Summary
이 프로토콜의 목표는 최근 호주 싱크로트론에서 의뢰한 고점성 인젝터 인Lipidico에서 데이터 수집을 위한 직렬 결정예학 샘플을 준비하는 방법을 시연하는 것입니다.
Abstract
호주 싱크로트론에서 직렬 결정학 측정을 위한 시설이 개발되었습니다. 이 시설은 실온에서 많은 수의 작은 결정을 측정하기 위해 대용량 분자 결정학 (MX2) 빔 라인의 일환으로 고점성 인젝터 인Lipidico를 통합합니다. 이 기술의 목표는 크리스탈을 유리 주사기로 재배/전송하여 직렬 결정학 데이터 수집을 위한 인젝터에 직접 사용할 수 있도록 하는 것입니다. 이 인젝터의 장점은 스트림의 중단없이 유량의 변화에 신속하게 대응하는 기능을 포함한다. 이 높은 점도 인젝터 (HVI)에 대한 몇 가지 제한은 허용 된 샘플 점도에 대한 제한을 포함하는 존재 >10 Pa.s. 스트림 안정성은 샘플의 특정 특성에 따라 문제가 될 수도 있습니다. 샘플을 설정하고 호주 싱크로트론에서 직렬 결정학 측정을 위한 인젝터를 작동하는 방법에 대한 자세한 프로토콜이 여기에 제시됩니다. 이 방법은 리소지메 결정의 높은 점성 매체(실리콘 그리스)로의 전송을 포함한 시료의 제조를 시연하고, MX2에서 데이터 수집을 위한 인젝터의 작동을 보여 준다.
Introduction
직렬 결정학(SX)은 X선 자유 전자 레이저(XFELs)1,2,3,4의맥락에서 처음에 개발된 기술이다. 고정 대상 접근법은 SX5,6,7,전형적으로 사용될 수 있지만 인젝터 시스템은 연속 스트림에서 X선 빔에 크리스탈을 전달하기 위해 사용됩니다. 많은 수의 결정으로부터의 데이터를 결합하기 때문에 SX는 실험 중에 모든 결정 정렬의 필요성을 피하고 실온8,9에서데이터를 수집할 수 있게 한다. 적합한 인젝터의 도움으로, 결정은 X선 상호작용 영역으로 하나씩 스트리밍되고 그 결과 회절 데이터는 영역 검출기9,10에서수집된다. 현재까지 SX는 종래의 결정학을 사용하여 측정하기에는 너무 작은 결정을 포함하여1,11,12,13의 다수의 단백질 구조를 해결하는 데 성공했습니다. 또한 XFEL의 펨토초 펄스 지속 시간을 활용하여 시간 해결 된 분자 역학에 대한 새로운 통찰력을 제공했습니다. 광학 레이저 소스와 펌프 프로브 반응을 시공함으로써, 광시스템 II14,15,광활성 황색 단백질16,17,사이토크롬 C 산화제 18, 박테리오호도프신(19,20,21)에서심층적인 연구가 수행되었다. 이러한 연구는 시간 해결된 생물학적 과정을 이해하기 위한 직렬 결정촬영의 중요한 잠재력을 보여주는 빛 활성화 에 따라 발생하는 전자 전달 역학을 조사했습니다.
직렬 결정학의 개발은 또한 싱크로트론 소스9,12,20,22,23,24에서점점 더 널리 퍼지고있다. Synchrotron 기반 SX를 사용하면 적절한 인젝터 시스템을 사용하여 실온에서 많은 수의 개별 결정을 효율적으로 측정할 수 있습니다. 이 방법은 더 작은 결정에 적합하므로 데이터를 수집하기 위해 빠른 프레임 속도 검출기를 요구하는 것 외에도 마이크로 집중 빔도 필요합니다. 기존의 결정예촬영과 비교하여, SX는 X선 빔에 개별 결정의 장착 및 정렬을 포함하지 않습니다. 다수의 개별 결정으로부터의 데이터가 병합되기 때문에, 각 결정에 의해 수신된 방사선 량은 종래의 결정예예촬영에 비해 실질적으로 감소될 수 있다. 싱크로트론 SX는 또한 밀리초 정권에 이르기까지 시간 해결 된 반응의 연구에 적용 될 수 있으며, 충분히 높은 프레임 속도를 가진 검출기가 사용할 수 있는 경우 (예를 들어, 100 Hz 이상). 몇몇 직렬 결정학 실험은 XFEL 근원에서 처음 개발된 인젝터를 사용하여 싱크로트론에서 수행되었습니다20,22,23. 인젝터의 두 가지 가장 일반적인 유형은 가스 동적 가상 노즐 (GDVN)25 및 고점성 인젝터 (HVI)9,24,26,27,28이다. GDVN은 낮은 점도, 액체 샘플을 주입하는 데 이상적이지만 안정적인 스트림을 달성하기 위해 높은 유량이 필요하며, 이는 높은 시료 소비율로 이어집니다. 대조적으로, HVI는 훨씬 낮은 유량에서 안정적인 스트림의 생성을 허용하는 높은 점도 샘플에 적합하여 훨씬 낮은 샘플 소비로 이어집니다. 따라서 HVI 인젝터는 점성 담체가 바람직하다는 샘플(예: 막 단백질용 지질 계주) 및/또는 다량의 시료를 사용할 수 없는 시료의 전달을 선호합니다. SX 인젝터는 일반적으로 사용하기 가 어렵고 운영에 광범위한 교육이 필요합니다. 그들은 또한 샘플이 전문 저수지에 로드되어야하기 때문에 긴 샘플 전송 프로토콜을 포함하며, 일반적으로 샘플이 '죽은 부피'에서 또는 연결의 누출을 통해 손실되는 것과 관련된 고위험이 있습니다. 따라서, X선 빔에 도달하는 샘플이전에 손실을 완화하기 위해 인젝터 설계를 최적화하는 것이 바람직하다.
