Summary
Målet med denne protokol er at demonstrere, hvordan man forbereder serielle krystallografiprøver til dataindsamling på en høj tyktflydende injektor, Lipidico, der for nylig blev bestilt på den australske synkrotron.
Abstract
En facilitet til udførelse af serielle krystallografi målinger er blevet udviklet på den australske synkrotron. Denne facilitet indeholder et formål bygget høj tyktflydende injektor, Lipidico, som en del af makromolekylær krystallografi (MX2) strålelinje til at måle et stort antal små krystaller ved stuetemperatur. Formålet med denne teknik er at gøre det muligt at dyrke/overføre krystaller til glassprøjter direkte i injektoren til indsamling af serielle krystallografidata. Fordelene ved denne injektor omfatter evnen til at reagere hurtigt på ændringer i strømningshastigheden uden afbrydelse af strømmen. Der findes flere begrænsninger for denne injektor med høj viskositet (HVI), som omfatter en begrænsning af de tilladte prøveviskositeter til >10 Pa.s. Streamstabilitet kan også potentielt være et problem afhængigt af prøvens specifikke egenskaber. En detaljeret protokol for, hvordan man opsætter prøver og betjener injektoren til serielle krystallografimålinger ved den australske synkrotron, præsenteres her. Metoden demonstrerer forberedelse af prøven, herunder overførsel af lysozymkrystaller til et højkøst medie (silikonefedt) og injektorens funktion til dataindsamling hos MX2.
Introduction
Seriel krystallografi (SX) er en teknik, der oprindeligt blev udviklet i forbindelse med røntgenfri elektronlasere (XFELs)1,2,3,4. Selvom faste måltilgange kan bruges til SX5,6,7, anvendes injektorsystemer typisk til at levere krystaller i en kontinuerlig strøm til røntgenstrålen. Da SX kombinerer data fra et stort antal krystaller, undgår det behovet for krystaljustering under eksperimentet og gør det muligt at indsamle data ved stuetemperatur8,9. Ved hjælp af en passende injektor streames krystallerne en efter en ind i røntgeninteraktionsområdet, og de resulterende diffraktionsdata indsamles på en områdedetektor9,10. Til dato har SX haft succes med at løse en række proteinstrukturer1,11,12,13 inklusive krystaller for små til at måle ved hjælp af konventionel krystallografi. Det har også givet ny indsigt i tidsløst molekylær dynamik ved at udnytte XFEL's femtosekunds pulsvarighed. Ved at indlede pumpe-sonde reaktioner med optiske laserkilder, dybdegående undersøgelser er blevet udført på fotosystem II14,15, fotoaktiv gult protein16,17, cytochrom C oxidase18, samt bacteriorhodopsin19,20,21. Disse undersøgelser har undersøgt den elektronoverførselsdynamik, der opstår efter lysaktivering, hvilket viser det betydelige potentiale i seriel krystallografi til forståelse af tidsløste biologiske processer.
Udviklingen af seriel krystallografi bliver også mere og mere udbredt ved synkrotronkilder9,12,20,22,23,24. Synkrotronbaseret SX gør det muligt at måle et stort antal individuelle krystaller effektivt ved stuetemperatur ved hjælp af et passende injektorsystem. Denne tilgang er velegnet til mindre krystaller, og ud over at kræve en hurtig billedhastighedsdetektor til at indsamle dataene kræves der også en mikrofokuseret stråle. Sammenlignet med konventionel krystallografi involverer SX ikke montering og justering af individuelle krystaller i røntgenstrålen. Da data fra et stort antal individuelle krystaller flettes sammen, kan den strålingsdosis, som hver krystal har modtaget, reduceres betydeligt sammenlignet med konventionel krystallografi. Synkrotron SX kan også anvendes til undersøgelse af tidsløste reaktioner, selv ned til millisekundregimet, forudsat at en detektor med en tilstrækkelig høj billedhastighed er tilgængelig (f.eks. 100 Hz eller mere). Flere serielle krystallografi eksperimenter er blevet udført på synkrotronen ved hjælp af injektorer, der oprindeligt blev udviklet på XFEL kilder20,22,23. De to mest almindelige typer injektorer er Gas Dynamic Virtual Nozzle (GDVN)25 og High Viscous Injector (HVI)9,24,26,27,28. GDVN er ideel til injektion af lav viskositet, flydende prøver, men kræver høje strømningshastigheder for at opnå stabile vandløb, hvilket igen fører til høje prøveforbrugshastigheder. Derimod er HVI'er velegnede til prøver med høj viskositet, som gør det muligt at frembringe en stabil strøm ved meget lavere strømningshastigheder, hvilket fører til et meget lavere prøveforbrug. HVI-injektoren favoriserer derfor levering af prøver, hvor en tyktflydende bærer er at foretrække (f.eks. lipidbaseret for membranproteiner) og/eller store mængder prøve er ikke tilgængelige. SX-injektorer er generelt udfordrende at bruge og kræver omfattende træning for at fungere. De omfatter også lange prøveoverførselsprotokoller, da prøven skal indlæses i et specialiseret reservoir, har dette generelt en høj risiko forbundet med, at prøven går tabt enten i det "døde volumen" eller via lækager i forbindelserne. Det er derfor ønskeligt at optimere injektordesignet for at afbøde eventuelle tab, før prøven når røntgenstrålen.
