Summary
Målet med denne protokollen er å demonstrere hvordan man forbereder seriekrystallografiprøver for datainnsamling på en høy viskøs injektor, Lipidico, nylig bestilt på den australske synchrotron.
Abstract
Et anlegg for å utføre seriekrystallografimålinger er utviklet ved den australske synchrotron. Dette anlegget inneholder en spesialbygd høy viskøs injektor, Lipidico, som en del av den makromolekylære krystallografien (MX2) strålelinjen for å måle et stort antall små krystaller ved romtemperatur. Målet med denne teknikken er å gjøre det mulig for krystaller å bli dyrket/ overført til glasssprøyter som skal brukes direkte i injektoren for seriell krystallografi datainnsamling. Fordelene med denne injektoren inkluderer evnen til å reagere raskt på endringer i strømningshastigheten uten avbrudd i strømmen. Flere begrensninger for denne høyviskositetinjektoren (HVI) finnes som inkluderer en begrensning på de tillatte prøveviskositetene til > 10 Pa.s. Stream stabilitet kan også potensielt være et problem avhengig av de spesifikke egenskapene til utvalget. En detaljert protokoll for hvordan du setter opp prøver og bruker injektoren for seriell krystallografi målinger på den australske synchrotron presenteres her. Metoden demonstrerer fremstilling av prøven, inkludert overføring av lysozymkrystaller til et høyt viskøs medium (silikonfett), og driften av injektoren for datainnsamling ved MX2.
Introduction
Seriekrystallografi (SX) er en teknikk som ble utviklet i utgangspunktet i sammenheng med røntgenfrie elektronlasere (XFELs)1,2,3,4. Selv om faste måltilnærminger kan brukes til SX5,6,7, brukes vanligvis injektorsystemer til å levere krystaller i en kontinuerlig strøm til røntgenstrålen. Fordi den kombinerer data fra et stort antall krystaller, unngår SX behovet for krystalljustering under eksperimentet, og gjør det mulig å samle inn data ved romtemperatur8,9. Ved hjelp av en egnet injektor strømmer krystallene en etter en inn i røntgeninteraksjonsområdet, og de resulterende diffraksjonsdataene samles inn på enområdedetektor 9,10. Hittil har SX vært vellykket i å løse en rekke proteinstrukturer1,11,12,13 inkludertkrystaller for små til å måle ved hjelp av konvensjonell krystallografi. Det har også gitt ny innsikt i tidsløs molekylær dynamikk ved å utnytte femtosekunders pulsvarighet for XFEL. Ved å initiere pumpe-sonde reaksjoner med optiske laserkilder, grundige studier har blitt utført på fotosystem II14,15, fotoaktivt gult protein16,17, cytokrom C oksidase18, samt bakteriorhodopsin19,20,21. Disse studiene har undersøkt elektronoverføringsdynamikken som oppstår etter lysaktivering som viser det betydelige potensialet for seriekrystallografi for å forstå tidsavklarte biologiske prosesser.
Utvikling av seriekrystallografi blir også stadig mer utbredt ved synchrotron kilder9,12,20,22,23,24. Synchrotron basert SX gjør det mulig for et stort antall individuelle krystaller som skal måles effektivt ved romtemperatur ved hjelp av et passende injektorsystem. Denne tilnærmingen er egnet for mindre krystaller derav, i tillegg til å kreve en rask bildefrekvensdetektor for å samle inn dataene, er det også nødvendig med en mikrofokusert stråle. Sammenlignet med konvensjonell krystallografi, involverer SX ikke montering og justering av individuelle krystaller i røntgenstrålen. Fordi data fra et stort antall individuelle krystaller slås sammen, kan strålingsdosen mottatt av hver krystall reduseres betydelig sammenlignet med konvensjonell krystallografi. Synchrotron SX kan også brukes på studiet av tidsoppsagte reaksjoner, selv ned til millisekundregimet, forutsatt at en detektor med tilstrekkelig høy bildefrekvens er tilgjengelig (f.eks. 100 Hz eller mer). Flere seriell krystallografi eksperimenter har blitt utført på synchrotron ved hjelp av injektorer som opprinnelig ble utviklet på XFELkilder 20,22,23. De to vanligste typene injektor er gass dynamisk virtuell dyse (GDVN)25 og høy viskøs injektor (HVI)9,24,26,27,28. GDVN er ideell for å injisere lav viskositet, flytende prøver, men krever høye strømningshastigheter for å oppnå stabile bekker, noe som igjen fører til høye utvalgsforbruksrater. HVI-er er derimot egnet for høyviskositetsprøver som gjør det mulig å lage en stabil strøm ved mye lavere strømningshastigheter, noe som fører til mye lavere utvalgsforbruk. HVI-injektoren favoriserer derfor levering av prøver der en viskøs transportør er å foretrekke (f.eks. lipidbasert for membranproteiner) og/eller store mengder prøve er ikke tilgjengelige. SX injektorer er generelt utfordrende å bruke og krever omfattende opplæring for å operere. De involverer også lange prøveoverføringsprotokoller, da prøven må lastes inn i et spesialisert reservoar, dette har generelt en høy risiko forbundet med at prøven går tapt enten i "dødt volum" eller via lekkasjer i forbindelsene. Derfor er det ønskelig å optimalisere injektordesignen for å redusere eventuelle tap før prøven når røntgenstrålen.