최근에는 아이거 16M 검출기를 사용하여 리소지메 표적을 가진 Lipidico23을 사용하여 첫 번째 SX 결과가 발표되었습니다. 이 인젝터 설계는 초기 결정화에서 인젝터로 의결정 전달에 관련된 단계수를 최소화한 다음 X선 빔에 시료를 전달하는 데 관련된 단계 수를 최소화하여 샘플 낭비를 제한합니다. 이 원고는 샘플 준비부터 동일한 결정화 용기를 사용하여 주사 공정으로 이동하고 마지막으로 데이터 수집을 통해 샘플 전송 절차를 설명하고 시연합니다. 인젝터의 작동도 설명되어 있다.
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Protocol
1. 유리 주사기를 사용하여 높은 점성 매체에서 결정의 준비
- 결정 용액을 부드럽게 원심분리(~1,000xg, 22°C에서 ~10분)하여 부드러운 크리스탈 펠릿을 형성하고 과잉 버퍼를 제거합니다. 이것은 데이터 수집에 사용될 수 있는 펠릿에 있는 결정의 고농도 귀착될 것입니다.
참고: 점성 매체의 희석을 방지하기 위해 이 단계에서 결정 농도를 증가시다. 각 시료에 대한 점성 매체의 비율을 최적화하여 고농도의 결정을 획득하는 동시에 미디어에 대한 높은 점도를 유지합니다. 결정용액을 원심분리하여 펠릿을 형성하고 과도한 버퍼를 제거하여 다마닌 에 설명된 바와 같이 용액의 결정 농도를 증가시다. al.29. - 커플러로 100 μL 주사기 두 개를 설정합니다.
- 첫 번째 주사기 의 끝에 커플러를 고정하고 주사기의 상단에 결정 용액의 28 μL을 추가합니다. 천천히 플런저를 주사기 의 상단에 삽입하고 부드럽게 결합기 팁의 끝으로 용액을 밀어 형성되는 기포를 제거합니다. 아래에 설명된 두 가지 방법 중 하나를 따라 이 작업을 수행합니다.
참고: 고점성 매체에 첨가되는 결정의 부피는 전체 시료의 점도를 크게 변화시키지 않으면 다양할 수 있다.- 첫 번째 방법: 급속한 압력 변경을 사용하여 기포를 파열시세요.
- 장갑을 낀 손가락 한 개를 무딘 커플러 바늘 점 위에 조심스럽게 놓고 (매우 부드럽게) 압력을 가하여 씰을 만듭니다. 이 바늘 스틱 부상이 발생할 수 있기 때문에 너무 많은 압력을 적용하지 마십시오.
- 이제 플런저를 다시 당겨 바늘 지점에서 용액을 끌어내어 주사기에 압력이 축적됩니다.
- 무딘 바늘 끝에서 장갑을 낀 손가락을 제거하여 주사기 상단의 압력을 신속하게 해제합니다. 손가락이 제거될 때 샘플이 팁에 너무 가까워지면 시료손실이 발생할 수 있습니다. 주사기 내의 압력의 급격한 변화는 기포를 파열합니다. 모든 거품이 제거될 때까지 반복합니다.
- 두 번째 방법: '인간 원심분리기'를 사용하여 기포를 제거합니다.
- 주사기를 한 손에 놓고 바늘이 위쪽으로 향하고 플런저가 두 손가락 사이에 끼어 움직이면 움직일 수 없습니다.
- 주사기를 한 방향으로 2-3번 빠르게 회전하면 시료의 원심력은 주사기에서 기포를 강제로 꺼낼 수 있습니다. 너무 느리게 샘플을 잃어 버릴 수 있습니다.
- 기포가 남아 있는 경우 기포에 대한 주사기를 검사하여 모든 기포가 제거될 때까지 1.3.2.1 - 1.3.2.2 단계를 반복합니다.