For nylig blev de første SX-resultater offentliggjort ved hjælp af Lipidico23 med et lysozymmål ved hjælp af en Eiger 16M-detektor. Dette injektordesign begrænser prøvespildet ved at minimere antallet af trin, der er involveret i at gå fra indledende krystallisering til overførsel af krystaller til injektoren efterfulgt af levering af prøve til røntgenstrålen. Dette manuskript beskriver og demonstrerer prøveoverførselsproceduren fra prøveforberedelse, overgang til injektionsprocessen og endelig dataindsamling ved hjælp af det samme krystalliseringsbeholder. Injektorens funktion er også beskrevet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af krystaller i et højkøst medie ved hjælp af glassprøjter
- Krystalopløsningen centrifugeres forsigtigt (~1.000 x g, ~10 min ved 22 °C) for at danne en blød krystalpellet og fjerne den overskydende buffer. Dette vil resultere i en høj koncentration af krystaller i pellet, som kan bruges til dataindsamling.
BEMÆRK: For at forhindre fortynding af det tyktflydende medie øges krystalkoncentrationen på dette trin. Optimer forholdet mellem tyktflydende medier og krystalvolumen for hver prøve for at opnå en høj koncentration af krystaller, samtidig med at der opretholdes en høj viskositet for mediet. Centrifuge krystalopløsningen til at danne en pellet og fjerne overskydende buffer for at øge krystalkoncentrationen i opløsningen, som beskrevet i Darmanin et. al.29. - Sæt to 100 μL sprøjter op med en kobling.
- Koblingen fastgøres til enden af den første sprøjte, og der tilsættes 28 μL krystalopløsning til toppen af sprøjten. Sæt langsomt stemplet ind i toppen af sprøjten, og skub forsigtigt opløsningen ned til enden af koblingsspidsen, og fjern eventuelle luftbobler, der dannes. Gør dette ved at følge en af de to metoder, der er beskrevet nedenfor.
BEMÆRK: Mængden af krystaller, der skal tilsættes til de høje viskøse medier, kan varieres, hvis den ikke ændrer viskositeten af den samlede prøve væsentligt.- Første metode: Brug hurtige trykændringer til at sprænge luftboblerne.
- Placer forsigtigt en behandsket finger på toppen af det afstumpede koblingsnålpunkt og (meget forsigtigt) tryk for at skabe en forsegling. Der må ikke udøves for meget tryk, da dette kan resultere i en nålestiksskade.
- Træk nu stemplet tilbage for at trække opløsningen væk fra nålepunktet, dette vil generere en ophobning af tryk i sprøjten.
- Slip hurtigt trykket øverst i sprøjten ved at fjerne den behandskede finger fra den afstumpede nålespids. Vær forsigtig, hvis prøven er for tæt på spidsen, når fingeren fjernes, kan den sprøjte ud, hvilket resulterer i tab af prøve. Den hurtige ændring i trykket i sprøjten vil sprænge luftboblerne. Gentag dette, indtil alle bobler er fjernet.
- Anden metode: Brug af 'menneskelig centrifuge' til at fjerne luftbobler.
- Placer sprøjten i den ene hånd med nålen opad og stemplet kilet mellem to fingre, så den ikke kan bevæge sig.
- Drej hurtigt armen, der holder sprøjten i én retning 2-3 gange, den resulterende centrifugalkraft på prøven vil tvinge eventuelle luftbobler ud af sprøjten. Vær forsigtig, hvis det gøres for langsomt prøve kan gå tabt.
- Undersøg sprøjten for luftbobler, hvis der er bobler tilbage, gentag trin 1.3.2.1 – 1.3.2.2, indtil alle luftbobler er fjernet.
- Første metode: Brug hurtige trykændringer til at sprænge luftboblerne.
- Ved hjælp af en fin spatel tilsættes ~ 42 μL høj vakuum silikonefedt direkte til toppen af den anden sprøjte. Skub stemplet helt ned til enden, fjern alle luftboblerne, og sørg for, at der ikke er luftgab i enden af sprøjten.
BEMÆRK: Den nøjagtige sammensætning af silikonefedtet er ikke kritisk, da det fungerer som en inert holder. En viskositetsværdi på >10 Pa.s eller et forhold på ca. 60:40 silikonefedt til krystalopløsning er optimal til injektion, men det er muligt, at dette kan variere afhængigt af prøvens nøjagtige egenskaber. Juster mængden af krystalopløsning, der tilsættes silikonefedtet, for at optimere krystalkoncentrationen i blandingen, som skitseret i diskussionen. Andre medier end silikonefedt kan anvendes, så længe de er kompatible med prøven30,31,32,33. - Sørg for, at der ikke er luftbobler i nogen af de to sprøjter, og fastgør sprøjterne sammen ved hjælp af koblingen. Hold sprøjterne lodret ved at gribe fat i kun enden af sprøjten, da opvarmning af sprøjten på grund af den varme, der genereres fra fingrene, kan påvirke prøven.
