Summary
Цель этого протокола состоит в том, чтобы продемонстрировать, как подготовить серийные образцы кристаллографии для сбора данных на высоком вязком инжекторе, Lipidico, недавно введенном в эксплуатацию в австралийском синхротроне.
Abstract
На австралийском синхротроне разработана система для проведения серийных измерений кристаллографии. Этот объект включает в себя специально построенный высоковязкий инжектор, Lipidico, как часть макромолекулярной кристаллографии (MX2) луч для измерения большого количества мелких кристаллов при комнатной температуре. Цель этого метода заключается в том, чтобы позволить кристаллы, которые будут выращиваться / передаваться в стеклянные шприцы, которые будут использоваться непосредственно в инжектор для последовательного сбора данных кристаллографии. Преимущества этого инжектора включают способность быстро реагировать на изменения скорости потока без прерывания потока. Существует ряд ограничений для этого высоковязкого инжектора (HVI), которые включают в себя ограничение на разрешенную вязкость образца до 10 па.с. Стабильность потока также потенциально может быть проблемой в зависимости от конкретных свойств образца. Здесь представлен подробный протокол о том, как настроить образцы и эксплуатировать инжектор для серийных измерений кристаллографии на австралийском синхротроне. Метод демонстрирует подготовку образца, в том числе передачу кристаллов лизозима в высоковязкие средства массовой информации (силиконовая смазка), а также работу инжектора для сбора данных на MX2.
Introduction
Серийная кристаллография (SX) является метод, который был разработан первоначально в контексте рентгеновских свободных электронных лазеров (XFELs)1,2,3,4. Хотя фиксированные целевые подходы могут быть использованы для SX5,6,7, как правило, инъекционные системы используются для доставки кристаллов в непрерывном потоке к рентгеновскому лучу. Поскольку он сочетает в себе данные из большого количества кристаллов, SX избегает необходимости любого выравнивания кристалла во время эксперимента, и позволяет собирать данные прикомнатной температуре 8,9. С помощью подходящего инжектора кристаллы потекли один за другим в область рентгеновского взаимодействия, и полученные данные дифракции собираются на детектореобласти 9,10. На сегодняшний день, SX был успешным в решении рядабелковых структур 1,11, 12,13в томчислекристаллы слишком малы, чтобы измерить с помощью обычной кристаллографии. Он также предоставил новые идеи в время решена молекулярной динамики, используя фемтосекундный пульс продолжительность XFEL. Путем инициирования насос-зонд реакции с оптическими лазерными источниками, углубленные исследования были проведены нафотосистеме II 14,15, фотоактивный желтый белок16,17, цитохром Cоксидазы 18, а также бактериофодопсин19,20,21. Эти исследования исследовали динамику передачи электронов, которые происходят после активации света, демонстрируя значительный потенциал серийной кристаллографии для понимания времени решенных биологических процессов.
Развитие серийной кристаллографии также становится все более распространенным присинхротронных источниках 9,12,20,22,23,24. Синхротрон на основе SX позволяет эффективно измерять большое количество отдельных кристаллов при комнатной температуре с помощью соответствующей инжекторной системы. Этот подход подходит для небольших кристаллов, следовательно, в дополнение к необходимости быстрого детектора частоты кадров для сбора данных, микро-ориентированный луч также требуется. По сравнению с обычной кристаллографией, SX не предполагает монтажа и выравнивания отдельных кристаллов в рентгеновском луче. Поскольку данные из большого количества отдельных кристаллов сливаются, доза радиации, полученная каждым кристаллом, может быть существенно снижена по сравнению с обычной кристаллографией. Синхротрон SX также может быть применен к изучению реакций, решенных по времени, вплоть до миллисекундного режима, при условии наличия детектора с достаточно высокой частотой кадров (например, 100 Гц и более). Несколько серийных экспериментов кристаллографии были проведены на синхротроне с использованием инжекторов, которые были первоначально разработаны в источниках XFEL20,22,23. Двумя наиболее распространенными типами инжекторов являются Gas Dynamic Virtual Nozzle (GDVN)25 и High Viscous Injector (HVI)9,24,26,27,28. GDVN идеально подходит для введения низкой вязкости, жидких образцов, но требует высоких скоростей потока для достижения стабильных потоков, что, в свою очередь, приводит к высоким показателям потребления выборки. В отличие от этого, HVI подходят для образцов высокой вязкости, что позволяет создавать стабильный поток при гораздо более низких скоростях потока, что приводит к гораздо более низкому потреблению выборки. Таким образом, инжектор HVI выступает за доставку образцов, в которых предпочтительнее вязкий носитель (например, липидная основе мембранных белков) и/или большое количество образцов. SX инжекторы, как правило, сложны в использовании и требуют обширной подготовки для работы. Они также включают в себя длительные протоколы передачи образцов, так как образец должен быть загружен в специализированный резервуар, это, как правило, имеет высокий риск, связанный с его образца теряется либо в "мертвый объем" или через утечки в соединениях. Поэтому желательно оптимизировать конструкцию инжектора, чтобы смягчить любые потери до того, как образец достиг рентгеновского луча.
