Summary
El objetivo de este protocolo es demostrar cómo preparar muestras de cristalografía en serie para la recopilación de datos en un inyector viscoso alto, Lipidico, recientemente encargado en el sincrotrón australiano.
Abstract
Se ha desarrollado una instalación para realizar mediciones de cristalografía en serie en el sincrotrón australiano. Esta instalación incorpora un inyector de alto viscoso construido específicamente, Lipidico, como parte de la línea de haz de cristalografía macromolecular (MX2) para medir un gran número de pequeños cristales a temperatura ambiente. El objetivo de esta técnica es permitir que los cristales se cultieran/transfieran a jeringas de vidrio para ser utilizados directamente en el inyector para la recopilación de datos de cristalografía en serie. Las ventajas de este inyector incluyen la capacidad de responder rápidamente a los cambios en el caudal sin interrupción de la corriente. Existen varias limitaciones para este inyector de alta viscosidad (HVI) que incluyen una restricción a las viscosidades de muestra permitidas a >10 Pa.s. La estabilidad de la secuencia también puede ser un problema en función de las propiedades específicas del ejemplo. Aquí se presenta un protocolo detallado sobre cómo configurar muestras y utilizar el inyector para mediciones de cristalografía en serie en el sincrotrón australiano. El método demuestra la preparación de la muestra, incluyendo la transferencia de cristales de liozima a un medio viscoso alto (grasa de silicona), y el funcionamiento del inyector para la recolección de datos en MX2.
Introduction
La cristalografía en serie (SX) es una técnica que se desarrolló inicialmente en el contexto de láseres electrónicos libres de rayos X (XFELs)1,2,3,4. Aunque los enfoques de destino fijos se pueden utilizar para SX5,6,7, normalmente, los sistemas de inyectores se emplean para entregar cristales en un flujo continuo al haz de rayos X. Debido a que combina datos de un gran número de cristales, SX evita la necesidad de cualquier alineación de cristal durante el experimento, y permite recopilar datos a temperatura ambiente8,9. Con la ayuda de un inyector adecuado, los cristales se transmiten uno por uno en el área de interacción de rayos X y los datos de difracción resultantes se recogen en un detector de área9,10. Hasta la fecha, SX ha tenido éxito en la resolución de una serie de estructuras proteicas1,11,12,13 incluyendo cristales demasiado pequeños para medir utilizando cristalografía convencional. También ha proporcionado nuevos conocimientos sobre la dinámica molecular resuelta en el tiempo mediante la explotación de la duración del pulso femtosegundo de la XFEL. Al iniciar reacciones bomba-sonda con fuentes láser ópticas, se han realizado estudios en profundidad en el fotosistema II14,15,proteína amarilla fotoactiva16,17,citocromo C oxidasa18,así como bacteriorhodopsina19,20,21. Estos estudios han sondeado la dinámica de transferencia de electrones que se produce después de la activación de la luz que demuestra el potencial significativo de la cristalografía en serie para comprender los procesos biológicos resueltos por el tiempo.
El desarrollo de la cristalografía en serie también es cada vez más frecuente en las fuentes de sincrotrón9,12,20,22,23,24. SX basado en sincrotrón permite medir un gran número de cristales individuales eficientemente a temperatura ambiente utilizando un sistema de inyector adecuado. Este enfoque es adecuado para cristales más pequeños, por lo tanto, además de requerir un detector rápido de velocidad de fotogramas para recopilar los datos, también se requiere un haz microenfoque. En comparación con la cristalografía convencional, SX no implica el montaje y alineación de cristales individuales en el haz de rayos X. Debido a que los datos de un gran número de cristales individuales se fusionan, la dosis de radiación recibida por cada cristal se puede reducir sustancialmente en comparación con la cristalografía convencional. Synchrotron SX también se puede aplicar al estudio de reacciones resueltas en el tiempo, incluso hasta el régimen de milisegundos, siempre que haya un detector con una velocidad de fotogramas suficientemente alta (por ejemplo, 100 Hz o más). Se han llevado a cabo varios experimentos de cristalografía en serie en el sincrotrón utilizando inyectores que se desarrollaron inicialmente en fuentes XFEL20,22,23. Los dos tipos más comunes de inyector son la boquilla virtual dinámica de gas (GDVN)25 y el inyector viscoso alto (HVI)9,24,26,27,28. El GDVN es ideal para inyectar baja viscosidad, muestras líquidas, pero requiere altos caudales para lograr flujos estables, lo que a su vez conduce a altas tasas de consumo de muestras. Por el contrario, los HVI son adecuados para muestras de alta viscosidad que permiten la generación de una corriente estable a caudales mucho más bajos, lo que conduce a un consumo de muestra mucho menor. El inyector HVI, por lo tanto, favorece la entrega de muestras cuando un portador viscoso es preferible (por ejemplo, a base de lípidos para proteínas de membrana) y/o grandes cantidades de muestra no están disponibles. Los inyectores SX son generalmente difíciles de usar y requieren una amplia capacitación para operar. También implican largos protocolos de transferencia de muestras, ya que la muestra necesita ser cargada en un depósito especializado, esto generalmente tiene un alto riesgo asociado con que se pierda la muestra ya sea en el "volumen muerto" o a través de fugas en las conexiones. Por lo tanto, es deseable optimizar el diseño del inyector para mitigar cualquier pérdida antes de que la muestra llegue al haz de rayos X.