Nylig ble de første SX-resultatene publisert ved hjelp av Lipidico23 med et lysozymmål, ved hjelp av en Eiger 16M detektor. Denne injektordesignen begrenser prøvesvinn ved å minimere antall skritt involvert i å gå fra første krystallisering til overføring av krystaller til injektoren etterfulgt av levering av prøve til røntgenstrålen. Dette manuskriptet beskriver og demonstrerer prøveoverføringsprosedyren fra prøveforberedelse, går videre til injeksjonsprosessen, og til slutt datainnsamling, ved hjelp av samme krystalliseringsfartøy. Injektorens drift er også beskrevet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling av krystaller i et høyt viskøs medium ved hjelp av glasssprøyter
- Sentrifuger krystalloppløsningen forsiktig (~ 1000 x g, ~ 10 min ved 22 ° C) for å danne en myk krystallpellet og fjerne overflødig buffer. Dette vil resultere i en høy konsentrasjon av krystaller i pellet som kan brukes til datainnsamling.
MERK: For å forhindre fortynning av det viskøse mediet øker krystallkonsentrasjonen på dette trinnet. Optimaliser forholdet mellom viskøs media og krystallvolum for hver prøve for å oppnå en høy konsentrasjon av krystaller samtidig som det opprettholder en høy viskositet for media. Sentrifuger krystallløsningen for å danne en pellet og fjerne overflødig buffer for å øke krystallkonsentrasjonen i løsningen, som beskrevet i Darmanin et. 29. - Sett opp to 100 μL sprøyter med en coupler.
- Fest miksen til enden av den første sprøyten og tilsett 28 μL krystalloppløsning på toppen av sprøyten. Sett stempelet langsomt inn i toppen av sprøyten og skyv forsiktig oppløsningen ned til enden av couplerspissen, og fjern eventuelle luftbobler som dannes. Gjør dette ved å følge en av de to metodene som er omtalt nedenfor.
MERK: Volumet av krystaller som skal legges til det høye viskøse mediet kan varieres hvis det ikke endrer viskositeten til den totale prøvens viskositet betydelig.- Første metode: Bruk raske trykkendringer for å sprenge luftboblene.
- Plasser forsiktig en hanskefinger på toppen av det sløve nålepunktet og (veldig forsiktig) legg press for å skape en forsegling. Ikke bruk for mye trykk, da dette kan føre til en nålepinneskade.
- Trekk stempelet tilbake for å trekke oppløsningen bort fra nålepunktet, dette vil generere en oppbygging av trykk i sprøyten.
- Slipp trykket raskt på toppen av sprøyten ved å fjerne hanskefingeren fra den sløve nålespissen. Vær forsiktig, hvis prøven er for nær spissen når fingeren er fjernet, kan den sprøyte ut noe som resulterer i tap av prøve. Den raske trykkendringen i sprøyten vil sprekke luftboblene. Gjenta til alle boblene er fjernet.
- Andre metode: Ved hjelp av "menneskelig sentrifuge" for å fjerne luftbobler.
- Plasser sprøyten i den ene hånden med nålen vendt oppover og stempelet kilt mellom to fingre, slik at den ikke kan bevege seg.
- Roter raskt armen mens sprøyten holder i én retning 2–3 ganger, og den resulterende sentrifugalkraften på prøven vil tvinge eventuelle luftbobler ut av sprøyten. Vær forsiktig, hvis gjort for sakte prøve kan gå tapt.
- Inspiser sprøyten for luftbobler, hvis bobler gjenstår, gjenta trinn 1.3.2.1 – 1.3.2.2 til alle luftboblene er fjernet.
- Første metode: Bruk raske trykkendringer for å sprenge luftboblene.
- Bruk en fin slikkepott, tilsett ~ 42 μL med høyt vakuum silikonfett direkte til toppen av den andre sprøyten. Skyv stempelet helt ned til enden, fjern alle luftboblene og sørg for at det ikke er luftgap i enden av sprøyten.
MERK: Den nøyaktige sammensetningen av silikonfettet er ikke kritisk, da det fungerer som en inert bærer. En viskositetsverdi på > 10 Pa.s eller forholdet på ca 60:40 silikonfett til krystalloppløsning er optimal for injeksjon, men det er mulig at dette kan variere avhengig av de nøyaktige egenskapene til prøven. Juster volumet av krystallløsning lagt til silikonfettet for å optimalisere krystallkonsentrasjonen i blandingen, som beskrevet i diskusjonen. Andre medier med høyt viskøs enn silikonfett kan brukes så lenge de er kompatible medprøven 30,31,32,33. - Pass på at det ikke er luftbobler i en av de to sprøytene og fest sprøytene sammen ved hjelp av coupleen. Hold sprøytene vertikalt ved å gripe bare enden av sprøyten som oppvarming av sprøyten på grunn av varmen som genereres fra fingrene kan påvirke prøven.