- 첫 번째 방법: 급속한 압력 변경을 사용하여 기포를 파열시세요.
- 미세주걱을 사용하여 두 번째 주사기의 상단에 직접 높은 진공 실리콘 그리스의 ~ 42 μL을 추가합니다. 플런저를 끝까지 밀어 모든 기포를 제거하고 주사기 의 끝에 공기 간격이 없도록합니다.
참고: 실리콘 그리스의 정확한 조성은 불활성 담체역할을 하기 때문에 중요하지 않습니다. 점도 값 >10 Pa.s 또는 약 60:40 실리콘 그리스의 결정 용액에 대한 비율은 주입에 최적이지만, 이는 시료의 정확한 특성에 따라 달라질 수 있다. 실리콘 그리스에 첨가된 결정 용액의 부피를 조정하여 논의에 설명된 바와 같이 혼합물의 결정 농도를 최적화합니다. 실리콘 그리스 이외의 고점성 매체는 시료(30,31,32,33)와호환되는 한 사용할 수 있다. - 두 주사기 중 하나에 기포가 없는지 확인하고 커플러를 사용하여 주사기를 함께 부착하십시오. 손가락에서 생성 된 열로 인해 주사기를 따뜻하게하면 주사기의 끝만 그립하여 주사기를 수직으로 유지하면 샘플에 영향을 줄 수 있습니다.
- 크리스탈 용액 측의 플런저를 부드럽게 우울시켜 실리콘 그리스에 섞은 다음 실리콘 그리스 측의 플런저를 밀어 서 샘플을 크리스탈 용액 쪽으로 밀어 넣습니다. 부드럽게, 샘플이 철저하게 혼합하고 균일 한 보이도록이 과정을 50 ~ 100 번반복합니다.
참고: 결정이 점성이 높은 매체(예: 립디딕 입방상, LCP)에서 직접 재배되는 경우 1.1-1.6단계는 필요하지 않습니다. 주사기 내에서 커지는 결정을 위한 프로토콜은 리우 et.al 찾을 수 있습니다. 34,35. 이 프로토콜을 따라 샘플 통합, 10단계, 모든 샘플이 하나의 주사기에 포함되고 결정화 버퍼가 제거됩니다. 이 프로토콜에 7.9MAG를 추가할 필요는 없습니다. 대신, 더 이상 액체가 주사기에 남아 있지 때까지 시료의 플런저를 부드럽게 밀어 주사기에서 모든 여분의 액체를 제거합니다. - 광학 현미경으로 결정을 시각화하거나 최상의 결과를 얻으려면 소량(~1 μL)을 유리 슬라이드에 추출하여 상단에 덮개 슬립을 놓습니다.
- 결정 농도를 확인합니다.
- 광학 현미경 이미지를 사용하여 특정 영역에서 결정수를 계산하여 실리콘 그리스의 결정 농도를 결정한다. 최상의 결과를 위해, 높은 결정 적중률을 얻기 위해 미디어 전체에 균일하게 분배된 고밀도의 결정(>106 결정/mL)이 이상적입니다.
- 1.3 및 1.4 단계에서 점성 매체로 결정의 비율을 변경하여 주사기의 결정 농도를 조정합니다.
- 결정 농도를 감소시키기 위해, 1.4단계에서 실리콘 그리스/HV 매체의 양을 증가시키거나 결정화 버퍼로 용액을 희석하여 주사기의 주사기를 1.1단계에서 설정하여 주사기내의 결정을 희석시켰다.
- 결정 농도를 증가시키기 위해, 1.4 단계에서 실리콘 그리스의 양을 감소시키지만 10 Pa.s 이하의 점도를 감소시키지 않도록 주의하십시오.
참고: 여기에서 보고된 결정 농도는 이 특정 시료 및 결정 크기에 최적화되었습니다. 그러나 이상적인 결정 농도는 결정 크기, 빔 크기, 바늘 내부 직경(I.D.) 및 사고 X선 플럭스에 따라 달라집니다. 이는 '좋기'로 간주되는 ~30%의 적중률로 적중률에서 확인할 수 있다. 실제로, 결정 농도는 원하는 적중률을 얻기 위해 빔 시간 동안 다른 샘플에 최적화되어야 한다. 고농도 크리스탈, 109 크리스탈/mL로 시작합니다. 결정 농도조정 절차는 리우 et.al 주어진다. 35.
- 인젝터가 데이터 수집에 준비가 될 때까지 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
- 결정이 LCP에서 재배되면 밀봉하여 실온에서 최대 며칠 동안 주사기에 보관하십시오.
- 결정이 다른 고점성 매체(예: 실리콘 그리스)로 옮겨진 경우, 시간이 지남에 따라 결정의 안정성 테스트를 측정하기 전에 수행해야 합니다. 이렇게 하면 불활성 미디어(이상적으로 > 8h)에서 결정이 얼마나 안정되어 있는지, 데이터 수집시 시간 제한이 결정됩니다. 여기서 리소지메 결정은 실리콘 그리스에서 며칠 동안 안정적이었으며 광학 현미경을 사용하여 검사할 때 용해의 징후를 보이지 않았다.
