Summary
O objetivo deste protocolo é demonstrar como preparar amostras de cristalografia serial para coleta de dados em um injetor viscoso alto, Lipidico, recentemente encomendado no síncrotron australiano.
Abstract
Uma instalação para a realização de medições de cristalografia serial foi desenvolvida no síncrotron australiano. Esta instalação incorpora um injetor viscoso de alto efeito construído, Lipidico, como parte da linha de cristalografia macromolecular (MX2) para medir um grande número de pequenos cristais à temperatura ambiente. O objetivo desta técnica é permitir que cristais sejam cultivados/transferidos para seringas de vidro para serem usados diretamente no injetor para coleta de dados de cristalografia serial. As vantagens deste injetor incluem a capacidade de responder rapidamente às mudanças na taxa de fluxo sem interrupção do fluxo. Existem várias limitações para este injetor de alta viscosidade (HVI) que incluem uma restrição sobre as viscosidades amostrais permitidas para >10 Pa.s. A estabilidade do fluxo também pode ser um problema potencialmente dependendo das propriedades específicas da amostra. Um protocolo detalhado de como configurar amostras e operar o injetor para medições de cristalografia serial no síncrotron australiano é apresentado aqui. O método demonstra a preparação da amostra, incluindo a transferência de cristais de lise em uma alta mídia viscosa (graxa de silicone), e o funcionamento do injetor para coleta de dados em MX2.
Introduction
A cristalografia serial (SX) é uma técnica que foi desenvolvida inicialmente no contexto de Lasers eletrônicos livres de raios-X (XFELs)1,2,3,4. Embora abordagens de alvo fixas possam ser usadas para SX5,6,7, normalmente, sistemas injetores são empregados para fornecer cristais em um fluxo contínuo para o feixe de raios-X. Por combinar dados de um grande número de cristais, o SX evita a necessidade de qualquer alinhamento de cristal durante o experimento, e permite que os dados sejam coletados à temperatura ambiente8,9. Com o auxílio de um injetor adequado, os cristais são transmitidos um a um na área de interação com raios-X e os dados de difração resultantes são coletados em um detector de área9,10. Até o momento, a SX foi bem sucedida na resolução de uma série de estruturas proteicas1,11,12,13 incluindocristais muito pequenos para medir usando a cristalografia convencional. Ele também forneceu novas percepções sobre a dinâmica molecular resolvida pelo tempo explorando a duração do pulso femtosegundo do XFEL. Iniciando reações de bomba-sonda com fontes ópticas de laser, estudos aprofundados foram realizados no fotossistema II14,15, proteína amarela fotoativa16,17, citocromo C oxidase18, bem como bacteriorhodopsin19,20,21. Esses estudos sondaram a dinâmica de transferência de elétrons que ocorrem após a ativação da luz demonstrando o potencial significativo da cristalografia serial para a compreensão de processos biológicos resolvidos pelo tempo.
O desenvolvimento da cristalografia serial também está se tornando cada vez mais prevalente nas fontes síncrotrons9,12,20,22,23,24. O SX baseado em síncrotron permite que um grande número de cristais individuais seja medido eficientemente à temperatura ambiente usando um sistema injetor apropriado. Essa abordagem é adequada para cristais menores, portanto, além de exigir um detector rápido de taxa de quadros para coletar os dados, um feixe micro-focado também é necessário. Em comparação com a cristalografia convencional, o SX não envolve a montagem e alinhamento de cristais individuais no feixe de raios-X. Como os dados de um grande número de cristais individuais são mesclados, a dose de radiação recebida por cada cristal pode ser substancialmente reduzida em comparação com a cristalografia convencional. O SX síncrotron também pode ser aplicado ao estudo de reações resolvidas pelo tempo, mesmo até o regime de milissegundos, desde que um detector com uma taxa de quadro suficientemente alta esteja disponível (por exemplo, 100 Hz ou mais). Vários experimentos de cristalografia serial foram realizados no síncrotron usando injetores que foram inicialmente desenvolvidos nas fontes XFEL20,22,23. Os dois tipos mais comuns de injetor são o Bocal Virtual Gas Dynamic (GDVN)25 e o Injetor Viscoso Alto (HVI)9,24,26,27,28. O GDVN é ideal para injetar baixa viscosidade, amostras líquidas, mas requer altas taxas de fluxo para alcançar fluxos estáveis, o que por sua vez leva a altas taxas de consumo amostral. Em contrapartida, os HVI's são adequados para amostras de alta viscosidade que permitem a geração de um fluxo estável a taxas de fluxo muito mais baixas, levando a um consumo amostral muito menor. O injetor HVI, portanto, favorece a entrega de amostras onde um portador viscoso é preferível (por exemplo, à base de lipídios para proteínas de membrana) e/ou grandes quantidades de amostra não estão disponíveis. Os injetores SX são geralmente desafiadores de usar e requerem treinamento extensivo para operar. Eles também envolvem protocolos longos de transferência de amostras, uma vez que a amostra precisa ser carregada em um reservatório especializado, isso geralmente tem um alto risco associado a ela de a amostra ser perdida no 'volume morto' ou através de vazamentos nas conexões. Portanto, é desejável otimizar o design do injetor para mitigar quaisquer perdas antes da amostra atingir o feixe de raios-X.
