Summary
Målet med detta protokoll är att visa hur man förbereder seriella kristallografiprover för datainsamling på en hög viskös injektor, Lipidico, som nyligen beställdes på den australiska synkrotronen.
Abstract
En anläggning för att utföra seriella kristallografimätningar har utvecklats vid den australiska synkrotronen. Denna anläggning innehåller en specialbyggd hög viskös injektor, Lipidico, som en del av den makromolekylära kristallografin (MX2) beamline för att mäta ett stort antal små kristaller vid rumstemperatur. Målet med denna teknik är att göra det möjligt att odla/överföra kristaller till glassprutor direkt i injektorn för insamling av seriekristallografidata. Fördelarna med denna injektor inkluderar förmågan att reagera snabbt på förändringar i flödeshastigheten utan avbrott i strömmen. Det finns flera begränsningar för denna HVI-injektor (High Viscosity Injector) som inkluderar en begränsning av tillåtna provviskositeter till >10 Pa.s. Strömstabilitet kan också potentiellt vara ett problem beroende på exemplets specifika egenskaper. Ett detaljerat protokoll för hur man ställer in prover och använder injektorn för seriella kristallografimätningar vid den australiska synkrotronen presenteras här. Metoden visar beredning av provet, inklusive överföring av lysozymekristaller till ett högvisköst medium (silikonfett) och injektorns funktion för datainsamling vid MX2.
Introduction
Seriell kristallografi (SX) är en teknik som utvecklades ursprungligen i samband med röntgenfria elektronlasrar (XFELs)1,2,3,4. Även om fasta målinflygningar kan användas för SX5,6,7, vanligtvis används injektorsystem för att leverera kristaller i en kontinuerlig ström till röntgenstrålen. Eftersom det kombinerar data från ett stort antal kristaller undviker SX behovet av kristalljustering under experimentet och gör det möjligt att samla in data vid rumstemperatur8,9. Med hjälp av en lämplig injektor strömmas kristallerna en efter en till röntgeninteraktionsområdet och de resulterande diffraktionsdata samlas in på enområdesdetektor 9,10. Hittills har SX lyckats lösa ett antal proteinstrukturer1, 11,12,13inklusive kristaller för små för att mäta med konventionell kristallografi. Det har också gett nya insikter om tidsupp lös molekylär dynamik genom att utnyttja XFEL: s femtosekerade pulsvaraktighet. Genom att initiera pumpsondreaktioner med optiska laserkällor har djupgående studier utförts på fotosystem II14,15, fotoaktivt gult protein16,17, cytokrom C oxidas18, liksom bakteriorhodopsin19,20,21. Dessa studier har undersökt elektronöverföringsdynamiken som uppstår efter ljusaktivering som visar den betydande potentialen hos seriell kristallografi för att förstå tids lösta biologiska processer.
Utveckling av seriell kristallografi blir också allt vanligare vid synkrotronkällor9,12,20,22,23,24. Synkrotronbaserade SX gör det möjligt att mäta ett stort antal enskilda kristaller effektivt vid rumstemperatur med hjälp av ett lämpligt injektorsystem. Detta tillvägagångssätt är lämpligt för mindre kristaller, förutom att kräva en snabb bildhastighetsdetektor för att samla in data, krävs också en mikrofokuserad stråle. Jämfört med konventionell kristallografi innebär SX inte montering och justering av enskilda kristaller i röntgenstrålen. Eftersom data från ett stort antal enskilda kristaller slås samman kan stråldosen som tas emot av varje kristall minskas avsevärt jämfört med konventionell kristallografi. Synkrotron SX kan också tillämpas på studier av tidsuppfriade reaktioner, även ner till millisekekondriska systemet, förutsatt att en detektor med en tillräckligt hög bildhastighet finns tillgänglig (t.ex. 100 Hz eller mer). Flera seriella kristallografi experiment har utförts vid synkrotronen med hjälp av injektorer som ursprungligen utvecklades vid XFEL källor20,22,23. De två vanligaste typerna av injektor är Gas Dynamic Virtual Nozzle (GDVN)25 och High Viscous Injector (HVI)9,24,26,27,28. GDVN är idealisk för att injicera låg viskositet, flytande prover, men kräver höga flödeshastigheter för att uppnå stabila strömmar, vilket i sin tur leder till höga provförbrukningshastigheter. Däremot är HVI: s lämpliga för prover med hög viskositet som möjliggör generering av en stabil ström vid mycket lägre flödeshastigheter, vilket leder till mycket lägre provförbrukning. HVI-injektorn föredrar därför leverans av prover där en trögflytande bärare är att föredra (t.ex. lipidbaserad för membranproteiner) och/eller stora mängder prov inte finns tillgängliga. SX-injektorer är i allmänhet utmanande att använda och kräver omfattande utbildning för att fungera. De omfattar också långa protokoll för överföring av prover, eftersom provet måste laddas i en specialiserad reservoar, vilket i allmänhet har en hög risk i samband med att provet går förlorat antingen i "död volym" eller via läckage i anslutningarna. Därför är det önskvärt att optimera injektordesignen för att mildra eventuella förluster innan provet når röntgenstrålen.