Recientemente, los primeros resultados de SX se publicaron usando Lipidico23 con un objetivo de lysozyme, utilizando un detector Eiger 16M. Este diseño del inyector limita el desperdicio de muestras al minimizar el número de pasos implicados en pasar de la cristalización inicial a la transferencia de cristales al inyector, seguido de la entrega de muestras al haz de rayos X. Este manuscrito describe y muestra el procedimiento de transferencia de muestras a partir de la preparación de la muestra, pasando al proceso de inyección y, finalmente, a la recopilación de datos, utilizando el mismo recipiente de cristalización. También se describe el funcionamiento del inyector.
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Protocol
1. Preparación de cristales en un medio viscoso alto utilizando jeringas de vidrio
- Centrífuga la solución de cristal suavemente (~ 1,000 x g, ~ 10 min a 22 °C) para formar un pellet de cristal suave y eliminar el exceso de búfer. Esto dará lugar a una alta concentración de cristales en el pellet que se puede utilizar para la recopilación de datos.
NOTA: Para evitar la dilución del medio viscoso aumentar la concentración de cristal en este paso. Optimice la relación entre el medio viscoso y el volumen de cristal para cada muestra para obtener una alta concentración de cristales manteniendo una alta viscosidad para los medios. Centrífuga la solución de cristal para formar un pellet y eliminar el exceso de amortiguador para aumentar la concentración de cristal en la solución, como se describe en Darmanin et. 29. - Configure dos jeringas de 100 μL con un acoplador.
- Fije el acoplador hasta el final de la primera jeringa y agregue 28 μL de solución de cristal a la parte superior de la jeringa. Lentamente, inserte el émbolo en la parte superior de la jeringa y empuje suavemente la solución hasta el final de la punta del acoplador, eliminando las burbujas de aire que se formen. Para ello, siga uno de los dos métodos que se describen a continuación.
NOTA: El volumen de cristales que se añadirán al soporte viscoso alto puede variar si no cambia significativamente la viscosidad de la muestra general.- Primer método: Utilice cambios rápidos de presión para reventar las burbujas de aire.
- Coloque cuidadosamente un dedo con guantes en la parte superior del punto de aguja del acoplador contundente y (muy suavemente) aplique presión para crear un sello. No aplique demasiada presión, ya que esto puede resultar en una lesión en el palo de la aguja.
- Ahora tire del émbolo hacia atrás para alejar la solución del punto de la aguja, esto generará una acumulación de presión en la jeringa.
- Suelte rápidamente la presión en la parte superior de la jeringa quitando el dedo enguantado de la punta de la aguja contundente. Tenga cuidado, si la muestra está demasiado cerca de la punta cuando se retira el dedo puede rociar resultando en la pérdida de la muestra. El rápido cambio de presión dentro de la jeringa reventará las burbujas de aire. Repita hasta que se hayan eliminado todas las burbujas.
- Segundo método: Usar la "centrífuga humana" para eliminar las burbujas de aire.
- Coloque la jeringa en una mano con la aguja hacia arriba y el émbolo encajado entre dos dedos, para que no pueda moverse.
- Gire rápidamente el brazo sosteniendo la jeringa en una dirección 2–3 veces, la fuerza centrífuga resultante en la muestra forzará cualquier burbuja de aire fuera de la jeringa. Tenga cuidado, si se hace demasiado lentamente la muestra se puede perder.
- Inspeccione la jeringa en busca de burbujas de aire, si las burbujas permanecen, repita los pasos 1.3.2.1 – 1.3.2.2 hasta que se eliminen todas las burbujas de aire.
- Primer método: Utilice cambios rápidos de presión para reventar las burbujas de aire.
- Usando una espátula fina, agregue ~42 μL de grasa de silicona de alto vacío directamente a la parte superior de la segunda jeringa. Empuje el émbolo hasta el final, eliminando todas las burbujas de aire y asegurándose de que no haya brecha de aire en el extremo de la jeringa.
NOTA: La composición precisa de la grasa de silicona no es crítica, ya que actúa como un portador inerte. Un valor de viscosidad de >10 Pa.s o relación de aproximadamente 60:40 grasa de silicona a solución cristalina es óptimo para la inyección, sin embargo, es posible que esto pueda variar dependiendo de las características exactas de la muestra. Ajuste el volumen de solución de cristal añadido a la grasa de silicona para optimizar la concentración de cristal en la mezcla, como se describe en la discusión. Los medios altamente viscosos distintos de la grasa de silicona se pueden utilizar siempre y cuando sean compatibles con la muestra30,31,32,33. - Asegúrese de que no haya burbujas de aire en ninguna de las dos jeringas y unir las jeringas usando el acoplador. Sostenga las jeringas verticalmente agarrando sólo el extremo de la jeringa, ya que calentar la jeringa debido al calor generado por los dedos puede afectar a la muestra.