- 커플러를 분리하기 전에 모든 샘플을 하나의 주사기로 이동합니다. 주사기에서 커플러를 분리하고 주사 바늘을 부착합니다. 바늘을 주사기 의 바닥에 단단히 나사로 고정하고 누출을 방지하기 위해 단단히 고정되었는지 확인합니다. 이 실험에는 108 μm I.D. 바늘(바늘 길이 13mm, 포인트 스타일 3)이 사용하였다. 결정 크기와 빔 크기에 따라 51 μm 또는 108 μm I.D. 바늘을 부착합니다.
참고: 빔 시간 이전에 샘플 스트림의 사전 테스트는 올바른 인젝터 바늘 크기를 선택할 수 있어야 합니다. 시료 특성(즉, 점도, 충전, 완충 조성)과 바늘 I.D.에 따라 샘플이 다르게 흐릅니다. 따라서, 데이터 수집 시 신호 대 잡음 비율을 최대화하기 위해 가능한 가장 작은 I.D. 바늘로 가장 안정적인 스트림을 생성하기 위해 다양한 바늘 크기를 테스트하는 것이 좋습니다. - 인젝터가 이미 장착되고 빔 라인에 정렬되면 섹션 3로 이동하고 샘플 주사기를 인젝터에 직접 장착합니다.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.
2. 인젝터 장착 및 제어
- 인젝터를 빔라인에 장착합니다. MX2 빔라인의 극저온 노즐을 제거하고 인젝터로 대체합니다. 극저온 노즐을 고정하는 클램핑 나사를 풀고 전동 단계 옆에 있는 브래킷에 부착합니다.
- 검은 손잡이를 잡고 트롤리에서 인젝터를 들어 올려 전동 무대에 놓습니다.
- 전동 단계에 인젝터를 고정하려면; 손은 검은 색 클램핑 나사 손잡이를 조입니다.
- 인젝터에 빈 주사기를 장착
- 인젝터 컴퓨터 제어 인터페이스(예: EPOS 위치 제어 소프트웨어)에서 소프트웨어 메뉴에서 도구 에서 호밍 모드를 선택합니다. 그런 다음 음극 한계 스위치를 선택하고 호밍을 시작하여나사가 나사 아래에 맞게 주사기에 충분히 맞을 때까지 소프트웨어를 실행하도록 합니다. 감독없이 실행하려면 제한 스위치가 나사를 자동으로 중지합니다.
- 주사기 홀더의 슬릿을 통해 바늘을 삽입하여 빈 ('더미') 주사기를 인젝터에 장착합니다. 브래킷에 주사기를 정렬합니다.
- 두 개의 O 링으로 주사기를 고정합니다.
- 주사기의 중간 부분에 첫 번째 O 링을 감아 주사기의 양쪽에 있는 후크에 부착합니다.
- 주사기의 상부 부분에 있는 후크 주위에 두 번째 O 링을 반복한 다음 데모 및 도 1B에표시된 것처럼 유리 주사기 의 상단에 O 링의 한 부분을 놓습니다.
- 인젝터를 X선 빔에 정렬
- 빔라인 제어 소프트웨어를 통해 인젝터를 X선 상호작용 지점으로 이동합니다. 이는 인라인 카메라를 사용하여 시각화할 수 있습니다. 빔의 크기와 위치는 화면상의 적십자에 의해 표시되고 전동 단계는 바늘을 X선 상호 작용 영역과 정렬하도록 이동할 수 있다.
- 바늘을 붉은 십자가와 정렬하기 위해 스테이지의 x 및 y 위치를 조정합니다.
- 바늘 끝이 초점에 올 때까지 z 위치를 조정합니다.
- 주사기 팁이 빔라인 카메라에 의해 생성된 광학 현미경 이미지에서 보이는 십자선과 만나는지 확인하여 바늘 끝과 X선 빔의 정렬을 시각적으로 확인합니다.
- 바늘 끝이 정렬되면 십자선 ~ 100 μm 위의 팁을 이동합니다. 이것은 바늘 끝에서 엑스레이 산란을 제거합니다.
참고: 싱크로트론의 MX2 빔라인에 인젝터를 장착하고 정렬하는 것은 빔라인 과학자들에 의해 수행되어야 하며 30분 이내에 완료할 수 있습니다.
3. 샘플 주사기 장착
- 다음 단계 2.3에 의해 샘플 주사기로 빈 주사기를 교체합니다.
- 샘플 주사기 플런저 헤드에 인젝터 캡을 놓습니다.
- 드라이브 나사를 캡 의 맨 위로 이동합니다.