- Bland prøven sammen ved forsigtigt at trykke stemplet på krystalopløsningssiden, så det blandes i silikonefedtet, og skub derefter stemplet på silikonefedtsiden, så det skubber prøven tilbage mod krystalopløsningssiden. Gentag forsigtigt denne proces 50 til 100 gange, så prøven blandes grundigt og ser homogen ud.
BEMÆRK: Hvis krystallerne dyrkes direkte i meget tyktflydende medier (f.eks. lipidisk kubisk fase, LCP), er trin 1.1-1.6 ikke påkrævet. Protokoller til dyrkning af krystaller i sprøjterne findes i Liu et.al. 34,35. Følg denne protokol op for at prøve konsolidering, trin 10, hvor hele prøven nu er indeholdt i en sprøjte, og krystalliseringsbufferen fjernes. Tilføjelsen af 7.9MAG er ikke påkrævet for denne protokol. Fjern i stedet al overskydende væske fra sprøjten ved forsigtigt at skubbe stemplet ned i prøven, indtil der ikke er mere væske tilbage i sprøjten. - Visualiser krystallerne under et optisk mikroskop enten gennem sprøjten eller, for at opnå det bedste resultat, ekstrakt en lille mængde (~ 1 μL) på et glas dias og læg et dæksel slip på toppen.
- Tjek krystalkoncentrationen.
- Bestem krystalkoncentrationen i silikonefedtet ved at tælle antallet af krystaller i et bestemt område ved hjælp af de optiske mikroskopbilleder. For at opnå de bedste resultater er en høj densitet af krystaller, der er jævnt udleveret i hele mediet, ideel (>106 krystaller/mL) for at opnå en høj krystalhithastighed.
- Krystalkoncentrationen i sprøjten justeres ved at ændre forholdet mellem krystaller og tyktflydende medier i trin 1.3 og 1.4.
- For at mindske krystalkoncentrationen fortyndes krystallerne i sprøjten ved at øge mængden af silikonefedt/HV-medier ved trin 1.4 eller ved at fortynde krystalpillen i opløsning med krystalliseringsbufferen, inden sprøjterne opsættes i trin 1.1.
- For at øge krystalkoncentrationen skal du reducere mængden af silikonefedt i trin 1.4, men vær opmærksom på ikke at reducere viskositeten under 10 Pa.s.
BEMÆRK: Den krystalkoncentration, der rapporteres her, blev optimeret til denne specifikke prøve og krystalstørrelse. Den ideelle krystalkoncentration afhænger dog af krystalstørrelsen, strålestørrelsen, nålens indvendige diameter (ID) og hændelsen røntgenflux. Dette kan bestemmes ud fra hitraten med en optimal hitrate på ~ 30% betragtes som 'god'. I praksis skal krystalkoncentrationen optimeres til forskellige prøver i stråletiden for at opnå den ønskede hithastighed. Start med en høj koncentration af krystaller, 109 krystaller/mL. Proceduren for justering af krystalkoncentrationen er angivet i Liu et.al. 35.
- Protokollen kan sættes på pause her, indtil injektoren er klar til dataindsamling.
- Hvis krystallerne dyrkes i LCP, skal du forsegle dem og lade dem forblive i sprøjter i op til et par dage ved stuetemperatur.
- Hvis krystallerne er blevet overført til et andet højkøst medie (f.eks. silikonefedt), skal der udføres en stabilitetstest af krystallerne over tid forud for målingen. Dette bestemmer, hvor længe krystallerne er stabile i inertmediet (ideelt > 8 timer) og tidsgrænsen for dataindsamling. Her var lysozymkrystaller stabile i dagevis i silikonefedt og viste ikke tegn på opløsning, når de blev inspiceret ved hjælp af et optisk mikroskop.
- Flyt hele prøven i én sprøjte, før koblingen afbrydes. Afbryd koblingen fra sprøjten, og fastgør injektionsnålen. Skru kanylen fast i bunden af sprøjten og sørg for, at den er fastgjort tæt for at forhindre lækager. Der blev anvendt en 108 μm ID-nål (nålelængde 13 mm, punkttype 3) til dette forsøg. Afhængigt af krystalstørrelsen og strålestørrelsen fastgøres enten en 51 μm eller 108 μm I.D. nål.
BEMÆRK: Fortestning af prøvestrømmen inden stråletid er nødvendig for at kunne vælge den korrekte injektornålstørrelse. Afhængigt af prøveegenskaberne (dvs. viskositet, opladning, buffersammensætning) og nåle-ID vil prøverne flyde forskelligt. Derfor anbefales det at teste en række nålestørrelser for at producere den mest stabile strøm med den mindst mulige ID-nål for at maksimere signal-til-støj-forholdet under dataindsamlingen. - Hvis injektoren allerede er monteret og justeret på bjælkelinjen, skal du gå videre til sektion 3 og montere prøvesprøjten direkte på injektoren.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her.
2. Injektormontering og -kontrol
- Monter injektoren på bjælkelinjen. Fjern den kryogene dyse på MX2-bjælkelinjen, og udløst den med injektoren. Løsn fastspændingsskruen, der holder kryogen dysen, og fastgør den til beslaget ved siden af den motoriserede fase.
- Løft injektoren op fra vognen ved at holde det sorte håndtag og placere det på den motoriserede scene.
