות שהקריסטל עלול להפוך לבלתי יציב. לכן, סינון של מגוון של מדיה^{אינרטית 26}^,²⁷^,²⁸^,²⁹ צריך להיחקר הראשון כדי להבטיח יציבות מדגם נשמרת. שנית, גודל הגביש ואיכות אריזת הגביש ישפיעו על איכות עקיפה. קרן MX2 פועלת בגודל קרן אופטימלי של 22 x 12 מיקרומטר (H x W) ושטף ~ 10¹² פוטון / s. גודל הגביש האופטימלי לביצוע SX ב- MX2 הוא ~ 10 מיקרומטר והוכח שהוא מניב יחס אות לרעש גבוה. עם זאת, ניתן לאסוף נתונים על גבישים בגודל קטן יותר אם הם מסודרים היטב לפזר ברזולוציה גבוהה. יש אפשרות לחתך את גודל הקרן בקו קרן זה ~ 7.5 מיקרומטר, עם זאת, זה מגיע במחיר שכן הוא מפחית את שטף האירוע אשר צריך להילקח בחשבון במהלך הניסוי.

הפיתוח של מזרק זה הופך SX נגיש בקלות קריסטלוגרפים המיינסטרים. הפעולה המוצלחת של Lipidico, פותח את הדלת לשיטה מהירה וקלה לאיסוף נתוני SX במגוון רחב של מקורות synchrotron. היא מאפשרת איסוף נתוני טמפרטורת חדר על גבישים שהם 10 מיקרומטר או פחות ב- MX2, מה שמגביל את השפעות נזקי הקרינה עבור גבישים בודדים. זה גם מספק הזדמנות חדשה באוסטרליה לבצע אלפית השנייה זמן נפתר SX שהוא המדינה-of-the-art הנוכחי עבור crystallographers. יישומים עתידיים של מערכת מזרק זה להרחיב אפיון רנטגן של חומרים צמיגים מאוד באמצעות פיזור רנטגן זווית קטנה (SAXS) המאפשר מזרק להיות מותאם בקלות לקורות אחרות ב Synchrotron האוסטרלי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ח"כ עובד עבור עיצובי Kusel. Kusel Design, מפתחת מכשיר מעבדה מותאמת אישית, הייתה מאורסת על ידי ד"ר פיטר בנסן מאוניברסיטת לה טרובה וד"ר טום קרדוק-דייויס מ- ANSTO ולפתח מכשיר בעלות נמוכה כדי לאפשר מחקרים צמיגים גבוהים בקו קרן MX2 בסינכרוטרון האוסטרלי. המכשיר פותח בהתייעצות הדוקה עם ד"ר קרדוק-דייויס. למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מרכז המצוינות של מועצת המחקר האוסטרלית בהדמיה מולקולרית מתקדמת (CE140100011) (http://www.imagingcoe.org/). מחקר זה נערך בחלקו באמצעות קרן MX2 ב Synchrotron האוסטרלי, חלק ANSTO, ועשה שימוש בגלאי הקרן האוסטרלית לחקר הסרטן (ACRF).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hen eggwhite lysozyme	Sigma-Aldrich	L6876	Used to grow crystals for testing the injector and the crystals are transferred into silicon grease. https://www.sigmaaldrich.com/
High vacuum silicon grease	Dow Corning	Z273554-1EA	Used for testing of injector. https://www.sigmaaldrich.com/
Injector needle (108 µm ID)	Hamilton	part No: 7803-05	www.hamiltoncompany.com
Glass gas-tight syringes, 100 µl	Hamilton	part no: 7656-01	Syringes used for sample injection. www.hamiltoncompany.com
LCP syringe coupler	Formulatrix	209526	Syringe coupler to mix the samples
Lipidico injector	La Trobe Univerity/ANSTO		This is a specific piece of equipment that can be accessed through La Trobe University / ANSTO Australian Synchrotron Facility