- 인젝터 제어 소프트웨어에서 속도 모드를 선택합니다.
- 설정 값으로 입력 3000 rpm (~115 nL/s)을 설정 값으로 입력하고 설정 값 적용을누릅니다.
- 드라이브 나사가 주사기 플런저 헤드의 캡에 닿으면 모터를 중지합니다.
- 나사가 캡에 접근할 때 설정 값을 '0'으로 변경하여 인젝터 제어 소프트웨어에서 rpm 값을 0으로 설정합니다.
- 접촉이 이루어지면 설정 값 적용을 눌러 나사를 즉시 중지하여 사전 설정 값을 활성화합니다.
- 캡을 부드럽게 흔들어 제자리에 단단히 고정되어 있는지 확인합니다.
참고: 컨트롤 소프트웨어의 설정 값 상자에 새 설정 값을 입력할 때마다 설정 적용 값을누른 후에만 활성화됩니다.
4. 인젝터 실행
- 캡 드라이브 나사가 플런저 상단과 단단히 접촉한 후 rpm 설정 값을 100으로 변경합니다. 이는 ~ 4nL/s와 동일합니다.
- 샘플이 처음 나올 때 바늘 끝을 육안으로 검사하거나 바늘의 빔 라인 카메라 이미지를 보고 샘플이 바늘 끝에서 돌출되기 시작할 때 관찰합니다.
- 오두막을 수색하고, 오두막 문을 닫고, 엑스레이 빔을 켭니다. 이 시점에서 인젝터는 오두막 외부에서 원격으로 작동해야합니다.
- 안정적인 스트림이 생성될 때까지 rpm을 조정합니다.
- rpm 설정 값을 90으로 줄입니다.
- 반복 단계 4.4.1, 10의 단위로 rpm 설정 값을 감소, 스트림을 느리게하지만 여전히 안정적인 스트림을 유지합니다. 실리콘 그리스의 경우 30 rpm의 값을 사용했습니다.
참고: 일반적인 rpm 범위는 샘플 특성 및 X선 노출 시간에 따라 30~ 100rpm(1 ~ 4nL/s) 사이입니다. 일반적으로 rpm은 안정적인 스트림을 유지하면서 가장 느린 유량(샘플 소비를 최소화)하도록 조정해야 합니다.
- 잘 흐르지 않는 샘플 스트림을 관리합니다.
- 스트림이 더 똑바르게 될 때까지 rpm 설정 값을 10의 단위로 계속 늘린다. 스트림이 안정화되지 않으면 rpm 설정 값을 최대 값으로 100rpm으로 늘린 후에도 아래에 설명된 두 가지 방법 중 하나를 구현하여 안정성을 개선하려고 노력한다.
- 첫 번째 방법: 샘플 스트림 아래에 폴리스티렌 샘플 포수를 삽입하여 샘플을 안내합니다. 이 방법은 고충전 된 샘플 스트림에 적합합니다.
- 두 번째 방법: 샘플 포수에 벤츄리 흡입 깔때기를 삽입합니다. 깔때기에 공기를 공급하려면 허치에 있는 공기 콘센트 튜브에 연결합니다. 이 방법은 스트림의 전하에 샘플 흐름을 지시하고 안정화하는 데 도움이 될 수 있습니다.
- 스트림이 더 똑바르게 될 때까지 rpm 설정 값을 10의 단위로 계속 늘린다. 스트림이 안정화되지 않으면 rpm 설정 값을 최대 값으로 100rpm으로 늘린 후에도 아래에 설명된 두 가지 방법 중 하나를 구현하여 안정성을 개선하려고 노력한다.
- 일정하고 안정적인 스트림이 달성되면 일반 X선 결정학 실험에 따라 데이터 수집을 시작하고 검출기 거리를 최적화합니다.
참고: rpm은 보충 정보인 '지질 장치 계산기'에서 제공된 변환 테이블을 사용하여 유량으로 변환됩니다. rpm 값, 바늘 직경 및 주사기 볼륨을 입력하여 이 계산기를 사용하여 유량을 계산합니다.
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Representative Results
Lipidico는 MX2(그림 1)에사용하기위한 대체 배달 시스템으로 구축 된 HVI입니다. 크리스탈이 립디큐피너 단계에서 재배되거나 고점성 불활성 매체로 옮겨지는 SX에 이상적입니다.
리조지메 결정과 혼합된 인젝터 애플리케이션 실리콘 그리스를 시연하기 위해 호주 싱크론의 MX2 빔라인에서 SX 데이터를 수집하는 데 사용되었다. MX2 빔라인에 인젝터를 탑재하려면 극저온 노즐이 도 1에도시된 바와 같이 인젝터로 제거되고 대체된다. 주사기 샘플은 인젝터에 직접 장착되고 O-링(도1B)을사용하여 고정됩니다. 샘플 변경 후 몇 분 내에 데이터 수집을 시작할 수 있습니다. 인젝터는 SX에 익숙하지 않은 사용자를 위해 조작하기 쉬운 간단한 설정으로 빠른 샘플 제어를 위해 설계되었습니다.