- At fastgøre injektoren til den motoriserede fase; hånd stramme den sorte fastspænding skrue knop.
- Monter en tom sprøjte på injektoren
- I injektorens computerstyringsgrænseflade (dvs. EPOS-positionsstyringssoftware) skal du vælge Homing Mode under Værktøjer i softwaremenuen. Vælg derefter Negative Limit Switch, og Start Homing, lad softwaren køre, indtil skruen er trukket tilstrækkeligt tilbage til, at sprøjten kan passe under skruen. Hvis det overlades til at køre uden opsyn, stopper grænsekontakten skruen automatisk.
- Monter en tom sprøjte ('dummy') på injektoren ved at indsætte nålen gennem slidsen i sprøjteholderen. Stil sprøjten op mod beslaget.
- Fastgør sprøjten med to O-ringe.
- Wrap den første O-ring på tværs af midten af sprøjten, der fastgøres til krogene på hver side af sprøjten.
- Loop den anden O-ring rundt om krogene på den øverste del af sprøjten, og sæt derefter en del af O-ringen på toppen af glassprøjten som vist i demonstrationen og Figur 1B.
- Juster injektoren til røntgenstråle
- Flyt den motoriserede fase med injektoren mod røntgeninteraktionspunktet via beamline-kontrolsoftwaren. Dette kan visualiseres ved hjælp af det indbyggede kamera. Strålens størrelse og placering er angivet med et rødt kryds på skærmen, og den motoriserede fase kan flyttes for at justere nålen med røntgeninteraktionsområdet.
- Juster x- og y-positionen på scenen for at justere nålen med røde kors.
- Juster z-positionen, indtil nålespidsen kommer i fokus.
- Kontroller, at nålespidsen og røntgenstrålen er tilpasset visuelt, ved at kontrollere, at sprøjtespidsen opfylder sigtekornet, som er synligt i det optiske mikroskopbillede, der genereres af strålekameraet.
- Når nålespidsen er justeret, skal du flytte spidsen over hårene ~100 μm. Dette eliminerer røntgenspredning fra nålespidsen.
BEMÆRK: Montering og justering af injektoren på MX2-strålelinjen ved synkrotronen skal udføres af beamline-forskerne og kan færdiggøres på mindre end 30 minutter.
3. Montering af prøvesprøjten
- Udskift den tomme sprøjte med prøvesprøjten ved at følge trin 2.3.
- Placer injektorhætten på prøvesprøjtens stemplets hoved.
- Flyt drevskruen til toppen af hætten.
- Vælg Hastighedstilstand i injektorstyringssoftwaren.
- Indtast 3000 omdrejninger i minuttet (~115 nL/s) som indstillingsværdi, og tryk på Anvend indstillingsværdi.
- Når drivskruen rører hætten på sprøjtestemplets hoved, skal du stoppe motoren.
- Indstil rpm-værdien til nul i injektorstyringssoftwaren ved at ændre indstillingsværdien til '0', når skruen nærmer sig hætten.
- Når kontakten er foretaget, skal du aktivere den forudindstillede værdi ved at trykke på Anvend indstillingsværdi for at stoppe skruen med det samme.
- Vrikke forsigtigt hætten for at sikre, at den er fast holdt på plads.
BEMÆRK: Når der indtastes en ny angivet værdi i feltet Indstillingsværdi i kontrolsoftwaren, aktiveres den først, når du har trykket på Anvend indstillingsværdi.
4. Kørsel af injektoren
- Når hætten drev skruen har gjort fast kontakt med toppen af stemplet ændre rpm Indstilling Værdi til 100. Dette svarer til ~ 4 nL / s.
- Undersøg nålespidsen visuelt, når prøven først kommer ud, eller se på nålens strålekamerabillede for at observere, hvornår prøven begynder at ekstrudere fra nålespidsen.
- Udfør en ransagning af buret, luk hutch døren, og tænd røntgenstrålen. Fra dette tidspunkt skal injektoren betjenes eksternt uden for buret.
- Stil omdrejninger i minuttet, indtil der genereres en stabil strøm.
- Reducer rpm-indstillingsværdien til 90.
- Gentag trin 4.4.1, og reducer rpm-indstillingsværdien i intervaller på 10 for at bremse strømmen, men stadig opretholde en stabil strøm. For silikonefedt blev der anvendt en værdi på 30 omdrejninger i minuttet.
BEMÆRK: Det typiske omdrejningersområde varierer mellem 30 og 100 omdrejninger i minuttet (1 – 4 nL/s) afhængigt af prøveegenskaberne og X-ray-eksponeringstiden. Generelt skal omdrejningstal indstilles til at producere den langsomste strømningshastighed (for at minimere prøveforbruget), samtidig med at der opretholdes en stabil strøm.
- Administration af en eksempelstream, der ikke flyder godt.
- Fortsæt med at øge rpm-indstillingsværdien i intervaller på 10, indtil strømmen bliver mere lige. Hvis strømmen ikke stabiliseres, selv efter at have øget omdrejningsværdien til den maksimale værdi på 100 omdrejninger i minuttet, skal du forsøge at forbedre stabiliteten ved at implementere en af de to metoder, der er beskrevet nedenfor.