- Bland prøven sammen ved å forsiktig trykke stempelet på krystalloppløsningssiden slik at den blandes inn i silikonfettet og skyv deretter stempelet på silikonfettsiden, slik at det skyver prøven tilbake mot krystalloppløsningssiden. Gjenta forsiktig denne prosessen 50 til 100 ganger slik at prøven blandes grundig og ser homogen ut.
MERK: Hvis krystallene dyrkes direkte i svært viskøse medier (f.eks. lipidisk kubikkfase, LCP), er det ikke nødvendig med trinn 1,1–1,6. Protokoller for voksende krystaller i sprøytene finnes i Liu et.al. 34,35. Følg denne protokollen opp for å prøve konsolidering, trinn 10, hvor alle prøven nå finnes i én sprøyte og krystalliseringsbufferen fjernes. Tillegg av 7.9MAG er ikke nødvendig for denne protokollen. Fjern i stedet all overflødig væske fra sprøyten ved å skyve stempelet forsiktig ned i prøven til det ikke er mer væske igjen i sprøyten. - Visualiser krystallene under et optisk mikroskop enten gjennom sprøyten eller, for best resultat, trekk ut en liten mengde (~ 1 μL) på et glasssklie og plasser en dekselslipp på toppen.
- Kontroller krystallkonsentrasjonen.
- Bestem krystallkonsentrasjonen i silikonfettet ved å telle antall krystaller i et bestemt område ved hjelp av de optiske mikroskopbildene. For best resultat er en høy tetthet av krystaller jevnt dispensert i hele media ideell (> 106 krystaller / ml) for å oppnå en høy krystall-hit hastighet.
- Juster krystallkonsentrasjonen i sprøyten ved å endre forholdet mellom krystaller og viskøs media i trinn 1,3 og 1,4.
- For å redusere krystallkonsentrasjonen, fortynne krystallene i sprøyten ved å øke mengden silikonfett/HV-medier i trinn 1,4 eller ved å fortynne krystallpelleten i oppløsning med krystalliseringsbufferen før du setter opp sprøytene i trinn 1.1.
- For å øke krystallkonsentrasjonen, reduser mengden silikonfett i trinn 1.4, men vær oppmerksom på ikke å redusere viskositeten under 10 Pa.s.
MERK: Krystallkonsentrasjonen som rapporteres her, ble optimalisert for denne spesifikke prøven og krystallstørrelsen. Imidlertid vil den ideelle krystallkonsentrasjonen avhenge av krystallstørrelsen, strålestørrelsen, nålen Intern diameter (ID), og hendelsen røntgenfluks. Dette kan bestemmes fra trefffrekvensen med en optimal trefffrekvens på ~ 30% betraktet som "bra". I praksis må krystallkonsentrasjonen optimaliseres for ulike prøver under stråletiden for å oppnå ønsket treffhastighet. Start med en høy konsentrasjon av krystaller, 109 krystaller / ml. Prosedyren for justering av krystallkonsentrasjonen er gitt i Liu et.al. 35.
- Protokollen kan settes på pause her til injektoren er klar for datainnsamling.
- Hvis krystallene dyrkes i LCP, forsegler du dem og lar dem forbli i sprøyter i opptil noen dager ved romtemperatur.
- Hvis krystallene har blitt overført til et annet høyt viskøs medium (f.eks. silikonfett), bør en stabilitetstest av krystallene over tid utføres før målingen. Dette vil avgjøre hvor lenge krystallene er stabile i inerte medier (ideelt > 8 h) og fristen for datainnsamling. Her var lysozymkrystaller stabile i dagevis i silikonfett og viste ikke tegn til oppløsning når de ble inspisert ved hjelp av et optisk mikroskop.
- Flytt hele prøven i én sprøyte før du kobler fra. Koble koplen fra sprøyten og fest injeksjonsnålen. Skru kanylen godt inn i bunnen av sprøyten og sørg for at den er godt festet for å unngå lekkasjer. En 108 μm ID kanyle (nållengde 13 mm, punktstil 3) ble brukt til dette eksperimentet. Avhengig av krystallstørrelsen og strålestørrelsen festes enten en 51 μm eller 108 μm ID-nål.
MERK: Forhåndstesting av prøvestrømmen før stråletiden er nødvendig for å kunne velge riktig innjektornålestørrelse. Avhengig av prøveegenskapene (det vil si viskositet, lading, buffersammensetning) og nåle-ID, vil prøvene flyte annerledes. Derfor anbefales det å teste en rekke nålstørrelser for å produsere den mest stabile strømmen med den minste mulige ID-nålen for å maksimere signal-til-støy-forholdet under datainnsamling. - Hvis injektoren allerede er montert og justert på stråleledningen, flyttes du til del 3 og monterer prøvesprøyten direkte på injektoren.
MERK: Protokollen kan settes på pause her.
2. Montering og kontroll av injektor
- Monter injektoren på strålesnoren. Fjern den kryogene dysen på MX2-strålesnoren og sett den ut med injektoren. Løsne klemskruen som holder den kryogene dysen og fest den til braketten ved siden av det motoriserte stadiet.