Nyligen publicerades de första SX-resultaten med Lipidico23 med ett lysozyme-mål, med hjälp av en Eiger 16M-detektor. Denna injektordesign begränsar provslöseriet genom att minimera antalet steg som är involverade i att gå från inledande kristallisering till överföring av kristaller till injektorn följt av provleverans till röntgenstrålen. Detta manuskript beskriver och demonstrerar provöverföringsproceduren från provberedning, går vidare till injektionsprocessen och slutligen datainsamling med samma kristalliseringskärl. Injektorns funktion beskrivs också.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av kristaller i ett högt visköst medium med hjälp av glassprutor
- Centrifugera kristalllösningen försiktigt (~1 000 x g, ~10 min vid 22 °C) för att bilda en mjuk kristallpellet och ta bort överskottsbufferten. Detta kommer att resultera i en hög koncentration av kristaller i pelleten som kan användas för datainsamling.
OBS: För att förhindra utspädning av viskösa medier öka kristallkoncentrationen i detta steg. Optimera förhållandet mellan viskös media och kristallvolym för varje prov för att få en hög koncentration av kristaller samtidigt som en hög viskositet för mediet bibehålls. Centrifugera kristalllösningen för att bilda en pellet och ta bort överskottsbuffert för att öka kristallkoncentrationen i lösningen, enligt beskrivningen i Darmanin et. al.29. - Sätt upp två 100 μL sprutor med ett ihoppar.
- Fäst ihopparet i slutet av den första sprutan och tillsätt 28 μL kristalllösning på sprutans överst. Sätt långsamt in kolven i toppen av sprutan och tryck försiktigt ner lösningen till änden av ihopstuggspetsen och ta bort eventuella luftbubblor som bildas. Gör detta genom att följa en av de två metoder som diskuteras nedan.
OBS: Mängden kristaller som ska tillsättas det höga viskösa mediet kan varieras om det inte väsentligt ändrar det totala provets viskositet.- Första metoden: Använd snabba tryckförändringar för att spräcka luftbubblorna.
- Placera försiktigt ett handskfinger på toppen av den trubbiga nålspetsen och (mycket försiktigt) tryck för att skapa en tätning. Tryck inte för mycket eftersom detta kan leda till en nålsticksskada.
- Dra nu kolven tillbaka för att dra lösningen bort från nålpunkten, detta kommer att generera en ansamling av tryck i sprutan.
- Släpp snabbt trycket högst upp på sprutan genom att ta bort det handskade fingret från den trubbiga nålspetsen. Var försiktig, om provet är för nära spetsen när fingret tas bort kan det spruta ut vilket resulterar i förlust av prov. Den snabba tryckförändringen i sprutan kommer att spräcka luftbubblorna. Upprepa tills alla bubblor har tagits bort.
- Andra metoden: Använda den "mänskliga centrifugen" för att avlägsna luftbubblor.
- Placera sprutan i ena handen med nålen vänd uppåt och kolven kilad mellan två fingrar, så att den inte kan röra sig.
- Rotera snabbt armen som håller sprutan i en riktning 2-3 gånger, den resulterande centrifugalkraften på provet kommer att tvinga ut eventuella luftbubblor ur sprutan. Var försiktig, om du gör för långsamt kan provet gå förlorat.
- Inspektera sprutan för luftbubblor, om bubblor kvarstår, upprepa steg 1.3.2.1 – 1.3.2.2 tills alla luftbubblor har avlägsnats.
- Första metoden: Använd snabba tryckförändringar för att spräcka luftbubblorna.
- Använd en fin spatel och tillsätt ~42 μL högvakuum silikonfett direkt till toppen av den andra sprutan. Tryck kolven hela vägen ner till slutet, ta bort alla luftbubblor och se till att det inte finns något luftspalt i slutet av sprutan.
OBS: Silikonfettets exakta sammansättning är inte kritisk eftersom det fungerar som en inert bärare. Ett viskositetsvärde på >10 Pa.s eller förhållandet mellan cirka 60:40 silikonfett och kristalllösning är optimalt för injektion, men det är möjligt att detta kan variera beroende på provet. Justera volymen av kristalllösning som tillsätts silikonfettet för att optimera kristallkoncentrationen i blandningen, som beskrivs i diskussionen. Andra högviskösa medier än silikonfett kan användas så länge de är kompatibla medprovet 30,31,32,33. - Se till att det inte finns några luftbubblor i någon av de två sprutorna och fäst sprutorna tillsammans med hjälp av ihopsprutan. Håll sprutorna vertikalt genom att greppa precis slutet av sprutan eftersom uppvärmning av sprutan på grund av värmen som genereras från fingrarna kan påverka provet.