Recentemente, os primeiros resultados do SX foram publicados usando Lipidico23 com um alvo lysozyme, usando um detector Eiger 16M. Este projeto do injetor limita o desperdício da amostra, minimizando o número de etapas envolvidas na ida da cristalização inicial à transferência de cristais no injetor seguido pela entrega da amostra para o feixe de raios-X. Este manuscrito descreve e demonstra o procedimento de transferência de amostras a partir da preparação da amostra, passando para o processo de injeção e, finalmente, coleta de dados, usando o mesmo vaso de cristalização. O funcionamento do injetor também é descrito.
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Protocol
1. Preparação de cristais em uma mídia viscosa alta usando seringas de vidro
- Centrifugar a solução de cristal suavemente (~1.000 x g, ~10 min a 22 °C) para formar uma pelota de cristal macio e remover o excesso de tampão. Isso resultará em uma alta concentração de cristais na pelota que podem ser usados para coleta de dados.
NOTA: Para evitar a diluição da mídia viscosa aumente a concentração de cristal nesta etapa. Otimize a proporção de mídia viscosa ao volume de cristal para cada amostra para obter uma alta concentração de cristais, mantendo uma alta viscosidade para a mídia. Centrifugar a solução de cristal para formar uma pelota e remover o excesso de tampão para aumentar a concentração de cristal na solução, como descrito em Darmanin et. al.29. - Configure duas seringas de 100 μL com um acotodo.
- Aperte o acostreiro até o final da primeira seringa e adicione 28 μL de solução cristalina ao topo da seringa. Lentamente, insira o êmbolo na parte superior da seringa e empurre suavemente a solução até o final da ponta do acoocoplador, removendo quaisquer bolhas de ar que se formam. Faça isso seguindo um dos dois métodos discutidos abaixo.
NOTA: O volume de cristais a serem adicionados à mídia viscosa alta pode ser variado se não alterar significativamente a viscosidade da amostra geral.- Primeiro método: Use mudanças rápidas de pressão para estourar as bolhas de ar.
- Coloque cuidadosamente um dedo enluvado na parte superior do ponto de agulha acotodo e (muito suavemente) aplique pressão para criar uma vedação. Não aplique muita pressão, pois isso pode resultar em uma lesão na agulha.
- Agora puxe o êmbolo de volta para afastar a solução do ponto da agulha, isso vai gerar um acúmulo de pressão na seringa.
- Solte rapidamente a pressão na parte superior da seringa removendo o dedo enluvado da ponta da agulha. Tenha cuidado, se a amostra estiver muito perto da ponta quando o dedo for removido, pode pulverizar, resultando na perda da amostra. A rápida mudança de pressão dentro da seringa vai estourar as bolhas de ar. Repita até que todas as bolhas tenham sido removidas.
- Segundo método: Usar a "centrífuga humana" para remover bolhas de ar.
- Coloque a seringa em uma mão com a agulha voltada para cima e o êmbolo preso entre dois dedos, de modo que não possa se mover.
- Gire rapidamente o braço segurando a seringa em uma direção 2-3 vezes, a força centrífuga resultante na amostra forçará qualquer bolha de ar para fora da seringa. Tenha cuidado, se for feita muito lentamente a amostra pode ser perdida.
- Inspecione a seringa em busca de bolhas de ar, se as bolhas permanecerem, repita as etapas 1.3.2.1 – 1.3.2.2 até que todas as bolhas de ar sejam removidas.
- Primeiro método: Use mudanças rápidas de pressão para estourar as bolhas de ar.