- Første metode: Indsæt en polystyrenprøvefanger under prøvestrømmen for at hjælpe med at styre prøven. Denne metode fungerer godt til højt opladede prøvestrømme.
- Anden metode: Sæt en venturi sugetragt på prøvefangeren. Hvis du vil levere luft til tragten, skal du tilslutte den til luftudtagsrøret, der er placeret i buret. Denne metode kan hjælpe med at lede og stabilisere prøvestrømmen uafhængigt af strømmens ladning.
- Fortsæt med at øge rpm-indstillingsværdien i intervaller på 10, indtil strømmen bliver mere lige. Hvis strømmen ikke stabiliseres, selv efter at have øget omdrejningsværdien til den maksimale værdi på 100 omdrejninger i minuttet, skal du forsøge at forbedre stabiliteten ved at implementere en af de to metoder, der er beskrevet nedenfor.
- Når en konstant og stabil strøm er opnået, skal du starte dataindsamlingen og optimere detektorafstanden i henhold til et normalt røntgenkrystallografieksperiment.
BEMÆRK: Omdrejningstal konverteres til strømningshastighed ved hjælp af den medfølgende konverteringstabel i supplerende oplysninger, 'Lipidico Device Calculator'. Indtast rpm-værdien, nålediametre og sprøjtevolumener for at beregne strømningshastigheden ved hjælp af denne lommeregner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lipidico er en HVI bygget som et alternativt leveringssystem til brug på MX2 (Figur 1). Den er ideel til SX, hvor krystaller enten dyrkes i lipidisk kubisk fase eller overføres til et højt tyktflydende inert medie.
For at demonstrere injektorapplikationen blev silikonefedt blandet med lysozymkrystaller brugt til at indsamle SX-data ved MX2-strålelinjen ved den australske synkrotron. For at montere injektoren på MX2-strålelinjen fjernes den kryogene dyse og erstattes af injektoren som vist i figur 1. Sprøjteprøverne monteres direkte på injektoren og fastgøres ved hjælp af O-ringe (Figur 1B). Dataindsamlingen kan påbegyndes få minutter efter en eksempelændring. Injektoren er designet til hurtig prøvestyring med en enkel opsætning, der er nem at betjene for brugere, der ikke er bekendt med SX.
Figur 1: Billeder af Lipidico, en tyktflydende injektor, der anvendes på den australske synkrotron til SX eksperimenter. (A)Viser et billede af Lipidico indarbejdet i MX2. Den røde pil angiver røntgenstrålens retning. (B) Et nærmere billede af prøveindehaverregionen på Lipidico. Sprøjten holdes på plads af to O-ringe, og prøven opsamles i catcheren. (D) Et nærbillede af prøvestrømmen, der viser injektornålen og prøveaffaldsfangeren, som kan ændres, så den omfatter en polystyren/venturi sugefanger, der ses under nålen i (A). Figuren er blevet tilpasset fra Berntsen et. al. 201923 med tilladelse fra AIP Publishing. Klik her for at se en større version af dette tal.
Injektoren er kompatibel med forskellige typer meget tyktflydende bærere. Den optimale prøvehastighed for injektoren er afgørende for strømstabiliteten, for langsom vil forårsage en curlingeffekt/strømudvidelse og for hurtigt vil resultere i strømbrud. Den optimale hastighed varierer afhængigt af det anvendte bæresystem. Figur 2 og figur 3 viser silikonefedt, der er testet ved forskellige injektorhastigheder, og viser, hvordan streamadfærden kan variere. En langsom strømningshastighed(figur 2A, 2,3 nL/s) resulterer i en udvidelse af silikonefedtet ekstruderet fra injektoren, mens en hurtigere strømningshastighed(figur 2C, 6,6 nL/s) giver en tyndere strøm. Der er regelmæssigt observeret curling af den tyktflydende mediestrøm (figur 3A). For at løse dette problem blev der testet to innovative løsninger: en polystyrenfanger og en venturi sugetragt under nålen. Polystyrenfangeren introducerer en svag elektrostatisk kraft og fungerer bedst på højt ladede prøver, som det er tilfældet med silikonefedt (Figur 3B), mens venturi sugetragten hjælper med at lede strømmen lodret nedad til catcheren, uafhængigt af prøveopladning. Afhængigt af stikprøvens egenskaber kan begge muligheder anvendes med succes.
Figur 2: Effekten af en høj tyktflydende bærestrøm ved hjælp af forskellige injektorhastigheder. 100% silikonefedt blev testet ved forskellige prøvehastigheder for at vurdere dets flowegenskaber. (A) . 2,3 nL/s (30 omdrejninger), (B) 3,5 nl/s (90 omdrejninger) og (C) 6,6 n/s (170 omdrejninger i minuttet). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Strømadfærd på 100% silikonefedt, der demonstrerer curling af det tyktflydende medie. (A) Curlingeffekt ved 2,3 nl/s (30 omdrejninger) (B) Virkningen af at tilsætte polystyrenfangeren til prøveaffaldsholderen med injektorhastigheden ved 2,3 nL/s (30 omdrejninger i minuttet). Klik her for at se en større version af dette tal.