- Blanda provet genom att försiktigt trycka kolven på kristalllösningssidan så att den blandas i silikonfettet och tryck sedan kolven på silikonfettsidan så att provet trycks tillbaka mot kristalllösningssidan. Upprepa försiktigt denna process 50 till 100 gånger så att provet blandas noggrant och ser homogent ut.
OBS: Om kristallerna odlas direkt i mycket trögflytande medier (t.ex. lipidisk kubikfas, LCP) krävs inte steg 1.1–1.6. Protokoll för odling av kristaller i sprutorna finns i Liu et.al. 34,35. Följ upp det här protokollet till provkonsolidering, steg 10, där allt prov nu finns i en spruta och kristalliseringsbufferten tas bort. Tillägget av 7.9MAG krävs inte för detta protokoll. Ta istället bort all överflödig vätska från sprutan genom att försiktigt trycka ner kolven i provet tills ingen mer vätska finns kvar i sprutan. - Visualisera kristallerna under ett optiskt mikroskop antingen genom sprutan eller, för bästa resultat, extrahera en liten mängd (~ 1 μL) på en glasrutschbana och placera en täckslir på toppen.
- Kontrollera kristallkoncentrationen.
- Bestäm kristallkoncentrationen i silikonfettet genom att räkna antalet kristaller i ett visst område med hjälp av de optiska mikroskopbilderna. För bästa resultat är en hög densitet av kristaller som fördelas jämnt i hela mediet idealisk (>106 kristaller/ml) för att få en hög kristallträffhastighet.
- Justera kristallkoncentrationen i sprutan genom att ändra förhållandet mellan kristaller och viskösa medier i steg 1.3 och 1.4.
- För att minska kristallkoncentrationen, späd kristallerna i sprutan genom att öka mängden silikonfett/HV-media i steg 1.4 eller genom att späda ut kristallpelleten i lösning med kristalliseringsbufferten innan sprutorna sätts upp i steg 1.1.
- För att öka kristallkoncentrationen, minska mängden silikonfett i steg 1.4 men var uppmärksam på att inte minska viskositeten under 10 Pa.s.
OBS: Kristallkoncentrationen som rapporterades här optimerades för detta specifika prov och kristallstorlek. Den idealiska kristallkoncentrationen beror dock på kristallstorlek, strålstorlek, nålens inre diameter (ID) och incidentröntgenflödet. Detta kan bestämmas från träfffrekvensen med en optimal träfffrekvens på ~ 30% som anses vara "bra". I praktiken måste kristallkoncentrationen optimeras för olika prover under stråltiden för att uppnå önskad träffhastighet. Börja med en hög koncentration av kristaller, 109 kristaller/ml. Förfarandet för att justera kristallkoncentrationen ges i Liu et.al. 35. I artikel 35 i eu 20
- Protokollet kan pausas här tills injektorn är klar för datainsamling.
- Om kristallerna odlas i LCP, försegla dem och låt dem stanna i sprutor i upp till några dagar vid rumstemperatur.
- Om kristallerna har överförts till ett annat högvisköst medium (t.ex. silikonfett) bör ett stabilitetstest av kristallerna över tiden utföras före mätningen. Detta avgör hur länge kristallerna är stabila i inert media (helst > 8 h) och tidsgränsen för datainsamling. Här var lysozymekristaller stabila i flera dagar i silikonfett och visade inga tecken på upplösning när de inspekterades med hjälp av ett optiskt mikroskop.
- Flytta hela provet till en spruta innan du kopplar bort kopplingen. Koppla bort kopplingen från sprutan och fäst injektionsnålen. Skruva fast nålen ordentligt i sprutans botten och se till att den är ordentligt fastsatt för att förhindra läckage. En 108 μm ID-nål (nållängd 13 mm, punktstil 3) användes för detta experiment. Beroende på kristallstorlek och strålstorlek fäster antingen en 51 μm eller 108 μm ID-nål.
OBS: Förtestning av provströmmen före stråltid krävs för att kunna välja rätt injektornålstorlek. Beroende på provegenskaperna (dvs. viskositet, laddning, buffertsammansättning) och nål-ID:t kommer proverna att flöda annorlunda. Därför rekommenderas att testa en mängd olika nålstorlekar för att producera den mest stabila strömmen med minsta möjliga ID-nål för att maximera signal-till-brusförhållandet under datainsamlingen. - Om injektorn redan är monterad och justerad på strållinjen, flytta till sektion 3 och montera provsprutan direkt på injektorn.
Protokollet kan pausas här.
2. Injektormontering och styrning
- Montera injektorn på strållinjen. Ta bort det kryogena munstycket på MX2-strållinjen och ersätt det med injektorn. Lossa klämskruven som håller det kryogena munstycket och fäst det på fästet bredvid det motoriserade stadiet.