- Com uma espátula fina, adicione ~42 μL de graxa de silicone de alto vácuo diretamente ao topo da segunda seringa. Empurre o êmbolo até o fim, removendo todas as bolhas de ar e garantindo que não haja abertura de ar no final da seringa.
NOTA: A composição precisa da graxa de silicone não é crítica, pois está agindo como um portador inerte. Um valor de viscosidade de >10 Pa.s ou razão de aproximadamente 60:40 graxa de silicone para solução de cristal é ideal para injeção, no entanto, é possível que isso possa variar dependendo das características exatas da amostra. Ajuste o volume da solução cristalina adicionada à graxa de silicone para otimizar a concentração de cristal na mistura, conforme descrito na discussão. A mídia de alta viscosidade que não a graxa de silicone pode ser usada desde que sejam compatíveis com a amostra30,31,32,33. - Certifique-se de que não há bolhas de ar em nenhuma das duas seringas e conecte as seringas juntas usando o acoedador. Segure as seringas verticalmente, agarrando apenas a extremidade da seringa, pois o aquecimento da seringa devido ao calor gerado pelos dedos pode afetar a amostra.
- Misture a amostra deprimindo suavemente o êmbolo do lado da solução de cristal para que se misture na graxa de silicone e, em seguida, empurre o êmbolo no lado da graxa de silicone, de modo que ele empurre a amostra de volta para o lado da solução de cristal. Suavemente, repita este processo 50 a 100 vezes para que a amostra seja completamente misturada e pareça homogênea.
NOTA: Se os cristais forem cultivados diretamente em mídia altamente viscosa (por exemplo, fase cúbica lipídica, LCP), as etapas 1.1-1.6 não são necessárias. Protocolos para o cultivo de cristais dentro das seringas podem ser encontrados em Liu et.al. 34,35. Siga este protocolo até a consolidação da amostra, etapa 10, onde toda a amostra está agora contida em uma seringa e o tampão de cristalização é removido. A adição de 7.9MAG não é necessária para este protocolo. Em vez disso, remova todo o excesso de líquido da seringa empurrando suavemente o êmbolo para baixo na amostra até que não haja mais líquido na seringa. - Visualize os cristais sob um microscópio óptico através da seringa ou, para obter melhores resultados, extraia uma pequena quantidade (~1 μL) em um slide de vidro e coloque um deslizamento de tampa na parte superior.
- Verifique a concentração de cristal.
- Determine a concentração de cristal na graxa de silicone contando o número de cristais em uma área específica usando as imagens do microscópio óptico. Para obter melhores resultados, uma alta densidade de cristais uniformemente dispensados em toda a mídia é ideal (>106 cristais/mL) a fim de obter uma alta taxa de acerto de cristal.
- Ajuste a concentração de cristal na seringa alterando a proporção de cristais para mídia viscosa nas etapas 1.3 e 1.4.
- Para diminuir a concentração de cristal, dilui os cristais na seringa aumentando a quantidade de graxa de silicone/mídia HV na etapa 1.4 ou diluindo a pelota de cristal em solução com o tampão de cristalização antes de configurar as seringas na etapa 1.1.
- Para aumentar a concentração de cristal, diminua a quantidade de graxa de silicone na etapa 1.4, mas tenha em atenção para não reduzir a viscosidade abaixo de 10 Pa.s.
NOTA: A concentração de cristal relatada aqui foi otimizada para esta amostra específica e tamanho de cristal. No entanto, a concentração ideal de cristal dependerá do tamanho do cristal, do tamanho do feixe, do diâmetro interno da agulha (I.D.), e do fluxo de raios-X incidentes. Isso pode ser determinado a partir da taxa de acerto com uma taxa de acerto ideal de ~30% considerada como 'boa'. Na prática, a concentração de cristal deve ser otimizada para diferentes amostras durante o tempo do feixe para obter a taxa de acerto desejada. Comece com uma alta concentração de cristais, 109 cristais/mL. O procedimento para ajustar a concentração de cristal é dado em Liu et.al. 35.
- O protocolo pode ser pausado aqui até que o injetor esteja pronto para coleta de dados.
- Se os cristais são cultivados em LCP, então sele-os e deixe-os permanecer em seringas por até alguns dias à temperatura ambiente.