- Løft injektoren opp fra trallen ved å holde det svarte håndtaket og plasser den på det motoriserte trinnet.
- For å feste injektoren til det motoriserte stadiet; trekk til den svarte klemskrueknappen.
- Monter en tom sprøyte på injektoren
- I injektorens datakontrollgrensesnitt (det vil vil at EPOS-posisjonskontrollprogramvaren) velger du Homing-modus under Verktøy i programvaremenyen. Velg deretter Negativ grensebryter, og Start Homing, la programvaren kjøre til skruen er trukket tilstrekkelig til at sprøyten kan passe under skruen. Hvis det blir stående uten tilsyn, stopper grensebryteren skruen automatisk.
- Monter en tom ('dummy') sprøyte på injektoren ved å sette kanylen gjennom spalten i sprøyteholderen. Rett opp sprøyten mot braketten.
- Fest sprøyten med to O-ringer.
- Pakk den første O-ringen over midtdelen av sprøyten som fester den til krokene på hver side av sprøyten.
- Loop den andre O-ringen rundt krokene på den øvre delen av sprøyten og sett deretter en del av O-ringen på toppen av glasssprøyten som vist i demonstrasjonen og figur 1B.
- Juster injektoren til røntgenstrålen
- Flytt det motoriserte stadiet med injektoren mot røntgeninteraksjonspunktet via programvaren for strålelinjekontroll. Dette kan visualiseres ved hjelp av det innebygde kameraet. Størrelsen og posisjonen til strålen er merket med et rødt kors på skjermen, og det motoriserte stadiet kan flyttes for å justere nålen etter røntgeninteraksjonsområdet.
- Juster x- og y-posisjonen til scenen for å justere nålen etter røde kors.
- Juster z-posisjonen til nålespissen kommer i fokus.
- Kontroller justeringen av nålespissen og røntgenstrålen visuelt ved å kontrollere at sprøytespissen oppfyller trådkorset som er synlige i det optiske mikroskopbildet som genereres av strålekameraet.
- Når nålespissen er justert, beveger spissen spissen over trådkorset ~100 μm. Dette eliminerer røntgensp scatter fra nålespissen.
MERK: Montering og justering av injektoren på MX2-strålelinjen ved synchrotron må utføres av strålelinjeforskerne og kan fullføres på mindre enn 30 minutter.
3. Montere prøvesprøyten
- Bytt den tomme sprøyten med prøvesprøyten ved å følge trinn 2.3.
- Plasser injektorhetten på prøvesprøytestempelhodet.
- Flytt drivskruen til toppen av hetten.
- Velg Hastighetsmodus i injektorkontrollprogramvaren.
- Inngang 3000 rpm (~115 nL/s) som innstillingsverdi og trykk Bruk innstillingsverdi.
- Når drivskruen berører hetten på sprøytestempelhodet, må du stoppe motoren.
- Sett rpm-verdien til null i injektorkontrollprogramvaren ved å endre innstillingsverdien til '0' når skruen nærmer seg hetten.
- Når kontakten er gjort, aktiverer du den forhåndsinnstilte verdien ved å trykke på Bruk innstillingsverdi for å stoppe skruen umiddelbart.
- Vrikk forsiktig hetten for å forsikre deg om at den holdes godt på plass.
MERK: Når det angis en ny angitt verdi i boksen Innstillingsverdi i kontrollprogramvaren, aktiveres den bare etter at du har trykket på Bruk innstillingsverdi.
4. Kjøre injektoren
- Etter at hettens drivskrue har fått fast kontakt med toppen av stempelet, endrer du turtallinnstillingsverdien til 100. Dette tilsvarer ~ 4 nL / s.
- Inspiser nålespissen visuelt når prøven først kommer ut eller se på strålekamerabildet på nålen for å observere når prøven begynner å ekstrudere fra nålespissen.
- Utfør et søk i hytta, lukk hyttedøren, og slå på røntgenstrålen. Fra dette punktet må injektoren betjenes eksternt fra utsiden av hytta.
- Still inn rpm til en stabil strøm genereres.
- Reduser verdien for rpm-innstilling til 90.
- Gjenta trinn 4.4.1, redusere rpm Innstillingsverdien i trinn på 10, for å bremse strømmen, men fortsatt opprettholde en stabil strøm. For silikonfett ble det brukt en verdi på 30 o/min.
MERK: Det typiske turtallsområdet varierer mellom 30 – 100 o/min (1 – 4 dl/s) avhengig av prøveegenskapene og røntgeneksponeringstiden. Generelt bør rpm justeres for å produsere den tregeste strømningshastigheten (for å minimere prøveforbruket) samtidig som en stabil strøm opprettholdes.
- Administrere en prøvestrøm som ikke flyter godt.
- Fortsett å øke rpm Innstillingsverdien i trinn på 10 til strømmen blir rettere. Hvis strømmen ikke stabiliserer seg, selv etter å ha økt rpm Innstillingsverdien til maksimumsverdien på 100 rpm, prøv å forbedre stabiliteten ved å implementere en av de to metodene som er beskrevet nedenfor.