- Mezcle la muestra deprimiendo suavemente el émbolo en el lado de la solución de cristal para que se mezcle en la grasa de silicona y luego empuje el émbolo en el lado de la grasa de silicona, de modo que empuje la muestra hacia el lado de la solución de cristal. Suavemente, repita este proceso de 50 a 100 veces para que la muestra se mezcle a fondo y se vea homogénea.
NOTA: Si los cristales se cultivan directamente en medios altamente viscosos (por ejemplo, fase cúbica lipídica, LCP), no se requieren pasos 1.1–1.6. Los protocolos para el cultivo de cristales dentro de las jeringas se pueden encontrar en Liu et.al. 34,35. Siga este protocolo hasta la consolidación de muestras, paso 10, donde toda la muestra está ahora contenida en una jeringa y se elimina el búfer de cristalización. La adición de 7.9MAG no es necesaria para este protocolo. En su lugar, retire todo el exceso de líquido de la jeringa empujando suavemente el émbolo hacia abajo en la muestra hasta que no quede más líquido en la jeringa. - Visualice los cristales bajo un microscopio óptico a través de la jeringa o, para obtener mejores resultados, extraiga una pequeña cantidad (~1 μL) en una diapositiva de vidrio y coloque un resbalón de cubierta en la parte superior.
- Compruebe la concentración de cristal.
- Determine la concentración de cristal en la grasa de silicona contando el número de cristales en un área específica utilizando las imágenes ópticas del microscopio. Para obtener mejores resultados, una alta densidad de cristales dispensados uniformemente en todo el medio es ideal (>106 cristales/ml) con el fin de obtener una alta tasa de golpe de cristal.
- Ajuste la concentración de cristal en la jeringa cambiando la relación de cristales a medios viscosos en los pasos 1.3 y 1.4.
- Para disminuir la concentración de cristal, diluya los cristales de la jeringa aumentando la cantidad de grasa de silicona/soporte HV en el paso 1.4 o diluyendo el pellet de cristal en solución con el búfer de cristalización antes de configurar las jeringas en el paso 1.1.
- Para aumentar la concentración de cristal, disminuya la cantidad de grasa de silicona en el paso 1.4, pero tenga en cuenta no reducir la viscosidad por debajo de 10 Pa.s.
NOTA: La concentración de cristal reportada aquí fue optimizada para esta muestra específica y tamaño de cristal. Sin embargo, la concentración de cristal ideal dependerá del tamaño del cristal, el tamaño del haz, el diámetro interno de la aguja (I.D.) y el flujo de rayos X incidente. Esto se puede determinar a partir de la tasa de golpe con una tasa de golpe óptima de ~ 30% considerado como 'bueno'. En la práctica, la concentración de cristal debe optimizarse para diferentes muestras durante el tiempo de haz para obtener la velocidad de golpe deseada. Comienza con una alta concentración de cristales, 109 cristales/ml. El procedimiento para ajustar la concentración de cristal se administra en Liu et.al. 35.
- El protocolo se puede pausar aquí hasta que el inyector esté listo para la recopilación de datos.
- Si los cristales se cultivan en LCP, entonces escindelos y déjelos permanecer en jeringas hasta por unos días a temperatura ambiente.
- Si los cristales se han transferido a un medio viscoso alto diferente (por ejemplo, grasa de silicona), se debe realizar una prueba de estabilidad de los cristales a lo largo del tiempo antes de la medición. Esto determinará cuánto tiempo los cristales son estables en el medio inerte (idealmente > 8 h) y el límite de tiempo para la recopilación de datos. Aquí, los cristales de lysozyme estuvieron estables durante días en grasa de silicona y no mostraron signos de disolución cuando se inspeccionaron con un microscopio óptico.
- Mueva toda la muestra a una jeringa antes de desconectar el acoplador. Desconecte el acoplador de la jeringa y coloque la aguja de inyección. Atornille firmemente la aguja en la base de la jeringa y asegúrese de que esté fijada firmemente para evitar fugas. Para este experimento se utilizó una aguja de identificación de 108 μm (longitud de la aguja 13 mm, estilo punto 3). Dependiendo del tamaño del cristal y del tamaño del haz, coloque una aguja de identificación de 51 μm o 108 μm.
NOTA: Se requiere una prueba previa de la secuencia de muestras antes del tiempo de haz para poder seleccionar el tamaño correcto de la aguja del inyector. Dependiendo de las características de la muestra (es decir, viscosidad, carga, composición del búfer) y la identificación de la aguja, las muestras fluirán de manera diferente. Por lo tanto, se recomienda probar una variedad de tamaños de aguja para producir el flujo más estable con la aguja de identificación más pequeña posible para maximizar la relación señal-ruido durante la recopilación de datos. - Si el inyector ya está montado y alineado en la línea de haz, muévase a la sección 3 y monte la jeringa de muestra directamente en el inyector.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.
2. Montaje y control del inyector
- Monte el inyector en la línea de haz. Retire la boquilla criogénica en la línea de haz MX2 y la reemplazó con el inyector. Afloje el tornillo de sujeción que sostiene la boquilla criogénica y colóquela en el soporte situado junto a la etapa motorizada.
- Levante el inyector de su carro sosteniendo la manija negra y colóquela en el escenario motorizado.