- Se os cristais foram transferidos para uma mídia viscosa diferente (por exemplo, graxa de silicone), então um teste de estabilidade dos cristais ao longo do tempo deve ser realizado antes da medição. Isso determinará quanto tempo os cristais estão estáveis na mídia inerte (idealmente > 8 h) e o prazo para coleta de dados. Aqui, os cristais de lise foram estáveis por dias em graxa de silicone e não mostraram sinais de dissolução quando inspecionados usando um microscópio óptico.
- Mova toda a amostra para uma seringa antes de desconectar o acotravador. Desconecte o acotrador da seringa e conecte a agulha de injeção. Enrosque a agulha firmemente na base da seringa e certifique-se de que ela está bem presa para evitar vazamentos. Uma agulha de 108 μm (comprimento da agulha 13 mm, estilo ponto 3) foi usada para este experimento. Dependendo do tamanho do cristal e do tamanho do feixe, conecte uma agulha de 51 μm ou 108 μm.
NOTA: O pré-teste do fluxo de amostras antes do tempo do feixe é necessário para poder selecionar o tamanho correto da agulha do injetor. Dependendo das características da amostra (ou seja, viscosidade, carregamento, composição tampão) e da ID da agulha, as amostras fluirão de forma diferente. Portanto, recomenda-se testar uma variedade de tamanhos de agulha para produzir o fluxo mais estável com a menor agulha de I.D. possível para maximizar a relação sinal-ruído durante a coleta de dados. - Se o injetor já estiver montado e alinhado na linha do feixe, mova-se para a seção 3 e monte a seringa da amostra diretamente no injetor.
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.
2. Montagem e controle do injetor
- Monte o injetor na linha de vigas. Remova o bocal criogênico na linha de feixe MX2 e substitua-o pelo injetor. Solte o parafuso de fixação que segura o bocal criogênico e fixe-o ao suporte localizado ao lado do estágio motorizado.
- Levante o injetor do carrinho segurando a alça preta e coloque-o no palco motorizado.
- Para fixar o injetor ao estágio motorizado; aperte a mão do botão do parafuso de fixação preto.
- Monte uma seringa vazia no injetor
- Na interface de controle do computador injetor (ou seja, software de controle de posição EPOS), selecione O Modo Homing em Ferramentas no menu de software. Em seguida, selecione O Interruptor de Limite Negativo e o Início do Homing,deixe o software funcionar até que o parafuso seja retraído o suficiente para que a seringa encaixe sob o parafuso. Se deixado para funcionar sem supervisão, o interruptor de limite pára automaticamente o parafuso.
- Monte uma seringa vazia ('manequim') no injetor inserindo a agulha através da fenda no suporte da seringa. Alinhe a seringa contra o suporte.
- Aperte a seringa com dois anéis O.
- Enrole o primeiro o-ring através da seção média da seringa anexando-o aos ganchos em ambos os lados da seringa.
- Enrole o segundo o-ring em torno dos ganchos na parte superior da seringa e, em seguida, coloque uma parte do anel O no topo da seringa de vidro, como mostrado na demonstração e figura 1B.
- Alinhe o injetor ao raio-X
- Mova o estágio motorizado com o injetor em direção ao ponto de interação de raios-X através do software de controle de linha de vigas. Isso pode ser visualizado usando a câmera inline. O tamanho e a posição do feixe são denotados por uma cruz vermelha na tela e o estágio motorizado pode ser movido para alinhar a agulha com a região de interação raio-X.
- Ajuste a posição x e y do palco para alinhar a agulha com a cruz vermelha.
- Ajuste a posição z até que a ponta da agulha entre em foco.
- Verifique o alinhamento da ponta da agulha e do raio-X visualmente verificando se a ponta da seringa atende às miras que são visíveis na imagem do microscópio óptico gerada pela câmera de linha de luz.
- Uma vez que a ponta da agulha esteja alinhada, mova a ponta acima dos cabelos cruzados ~100 μm. Isso elimina a dispersão de raios-X da ponta da agulha.
NOTA: A montagem e o alinhamento do injetor na linha de feixe MX2 no síncrotron devem ser realizados pelos cientistas da linha de trave e podem ser concluídos em menos de 30 minutos.
3. Montagem da seringa amostral
- Substitua a seringa vazia pela seringa amostrada seguindo o passo 2.3.
- Coloque a tampa injetora na cabeça do êmbolo da seringa da amostra.
- Mova o parafuso da unidade para a parte superior da tampa.
- No software de controle do injetor selecione Modo Velocidade.