그림 1: SX 실험을 위해 호주 싱크로트론에서 사용되는 점성 인젝터인 Lipidico의 이미지입니다. (A)MX2에 통합된 Lipidico의 사진을 보여줍니다. 빨간색 화살표는 X선 빔의 방향을 나타냅니다. (B)Lipidico에서 샘플 홀더 영역의 면밀한 보기. 주사기는 두 개의 O 링에 의해 제자리에 보관되며 샘플은 포수에서 수집됩니다. (D)주입기 바늘과 샘플 폐기물 포수를 나타내는 샘플 스트림의 클로즈업 뷰는 바늘 하에서 본 폴리스티렌/벤츄리 흡입 포수를 통합하도록 변경될 수있다(A). 이 수치는 베른트센 등에서 적용되었습니다. al. 201923 AIP 출판의 허가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
인젝터는 점성이 높은 캐리어의 다양한 유형과 호환됩니다. 인젝터에 대한 최적의 샘플 실행 속도는 스트림 안정성에 매우 중요하며, 너무 느리게 컬링 효과/스트림 확장이 발생하고 너무 빠르면 스트림 이별이 발생합니다. 최적의 속도는 사용되는 캐리어 시스템에 따라 달라집니다. 그림 2 및 그림 3은 서로 다른 인젝터 속도로 테스트된 실리콘 그리스를 표시하고 스트림 동작이 어떻게 달라질 수 있는지 를 보여줍니다. 느린 유량(도2A,2.3 nL/s)은 인젝터로부터 압출된 실리콘 그리스의 팽창을 초래하며, 빠른 유량(도2C,6.6nL/s)은 더 얇은 스트림을 생성한다. 점성 미디어 스트림의 컬링은 정기적으로 관찰되었습니다(그림 3A). 이 문제를 극복하기 위해 두 가지 혁신적인 솔루션을 테스트했습니다: 폴리스티렌 포수와 바늘 아래의 벤츄리 흡입 깔때기. 폴리스티렌 포수는 약한 정전기력을 도입하고 고충전 된 샘플에서 가장 잘 작동하며 실리콘 그리스(그림 3B)의경우와 같이 벤츄리 흡입 깔때기는 시료 충전과 는 별개로 캐처에 수직으로 하천으로 스트림을 안내하는 데 보조합니다. 샘플의 특성에 따라 두 옵션 중 하나를 성공적으로 사용할 수 있습니다.
그림 2: 다른 인젝터 속도를 사용하여 고점성 캐리어 스트림의 효과. 100% 실리콘 그리스는 다양한 시료 속도로 테스트하여 유동 특성을 평가하였다. (A) . 2.3 nL/s (30 rpm),(B)3.5 nl/s (90 rpm) 및(C)6.6 n/s (170 rpm). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 점성 매체의 컬링을 보여주는 100% 실리콘 그리스의 스트림 동작. (A)컬링 효과는 2.3 nl/s(30rpm)(B)에서 2.3nL/s(30rpm)에서 작동되는 인젝터 속도로 샘플 폐기물 홀더에 폴리스티렌 포수를 추가하는 효과가 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
실리콘 그리스에 매달린 리소지메 결정(크리스탈 크기 10 μm x 10 μm x 20 μm)의 26 μL을 함유한 유리 주사기가 사용하였다(도4A). Lipidico는 108 μm 바늘 I.D.를 사용하여 일정한 시료 스트림을 생성했으며 평균 유량은 1.14 nL/s (모터가 30 rpm으로 설정되어 있음). 피크 찾기알고리즘(36)은 적중률을 평가하는 데 사용되었고 충분한 양의 데이터(총 224,200개의 이미지)가 데이터 수집 시간의 38분 이내에 수집되어 구조 검색(PDB 코드 6MQV)을 가능하게 하였다. 표 1은 데이터 수집 통계의 요약을 제공하고 도 4B는 리소지메구조(20)에서디-황화물 결합 중 하나를 둘러싼 전자 밀도 맵의 대표적인 이미지를 나타낸다.