- Første metode: Sett inn en polystyrenprøvefanger under prøvestrømmen for å hjelpe til med å lede prøven. Denne metoden fungerer bra for svært ladede prøvestrømmer.
- Andre metode: Sett inn en venturi sugetrakt til prøvefangeren. For å tilsyne luft til trakten, koble den til luftutløpsrøret som ligger i hytta. Denne metoden kan hjelpe til med å lede og stabilisere prøveflyten uavhengig av ladningen av strømmen.
- Fortsett å øke rpm Innstillingsverdien i trinn på 10 til strømmen blir rettere. Hvis strømmen ikke stabiliserer seg, selv etter å ha økt rpm Innstillingsverdien til maksimumsverdien på 100 rpm, prøv å forbedre stabiliteten ved å implementere en av de to metodene som er beskrevet nedenfor.
- Når en konstant og jevn strøm er oppnådd, start datainnsamling og optimaliser detektoravstanden i henhold til et vanlig røntgenkrystallografieksperiment.
MERK: Turtallet konverteres til strømningshastighet ved hjelp av den medfølgende konverteringstabellen i tilleggsinformasjonen Lipidico Device Calculator. Angi rpm-verdien, nåldiameter og sprøytevolumer for å beregne strømningshastigheten ved hjelp av denne kalkulatoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lipidico er et HVI bygget som et alternativt leveringssystem for bruk på MX2 (figur 1). Den er ideell for SX hvor krystaller enten dyrkes i lipidisk kubikkfase eller overføres til et høyt viskøs inert media.
For å demonstrere injektoren påføring silikon fett blandet med lysozyme krystaller ble brukt til å samle SX data på MX2 strålelinje på den australske synchrotron. For å montere injektoren på MX2-strålesnoren fjernes kryogendysen og erstattes av injektoren som vist i figur 1. Sprøyteprøvene monteres direkte på injektoren og festes ved hjelp av O-ringer (figur 1B). Datainnsamling kan startes i løpet av minutter etter en prøveendring. Injektoren er designet for rask prøvekontroll med et enkelt oppsett som er enkelt å betjene for brukere som ikke er kjent med SX.
Figur 1: Bilder av Lipidico, en viskøs injektor som brukes på den australske synchrotron for SX eksperimenter. (A) Viser et bilde av Lipidico innlemmet i MX2. Den røde pilen indikerer retningen på røntgenstrålen. (B) En nærmere visning av prøveholderregionen på Lipidico. Sprøyten holdes på plass av to O-ringer og prøven samles i fangeren. (D) Et nærbilde av prøvestrømmen som viser injektornålen og prøveavfallsfangeren som kan endres for å innlemme en polystyren / venturi sugefanger sett under nålen i (A). Figuren er tilpasset fra Berntsen et. al. 201923 med tillatelse fra AIP Publishing. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Injektoren er kompatibel med ulike typer svært viskøse bærere. Den optimale prøven kjører hastighet for injektoren er avgjørende for strømmen stabilitet, for treg vil føre til en curling effekt / stream ekspansjon og for fort vil resultere i strømmen breakup. Den optimale hastigheten vil variere avhengig av bæresystemet som brukes. Figur 2 og Figur 3 viser silikonfett testet ved forskjellige injektorhastigheter og viser hvordan strømatferden kan variere. En langsom strømningshastighet (figur 2A, 2,3 dl/s) resulterer i utvidelse av silikonfettet som ekstruderes fra injektoren, mens en raskere strømningshastighet (figur 2C, 6,6 nL/s) produserer en tynnere strøm. Curling av den viskøse mediestrømmen har regelmessig blitt observert (figur 3A). For å overvinne dette problemet ble to innovative løsninger testet: en polystyrenfanger og en venturi sugetrakt under nålen. Polystyrenfangeren introduserer en svak elektrostatisk kraft og fungerer best på høyt ladede prøver, som i tilfelle av silikonfett (figur 3B), mens venturi-sugetrakten hjelper til med å styre strømmen vertikalt nedover til fangeren, uavhengig av prøvelading. Avhengig av egenskapene til prøven kan begge alternativene brukes.
Figur 2: Effekten av en høy viskøse bærestrøm ved hjelp av forskjellige injektorhastigheter. 100% silikonfett ble testet ved forskjellige prøvehastigheter for å vurdere strømningsegenskapene. (A) . 2,3 dl/s (30 o/min),(B) 3,5 nl/s (90 o/min) og(C) 6,6 n/s (170 o/min). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Stream atferd av 100% silikon fett demonstrere curling av viskøs media. (A) Curlingeffekt ved 2,3 nl/s (30 o/min) (B) Effekten av å tilsette polystyrenfangeren i prøveavfallsholderen med injektorhastigheten ved 2,3 dl/s (30 o/min). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
En glasssprøyte som inneholder 26 μL lysozymkrystaller (krystallstørrelse 10 μm x 10 μm x 20 μm) suspendert i silikonfett ble brukt (figur 4A). Lipidico genererte en konstant prøvestrøm ved hjelp av 108 μm nål ID, med en gjennomsnittlig strømningshastighet på 1,14 nL /s (med motoren satt til 30 rpm). En topp finnealgoritme 36 ble brukt til å vurdere trefffrekvensen og en tilstrekkelig mengde data (totalt 224 200 bilder) ble samlet inn innen 38 min av datainnsamling tid, slik at struktur henting (PDB-kode 6MQV). Tabell 1 gir et sammendrag av datainnsamlingsstatistikken, og figur 4B viser et representativt bilde av elektrontetthetskartet rundt en av disulfidbindingene i lysozymstrukturen20.