- Entrada 3000 rpm (~115 nL/s) como o Valor de Configuração e pressione aplicar valor de configuração.
- Quando o parafuso da unidade tocar a tampa na cabeça do êmbolo da seringa, pare o motor.
- Defina o valor rpm a zero no software de controle do injetor alterando o Valor de Configuração para '0' à medida que o parafuso se aproxima da tampa.
- Uma vez feito o contato, ative o valor predefinido pressionando Aplicar valor de configuração para parar o parafuso instantaneamente.
- Mova suavemente a tampa para ter certeza de que ela está firmemente presa no lugar.
NOTA: Sempre que um novo valor definido é inserido na caixa "Definir valor" no software de controle, ele só é ativado após pressionar o Apply Setting Value.
4. Executando o injetor
- Depois que o parafuso da unidade da tampa tiver feito contato firme com a parte superior do êmbolo, mude o valor de configuração rpm para 100. Isso equivale a ~ 4 nL/s.
- Inspecione visualmente a ponta da agulha quando a amostra sair pela primeira vez ou olhe a imagem da câmera de feixe da agulha para observar quando a amostra começa a extrusão da ponta da agulha.
- Faça uma busca na cabana, feche a porta da cabana e ligue o raio-X. A partir deste ponto, o injetor deve ser operado remotamente de fora da cabana.
- Sintonize o rpm até que um fluxo estável seja gerado.
- Diminua o valor de configuração rpm para 90.
- Repita o passo 4.4.1, diminuindo o valor de ajuste rpm em incrementos de 10, para diminuir a velocidade do fluxo, mas ainda manter um fluxo estável. Para graxa de silicone foi utilizado um valor de 30 rpm.
NOTA: A faixa típica de rpm varia entre 30 a 100 rpm (1 – 4 nL/s) dependendo das características da amostra e do tempo de exposição ao raio-X. Em geral, a rpm deve ser ajustada para produzir a taxa de fluxo mais lenta (para minimizar o consumo de amostras) mantendo um fluxo estável.
- Gerenciamento de um fluxo de amostra que não flui bem.
- Continue aumentando o valor de configuração rpm em incrementos de 10 até que o fluxo fique mais reto. Se o fluxo não estabilizar, mesmo depois de aumentar o valor de ajuste rpm para o valor máximo de 100 rpm tente melhorar a estabilidade implementando um dos dois métodos descritos abaixo.
- Primeiro método: Insira um apanhador de amostras de poliestireno sob o fluxo de amostras para ajudar a guiar a amostra. Este método funciona bem para fluxos de amostras altamente carregados.
- Segundo método: Insira um funil de sucção venturi no apanhador de amostras. Para fornecer ar ao funil, conecte-o ao tubo de saída de ar localizado na cabana. Este método pode auxiliar na direção e estabilização do fluxo amostral independente da carga do fluxo.
- Continue aumentando o valor de configuração rpm em incrementos de 10 até que o fluxo fique mais reto. Se o fluxo não estabilizar, mesmo depois de aumentar o valor de ajuste rpm para o valor máximo de 100 rpm tente melhorar a estabilidade implementando um dos dois métodos descritos abaixo.
- Uma vez alcançado um fluxo constante e constante, inicie a coleta de dados e otimize a distância do detector de acordo com um experimento normal de cristalografia de raios-X.
NOTA: A rpm é convertida em taxa de fluxo usando a tabela de conversão fornecida na Information Complementar, 'Lipidico Device Calculator'. Digite o valor de rpm, diâmetros da agulha e volumes de seringa para calcular a taxa de fluxo usando esta calculadora.
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Representative Results
Lipidico é um HVI construído como um sistema de entrega alternativa para uso em MX2 (Figura 1). É ideal para SX onde os cristais são cultivados em fase cúbica lipídica ou transferidos para uma alta mídia inerte viscosa.
Para demonstrar a aplicação injetora, a graxa de silicone misturada com cristais de lisezímola foi usada para coletar dados SX na linha de feixe MX2 no síncrotron australiano. Para montar o injetor na linha de feixe MX2, o bocal criogênico é removido e substituído pelo injetor, conforme mostrado na Figura 1. As amostras de seringa são montadas diretamente no injetor e fixadas usando anéis O(Figura 1B). A coleta de dados pode ser iniciada em poucos minutos após uma alteração de amostra. O injetor foi projetado para o controle rápido de amostras com uma configuração simples que é fácil de operar para usuários que não estão familiarizados com o SX.