Недавно были опубликованы первые результаты SX с использованием Lipidico23 с лизозимной мишенью с помощью детектора Eiger 16M. Эта конструкция инжектора ограничивает потери образца, минимизируя количество шагов, участвующих в переходе от первоначальной кристаллизации к передаче кристаллов в инжектор с последующим доставкой образца в рентгеновский луч. Эта рукопись описывает и демонстрирует процедуру передачи образца, начиная с подготовки образца, переходя к процессу инъекций и, наконец, сбора данных, используя тот же сосуд кристаллизации. Описана также работа инжектора.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Приготовление кристаллов в высокой вязкой оболочке с использованием стеклянных шприцев
- Центрифуга кристаллического раствора осторожно (1000 х г , 10 мин при 22 градусов по Цельсию), чтобы сформировать мягкий кристаллический гранулы и удалить избыток буфера. Это приведет к высокой концентрации кристаллов в гранулах, которые могут быть использованы для сбора данных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для предотвращения разбавления вязких средств массовой информации увеличить концентрацию кристалла на этом этапе. Оптимизируйте соотношение вязких средств массовой информации и кристаллического объема для каждого образца, чтобы получить высокую концентрацию кристаллов, сохраняя при этом высокую вязкость для средств массовой информации. Центрифуга кристаллический раствор, чтобы сформировать гранулы и удалить избыток буфера для увеличения концентрации кристалла в растворе, как описано в Darmanin и. эл.29. - Установите два шприца по 100 йл с парой.
- Прикрепите парпер к концу первого шприца и добавьте 28 мкл кристаллического раствора в верхнюю часть шприца. Медленно вставьте поршень в верхней части шприца и осторожно нажмите раствор до конца кончика пары, удаляя любые пузырьки воздуха, которые образуются. Сделайте это, следуя одному из двух методов, обсуждаемых ниже.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем кристаллов, которые будут добавлены в высокие вязкие средства массовой информации могут быть разнообразны, если это не существенно изменить вязкость общего образца.- Первый метод: Используйте быстрые изменения давления, чтобы лопнуть пузырьки воздуха.
- Аккуратно поместите один палец в перчатке на верхней части притупленной точки пары иглы и (очень мягко) применить давление, чтобы создать уплотнение. Не применять слишком много давления, как это может привести к травме иглы палкой.
- Теперь потяните поршень назад, чтобы сделать решение от иглы точки, это будет генерировать накопление давления в шприце.
- Быстро отпустите давление в верхней части шприца, удалив палец в перчатках из притупленного кончика иглы. Будьте осторожны, если образец находится слишком близко к кончику, когда палец удаляется он может распылить в результате потери образца. Быстрое изменение давления внутри шприца лопнет пузырьки воздуха. Повторяйте до тех пор, пока все пузырьки не будут удалены.
- Второй метод: использование «человеческой центрифуги» для удаления пузырьков воздуха.
- Поместите шприц в одну руку с иглой вверх и поршень вклинивается между двумя пальцами, так что он не может двигаться.
- Быстро поверните руку, удерживая шприц в одном направлении 2-3 раза, в результате центробежной силы на образец заставит любые пузырьки воздуха из шприца. Будьте осторожны, если сделать слишком медленно образец может быть потерян.
- Осмотрите шприц на пузырьки воздуха, если пузырьки остаются, повторите шаги 1.3.2.1 - 1.3.2.2, пока все пузырьки воздуха не будут удалены.
- Первый метод: Используйте быстрые изменения давления, чтобы лопнуть пузырьки воздуха.
- Используя тонкий шпатель, добавьте 42 мкл высокой вакуумной силиконовой смазки непосредственно в верхнюю часть второго шприца. Нажмите поршень вплоть до конца, удаляя все пузырьки воздуха и обеспечения того, чтобы нет воздушного зазора в конце шприца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Точный состав силиконовой смазки не является критическим, поскольку он выступает в качестве инертного носителя. Значение вязкости в размере 10 па.с. или отношение примерно 60:40 силиконовой смазки к кристаллическому раствору является оптимальным для инъекций, однако, возможно, это может варьироваться в зависимости от точных характеристик образца. Отрегулируйте объем кристаллического раствора, добавленного в силиконовую смазку, чтобы оптимизировать концентрацию кристалла в смеси, как указано в обсуждении. Высоковязкие средства массовой информации, кроме силиконовой смазки могут быть использованы до техпор,пока они совместимы собразцом 30,31,32,33. - Убедитесь, что нет пузырьков воздуха в любом из двух шприцев и прикрепить шприцы вместе с помощью парпера. Держите шприцы вертикально, схвитя только конец шприца, как разогрев шприца из-за тепла, генерируемого от пальцев может повлиять на образец.