- Para sujetar el inyector a la etapa motorizada; apretar a mano la perilla del tornillo de sujeción negro.
- Monte una jeringa vacía en el inyector
- En la interfaz de control del ordenador del inyector (es decir, software de control de posición EPOS), seleccione Modo de homing en Herramientas en el menú de software. A continuación, seleccione Interruptor de límite negativo y Inicie Homing, deje que el software funcione hasta que el tornillo se retraiga lo suficiente como para que la jeringa encaje debajo del tornillo. Si se deja ejecutar sin supervisión, el interruptor de límite detiene el tornillo automáticamente.
- Monte una jeringa vacía ('maniquí') en el inyector insertando la aguja a través de la hendidura en el soporte de la jeringa. Alinee la jeringa contra el soporte.
- Abrocha la jeringa con dos O-anillos.
- Envuelva el primer anillo O a través de la sección media de la jeringa que lo une a los ganchos a ambos lados de la jeringa.
- Enrosque el segundo anillo O alrededor de los ganchos en la sección superior de la jeringa y luego coloque una parte del anillo O en la parte superior de la jeringa de vidrio como se muestra en la demostración y la Figura 1B.
- Alinee el inyector con el haz de rayos X
- Mueva la etapa motorizada con el inyector hacia el punto de interacción de rayos X a través del software de control de la línea de haz. Esto se puede visualizar utilizando la cámara en línea. El tamaño y la posición de la viga son denotados por una cruz roja en la pantalla y la etapa motorizada se puede mover para alinear la aguja con la región de interacción de rayos X.
- Ajuste la posición x e y del escenario para alinear la aguja con la cruz roja.
- Ajuste la posición z hasta que la punta de la aguja entre en el foco.
- Verifique la alineación de la punta de la aguja y el haz de rayos X visualmente comprobando que la punta de la jeringa se encuentra con el punto de mira que son visibles en la imagen del microscopio óptico generada por la cámara de línea de haz.
- Una vez alineada la punta de la aguja, mueva la punta por encima de los pelos cruzados ~100 μm. Esto elimina la dispersión de rayos X de la punta de la aguja.
NOTA: El montaje y alineación del inyector en la línea de haz MX2 en el sincrotrón debe ser llevado a cabo por los científicos de la línea de haz y se puede completar en menos de 30 minutos.
3. Montaje de la jeringa de muestra
- Reemplace la jeringa vacía por la jeringa de muestra siguiendo el paso 2.3.
- Coloque la tapa del inyector en la cabeza del émbolo de la jeringa de muestra.
- Mueva el tornillo de accionamiento a la parte superior de la tapa.
- En el software de control del inyector, seleccione Modo velocidad.
- Entrada 3000 rpm (~115 nL/s) como valor de ajuste y pulse Aplicar valor de ajuste.
- Cuando el tornillo de accionamiento toque la tapa de la cabeza del émbolo de la jeringa, detenga el motor.
- Ajuste el valor de rpm a cero en el software de control del inyector cambiando el Valor de ajuste a '0' a medida que el tornillo se acerca a la tapa.
- Una vez realizado el contacto, active el valor preestablecido pulsando Aplicar valor de ajuste para detener el tornillo al instante.
- Mueva suavemente la tapa para asegurarse de que está firmemente sujetada en su lugar.
NOTA: Cada vez que se introduce un nuevo valor establecido en el cuadro Valor de configuración del software de control, solo se activa después de pulsar Aplicar valor de ajuste.
4. Ejecutar el inyector
- Después de que el tornillo de la unidad de tapa ha hecho contacto firme con la parte superior del émbolo cambiar el valor de ajuste rpm a 100. Esto equivale a ~ 4 nL/s.
- Inspeccione visualmente la punta de la aguja cuando la muestra salga por primera vez o mire la imagen de la cámara de la aguja para observar cuándo la muestra comienza a extruirse de la punta de la aguja.
- Realice una búsqueda de la choza, cierre la puerta de la choza y encienda la viga de rayos X. A partir de este punto el inyector debe ser operado remotamente desde fuera de la cabaña.
- Ajuste las rpm hasta que se genere una secuencia estable.
- Disminuya el valor de ajuste de rpm a 90.
- Repita el paso 4.4.1, disminuyendo el valor de ajuste de rpm en incrementos de 10, para ralentizar la secuencia, pero aún así mantener una secuencia estable. Para la grasa de silicona se utilizó un valor de 30 rpm.
NOTA: El rango de rpm típico varía entre 30 – 100 rpm (1 – 4 nL/s) dependiendo de las características de la muestra y el tiempo de exposición a rayos X. En general, las rpm deben ajustarse para producir el caudal más lento (para minimizar el consumo de la muestra) manteniendo al mismo tiempo una corriente estable.
- Administrar una secuencia de ejemplo que no fluya bien.
- Siga aumentando el valor de ajuste de rpm en incrementos de 10 hasta que la secuencia se vuelva más recta. Si la secuencia no se estabiliza, incluso después de aumentar el valor de ajuste de rpm al valor máximo de 100 rpm intente mejorar la estabilidad mediante la implementación de uno de los dos métodos descritos a continuación.