Figura 1: Imagens de Lipidico, um injetor viscoso usado no síncrotron australiano para experimentos SX. (A) Mostra uma foto de Lipidico incorporada em MX2. A seta vermelha indica a direção do raio-X. (B) Uma visão mais atenta da região do titular da amostra em Lipidico. A seringa é mantida no lugar por dois anéis O e a amostra é coletada no apanhador. (D) Uma visão de perto do fluxo amostral mostrando a agulha injetora e o coletor de resíduos de amostra que pode ser alterado para incorporar um apanhador de sucção poliestireno/venturi visto sob a agulha em (A). A figura foi adaptada de Berntsen et. al. 201923 com a permissão da AIP Publishing. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
O injetor é compatível com vários tipos de portadores altamente viscosos. A velocidade ideal de execução da amostra para o injetor é crucial para a estabilidade do fluxo, muito lenta causará um efeito de enrolamento/expansão do fluxo e muito rápida resultará na quebra do fluxo. A velocidade ideal variará dependendo do sistema portador utilizado. As figuras 2 e figura 3 mostram a graxa de silicone testada em diferentes velocidades injetáveis e demonstra como o comportamento do fluxo pode variar. Uma taxa de fluxo lenta(Figura 2A, 2,3 nL/s) resulta na expansão da graxa de silicone extrudada do injetor, enquanto uma taxa de fluxo mais rápida(Figura 2C,6,6 nL/s) produz um fluxo mais fino. Curling do fluxo de mídia viscoso tem sido observado regularmente(Figura 3A). Para superar essa questão foram testadas duas soluções inovadoras: um apanhador de poliestireno e um funil de sucção venturi abaixo da agulha. O apanhador de poliestireno introduz uma fraca força eletrostática e funciona melhor em amostras altamente carregadas, como no caso da graxa de silicone(Figura 3B),enquanto o funil de sucção venturi ajuda a guiar o fluxo verticalmente para baixo para o receptor, independentemente do carregamento da amostra. Dependendo das características da amostra, qualquer opção pode ser usada com sucesso.
Figura 2: O efeito de um fluxo de alto porte viscoso usando diferentes velocidades injetáveis. A graxa de silicone 100% foi testada em diferentes velocidades de amostra para avaliar suas características de fluxo. (A) . 2,3 nL/s (30 rpm), (B) 3,5 nl/s (90 rpm) e (C) 6,6 n/s (170 rpm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Comportamento de fluxo de graxa 100% silicone demonstrando curling da mídia viscosa. (A) Efeito curling a 2,3 nl/s (30 rpm) (B) O efeito de adicionar o apanhador de poliestireno ao suporte de resíduos amostrais com a velocidade do injetor operando a 2,3 nL/s (30 rpm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Foi utilizada uma seringa de vidro contendo 26 μL de cristais de lisezina (tamanho de cristal 10 μm x 10 μm x 20 μm) suspensa em graxa de silicone(Figura 4A). Lipidico gerou um fluxo amostral constante, utilizando a agulha de 108 μm I.D., com uma taxa de fluxo média de 1,14 nL/s (com o motor definido a 30 rpm). Um algoritmo de localização de pico36 foi usado para avaliar a taxa de acerto e uma quantidade suficiente de dados (total de 224.200 imagens) foi coletada dentro de 38 minutos do tempo de coleta de dados, permitindo a recuperação da estrutura (código PDB 6MQV). A Tabela 1 fornece um resumo das estatísticas de coleta de dados e a Figura 4B mostra uma imagem representativa do mapa de densidade eletrônica em torno de uma das ligações di-sulfeto na estrutura lysozyme20.
Figura 4: Imagens de Lysozyme. (A) Imagens ópticas dos cristais de lise em graxa de silicone. Uma imagem polarizada cruzada (40x de ampliação) de cristais de lisezímola misturados com uma alta mídia viscosa, graxa de silicone, imagem usando um microscópio de luz visível. O tamanho dos cristais variam entre 15 e 20 μm e (B) Uma imagem representativa do mapa de densidade eletrônica (2Fo-Fc, 1σ) em torno das ligações dissulfetos da lysozyme. A figura foi adaptada de Berntsen et. al. 201923 com a permissão da AIP Publishing. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Informações complementares. Clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela 1: Tabela resumida mostrando as estatísticas de dados SX de Lipidico. Os cristais de lysozyme foram misturados com uma alta mídia viscosa, graxa de silicone, e transmitidos através da região de interação de raios-X da linha de luz MX2. Este é um resumo da tabela completa de resultados publicada em Berntsen et. al.23. A tabela é adaptada aqui com a permissão da AIP Publishing.