- Смешайте образец вместе, мягко угнетая поршень на стороне кристаллического раствора, так что он смешивается в силиконовую смазку, а затем нажмите поршень на стороне силиконовой смазки, так что он толкает образец обратно в сторону кристаллического раствора. Аккуратно повторите этот процесс от 50 до 100 раз, чтобы образец был тщательно смешан и выглядитоднородно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если кристаллы выращиваются непосредственно в высоковязких средствах массовой информации (например, липидной кубической фазе, LCP), шаги 1.1-1.6 не требуются. Протоколы для выращивания кристаллов в шприцах можно найти в Лю et.al. 34,35. Следуйте этому протоколу до консолидации выборки, шаг 10, где весь образец теперь содержится в одном шприце и буфер кристаллизации удаляется. Добавление 7.9MAG не требуется для этого протокола. Вместо этого удалите всю лишнюю жидкость из шприца, аккуратно толкая поршень вниз в образец, пока не останется больше жидкости в шприце. - Визуализуйте кристаллы под оптическим микроскопом либо через шприц, либо, для получения наилучших результатов, извлекайте небольшое количество (1 мл) на стеклянную горку и поместите крышку скольжения на вершине.
- Проверьте концентрацию кристаллов.
- Определите концентрацию кристалла в силиконовой смазке, подсчитав количество кристаллов в определенной области с помощью изображений оптического микроскопа. Для достижения наилучших результатов, высокая плотность кристаллов равномерно распределяется по всей средства массовой информации является идеальным (Nogt;106 кристаллов / мл), с тем чтобы получить высокий уровень кристаллического удара.
- Отрегулируйте кристаллическую концентрацию в шприце, изменив соотношение кристаллов к вязким средствам в шагах 1,3 и 1,4.
- Чтобы уменьшить концентрацию кристаллов, разбавить кристаллы в шприце, увеличивая количество силиконовой смазки / HV средств массовой информации на шаг 1,4 или путем разбавления кристаллической гранулы в растворе с буфером кристаллизации до создания шприцев в шаге 1.1.
- Чтобы увеличить концентрацию кристалла, уменьшить количество силиконовой смазки в шаге 1.4, но помните, чтобы не уменьшить вязкость ниже 10 Pa.s.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация кристаллов, о чем сообщалось здесь, была оптимизирована для этого конкретного образца и размера кристалла. Однако идеальная концентрация кристалла будет зависеть от размера кристалла, размера луча, внутреннего диаметра иглы (I.D.) и рентгеновского потока. Это можно определить по ставке попадания с оптимальной скоростью попадания в 30%, которая считается «хорошей». На практике кристаллическая концентрация должна быть оптимизирована для различных образцов во время пучка, чтобы получить желаемую скорость попадания. Начните с высокой концентрации кристаллов, 109 кристаллов/мл. Процедура регулировки кристаллической концентрации дается в Лю et.al. 35.
- Протокол можно приостановить здесь до тех пор, пока инжектор не будет готов к сбору данных.
- Если кристаллы выращиваются в LCP, то запечатать их и дайте им оставаться в шприцах до нескольких дней при комнатной температуре.
- Если кристаллы были перенесены в различные высокие вязкие средства (например, силиконовую смазку), то перед измерением необходимо продать тест на стабильность кристаллов. Это определит, как долго кристаллы стабильны в инертных средствах массовой информации (в идеале 8 ч) и срок сбора данных. Здесь кристаллы лизозима были стабильными в течение нескольких дней в силиконовой смазке и не показали признаков растворения при осмотре с помощью оптического микроскопа.
- Переместите весь образец в один шприц перед отключением парпера. Отсоедини пару от шприца и прикрепите инъекционной иглой. Винт иглы твердо в основание шприца и убедитесь, что он крепится плотно, чтобы предотвратить любые утечки. Для этого эксперимента была использована игла I.D. длиной 108 мкм (длина иглы 13 мм, точечный стиль 3). В зависимости от размера кристалла и размера луча прикрепляются либо 51 мкм, либо 108 МКМ иглы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительное тестирование потока образца до времени пучка требуется, чтобы иметь возможность выбрать правильный размер иглы инжектора. В зависимости от характеристик выборки (т.е. вязкости, зарядки, буферного состава) и игольчатого I.D., образцы будут течь по-разному. Поэтому рекомендуется протестировать различные размеры игл для получения наиболее стабильного потока с самой маленькой иглой I.D., чтобы максимизировать соотношение сигнала к шуму во время сбора данных. - Если инжектор уже установлен и выровнен на линии луча перейти к разделу 3 и смонтировать образец шприца непосредственно на инжектор.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь.