- Primer método: Inserte un captador de muestras de poliestireno debajo de la secuencia de muestras para ayudar a guiar la muestra. Este método funciona bien para secuencias de ejemplo altamente cargadas.
- Segundo método: Inserte un embudo de succión venturi en el captador de muestras. Para suministrar aire al embudo, conéctelo al tubo de salida de aire situado en la choza. Este método puede ayudar a dirigir y estabilizar el flujo de muestra independientemente de la carga de la corriente.
- Siga aumentando el valor de ajuste de rpm en incrementos de 10 hasta que la secuencia se vuelva más recta. Si la secuencia no se estabiliza, incluso después de aumentar el valor de ajuste de rpm al valor máximo de 100 rpm intente mejorar la estabilidad mediante la implementación de uno de los dos métodos descritos a continuación.
- Una vez que se logra un flujo constante y constante, inicie la recopilación de datos y optimice la distancia del detector según un experimento de cristalografía de rayos X normal.
NOTA: Las rpm se convierten en caudal utilizando la tabla de conversión suministrada en la información suplementaria, 'Calculadora de dispositivos Lipidico'. Introduzca el valor de rpm, los diámetros de las agujas y los volúmenes de jeringas para calcular el caudal utilizando esta calculadora.
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Representative Results
Lipidico es un HVI construido como un sistema de entrega alternativo para su uso en MX2 (Figura 1). Es ideal para SX, donde los cristales se cultivan en fase cúbica lipídica o se transfieren a un medio inerte viscoso alto.
Para demostrar la aplicación del inyector, la grasa de silicona mezclada con cristales de liozima se utilizó para recopilar datos SX en la línea de haz MX2 en el sincrotrón australiano. Para montar el inyector en la línea de haz MX2, la boquilla criogénica se elimina y reemplaza por el inyector como se muestra en la Figura 1. Las muestras de jeringa se montan directamente en el inyector y se fijan con O-rings (Figura 1B). La recopilación de datos se puede iniciar en cuestión de minutos después de un cambio de ejemplo. El inyector está diseñado para el control rápido de muestras con una configuración simple que es fácil de operar para los usuarios que no están familiarizados con SX.
Figura 1: Imágenes de Lipidico, un inyector viscoso utilizado en el sincrotrón australiano para experimentos SX. (A) Muestra una foto de Lipidico incorporada a MX2. La flecha roja indica la dirección del haz de rayos X. (B) Una vista más cercana de la región del portamuestras en Lipidico. La jeringa se mantiene en su lugar por dos O-anillos y la muestra se recoge en el receptor. (D) Una vista de cerca del flujo de muestra que muestra la aguja del inyector y el receptor de residuos de muestra que se puede modificar para incorporar un receptor de succión de poliestireno/venturi visto debajo de la aguja en (A). La figura ha sido adaptada de Berntsen et. al. 201923 con el permiso de AIP Publishing. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
El inyector es compatible con varios tipos de portadores altamente viscosos. La velocidad de funcionamiento óptima de la muestra para el inyector es crucial para la estabilidad de la corriente, demasiado lenta causará un efecto de curling / expansión de flujo y demasiado rápido dará lugar a la ruptura de la corriente. La velocidad óptima variará dependiendo del sistema portador utilizado. La Figura 2 y la Figura 3 muestran la grasa de silicona probada a diferentes velocidades del inyector y demuestra cómo el comportamiento de la corriente puede variar. Un caudal lento(Figura 2A, 2.3 nL/s) resulta en la expansión de la grasa de silicona extruida del inyector, mientras que un caudal más rápido(Figura 2C,6.6 nL/s) produce una corriente más delgada. Se ha observado regularmente el rizado de la corriente de medios viscosos(Figura 3A). Para superar este problema se probaron dos soluciones innovadoras: un receptor de poliestireno y un embudo de succión venturi debajo de la aguja. El receptor de poliestireno introduce una fuerza electrostática débil y funciona mejor en muestras altamente cargadas, como en el caso de la grasa de silicona(Figura 3B),mientras que el embudo de succión venturi ayuda a guiar la corriente verticalmente hacia abajo hacia el receptor, independientemente de la carga de la muestra. Dependiendo de las características de la muestra, cualquiera de las dos opciones se puede utilizar correctamente.
Figura 2: El efecto de una corriente portadora de alto viscoso utilizando diferentes velocidades de inyector. La grasa 100% silicona se probó en diferentes velocidades de muestra para evaluar sus características de flujo. (A) . 2,3 nL/s (30 rpm), (B) 3,5 nl/s (90 rpm) y (C) 6,6 n/s (170 rpm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Comportamiento del flujo de grasa 100% silicona que demuestra el rizado del medio viscoso. (A) Efecto de curling a 2,3 nl/s (30 rpm) (B) El efecto de añadir el receptor de poliestireno al soporte de residuos de muestra con la velocidad del inyector funcionando a 2,3 nL/s (30 rpm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Se utilizó una jeringa de vidrio que contenía 26 μL de cristales de lisozyme (tamaño cristalino 10 μm x 10 μm x 20 μm) suspendidos en grasa de silicona (Figura 4A). Lipidico generó un flujo de muestra constante, utilizando la aguja I.D., de 108 μm, con un caudal promedio de 1,14 nL/s (con el motor ajustado en 30 rpm). Se utilizó un algoritmo de búsqueda depicos 36 para evaluar la tasa de impacto y se recopiló una cantidad suficiente de datos (total de 224.200 imágenes) en un plazo de 38 minutos desde el tiempo de recopilación de datos, lo que permitió la recuperación de la estructura (código PDB 6MQV). La Tabla 1 proporciona un resumen de las estadísticas de recopilación de datos y la Figura 4B muestra una imagen representativa del mapa de densidad de electrones que rodea uno de los enlaces de di-sulfuro en la estructura de lysozyme20.