| Estatísticas de dados | Lipidico, linha de vigas MX2 |
| detetor | Dectris EIGER X 16M, |
| taxa de quadros | 100Hz |
| Distância do detector de amostras (mm) | 300 |
| Energia de raios-X (KeV) | 13 |
| Tamanho do feixe (WxH) (μm) | 12x22 |
| Não. de quadros | 224200 |
| Taxa de acerto (%) | 2.95 |
| Não. de quadros indexados | 4852 |
| Resolução (Å) | 17.74-1.83 |
| completude | 99.44 |
| Grupo espacial | P43212 |
| Célula unitária | |
| a, b, c (Å) | 78.68, 78.68, 34.48 |
| α, β, γ (°) | 90, 90, 90 |
| I/σ(I) | 5.08 |
| redundância | 73.97 |
| CC1/2 | 0.96 |
| Rtrabalho/Rgrátis | 0.18/0.26 |
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Discussion
Um HVI alternativo foi desenvolvido, ideal para a realização de experimentos SX em fontes síncrotrons. Ele tem duas vantagens fundamentais sobre os HVIs existentes. Primeiro, é fácil instalar na linha de trave permitindo uma comutação rápida entre cristalografia convencional e SX, apenas ~30 minutos é necessário para instalação e alinhamento no MX2. Em segundo lugar, as seringas amostrais usadas para cultivar cristais podem ser usadas diretamente como reservatórios para injeção, limitando o desperdício durante a transferência de amostras. O protocolo para a alteração das amostras foi descrito e demonstrado. O design elimina a necessidade de um fluxo de gás complicado para controlar o jato em comparação com outros HVIs. Foi demonstrado um processo simples para alterar a taxa de fluxo do injetor que pode ser ajustado sem uma resposta atrasada.
Os passos mais cruciais para a coleta bem-sucedida de dados SX são otimizar a concentração de cristal, obter uma mistura homogênea de mídia viscosa alta e produzir um fluxo estável para coleta de dados. A concentração e homogeneidade de cristal ideais podem ser alcançadas centrifugando os cristais até uma pelota e adicionando uma maior concentração de cristais à mídia portadora, garantindo que a amostra seja completamente misturada no sistema acotomante. Uma vez que a concentração de cristal é otimizada, a taxa de fluxo do injetor pode ser facilmente ajustada durante o tempo de feixe para obter um fluxo estável. Curling do fluxo viscoso é comumente observado com amostras viscosas altas. Duas soluções são apresentadas: o uso de um apanhador de amostras de poliestireno para amostras carregadas ou a adição de um funil de sucção venturi atuando como apanhador. Isso foi bem sucedido no controle do fluxo nos testes iniciais, mas em diferentes condições amostrais a enrolação do fluxo pode resultar na aderência da amostra ao ponto da agulha. É possível que isso possa ser superado alterando as propriedades de carga superficial da agulha adicionando revestimentos especiais. Agulhas revestidas com diferentes produtos químicos (ou seja, silicone) foram previamente adaptadas com sucesso para uso com robôs de manuseio líquido e podem ser encomendadas sob medida de fabricação para se adequar à seringa37.
O injetor não se limita à graxa de silicone e pode ser usado com outros líquidos altamente viscosos. Várias alternativas diferentes foram demonstradas23 que podem ser usadas com sucesso para injeção de cristal e são descritas em uma série de outras publicações22,30,33. O limite superior da viscosidade amostral usando este HVI ainda está sob investigação, porém as viscosidades amostrais de até 25 Pa.s (usando graxa de silicone de 100 %) resultaram em um fluxo estável. No entanto, quando a viscosidade amostral foi reduzida para <10 Pa.s (usando 70 % de amostra de graxa de silicone) um fluxo confiável não pôde ser produzido. Assim, 10 Pa.s representa o limite inferior atual na viscosidade amostral para injeção usando este HVI. A iD da agulha também é uma consideração importante. Embora 51 μm de identidade tenha sido testada com sucesso enquanto injetava vários carregadores sem cristais, a introdução de cristais interrompe o fluxo amostral. Portanto, dependendo do seu tamanho, com cristais introduzidos na matriz, há uma probabilidade muito maior de bloqueio ao usar a agulha de 51 μm de identidade em comparação com o tamanho maior da agulha. Quando um bloqueio ocorre um acúmulo crítico de pressão pode ocorrer, em outros injetores isso pode resultar em quebra de seringa. No entanto, o design deste HVI inclui um mecanismo de segurança onde a mecânica de acionamento se afastará do êmbolo da seringa se a pressão ficar muito alta até que um interruptor de desativação seja ativado. Isso faz com que a unidade seja parada e impeça a ruptura da seringa de vidro.