Der blev anvendt en glassprøjte med 26 μL lysozymkrystaller (krystalstørrelse 10 μm x 10 μm x 20 μm), suspenderet i silikonefedt (figur 4A). Lipidico genererede en konstant prøvestrøm ved hjælp af 108 μm nålen I.D., med en gennemsnitlig strømningshastighed på 1,14 nL/s (med motoren indstillet til 30 omdrejninger i minuttet). Entopsøgningsalgoritme 36 blev brugt til at vurdere hitraten, og der blev indsamlet en tilstrækkelig mængde data (i alt 224.200 billeder) inden for 38 minutter efter dataindsamlingstiden, hvilket muliggjorde strukturhentning (PDB-kode 6MQV). Tabel 1 indeholder en oversigt over dataindsamlingsstatistikkerne, og figur 4B viser et repræsentativt billede af kortet over elektrontætheden omkring en af disulfidbindingerne i lysozymstrukturen20.
Figur 4: Lysozyme billeder. (A) Optiske billeder af lysozymkrystallerne i silikonefedt. Et krydspolariseret (40x forstørrelse) billede af lysozymkrystaller blandet med et højt tyktflydende medie, silikonefedt, afbildet ved hjælp af et synligt lysmikroskop. Krystallernes størrelse ligger mellem 15 og 20 μm og (B) Et repræsentativt billede af elektrontæthedskortet (2Fo-Fc, 1σ), der omgiver lysozymets disulfidbindinger. Figuren er blevet tilpasset fra Berntsen et. al. 201923 med tilladelse fra AIP Publishing. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende oplysninger. Klik her for at hente denne fil.
Tabel 1: Sammenfattende tabel, der viser SX-datastatistik fra Lipidico. Lysozym krystaller blev blandet med en høj tyktflydende medier, silikone fedt, og strømmede gennem X-ray interaktion region af MX2 beamline. Dette er et sammendrag af den fuldstændige resultatoversigt, der blev offentliggjort i Berntsen et. al.23. Tabellen er tilpasset her med tilladelse fra AIP Publishing.
| Datastatistik | Lipidico, MX2 strålelinje |
| Detektor | Dectris EIGER X 16M, |
| billedhastighed | 100 Hz |
| Prøvedetektorafstand (mm) | 300 |
| Røntgenenergi (KeV) | 13 |
| Strålestørrelse (WxH) (μm) | 12x22 |
| Nej. af rammer | 224200 |
| Hitrate (%) | 2.95 |
| Nej. af indekserede rammer | 4852 |
| Beslutning (Å) | 17.74-1.83 |
| Fuldstændighed | 99.44 |
| Områdegruppe | P43212 |
| Enhedscelle | |
| a, b, c (Å) | 78.68, 78.68, 34.48 |
| α, β, γ (°) | 90, 90, 90 |
| I/σ(I) | 5.08 |
| Redundans | 73.97 |
| CC1/2 | 0.96 |
| Rarbejde/ Rgratis | 0.18/0.26 |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er udviklet en alternativ HVI, som er ideel til udførelse af SX-eksperimenter ved synkrotronkilder. Det har to vigtige fordele i forhold til eksisterende HVIs. For det første er det nemt at installere på beamline giver mulighed for hurtig skift mellem konventionelle krystallografi og SX, bare ~ 30 minutter er påkrævet for installation og justering på MX2. For det andet kan de prøvesprøjter, der bruges til at dyrke krystaller, bruges direkte som reservoirer til injektion, hvilket begrænser spild under prøveoverførsel. Protokollen for ændring af prøver er blevet beskrevet og demonstreret. Designet eliminerer behovet for en kompliceret gasstrøm til at styre strålen sammenlignet med andre HVIs. Der blev påvist en enkel proces til ændring af injektorens strømningshastighed, som kan justeres uden forsinket respons.
De mest afgørende skridt for en vellykket SX dataindsamling er at optimere krystalkoncentrationen, opnå en homogen blanding af høj tyktflydende medier og producere en stabil strøm til dataindsamling. Den optimale krystalkoncentration og homogenitet kan opnås ved at centrifugere krystallerne ned til en pellet og tilføje en højere koncentration af krystaller til bæremediet, hvilket sikrer, at prøven blandes grundigt i koblingssystemet. Når krystalkoncentrationen er optimeret, kan injektorflowhastigheden let justeres under stråletiden for at opnå en stabil strøm. Curling af den tyktflydende strøm observeres almindeligvis med høje tyktflydende prøver. Der præsenteres to opløsninger: anvendelse af en polystyrenprøvefanger til ladede prøver eller tilsætning af en venturi sugetragt, der fungerer som catcher. Dette har været en succes med at kontrollere strømmen i de indledende test, men under forskellige prøveforhold kan curling af strømmen resultere i stikning af prøven til nålepunktet. Det er muligt, at dette kan overvindes ved at ændre nålens overfladeladningsegenskaber ved at tilføje specielle belægninger. Nåle belagt med forskellige kemikalier (dvs. silikone) er tidligere blevet tilpasset til brug sammen med væskehåndteringsrobotter og kan specialbestilles fra producenter, der passer til sprøjten37.