Figura 4: Imágenes de Lysozyme. (A) Imágenes ópticas de los cristales de liozima en grasa de silicona. Una imagen polarizada cruzada (aumento de 40x) de cristales de lisozyme mezclados con un medio viscoso alto, grasa de silicona, imagenda con un microscopio de luz visible. El tamaño de los cristales oscila entre 15 y 20 μm y (B) Una imagen representativa del mapa de densidad de electrones (2Fo-Fc, 1σ) que rodea los enlaces de disulfuro de la lisozyme. La figura ha sido adaptada de Berntsen et. al. 201923 con el permiso de AIP Publishing. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Información complementaria. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Tabla 1: Tabla de resumen que muestra las estadísticas de datos SX de Lipidico. Los cristales de lysozyme se mezclaron con un medio viscoso alto, grasa de silicona y se transmitieron a través de la región de interacción de rayos X de la línea de haz MX2. Este es un resumen de la tabla completa de resultados publicado en Berntsen et. 23. La tabla se adapta aquí con el permiso de AIP Publishing.
| Estadísticas de datos | Lipidico, línea de haz MX2 |
| detector | Dectris EIGER X 16M, |
| velocidad de fotogramas | 100Hz |
| Distancia del detector de muestras (mm) | 300 |
| Energía de rayos X (KeV) | 13 |
| Tamaño del haz (WxH) (μm) | 32:22 |
| lol de marcos | 224200 |
| Tasa de golpe (%) | 2.95 |
| lol de marcos indexados | 4852 |
| Resolución (Å) | 17.74-1.83 |
| integridad | 99.44 |
| Grupo espacial | P43212 |
| Célula de la unidad | |
| a, b, c (Å) | 78.68, 78.68, 34.48 |
| α, β, γ (°) | 90, 90, 90 |
| I/σ(I) | 5.08 |
| redundancia | 73.97 |
| CC1/2 | 0.96 |
| Rtrabajo/Rlibre | 0.18/0.26 |
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Discussion
Se ha desarrollado un HVI alternativo, ideal para llevar a cabo experimentos SX en fuentes sincrotrón. Tiene dos ventajas clave sobre los HVIs existentes. En primer lugar, es fácil de instalar en la línea de haz que permite el cambio rápido entre la cristalografía convencional y SX, sólo ~ 30 minutos es necesario para la instalación y alineación en MX2. En segundo lugar, las jeringas de muestra utilizadas para cultivar cristales se pueden utilizar directamente como reservorios para inyección, lo que limita el desperdicio durante la transferencia de muestras. Se ha descrito y demostrado el protocolo para cambiar muestras. El diseño elimina la necesidad de una complicada corriente de gas para controlar el chorro en comparación con otros HVIs. Se demostró un proceso simple para cambiar el caudal del inyector que se puede ajustar sin una respuesta retardada.
Los pasos más cruciales para la recopilación exitosa de datos SX son optimizar la concentración de cristal, obtener una mezcla homogénea de medios viscosos altos y producir una secuencia estable para la recopilación de datos. La óptima concentración de cristal y homogeneidad se puede lograr centrifugando los cristales hasta un pellet y añadiendo una mayor concentración de cristales a los medios portadores, asegurando que la muestra se mezcle a fondo en el sistema de acoplador. Una vez optimizada la concentración de cristal, el caudal del inyector se puede ajustar fácilmente durante el tiempo de haz para obtener una corriente estable. El rizado de la corriente viscosa se observa comúnmente con muestras de alto viscoso. Se presentan dos soluciones: el uso de un captador de muestras de poliestireno para muestras cargadas o la adición de un embudo de succión venturi que actúa como receptor. Esto ha sido exitoso en el control de la corriente en las pruebas iniciales, pero bajo diferentes condiciones de muestra el rizado de la corriente puede resultar en la pegada de la muestra al punto de la aguja. Es posible que esto se pueda superar cambiando las propiedades de carga superficial de la aguja mediante la adición de recubrimientos especiales. Las agujas recubiertas con diferentes productos químicos (es decir, silicona) han sido previamente adaptadas con éxito para su uso con robots de manipulación de líquidos y se pueden pedir a medida de las manufacturas para adaptarse a la jeringa37.