Existem várias limitações para este injetor. O injetor foi projetado especificamente para amostras altamente viscosas, portanto, amostras líquidas como amostras não podem ser usadas diretamente para a entrega de amostras. Para superar essa limitação, os cristais cultivados em sistemas tampão podem ser misturados com uma mídia inerte adequada, como descrito na etapa 1, no entanto, há a possibilidade de o cristal se tornar instável. Portanto, a triagem de uma variedade de mídia inerte26,27,28,29 deve ser investigada primeiro para garantir a manutenção da estabilidade da amostra. Em segundo lugar, o tamanho do cristal e a qualidade da embalagem de cristal afetarão a qualidade da difração. A linha de feixe MX2 opera com um feixe ótimo de 22 x 12 μm (H x W) e fluxo ~1012 fótons/s. O tamanho ideal do cristal para realizar o SX no MX2 é de ~10 μm e mostrou-se que produz uma alta relação sinal-ruído. No entanto, é possível coletar dados sobre cristais de tamanho menor se forem bem ordenados e difundidos para alta resolução. Há uma opção de cortar o tamanho do feixe nesta linha de feixe para ~7,5 μm, no entanto, isso tem um custo, uma vez que reduz o fluxo de incidentes que precisa ser considerado durante o experimento.
O desenvolvimento deste injetor torna o SX facilmente acessível aos cristalógrafos tradicionais. A operação bem sucedida de Lipidico, abre as portas para um método rápido e fácil para a coleta de dados SX em uma ampla variedade de fontes síncrotrons. Permite a coleta de dados de temperatura ambiente em cristais que são de 10 μm ou menos em MX2, limitando os efeitos de dano à radiação para cristais individuais. Ele também oferece uma nova oportunidade na Austrália para realizar o tempo de milissegundo sx resolvido que é o atual estado da arte para cristalógrafos. As aplicações futuras deste sistema injetor estendem-se à caracterização de raios-X de materiais altamente viscosos usando a dispersão de raios-X de Pequeno Ângulo (SAXS) permitindo que o injetor seja prontamente adaptado a outras linhas de raios no Síncrotron Australiano.
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Disclosures
MK trabalha para projetos Kusel. Kusel Design, um desenvolvedor de dispositivos de laboratório personalizado, foi contratado pelo Dr. Peter Bentsen da Universidade de La Trobe e pelo Dr. Tom Caradoc-Davies da ANSTO e para desenvolver um dispositivo de baixo custo para permitir estudos viscosos elevados na linha de feixe MX2 no Síncrotron Australiano. O dispositivo foi desenvolvido em estreita consulta com o Dr. Caradoc-Davies. Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Australian Research Council Centre of Excellence in Advanced Molecular Imaging (CE140100011) (http://www.imagingcoe.org/). Esta pesquisa foi realizada em parte usando a linha de feixe MX2 no Síncrotron Australiano, parte do ANSTO, e fez uso do detector da Australian Cancer Research Foundation (ACRF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hen eggwhite lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | Used to grow crystals for testing the injector and the crystals are transferred into silicon grease. https://www.sigmaaldrich.com/ |
| High vacuum silicon grease | Dow Corning | Z273554-1EA | Used for testing of injector. https://www.sigmaaldrich.com/ |
| Injector needle (108 µm ID) | Hamilton | part No: 7803-05 | www.hamiltoncompany.com |
| Glass gas-tight syringes, 100 µl | Hamilton | part no: 7656-01 | Syringes used for sample injection. www.hamiltoncompany.com |
| LCP syringe coupler | Formulatrix | 209526 | Syringe coupler to mix the samples |
| Lipidico injector | La Trobe Univerity/ANSTO | This is a specific piece of equipment that can be accessed through La Trobe University / ANSTO Australian Synchrotron Facility |
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