Injektoren er ikke begrænset til silikonefedt og kan bruges sammen med andre meget tyktflydende væsker. Der er påvist flere forskellige alternativer23 , som med succes kan anvendes til krystalindsprøjtning , og som er beskrevet i en række andre publikationer22,30,33. Den øvre grænse for prøveviskositet ved hjælp af denne HVI undersøges stadig, men prøveviskositeter på op til 25 Pa.s (ved hjælp af 100 % silikonefedt) har resulteret i en stabil strøm. Men da prøvens viskositet blev reduceret til <10 Pa.s (ved hjælp af 70 % silikonefedtprøve), kunne der ikke produceres en pålidelig strøm. Derfor repræsenterer 10 Pa'er den nuværende nedre grænse for prøveviskositeten for injektion ved hjælp af denne HVI. Nålen ID er også en vigtig overvejelse. Selv om 51 μm I.D. blev testet med succes under injektion af forskellige bærere uden krystaller, forstyrrer indførelsen af krystaller prøvestrømmen. Afhængigt af deres størrelse, med krystaller indført i matrixen, er der derfor en meget højere sandsynlighed for blokering ved brug af 51 μm ID-nålen sammenlignet med den større nålestørrelse. Når en blokering opstår en kritisk ophobning af tryk kan forekomme, i andre injektorer dette kan resultere i sprøjte brud. Designet af denne HVI indeholder dog en sikkerhedsmekanisme, hvor drivmekanikken trækker sig væk fra sprøjtestemplet, hvis trykket bliver for højt, indtil en deaktiveringskontakt er aktiveret. Dette resulterer i, at drevet stoppes og forhindrer glassprøjten i at briste.
Der findes flere begrænsninger for denne injektor. Injektoren er specielt designet til meget tyktflydende prøver, derfor kan væskelignende prøver ikke anvendes direkte til prøvelevering. For at overvinde denne begrænsning kan krystaller dyrket i buffersystemer blandes med et passende inert medie som beskrevet i trin 1, men der er en mulighed for, at krystallen kan blive ustabil. Derfor bør screening af en række inerte medier26,27,28,29 undersøges først for at sikre, at prøvestabiliteten opretholdes. For det andet vil krystallens størrelse og kvalitet påvirke diffraktionskvaliteten. MX2-strålelinjen fungerer med en optimal strålestørrelse på 22 x 12 μm (H x W) og flux ~1012 foton/s. Den optimale krystalstørrelse til udførelse af SX ved MX2 er ~10 μm og har vist sig at give et højt signal-til-støj-forhold. Det er dog muligt at indsamle data om mindre krystaller, hvis de er velordnede og diffract til høj opløsning. Der er en mulighed for at skære ned strålestørrelsen på denne stråle linje til ~ 7,5 μm, men det kommer til en pris, da det reducerer hændelsen flux, som skal overvejes under forsøget.
Udviklingen af denne injektor gør SX let tilgængelig for almindelige krystallografer. Den vellykkede drift af Lipidico, åbner døren til en hurtig og nem metode til SX dataindsamling på en bred vifte af synkrotron kilder. Det gør det muligt at indsamle rumtemperaturdata om krystaller, der er 10 μm eller mindre ved MX2, hvilket begrænser strålingsskaderne for de enkelte krystaller. Det giver også en ny mulighed i Australien for at udføre millisekund tid løst SX, som er den nuværende state-of-the-art for crystallographers. Fremtidige anvendelser af dette injektorsystem omfatter røntgenkarakterisering af meget tyktflydende materialer ved hjælp af Small Angle X-ray Scattering (SAXS), så injektoren let kan tilpasses andre strålelinjer ved den australske synkrotron.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
MK arbejder for Kusel designs. Kusel Design, en brugerdefineret laboratorieenhedsudvikler, blev ansat af Dr. Peter Bentsen fra La Trobe University og Dr. Tom Caradoc-Davies fra ANSTO og til at udvikle en billig enhed for at muliggøre høje tyktflydende undersøgelser i MX2-strålelinjen ved den australske synkrotron. Enheden blev udviklet i tæt samråd med Dr. Caradoc-Davies. Forfatterne har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Australian Research Council Centre of Excellence in Advanced Molecular Imaging (CE140100011) (http://www.imagingcoe.org/). Denne forskning blev udført dels ved hjælp af MX2 beamline på den australske Synchrotron, en del af ANSTO, og gjort brug af den australske Cancer Research Foundation (ACRF) detektor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hen eggwhite lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | Used to grow crystals for testing the injector and the crystals are transferred into silicon grease. https://www.sigmaaldrich.com/ |
| High vacuum silicon grease | Dow Corning | Z273554-1EA | Used for testing of injector. https://www.sigmaaldrich.com/ |
| Injector needle (108 µm ID) | Hamilton | part No: 7803-05 | www.hamiltoncompany.com |
| Glass gas-tight syringes, 100 µl | Hamilton | part no: 7656-01 | Syringes used for sample injection. www.hamiltoncompany.com |
| LCP syringe coupler | Formulatrix | 209526 | Syringe coupler to mix the samples |
| Lipidico injector | La Trobe Univerity/ANSTO | This is a specific piece of equipment that can be accessed through La Trobe University / ANSTO Australian Synchrotron Facility |
References
- Boutet, S., et al. High-resolution protein structure determination by serial femtosecond crystallography. Science. 337 (6092), 362-364 (2012).