- Lyft upp injektorn från vagnen genom att hålla i det svarta handtaget och placera den på den motoriserade scenen.
- För att fästa injektorn på det motoriserade stadiet; dra åt den svarta fastspänningsskruvvredet.
- Montera en tom spruta på injektorn
- I injektordatorkontrollgränssnittet (dvs. EPOS-positionskontrollprogramvara) väljer du Homing Mode under Verktyg i programvarumenyn. Välj sedan Negative Limit Switch och Starta Homing, låt programvaran köras tills skruven är indragen tillräckligt för att sprutan ska passa under skruven. Om gränsbrytaren lämnas att köras utan uppsikt stoppas skruven automatiskt.
- Montera en tom (dummy) spruta på injektorn genom att föra in nålen genom slitsen i spruthållaren. Sätt upp sprutan mot fästet.
- Fäst sprutan med två O-ringar.
- Linda den första O-ringen över mitten av sprutan och fäst den på krokarna på vardera sidan av sprutan.
- Slinga den andra O-ringen runt krokarna på sprutans övre del och sätt sedan en del av O-ringen på toppen av glassprutan enligt demonstrationen och figur 1B.
- Rikta injektorn mot röntgenstrålen
- Flytta det motoriserade stadiet med injektorn mot röntgeninteraktionspunkten via beamline-styrprogramvaran. Detta kan visualiseras med hjälp av den infogade kameran. Strålens storlek och position betecknas med ett rött kors på skärmen och det motoriserade stadiet kan flyttas för att justera nålen med röntgeninteraktionsregionen.
- Justera scenens x- och y-läge för att rikta nålen mot röda korset.
- Justera z-läget tills nålspetsen kommer i fokus.
- Kontrollera nålspetsens och röntgenstrålens inriktning visuellt genom att kontrollera att sprutspetsen uppfyller de hårkors som är synliga i den optiska mikroskopbilden som genereras av strålkameran.
- När nålspetsen är i linje flytta spetsen ovanför hårkorset ~100 μm. Detta eliminerar röntgenspridning från nålspetsen.
OBS: Montering och justering av injektorn på MX2-strållinjen vid synkrotronen måste utföras av strållinjeforskarna och kan slutföras på mindre än 30 minuter.
3. Montering av provsprutan
- Byt ut den tomma sprutan mot provsprutan genom att följa steg 2.3.
- Placera injektorlocket på provsprutans kolvhuvud.
- Flytta drivskruven till lockets överst.
- Välj Hastighetsläge i injektorkontrollprogrammet.
- Mata in 3 000 varv/min (~115 nL/s) som inställningsvärde och tryck på Använd inställningsvärde.
- När drivskruven vidrör locket på sprutkolvens huvud, stoppa motorn.
- Ställ in varvtalsvärdet på noll i injektorkontrollprogramvaran genom att ändra inställningsvärdet till "0" när skruven närmar sig locket.
- När kontakten är gjord aktiverar du det förinställda värdet genom att trycka på Använd inställningsvärde för att stoppa skruven direkt.
- Vicka försiktigt på locket för att se till att det hålls ordentligt på plats.
OBS: När ett nytt set-värde anges i rutan Inställningsvärde i kontrollprogramvaran aktiveras det först efter att du har tryckt på Använd inställningsvärde.
4. Kör injektorn
- När lockets drivskruv har fått fast kontakt med kolvens överst ändrar du varvtalets inställningsvärde till 100. Detta motsvarar ~ 4 nL/s.
- Inspektera nålspetsen visuellt när provet först kommer ut eller titta på nålens strållinjekamerabild för att observera när provet börjar extrudera från nålspetsen.
- Gör en sökning av hyddan, stäng hutchdörren och sätt på röntgenstrålen. Från denna punkt måste injektorn fjärrstyras utanför hyddan.
- Justera varvtalet tills en stabil ström genereras.
- Minska varvtalets inställningsvärde till 90.
- Upprepa steg 4.4.1, vilket minskar varvtalets inställningsvärde i steg om 10, för att sakta ner strömmen men ändå upprätthålla en stabil ström. För silikonfett användes ett värde på 30 varv/min.
OBS: Det typiska varvtalsområdet varierar mellan 30 – 100 varv/min (1 – 4 nL/s) beroende på provegenskaper och röntgenexponeringstid. I allmänhet bör varvtalet justeras för att producera det långsammaste flödet (för att minimera provförbrukningen) samtidigt som en stabil ström bibehålls.
- Hantera en exempel ström som inte flödar bra.
- Fortsätt att öka varvtalsinställningsvärdet i steg om 10 tills strömmen blir rakare. Om strömmen inte stabiliseras, även efter att rpm-inställningsvärdet har ökats till det maximala värdet på 100 varv/min, försök att förbättra stabiliteten genom att implementera en av de två metoder som beskrivs nedan.
- Första metoden: Sätt in en polystyrenprovfångare under provströmmen för att hjälpa till att styra provet. Den här metoden fungerar bra för högddade exempel strömmar.