Figur 4: Lysozyme bilder. (A) Optiske bilder av lysozymkrystene i silikonfett. Et krysspolarisert (40x forstørrelse) bilde av lysozymkrystaller blandet med et høyt viskøs media, silikonfett, avbildet ved hjelp av et synlig lysmikroskop. Størrelsen på krystallene varierer mellom 15 og 20 μm og (B) Et representativt bilde av elektrontetthetskartet (2Fo-Fc, 1σ) rundt de disulfide bindingene til lysozyme. Figuren er tilpasset fra Berntsen et. al. 201923 med tillatelse fra AIP Publishing. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsinformasjon. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tabell 1: Sammendragstabell som viser SX-datastatistikk fra Lipidico. Lysozymekrystaller ble blandet med et høyt viskøs media, silikonfett og strømmet gjennom røntgeninteraksjonsområdet til MX2-strålelinjen. Dette er et sammendrag av den fullstendige resultattabellen publisert i Berntsen et. 23. Tabellen er tilpasset her med tillatelse fra AIP Publishing.
| Datastatistikk | Lipidico, MX2 strålelinje |
| Detektor | Destris EIGER X 16M, |
| Bildefrekvens | 100 Hz |
| Avstand for prøvedetektor (mm) | 300 |
| Røntgenenergi (KeV) | 13 |
| Strålestørrelse (BxH) (μm) | 12x22 |
| Nei. av rammer | 224200 |
| Trefffrekvens (%) | 2.95 |
| Nei. av indekserte rammer | 4852 |
| Vedtak (Å) | 17.74-1.83 |
| Fullstendighet | 99.44 |
| Romgruppe | P43212 |
| Enhetscelle | |
| a, b, c (Å) | 78.68, 78.68, 34.48 |
| α, β, γ (°) | 90, 90, 90 |
| I/σ(I) | 5.08 |
| Redundans | 73.97 |
| CC1/2 | 0.96 |
| Rarbeid/Rgratis | 0.18/0.26 |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En alternativ HVI er utviklet, ideell for å utføre SX-eksperimenter ved synchrotron kilder. Den har to viktige fordeler fremfor eksisterende HVIer. For det første er det enkelt å installere på strålelinjen slik at rask veksling mellom konvensjonell krystallografi og SX, bare ~ 30 minutter er nødvendig for installasjon og justering på MX2. For det andre kan prøvesprøytene som brukes til å dyrke krystaller, brukes direkte som reservoarer for injeksjon, noe som begrenser svelhet under prøveoverføring. Protokollen for endring av prøver er beskrevet og demonstrert. Designet eliminerer behovet for en komplisert gassstrøm for å kontrollere jet sammenlignet med andre HVIer. En enkel prosess for å endre strømningshastigheten til injektoren ble demonstrert som kan justeres uten forsinket respons.
De viktigste trinnene for vellykket SX-datainnsamling er å optimalisere krystallkonsentrasjonen, skaffe en homogen blanding av høye viskøse medier og produsere en stabil strøm for datainnsamling. Den optimale krystallkonsentrasjonen og homogeniteten kan oppnås ved å sentrifugere krystallene ned til en pellet og legge til en høyere konsentrasjon av krystaller til bærermediet, slik at prøven blandes grundig i miksesystemet. Når krystallkonsentrasjonen er optimalisert, kan injektorstrømningshastigheten enkelt justeres under stråletiden for å oppnå en stabil strøm. Curling av den viskøse strømmen observeres ofte med høye viskøse prøver. To løsninger presenteres: bruk av en polystyrenprøvefanger for ladede prøver eller tilsetning av en venturi sugetrakt som fungerer som en catcher. Dette har vært vellykket i å kontrollere strømmen i de første testene, men under forskjellige prøveforhold curling av strømmen kan resultere i stikker av prøven til nålepunktet. Det er mulig at dette kan overvinnes ved å endre overflaten lade egenskapene til nålen ved å legge til spesielle belegg. Nåler belagt med forskjellige kjemikalier (f.eks. silikon) har tidligere blitt tilpasset for bruk med væskehåndteringsroboter og kan tilpasses fra produserer som passer tilsprøyten 37.