그림 4: 리소지메 이미지. (A)실리콘 그리스에서 리소지메 결정의 광학 이미지. 가시광선 현미경을 이용하여 이미지화된 고점성 매체, 실리콘 그리스와 혼합된 리조지메 결정의 교차 편광(40배배) 영상. 결정의 크기는 15 와 20 μm 사이이며(B)리소지메의 이황화물 결합을 둘러싼 전자 밀도 맵(2Fo-Fc, 1마리아도)의 대표적인 이미지이다. 이 수치는 베른트센 등에서 적용되었습니다. al. 201923 AIP 출판의 허가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 정보. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: Lipidico의 SX 데이터 통계를 보여주는 요약 표입니다. 리소지메 결정은 높은 점성 매체, 실리콘 그리스와 혼합하고 MX2 빔라인의 X선 상호 작용 영역을 통해 스트리밍되었다. 이것은 Berntsen et에 게시 된 결과의 전체 테이블의 요약입니다. al.23. 표는 AIP 게시의 허가하에 여기에 적용됩니다.
| 데이터 통계 | 지질, MX2 빔라인 |
| 발견자 | 데트리스 아이거 X 16M, |
| 프레임 속도 | 100Hz |
| 샘플 검출기 거리(mm) | 300 |
| 엑스레이 에너지 (KeV) | 13 |
| 빔 크기(WxH) (μm) | 12x22 |
| 아니요. 프레임의 | 224200 |
| 적중률(%) | 2.95 |
| 아니요. 인덱싱된 프레임의 | 4852 |
| 해상도 (Å) | 17.74-1.83 |
| 완전성 | 99.44 |
| 공간 그룹 | P43212 |
| 단위 셀 | |
| a, b, c (Å) | 78.68, 78.68, 34.48 |
| α, β, γ (°) | 90, 90, 90 |
| I/σ(I) | 5.08 |
| 중복성 | 73.97 |
| CC1/2 | 0.96 |
| R작업/R무료 | 0.18/0.26 |
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Discussion
대체 HVI가 개발되어 싱크로트론 소스에서 SX 실험을 수행하는 데 이상적입니다. 기존 HV에 비해 두 가지 주요 장점이 있습니다. 첫째, 기존의 결정학과 SX 를 빠르게 전환할 수 있도록 빔라인에 설치하기 쉽고, MX2의 설치 및 정렬에 불과 ~30분이 소요된다. 둘째, 결정을 성장시키는 데 사용되는 샘플 주사기는 직접 주입을 위한 저수지로서 사용될 수 있으며, 시료 전달 시 낭비를 제한할 수 있다. 샘플 변경 프로토콜이 설명되고 입증되었습니다. 이 설계는 다른 HV에 비해 제트를 제어하는 복잡한 가스 스트림의 필요성을 제거합니다. 인젝터의 유량을 변경하는 간단한 프로세스가 지연된 응답 없이 조정할 수 있는 것으로 나타났다.
성공적인 SX 데이터 수집을 위한 가장 중요한 단계는 결정 농도를 최적화하고, 점도가 높은 매체의 균일한 혼합물을 획득하고, 데이터 수집을 위한 안정적인 스트림을 생성하는 것입니다. 최적의 결정 농도와 균질성은 결정을 펠릿으로 원심분리하고 캐리어 미디어에 더 높은 농도의 결정체를 추가하여 샘플이 커플러 시스템에서 철저히 혼합되도록 함으로써 달성될 수 있습니다. 결정 농도가 최적화되면, 인젝터 유량은 빔타임 동안 쉽게 조절하여 안정적인 스트림을 얻을 수 있다. 점성 스트림의 컬링은 일반적으로 높은 점성 샘플로 관찰됩니다. 두 가지 해결책이 제시됩니다 : 충전 된 샘플에 대한 폴리스티렌 샘플 포수의 사용 또는 포수 역할을하는 벤츄리 흡입 깔때기의 추가. 이것은 초기 시험에서 스트림을 제어하는 데 성공했지만, 스트림의 상이한 샘플 조건 하에서 컬링은 바늘 점에 샘플의 집착을 초래할 수 있다. 특수 코팅을 추가하여 바늘의 표면 전하 특성을 변경하여 이를 극복할 수 있습니다. 다른 화학 물질 (즉, 실리콘)으로 코팅 된 바늘은 이전에 성공적으로 액체 처리 로봇과 함께 사용하기 위해 적응되었으며 주사기(37)에맞게 제조품에서 주문 할 수 있습니다.
인젝터는 실리콘 그리스에 만국한되지 않으며 다른 점성 액체와 함께 사용할 수 있습니다. 여러 가지 다른 대안이 입증되어결정 주입에 성공적으로 사용될 수 있으며 다수의 다른간행물(22,30,33)에기재되어 있다. 이 HVI를 사용하여 샘플 점도에 대한 상한은 아직 조사 중이지만 최대 25 Pa.s (100 % 실리콘 그리스 사용)의 샘플 점도는 안정적인 스트림을 초래했습니다. 그러나, 시료 점도가 감소되었을 때 <10 Pa.s(70% 실리콘 그리스 시료를 사용하여) 신뢰할 수 있는 스트림을 생성할 수 없었다. 따라서, 10 Pa.s는 이 HVI를 사용하여 주사를 위한 시료 점도에 대한 현재 하한을 나타낸다. 바늘 I.D.는 또한 중요한 고려 사항입니다. 51 μm I.D.가 크리스탈없이 다양한 운반체를 주입하는 동안 성공적으로 테스트되었지만 결정의 도입은 시료 흐름을 방해합니다. 따라서, 그들의 크기에 따라, 매트릭스에 도입 된 결정, 더 큰 바늘 크기에 비해 51 μm I.D. 바늘을 사용할 때 막힘의 훨씬 더 높은 가능성이있다. 막힘이 발생하면 압력이 상당히 축적될 수 있으며, 다른 인젝터에서는 주사기 가중단이 발생할 수 있습니다. 그러나 이 HVI의 설계에는 비활성화 스위치가 활성화될 때까지 압력이 너무 높아지면 드라이브 역학이 주사기 플런저에서 벗어나는 안전 메커니즘이 포함되어 있습니다. 이로 인해 드라이브가 중지되고 유리 주사기가 파열되는 것을 방지할 수 있습니다.