El inyector no se limita a la grasa de silicona y se puede utilizar con otros líquidos altamente viscosos. Se han demostrado varias alternativas diferentes23 que se pueden utilizar con éxito para la inyección de cristal y se describen en un número de otras publicaciones22,30,33. El límite superior de viscosidad de la muestra con este HVI todavía está bajo investigación, sin embargo, las viscosidades de la muestra de hasta 25 Pa.s (usando grasa 100% silicona) han dado lugar a una corriente estable. Sin embargo, cuando la viscosidad de la muestra se redujo a <10 Pa.s (usando una muestra de grasa de silicona al 70 %)) no se pudo producir una corriente fiable. Por lo tanto, 10 Pa.s representa el límite inferior actual en la viscosidad de la muestra para la inyección utilizando este HVI. La identificación de la aguja también es una consideración importante. Aunque 51 μm de identificación se probó con éxito mientras se inyectaban varios portadores sin cristales, la introducción de cristales altera el flujo de la muestra. Por lo tanto, dependiendo de su tamaño, con cristales introducidos en la matriz, hay una probabilidad mucho mayor de bloqueo cuando se utiliza la aguja de identificación de 51 μm en comparación con el tamaño de la aguja más grande. Cuando se produce una obstrucción puede producirse una acumulación crítica de presión, en otros inyectores esto podría provocar una rotura de la jeringa. Sin embargo, el diseño de este HVI incluye un mecanismo de seguridad donde la mecánica de accionamiento se alejará del émbolo de la jeringa si la presión se vuelve demasiado alta hasta que se habilita un interruptor de desactivación. Esto hace que la unidad se detenga y evita que la jeringa de vidrio se rompa.
Existen varias limitaciones para este inyector. El inyector está diseñado específicamente para muestras altamente viscosas, por lo tanto, muestras líquidas similares no se pueden utilizar directamente para la entrega de muestras. Para superar esta limitación, los cristales cultivados en sistemas de amortiguación se pueden mezclar con un medio inerte adecuado como se describe en el paso 1, sin embargo, existe la posibilidad de que el cristal se vuelva inestable. Por lo tanto, primero debe investigarse la detección de una variedad de medios inertes26,27,28,29 para garantizar el mantenimiento de la estabilidad de la muestra. En segundo lugar, el tamaño del cristal y la calidad del embalaje de cristal afectarán a la calidad de la difracción. La línea de haz MX2 funciona a un tamaño óptimo de haz de 22 x 12 μm (H x W) y flujo ~ 1012 fotón/s. El tamaño óptimo del cristal para llevar a cabo SX en MX2 es ~10 μm y se ha demostrado que produce una alta relación señal-ruido. Sin embargo, es posible recopilar datos sobre cristales de menor tamaño si están bien ordenados y difractos a alta resolución. Hay una opción para reducir el tamaño de la viga en esta línea de haz a ~ 7.5 μm, sin embargo, esto tiene un costo ya que reduce el flujo de incidentes que debe ser considerado durante el experimento.
El desarrollo de este inyector hace que SX sea fácilmente accesible para los cristalógrafos convencionales. El exitoso funcionamiento de Lipidico, abre la puerta a un método rápido y fácil para la recopilación de datos SX en una amplia variedad de fuentes sincrotrón. Permite la recopilación de datos de temperatura ambiente en cristales de 10 μm o menos en MX2, limitando los efectos de daño por radiación para cristales individuales. También ofrece una nueva oportunidad en Australia para llevar a cabo milisegundos de tiempo resuelto SX que es el estado actual de la técnica para los cristalógrafos. Las aplicaciones futuras de este sistema de inyector se extienden a la caracterización de rayos X de materiales altamente viscosos utilizando dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS) que permite que el inyector se adapte fácilmente a otras líneas de haz en el Sincrotrón australiano.
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Disclosures
MK trabaja para diseños de Kusel. Kusel Design, un desarrollador de dispositivos de laboratorio personalizado, fue contratado por el Dr. Peter Bentsen de la Universidad La Trobe y el Dr. Tom Caradoc-Davies de ANSTO y para desarrollar un dispositivo de bajo costo para permitir estudios de alto viscoso en la línea de haz MX2 en el Sincrotrón Australiano. El dispositivo fue desarrollado en estrecha consulta con el Dr. Caradoc-Davies. Los autores no tienen intereses financieros competidores.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Centro de Excelencia en Imágenes Moleculares Avanzadas (CE140100011) del Consejo Australiano de Investigación (http://www.imagingcoe.org/). Esta investigación se llevó a cabo en parte utilizando la línea de haz MX2 en el Sincrotrón Australiano, parte de ANSTO, y hizo uso del detector de la Fundación Australiana de Investigación del Cáncer (ACRF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hen eggwhite lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | Used to grow crystals for testing the injector and the crystals are transferred into silicon grease. https://www.sigmaaldrich.com/ |
| High vacuum silicon grease | Dow Corning | Z273554-1EA | Used for testing of injector. https://www.sigmaaldrich.com/ |
| Injector needle (108 µm ID) | Hamilton | part No: 7803-05 | www.hamiltoncompany.com |
| Glass gas-tight syringes, 100 µl | Hamilton | part no: 7656-01 | Syringes used for sample injection. www.hamiltoncompany.com |
| LCP syringe coupler | Formulatrix | 209526 | Syringe coupler to mix the samples |
| Lipidico injector | La Trobe Univerity/ANSTO | This is a specific piece of equipment that can be accessed through La Trobe University / ANSTO Australian Synchrotron Facility |
References
- Boutet, S., et al. High-resolution protein structure determination by serial femtosecond crystallography. Science. 337 (6092), 362-364 (2012).