Injektoren er ikke begrenset til silikonfett og kan brukes sammen med andre svært viskøse væsker. Flere forskjellige alternativer har blitt demonstrert23 som kan brukes til krystallinjeksjon og er beskrevet i en rekke andrepublikasjoner 22,30,33. Den øvre grensen for prøveviskositet ved hjelp av denne HVI er fortsatt under undersøkelse, men prøveviskositeter på opptil 25 Pa.s (ved hjelp av 100 % silikonfett) har resultert i en stabil strøm. Men når prøveviskositeten ble redusert til <10 Pa.s (ved hjelp av 70 % silikonfettprøve) kunne det imidlertid ikke produseres en pålitelig strøm. Derfor representerer 10 Pa.s gjeldende nedre grense på prøveviskositeten for injeksjon ved hjelp av denne HVI. Nålen ID er også en viktig vurdering. Selv om 51 μm ID ble testet mens du injiserer ulike bærere uten krystaller, forstyrrer innføringen av krystaller prøvestrømmen. Derfor, avhengig av deres størrelse, med krystaller introdusert i matrisen, er det en mye høyere sannsynlighet for blokkering når du bruker 51 μm ID-nålen sammenlignet med den større nålestørrelsen. Når en blokkering oppstår en kritisk oppbygging av trykk kan oppstå, i andre injektorer dette kan resultere i sprøytebrudd. Utformingen av denne HVI inkluderer imidlertid en sikkerhetsmekanisme der drivmekanikken vil trekke seg bort fra sprøytestempelet hvis trykket blir for høyt til en deaktiveringsbryter er aktivert. Dette fører til at stasjonen stoppes og hindrer at glasssprøyten sprekker.
Flere begrensninger for denne injektoren finnes. Injektoren er spesielt utviklet for svært viskøse prøver, derfor kan væskelignende prøver ikke brukes direkte til prøvelevering. For å overvinne denne begrensningen kan krystaller dyrket i buffersystemer blandes med et egnet inert media som beskrevet i trinn 1, men det er en mulighet for at krystallen kan bli ustabil. Derfor bør screening av en rekke inerte medier26,27,28,29 undersøkes først for å sikre at prøvestabiliteten opprettholdes. For det andre vil størrelsen på krystallen og kvaliteten på krystall pakking påvirke diffraksjonskvaliteten. MX2-strålelinjen opererer med en optimal strålestørrelse på 22 x 12 μm (H x W) og fluks ~1012 foton/s. Den optimale krystallstørrelsen for å utføre SX ved MX2 er ~ 10 μm og har vist seg å gi et høyt signal-til-støy-forhold. Det er imidlertid mulig å samle inn data om mindre krystaller hvis de er godt bestilt og diffract til høy oppløsning. Det er et alternativ å kutte ned strålestørrelsen på denne strålelinjen til ~ 7,5 μm, men dette kommer til en kostnad siden det reduserer hendelsesstrøm som må vurderes under eksperimentet.
Utviklingen av denne injektoren gjør SX lett tilgjengelig for vanlige krystallografer. Den vellykkede driften av Lipidico, åpner døren til en rask og enkel metode for SX-datainnsamling på et bredt utvalg av synchrotron-kilder. Det muliggjør romtemperatur datainnsamling på krystaller som er 10 μm eller mindre ved MX2, begrense strålingsskader effekter for individuelle krystaller. Det gir også en ny mulighet i Australia til å utføre millisekund tid løst SX som er dagens state-of-the-art for krystallografer. Fremtidige anvendelser av dette injektorsystemet strekker seg til røntgenkarakterisering av svært viskøse materialer ved hjelp av Small Angle X-ray Scattering (SAXS) slik at injektoren lett kan tilpasses andre strålelinjer på den australske Synchrotron.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
MK fungerer for Kusel design. Kusel Design, en tilpasset utvikler av laboratorieapparater, ble engasjert av Dr Peter Bentsen fra La Trobe University og Dr Tom Caradoc-Davies fra ANSTO og for å utvikle en rimelig enhet for å muliggjøre høye viskøs studier i MX2-strålelinjen ved den australske Synchrotron. Enheten ble utviklet i nært samråd med Dr. Caradoc-Davies. Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Australian Research Council Centre of Excellence in Advanced Molecular Imaging (CE140100011) (http://www.imagingcoe.org/). Denne forskningen ble utført delvis ved hjelp av MX2-strålelinjen ved den australske Synchrotron, en del av ANSTO, og benyttet seg av Australian Cancer Research Foundation (ACRF) detektor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hen eggwhite lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | Used to grow crystals for testing the injector and the crystals are transferred into silicon grease. https://www.sigmaaldrich.com/ |
| High vacuum silicon grease | Dow Corning | Z273554-1EA | Used for testing of injector. https://www.sigmaaldrich.com/ |
| Injector needle (108 µm ID) | Hamilton | part No: 7803-05 | www.hamiltoncompany.com |
| Glass gas-tight syringes, 100 µl | Hamilton | part no: 7656-01 | Syringes used for sample injection. www.hamiltoncompany.com |
| LCP syringe coupler | Formulatrix | 209526 | Syringe coupler to mix the samples |
| Lipidico injector | La Trobe Univerity/ANSTO | This is a specific piece of equipment that can be accessed through La Trobe University / ANSTO Australian Synchrotron Facility |
References
- Boutet, S., et al. High-resolution protein structure determination by serial femtosecond crystallography. Science. 337 (6092), 362-364 (2012).