- Andra metoden: Sätt i en venturisugtratt i provfångaren. För att tillföra luft till tratten, anslut den till luftutloppsröret som ligger i hyddan. Denna metod kan bidra till att styra och stabilisera provflödet oberoende av flödets laddning.
- Fortsätt att öka varvtalsinställningsvärdet i steg om 10 tills strömmen blir rakare. Om strömmen inte stabiliseras, även efter att rpm-inställningsvärdet har ökats till det maximala värdet på 100 varv/min, försök att förbättra stabiliteten genom att implementera en av de två metoder som beskrivs nedan.
- När en konstant och jämn ström har uppnåtts startar du datainsamlingen och optimerar detektoravståndet enligt ett normalt röntgenkristallografiexperiment.
OBS: Varvtalet konverteras till flödeshastighet med hjälp av den medföljande konverteringstabellen i tilläggsinformationen Lipidico Device Calculator. Ange varvtalsvärdet, nåldiametrar och sprutvolymer för att beräkna flödeshastigheten med hjälp av denna kalkylator.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lipidico är ett HVI byggt som ett alternativt leveranssystem för användning på MX2 (Figur 1). Den är idealisk för SX där kristaller antingen odlas i lipidisk kubikfas eller överförs till ett högt trögflytande inert medium.
För att demonstrera injektorapplikationen användes silikonfett blandat med lysozymekristaller för att samla in SX-data vid MX2-strållinjen vid den australiska synkrotronen. För att montera injektorn på MX2-strållinjen avlägsnas det kryogena munstycket och ersätts av injektorn enligt figur 1. Sprutproverna monteras direkt på injektorn och fästs med O-ringar(figur 1B). Datainsamling kan initieras inom några minuter efter en exempeländring. Injektorn är utformad för snabb provkontroll med en enkel installation som är lätt att använda för användare som inte är bekanta med SX.
Figur 1: Bilder av Lipidico, en trögflytande injektor som används vid den australiska synkrotronen för SX-experiment. (A) Visar ett foto av Lipidico inkorporerat i MX2. Den röda pilen anger röntgenstrålens riktning. B)En närmare bild av provhållarregionen på Lipidico. Sprutan hålls på plats av två O-ringar och provet samlas i fångaren. d)En närbild av provströmmen som visar injektornålen och provavfallsfångaren som kan ändras för att inkorporera en polystyren/venturisugningsfångare som ses under nålen i (A). Siffran har anpassats från Berntsen et. 201923 med tillstånd av AIP Publishing. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Injektorn är kompatibel med olika typer av mycket trögflytande bärare. Den optimala provkörningshastigheten för injektorn är avgörande för strömstabiliteten, för långsam kommer att orsaka en curlingeffekt / strömexpansion och för snabbt kommer att resultera i att strömmen bryts upp. Den optimala hastigheten varierar beroende på vilket bärarsystem som används. Figur 2 och figur 3 visar silikonfett som testats med olika injektorhastigheter och visar hur strömbeteendet kan variera. Ett långsamt flöde(figur 2A,2,3 nL/s) resulterar i expansion av silikonfettet som extruderas från injektorn samtidigt som ett snabbare flöde(figur 2C,6,6 nL/s) ger en tunnare ström. Curling av den trögflytande medieströmmen har regelbundet observerats (figur 3A). För att övervinna denna fråga testades två innovativa lösningar: en polystyrenfångare och en venturisugtratt under nålen. Polystyrenfångaren inför en svag elektrostatisk kraft och fungerar bäst på högladdningsprover, som i fallet med silikonfett (figur 3B), medan venturisugtratten hjälper till att styra strömmen vertikalt nedåt till fångaren, oberoende av provladdning. Beroende på provets egenskaper kan båda alternativen användas framgångsrikt.
Figur 2: Effekten av en hög trögflytande bärvåg med olika injektorhastigheter. 100% silikonfett testades vid olika provhastigheter för att bedöma dess flödesegenskaper. a )I artikel 3.1 skall . 2,3 nL/s (30 varv/min), (B) 3,5 nl/s (90 varv/min) och(C)6,6 n/s (170 varv/min). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Strömbeteende av 100% silikonfett som visar curling av viskösa medier. a)Curlingeffekt vid 2,3 nl/s (30 varv/min) (B) Effekten av att tillsätta polystyrenfångaren till provavfallshållaren med injektorhastigheten i drift vid 2,3 nL/s (30 varv/min). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
En glasspruta innehållande 26 μL lysozymekristaller (kristallstorlek 10 μm x 10 μm x 20 μm) upphängd i silikonfett användes (figur 4A). Lipidico genererade en konstant provström med hjälp av 108 μm nål-ID, med ett genomsnittligt flöde på 1,14 nL/s (med motorn inställd på 30 varv/min). En toppsökningsalgoritm36 användes för att bedöma träfffrekvensen och en tillräcklig mängd data (totalt 224 200 bilder) samlades in inom 38 minuters datainsamlingstid, vilket möjliggör strukturhämtning (PDB-kod 6MQV). Tabell 1 innehåller en sammanfattning av datainsamlingsstatistiken och figur 4B visar en representativ bild av elektrontäthetskartan som omger en av di-sulfidbindningarna i lysozymestrukturen20.