이 인젝터에 대한 몇 가지 제한이 존재합니다. 인젝터는 점성이 높은 시료를 위해 특별히 설계되었기 때문에 샘플과 같은 액체는 샘플 전달을 위해 직접 사용할 수 없습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 완충 시스템에서 자란 결정은 1단계에서 설명된 바와 같이 적합한 불활성 매체와 혼합될 수 있지만, 결정이 불안정해질 가능성이 있다. 따라서, 다양한 불활성미디어(26,27,28,29)의 스크리닝은 시료 안정성이 유지되도록 먼저 조사되어야 한다. 둘째, 결정의 크기와 크리스탈 패킹의 품질은 회절 품질에 영향을 미칩니다. MX2 빔라인은 22 x 12 μm(H x W) 및 플럭스 ~1012 광자/s의 최적의 빔 크기로 작동합니다. MX2에서 SX를 수행하는 최적의 결정 크기는 ~10 μm이며 높은 신호 대 잡음 비율을 산출하는 것으로 나타났습니다. 그러나, 그들은 잘 정렬하고 고해상도에 확산하는 경우 작은 크기의 결정에 대한 데이터를 수집 할 수 있습니다. 이 빔 라인에서 빔 크기를 ~7.5 μm로 슬릿하는 옵션이 있지만 실험 중에 고려해야 할 인시던트 플럭스를 감소시키기 때문에 비용이 듭니다.
이 인젝터의 개발로 인해 SX는 주류 결정학자에 쉽게 접근할 수 있습니다. Lipidico의 성공적인 운영은 다양한 싱크로트론 소스에서 SX 데이터 수집을위한 빠르고 쉬운 방법의 문을 엽니 다. MX2에서 10μm 이하의 크리스탈에 대한 실온 데이터 수집을 가능하게 하여 개별 결정에 대한 방사선 손상 효과를 제한합니다. 또한 호주에서 는 현재 결정학자를 위한 최첨단 SX를 밀리초 단위로 수행할 수 있는 새로운 기회를 제공합니다. 이 인젝터 시스템의 향후 응용 프로그램은 작은 앵글 X 선 산란(SAXS)을 사용하여 점성이 높은 물질의 X선 특성화로 확장되어 인젝터가 호주 싱크로론의 다른 빔라인에 쉽게 적응할 수 있도록 합니다.
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Disclosures
MK는 쿠셀 디자인에 대해 작업합니다. 커스텀 실험실 장치 개발자인 Kusel Design은 라 트로브 대학의 피터 벤슨 박사와 ANSTO의 톰 카라독 데이비스 박사와 계약을 맺고 호주 싱크로트론의 MX2 빔 라인에서 높은 점도 연구를 가능하게 하는 저비용 장치를 개발했습니다. 이 장치는 카라독 데이비스 박사와 긴밀한 협의로 개발되었습니다. 저자는 경쟁 적인 재정적 이익이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 고급 분자 이미징 (CE14010001)의 우수성호주 연구 위원회 센터에 의해 지원되었다 (ce140100011) (http://www.imagingcoe.org/). 이 연구는 ANSTO의 일부인 호주 싱크로트론의 MX2 빔라인을 사용하여 부분적으로 착수되었으며 호주 암 연구 재단 (ACRF) 검출기를 사용했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hen eggwhite lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | Used to grow crystals for testing the injector and the crystals are transferred into silicon grease. https://www.sigmaaldrich.com/ |
| High vacuum silicon grease | Dow Corning | Z273554-1EA | Used for testing of injector. https://www.sigmaaldrich.com/ |
| Injector needle (108 µm ID) | Hamilton | part No: 7803-05 | www.hamiltoncompany.com |
| Glass gas-tight syringes, 100 µl | Hamilton | part no: 7656-01 | Syringes used for sample injection. www.hamiltoncompany.com |
| LCP syringe coupler | Formulatrix | 209526 | Syringe coupler to mix the samples |
| Lipidico injector | La Trobe Univerity/ANSTO | This is a specific piece of equipment that can be accessed through La Trobe University / ANSTO Australian Synchrotron Facility |
References
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