- Spence, J. C. H., Weierstall, U., Chapman, H. N. X-ray lasers for structural and dynamic biology. Reports on Progress in Physics. 75 (10), 102601 (2012).
- Aquila, A., et al. Time-resolved protein nanocrystallography using an X-ray free-electron laser. Optics Express. 20 (3), 2706-2716 (2012).
- Schlichting, I. Serial femtosecond crystallography: the first five years. International Union of Crystallography. 2, 246-255 (2015).
- Lee, D., et al. Nylon mesh-based sample holder for fixed-target serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 9, 6971 (2019).
- Martin, A. V., et al. Fluctuation X-ray diffraction reveals three-dimensional nanostructure and disorder in self-assembled lipid phases. Communications Materials. 1 (1), 1-8 (2020).
- Roedig, P., et al. High-speed fixed-target serial virus crystallography. Nature Methods. 14 (8), 805 (2017).
- Chapman, H. N., et al.
- Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nature Communications. 5, 3309 (2014).
- Weierstall, U. Liquid sample delivery techniques for serial femtosecond crystallography. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 369 (1647), 20130337 (2014).
- Gati, C., et al. Atomic structure of granulin determined from native nanocrystalline granulovirus using an X-ray free-electron laser. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2247-2252 (2017).
- Nam, K. H. Sample delivery media for serial crystallography. International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1094 (2019).
- Batyuk, A., et al. Native phasing of x-ray free-electron laser data for a G protein-coupled receptor. Science Advances. 2 (9), 1600292 (2016).
- Kern, J., et al. Structures of the intermediates of Kok's photosynthetic water oxidation clock. Nature. 563 (7731), 421 (2018).
- Suga, M., et al. An oxyl/oxo mechanism for oxygen-oxygen coupling in PSII revealed by an x-ray free-electron laser. Science. 366 (6463), 334-338 (2019).
- Tenboer, J., et al. Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein. Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).
- Pande, K., et al. Femtosecond structural dynamics drives the trans/cis isomerization in photoactive yellow protein. Science. 352 (6286), 725-729 (2016).
- Ishigami, I., et al. Snapshot of an oxygen intermediate in the catalytic reaction of cytochrome c oxidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3572-3577 (2019).
- Nango, E., et al. A three-dimensional movie of structural changes in bacteriorhodopsin. Science. 354 (6319), 1552-1557 (2016).
- Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation. International Union of Crystallography. 2, 168-176 (2015).
- Nogly, P., et al. Retinal isomerization in bacteriorhodopsin captured by a femtosecond x-ray laser. Science. 361 (6398), (2018).
- Martin-Garcia, J. M., et al. Serial millisecond crystallography of membrane and soluble protein microcrystals using synchrotron radiation. International Union of Crystallography. 4, 439-454 (2017).
- Berntsen, P., et al. The serial millisecond crystallography instrument at the Australian Synchrotron incorporating the "Lipidico" injector. Review of Scientific Instruments. 90 (8), 085110 (2019).
- Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallographica Section D-Structural Biology. 71, 387-397 (2015).
- DePonte, D. P., Nass, K., Stellato, F., Liang, M., Chapman, H. N. Sample injection for pulsed X-ray sources. Advances in X-Ray Free-Electron Lasers: Radiation Schemes, X-Ray Optics, and Instrumentation: Proceedings of Society of Photo-Optical Instrumentation Engineers. Tschentscher, T., Cocco, D. , Prague, Czech Republic. 8078 (2011).
- Park, S. Y., Nam, K. H. Sample delivery using viscous media, a syringe andasyringe pump for serial crystallography. Journal of Synchrotron Radiation. 26, 1815-1819 (2019).
- Shimazu, Y., et al. High-viscosity sample-injection device for serial femtosecond crystallography at atmospheric pressure. Journal of Applied Crystallography. 52, 1280-1288 (2019).
- Kovacsova, G., et al. Viscous hydrophilic injection matrices for serial crystallography. International Union of Crystallography. 4, 400-410 (2017).
- Darmanin, C., et al. Protein crystal screening and characterization for serial femtosecond nanocrystallography. Scientific Reports. 6, 25345 (2016).
- Conrad, C. E., et al. A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography. International Union of Crystallography. 2, 421-430 (2015).
- Sugahara, M., et al. Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography. Nature Methods. 12 (1), 61-63 (2015).
- Sugahara, M., et al. Oil-free hyaluronic acid matrix for serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 6, 24484 (2016).
- Fromme, R., et al. Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase. International Union of Crystallography. 2, 545-551 (2015).
- Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography. Journal of Visualized Experiments. (115), e54463 (2016).
- Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography. Nature Protocols. 9 (9), 2123-2134 (2014).
- Hadian-Jazi, M., et al. A peak-finding algorithm based on robust statistical analysis in serial crystallography. Journal of Applied Crystallography. 50, 1705-1715 (2017).
- Kong, F. W., Yuan, L., Zheng, Y. F., Chen, W. D. Automatic Liquid Handling for Life Science: A critical review of the current state of the art. Journal of Laboratory Automation. 17 (3), 169-185 (2012).