Bild 4: Lysozyme-bilder. A)Optiska bilder av lysozymekristallerna i silikonfett. En korspolariserad (40x förstoring) bild av lysozyme kristaller blandas med en hög trögflytande media, silikonfett, avbildas med hjälp av ett synligt ljusmikroskop. Kristallernas storlek varierar mellan 15 och 20 μm och (B) En representativ bild av elektrontäthetskartan (2Fo-Fc, 1σ) som omger lysozymes disulfidbindningar. Siffran har anpassats från Berntsen et. 201923 med tillstånd av AIP Publishing. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Kompletterande information. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tabell 1: Sammanfattningstabell som visar SX-datastatistik från Lipidico. Lysozyme kristaller blandades med en hög viskös media, silikon fett och strömmas genom röntgen interaktion regionen av MX2 beamline. Detta är en sammanfattning av den fullständiga resultattabellen som publicerats i Berntsen et. al.23. Tabellen är här anpassad med tillstånd från AIP Publishing.
| Datastatistik | Lipidico, MX2 strållinje |
| Detektor | Dectris EIGER X 16M, |
| Bildfrekvens | 100 Hz |
| Avstånd för provdetektor (mm) | 300 |
| Röntgenenergi (KeV) | 13 |
| Strålstorlek (WxH) (μm) | 12x22 |
| Nej. av ramar | 224200 |
| Träfffrekvens (%) | 2.95 |
| Nej. av indexerade ramar | 4852 |
| Beslut (Å) | 17.74-1.83 |
| Fullständighet | 99.44 |
| Rymdgrupp | P43212 |
| Enhetscell | |
| a, b, c (Å) | 78.68, 78.68, 34.48 |
| α, β, γ (°) | 90, 90, 90 |
| I/σ(I) | 5.08 |
| Redundans | 73.97 |
| CC1/2 | 0.96 |
| R-arbete/R-fritt | 0.18/0.26 |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En alternativ HVI har utvecklats, perfekt för att utföra SX-experiment på synkrotronkällor. Det har två viktiga fördelar jämfört med befintliga HVIs. För det första är det enkelt att installera på strållinjen vilket möjliggör snabb växling mellan konventionell kristallografi och SX, bara ~ 30 minuter krävs för installation och justering på MX2. För det andra kan provsprutorna som används för att odla kristaller användas direkt som reservoarer för injektion, vilket begränsar slöseriet under provöverföringen. Protokollet för att ändra prover har beskrivits och demonstrerats. Konstruktionen eliminerar behovet av en komplicerad gasström för att styra jeten jämfört med andra HVIs. En enkel process för att ändra injektorns flödeshastighet visades som kan justeras utan fördröjd respons.
De viktigaste stegen för framgångsrik SX-datainsamling är att optimera kristallkoncentrationen, få en homogen blandning av höga viskösa medier och producera en stabil ström för datainsamling. Den optimala kristallkoncentrationen och homogeniteten kan uppnås genom att centrifugera kristallerna ner till en pellet och lägga till en högre koncentration av kristaller till bärarmediet, vilket säkerställer att provet blandas noggrant i ihopparningssystemet. När kristallkoncentrationen är optimerad kan injektorflödet enkelt justeras under stråltiden för att få en stabil ström. Curling av den viskösa strömmen observeras ofta med höga viskösa prover. Två lösningar presenteras: användning av en polystyrenprovfångare för laddade prover eller tillsats av en venturisugtratt som fungerar som fångare. Detta har lyckats kontrollera strömmen i de första testerna, men under olika provförhållanden kan curling av strömmen resultera i att provet fastnar på nålpunkten. Det är möjligt att detta kan övervinnas genom att ändra nålens ytladdningsegenskaper genom att lägga till speciella beläggningar. Nålar belagda med olika kemikalier (dvs. silikon) har tidigare framgångsrikt anpassats för användning med vätskehanteringsrobotar och kan specialbeställas från tillverkare för att passasprutan 37.