- Spence, J. C. H., Weierstall, U., Chapman, H. N. X-ray lasers for structural and dynamic biology. Reports on Progress in Physics. 75 (10), 102601 (2012).
- Aquila, A., et al. Time-resolved protein nanocrystallography using an X-ray free-electron laser. Optics Express. 20 (3), 2706-2716 (2012).
- Schlichting, I. Serial femtosecond crystallography: the first five years. International Union of Crystallography. 2, 246-255 (2015).
- Lee, D., et al. Nylon mesh-based sample holder for fixed-target serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 9, 6971 (2019).
- Martin, A. V., et al. Fluctuation X-ray diffraction reveals three-dimensional nanostructure and disorder in self-assembled lipid phases. Communications Materials. 1 (1), 1-8 (2020).
- Roedig, P., et al. High-speed fixed-target serial virus crystallography. Nature Methods. 14 (8), 805 (2017).
- Chapman, H. N., et al.
- Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nature Communications. 5, 3309 (2014).
- Weierstall, U. Liquid sample delivery techniques for serial femtosecond crystallography. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 369 (1647), 20130337 (2014).
- Gati, C., et al. Atomic structure of granulin determined from native nanocrystalline granulovirus using an X-ray free-electron laser. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2247-2252 (2017).
- Nam, K. H. Sample delivery media for serial crystallography. International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1094 (2019).
- Batyuk, A., et al. Native phasing of x-ray free-electron laser data for a G protein-coupled receptor. Science Advances. 2 (9), 1600292 (2016).
- Kern, J., et al. Structures of the intermediates of Kok's photosynthetic water oxidation clock. Nature. 563 (7731), 421 (2018).
- Suga, M., et al. An oxyl/oxo mechanism for oxygen-oxygen coupling in PSII revealed by an x-ray free-electron laser. Science. 366 (6463), 334-338 (2019).
- Tenboer, J., et al. Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein. Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).
- Pande, K., et al. Femtosecond structural dynamics drives the trans/cis isomerization in photoactive yellow protein. Science. 352 (6286), 725-729 (2016).
- Ishigami, I., et al. Snapshot of an oxygen intermediate in the catalytic reaction of cytochrome c oxidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3572-3577 (2019).
- Nango, E., et al. A three-dimensional movie of structural changes in bacteriorhodopsin. Science. 354 (6319), 1552-1557 (2016).
- Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation. International Union of Crystallography. 2, 168-176 (2015).
- Nogly, P., et al. Retinal isomerization in bacteriorhodopsin captured by a femtosecond x-ray laser. Science. 361 (6398), (2018).
- Martin-Garcia, J. M., et al. Serial millisecond crystallography of membrane and soluble protein microcrystals using synchrotron radiation. International Union of Crystallography. 4, 439-454 (2017).
- Berntsen, P., et al. The serial millisecond crystallography instrument at the Australian Synchrotron incorporating the "Lipidico" injector. Review of Scientific Instruments. 90 (8), 085110 (2019).
- Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallographica Section D-Structural Biology. 71, 387-397 (2015).
- DePonte, D. P., Nass, K., Stellato, F., Liang, M., Chapman, H. N. Sample injection for pulsed X-ray sources. Advances in X-Ray Free-Electron Lasers: Radiation Schemes, X-Ray Optics, and Instrumentation: Proceedings of Society of Photo-Optical Instrumentation Engineers. Tschentscher, T., Cocco, D. , Prague, Czech Republic. 8078 (2011).
- Park, S. Y., Nam, K. H. Sample delivery using viscous media, a syringe andasyringe pump for serial crystallography. Journal of Synchrotron Radiation. 26, 1815-1819 (2019).
- Shimazu, Y., et al. High-viscosity sample-injection device for serial femtosecond crystallography at atmospheric pressure. Journal of Applied Crystallography. 52, 1280-1288 (2019).
- Kovacsova, G., et al. Viscous hydrophilic injection matrices for serial crystallography. International Union of Crystallography. 4, 400-410 (2017).
- Darmanin, C., et al. Protein crystal screening and characterization for serial femtosecond nanocrystallography. Scientific Reports. 6, 25345 (2016).
- Conrad, C. E., et al. A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography. International Union of Crystallography. 2, 421-430 (2015).
- Sugahara, M., et al. Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography. Nature Methods. 12 (1), 61-63 (2015).
- Sugahara, M., et al. Oil-free hyaluronic acid matrix for serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 6, 24484 (2016).
- Fromme, R., et al. Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase. International Union of Crystallography. 2, 545-551 (2015).
- Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography. Journal of Visualized Experiments. (115), e54463 (2016).
- Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography. Nature Protocols. 9 (9), 2123-2134 (2014).
- Hadian-Jazi, M., et al. A peak-finding algorithm based on robust statistical analysis in serial crystallography. Journal of Applied Crystallography. 50, 1705-1715 (2017).
- Kong, F. W., Yuan, L., Zheng, Y. F., Chen, W. D. Automatic Liquid Handling for Life Science: A critical review of the current state of the art. Journal of Laboratory Automation. 17 (3), 169-185 (2012).