- Spence, J. C. H., Weierstall, U., Chapman, H. N. X-ray lasers for structural and dynamic biology. Reports on Progress in Physics. 75 (10), 102601 (2012).
- Aquila, A., et al. Time-resolved protein nanocrystallography using an X-ray free-electron laser. Optics Express. 20 (3), 2706-2716 (2012).
- Schlichting, I. Serial femtosecond crystallography: the first five years. International Union of Crystallography. 2, 246-255 (2015).
- Lee, D., et al. Nylon mesh-based sample holder for fixed-target serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 9, 6971 (2019).
- Martin, A. V., et al. Fluctuation X-ray diffraction reveals three-dimensional nanostructure and disorder in self-assembled lipid phases. Communications Materials. 1 (1), 1-8 (2020).
- Roedig, P., et al. High-speed fixed-target serial virus crystallography. Nature Methods. 14 (8), 805 (2017).
- Chapman, H. N., et al.
- Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nature Communications. 5, 3309 (2014).
- Weierstall, U. Liquid sample delivery techniques for serial femtosecond crystallography. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 369 (1647), 20130337 (2014).
- Gati, C., et al. Atomic structure of granulin determined from native nanocrystalline granulovirus using an X-ray free-electron laser. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2247-2252 (2017).
- Nam, K. H. Sample delivery media for serial crystallography. International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1094 (2019).
- Batyuk, A., et al. Native phasing of x-ray free-electron laser data for a G protein-coupled receptor. Science Advances. 2 (9), 1600292 (2016).
- Kern, J., et al. Structures of the intermediates of Kok's photosynthetic water oxidation clock. Nature. 563 (7731), 421 (2018).
- Suga, M., et al. An oxyl/oxo mechanism for oxygen-oxygen coupling in PSII revealed by an x-ray free-electron laser. Science. 366 (6463), 334-338 (2019).
- Tenboer, J., et al. Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein. Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).
- Pande, K., et al. Femtosecond structural dynamics drives the trans/cis isomerization in photoactive yellow protein. Science. 352 (6286), 725-729 (2016).
- Ishigami, I., et al. Snapshot of an oxygen intermediate in the catalytic reaction of cytochrome c oxidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3572-3577 (2019).
- Nango, E., et al. A three-dimensional movie of structural changes in bacteriorhodopsin. Science. 354 (6319), 1552-1557 (2016).
- Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation. International Union of Crystallography. 2, 168-176 (2015).
- Nogly, P., et al. Retinal isomerization in bacteriorhodopsin captured by a femtosecond x-ray laser. Science. 361 (6398), (2018).
- Martin-Garcia, J. M., et al. Serial millisecond crystallography of membrane and soluble protein microcrystals using synchrotron radiation. International Union of Crystallography. 4, 439-454 (2017).
- Berntsen, P., et al. The serial millisecond crystallography instrument at the Australian Synchrotron incorporating the "Lipidico" injector. Review of Scientific Instruments. 90 (8), 085110 (2019).
- Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallographica Section D-Structural Biology. 71, 387-397 (2015).
- DePonte, D. P., Nass, K., Stellato, F., Liang, M., Chapman, H. N. Sample injection for pulsed X-ray sources. Advances in X-Ray Free-Electron Lasers: Radiation Schemes, X-Ray Optics, and Instrumentation: Proceedings of Society of Photo-Optical Instrumentation Engineers. Tschentscher, T., Cocco, D. , Prague, Czech Republic. 8078 (2011).
- Park, S. Y., Nam, K. H. Sample delivery using viscous media, a syringe andasyringe pump for serial crystallography. Journal of Synchrotron Radiation. 26, 1815-1819 (2019).
- Shimazu, Y., et al. High-viscosity sample-injection device for serial femtosecond crystallography at atmospheric pressure. Journal of Applied Crystallography. 52, 1280-1288 (2019).
- Kovacsova, G., et al. Viscous hydrophilic injection matrices for serial crystallography. International Union of Crystallography. 4, 400-410 (2017).
- Darmanin, C., et al. Protein crystal screening and characterization for serial femtosecond nanocrystallography. Scientific Reports. 6, 25345 (2016).
- Conrad, C. E., et al. A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography. International Union of Crystallography. 2, 421-430 (2015).
- Sugahara, M., et al. Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography. Nature Methods. 12 (1), 61-63 (2015).
- Sugahara, M., et al. Oil-free hyaluronic acid matrix for serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 6, 24484 (2016).
- Fromme, R., et al. Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase. International Union of Crystallography. 2, 545-551 (2015).
- Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography. Journal of Visualized Experiments. (115), e54463 (2016).
- Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography. Nature Protocols. 9 (9), 2123-2134 (2014).
- Hadian-Jazi, M., et al. A peak-finding algorithm based on robust statistical analysis in serial crystallography. Journal of Applied Crystallography. 50, 1705-1715 (2017).
- Kong, F. W., Yuan, L., Zheng, Y. F., Chen, W. D. Automatic Liquid Handling for Life Science: A critical review of the current state of the art. Journal of Laboratory Automation. 17 (3), 169-185 (2012).