Injektorn är inte begränsad till silikonfett och kan användas tillsammans med andra mycket trögflytande vätskor. Flera olika alternativ harvisats 23 som framgångsrikt kan användas för kristallinjektion och beskrivs i ett antal andra publikationer22,30,33. Den övre gränsen för provviskositet med denna HVI är fortfarande under utredning, men provviskositeter på upp till 25 Pa.s (med 100 % silikonfett) har resulterat i en stabil ström. När provviskositeten sänktes till <10 Pa.s (med 70 % silikonfettprov) kunde det dock inte produceras någon tillförlitlig ström. Därför representerar 10 Pa.s den nuvarande nedre gränsen för provviskositet för injektion med denna HVI. Nål-ID:t är också en viktig faktor. Även om 51 μm ID framgångsrikt testades medan man injicerade olika bärare utan kristaller, stör införandet av kristaller provflödet. Beroende på deras storlek, med kristaller som introduceras i matrisen, finns det därför en mycket högre sannolikhet för blockering när du använder 51 μm ID-nålen jämfört med den större nålstorleken. När en blockering inträffar kan en kritisk ansamling av tryck uppstå, i andra injektorer kan detta leda till sprutbrott. Utformningen av denna HVI inkluderar dock en säkerhetsmekanism där drivmekaniken drar sig bort från sprutkolven om trycket blir för högt tills en avaktiveringsbrytare är aktiverad. Detta resulterar i att enheten stoppas och förhindrar att glassprutan går över.
Det finns flera begränsningar för denna injektor. Injektorn är särskilt utformad för mycket trögflytande prover, därför kan flytande liknande prover inte användas direkt för provleverans. För att övervinna denna begränsning kan kristaller som odlas i buffertsystem blandas med ett lämpligt inert medium enligt beskrivningen i steg 1, men det finns en möjlighet att kristallen kan bli instabil. Screening av en mängd olika inerta medier26,27,28,29 bör därför undersökas först för att säkerställa att provstabiliteten upprätthålls. För det andra kommer kristallens storlek och kristallförpackningens kvalitet att påverka diffraktionskvaliteten. MX2-strållinjen arbetar med en optimal strålstorlek på 22 x 12 μm (H x W) och flöde ~1012 fotoner/s. Den optimala kristallstorleken för att utföra SX vid MX2 är ~10 μm och har visat sig ge ett högt signal-till-brusförhållande. Det är dock möjligt att samla in data om mindre kristaller om de är väl beställda och diffract till högupplöst. Det finns ett alternativ att skära ner strålstorleken vid denna balklinje till ~ 7,5 μm, men detta kommer till en kostnad eftersom det minskar incidentflödet som måste beaktas under experimentet.
Utvecklingen av denna injektor gör SX lättillgängligt för vanliga kristallografer. Den framgångsrika driften av Lipidico öppnar dörren till en snabb och enkel metod för SX-datainsamling på en mängd olika synkrotronkällor. Det möjliggör insamling av rumstemperaturdata på kristaller som är 10 μm eller mindre vid MX2, vilket begränsar strålningsskadorna för enskilda kristaller. Det ger också en ny möjlighet i Australien att genomföra millisekekunder tid löst SX som är den nuvarande toppmoderna för kristallografer. Framtida tillämpningar av detta injektorsystem sträcker sig till röntgenkarakterisering av mycket trögflytande material med hjälp av Small Angle X-ray Scattering (SAXS) så att injektorn lätt kan anpassas till andra strållinjer vid den australiska synkrotronen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
MK arbetar för Kusel-design. Kusel Design, en anpassad laboratorieenhetsutvecklare, anlitades av Dr Peter Bentsen vid La Trobe University och Dr Tom Caradoc-Davies från ANSTO och för att utveckla en billig enhet för att möjliggöra höga viskösa studier i MX2-strållinjen vid Australian Synchrotron. Enheten utvecklades i nära samråd med Dr. Caradoc-Davies. Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Australian Research Council Centre of Excellence in Advanced Molecular Imaging (CE140100011) (http://www.imagingcoe.org/). Denna forskning utfördes delvis med hjälp av MX2-strållinjen vid Australian Synchrotron, en del av ANSTO, och använde sig av Australian Cancer Research Foundation (ACRF) detektor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hen eggwhite lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | Used to grow crystals for testing the injector and the crystals are transferred into silicon grease. https://www.sigmaaldrich.com/ |
| High vacuum silicon grease | Dow Corning | Z273554-1EA | Used for testing of injector. https://www.sigmaaldrich.com/ |
| Injector needle (108 µm ID) | Hamilton | part No: 7803-05 | www.hamiltoncompany.com |
| Glass gas-tight syringes, 100 µl | Hamilton | part no: 7656-01 | Syringes used for sample injection. www.hamiltoncompany.com |
| LCP syringe coupler | Formulatrix | 209526 | Syringe coupler to mix the samples |
| Lipidico injector | La Trobe Univerity/ANSTO | This is a specific piece of equipment that can be accessed through La Trobe University / ANSTO Australian Synchrotron Facility |
References
- Boutet, S., et al. High-resolution protein structure determination by serial femtosecond crystallography. Science. 337 (6092), 362-364 (2012).
- Spence, J. C. H., Weierstall, U., Chapman, H. N. X-ray lasers for structural and dynamic biology. Reports on Progress in Physics. 75 (10), 102601 (2012).
- Aquila, A., et al. Time-resolved protein nanocrystallography using an X-ray free-electron laser. Optics Express. 20 (3), 2706-2716 (2012).
- Schlichting, I. Serial femtosecond crystallography: the first five years. International Union of Crystallography. 2, 246-255 (2015).
- Lee, D., et al. Nylon mesh-based sample holder for fixed-target serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 9, 6971 (2019).
- Martin, A. V., et al. Fluctuation X-ray diffraction reveals three-dimensional nanostructure and disorder in self-assembled lipid phases. Communications Materials. 1 (1), 1-8 (2020).
- Roedig, P., et al. High-speed fixed-target serial virus crystallography. Nature Methods. 14 (8), 805 (2017).
- Chapman, H. N., et al.
- Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nature Communications. 5, 3309 (2014).
- Weierstall, U. Liquid sample delivery techniques for serial femtosecond crystallography. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 369 (1647), 20130337 (2014).
- Gati, C., et al. Atomic structure of granulin determined from native nanocrystalline granulovirus using an X-ray free-electron laser. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2247-2252 (2017).
- Nam, K. H. Sample delivery media for serial crystallography. International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1094 (2019).
- Batyuk, A., et al. Native phasing of x-ray free-electron laser data for a G protein-coupled receptor. Science Advances. 2 (9), 1600292 (2016).
- Kern, J., et al. Structures of the intermediates of Kok's photosynthetic water oxidation clock. Nature. 563 (7731), 421 (2018).
- Suga, M., et al. An oxyl/oxo mechanism for oxygen-oxygen coupling in PSII revealed by an x-ray free-electron laser. Science. 366 (6463), 334-338 (2019).
- Tenboer, J., et al. Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein. Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).
- Pande, K., et al. Femtosecond structural dynamics drives the trans/cis isomerization in photoactive yellow protein. Science. 352 (6286), 725-729 (2016).
- Ishigami, I., et al. Snapshot of an oxygen intermediate in the catalytic reaction of cytochrome c oxidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3572-3577 (2019).
- Nango, E., et al. A three-dimensional movie of structural changes in bacteriorhodopsin. Science. 354 (6319), 1552-1557 (2016).
- Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation. International Union of Crystallography. 2, 168-176 (2015).
- Nogly, P., et al. Retinal isomerization in bacteriorhodopsin captured by a femtosecond x-ray laser. Science. 361 (6398), (2018).
- Martin-Garcia, J. M., et al. Serial millisecond crystallography of membrane and soluble protein microcrystals using synchrotron radiation. International Union of Crystallography. 4, 439-454 (2017).
- Berntsen, P., et al. The serial millisecond crystallography instrument at the Australian Synchrotron incorporating the "Lipidico" injector. Review of Scientific Instruments. 90 (8), 085110 (2019).
- Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallographica Section D-Structural Biology. 71, 387-397 (2015).
- DePonte, D. P., Nass, K., Stellato, F., Liang, M., Chapman, H. N. Sample injection for pulsed X-ray sources. Advances in X-Ray Free-Electron Lasers: Radiation Schemes, X-Ray Optics, and Instrumentation: Proceedings of Society of Photo-Optical Instrumentation Engineers. Tschentscher, T., Cocco, D. , Prague, Czech Republic. 8078 (2011).
- Park, S. Y., Nam, K. H. Sample delivery using viscous media, a syringe andasyringe pump for serial crystallography. Journal of Synchrotron Radiation. 26, 1815-1819 (2019).
- Shimazu, Y., et al. High-viscosity sample-injection device for serial femtosecond crystallography at atmospheric pressure. Journal of Applied Crystallography. 52, 1280-1288 (2019).
- Kovacsova, G., et al. Viscous hydrophilic injection matrices for serial crystallography. International Union of Crystallography. 4, 400-410 (2017).
- Darmanin, C., et al. Protein crystal screening and characterization for serial femtosecond nanocrystallography. Scientific Reports. 6, 25345 (2016).
- Conrad, C. E., et al. A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography. International Union of Crystallography. 2, 421-430 (2015).
- Sugahara, M., et al. Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography. Nature Methods. 12 (1), 61-63 (2015).
- Sugahara, M., et al. Oil-free hyaluronic acid matrix for serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 6, 24484 (2016).
- Fromme, R., et al. Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase. International Union of Crystallography. 2, 545-551 (2015).
- Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography. Journal of Visualized Experiments. (115), e54463 (2016).
- Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography. Nature Protocols. 9 (9), 2123-2134 (2014).
- Hadian-Jazi, M., et al. A peak-finding algorithm based on robust statistical analysis in serial crystallography. Journal of Applied Crystallography. 50, 1705-1715 (2017).
- Kong, F. W., Yuan, L., Zheng, Y. F., Chen, W. D. Automatic Liquid Handling for Life Science: A critical review of the current state of the art. Journal of Laboratory Automation. 17 (3), 169-185 (2012).