2. Инжектор монтажа и контроля
- Наведать инжектор на балку. Удалите криогенное сопло на линии луча MX2 и замените его инжектором. Ослабить зажим винт, который держит криогенный сопло и прикрепить его к кронштейну, расположенному рядом с моторизованной стадии.
- Поднимите инжектор из тележки, удерживая черную ручку и поместите ее на моторизованную сцену.
- прикрепить инжектор к моторизованной сцене; стороны затянуть черный зажим винт ручку.
- Намонтировать пустой шприц на инжектор
- В интерфейсе управления компьютером инжектора (т.е. программном обеспечении управления положением EPOS) выберите режим самонаведения под инструментами в программном меню. Затем выберите Отрицательный предел переключатель, и начать Homing , пусть программноеобеспечение работает до тех пор, пока винт убран достаточно для шприца, чтобы поместиться под винтом. Если оставить работать без надзора предел переключатель останавливает винт автоматически.
- Установить пустой ('dummy') шприц на инжектор, вставив иглу через щель в держатель шприца. Выстроить шприц против кронштейна.
- Закрепите шприц двумя O-кольцами.
- Оберните первое O-кольцо через середину сечения шприца, прикрепив его к крючкам по обе стороны от шприца.
- Петля второй O-кольцо вокруг крючков на верхней части шприца, а затем положить одну часть O-кольцо в верхней части стеклянного шприца, как показано на демонстрации и рисунок 1B.
- Выравнивание инжектора к рентгеновскому лучу
- Перемести моторизованную ступень с инжектором к точке рентгеновского взаимодействия с помощью программного обеспечения управления лучом. Это можно визуализировать с помощью камеры inline. Размер и положение луча обозначаются красным крестом на экране, а моторизованная ступень может быть перемещена для выравнивания иглы с областью рентгеновского взаимодействия.
- Отрегулируйте положение x и y этапа для того чтобы выровнять иглу с красным крестом.
- Отрегулируйте положение z до тех пор пока кончик иглы не придет в фокус.
- Пройдите проверку выравнивания кончика иглы и рентгеновского луча визуально, проверив, что кончик шприца встречает перекрестие, которое видно на изображении оптического микроскопа, генерируемом камерой лучевой линии.
- После того, как кончик иглы выровнены двигаться кончик выше перекрестия волос 100 мкм. Это устраняет рентгеновское рассеяние от кончика иглы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Монтаж и выравнивание инжектора на линии пучка MX2 на синхротроне должно осуществляться учеными лучевой линии и может быть завершено менее чем за 30 минут.
3. Монтаж образца шприца
- Замените пустой шприц на образец шприца следующим шагом 2.3.
- Поместите крышку инжектора на голову поршеня шприца образца.
- Перемести винт диска на верхнюю часть крышки.
- В программном обеспечении управления инжектором выберите режим скорости.
- Ввод 3000 об/мин (115 нл/с) в качестве значения настройки и нажмите Применить Значение настройки.
- Когда привод винт касается крышки на шприц поршень голову, остановить двигатель.
- Установите значение об/мин до нуля в программном обеспечении управления инжектором, изменив значение настройки на '0' по мере приближения винта к крышке.
- Как только контакт сделан, активируйте заданное значение путем нажимать Значение установки применения для того чтобы остановить винт немедленно.
- Аккуратно пошевелить крышкой, чтобы убедиться, что она прочно держится на месте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Всякий раз, когда новое значение набора внесено в поле Setting Value в программном обеспечении управления, оно активируется только после нажатия значения настройки Apply.
4. Запуск инжектора
- После крышки привод винт сделал твердый контакт с верхней части поршень изменения об / мин Настройка значение до 100. Это эквивалентно 4 нл/с.
- Визуально осмотрите кончик иглы, когда образец впервые выходит или посмотрите на изображение камеры луча иглы, чтобы наблюдать, когда образец начинает выдаваться из кончика иглы.
- Выполните поиск загона, закройте дверь загона и включите рентгеновский луч. С этого момента инжектор должен управляться удаленно из-за пределов загона.
- Настройте об/мин до тех пор, пока не будет создан стабильный поток.
- Снижение значения настройки об/мин до 90.
- Повторите шаг 4.4.1, уменьшая значение настройки об/мин с шагом в 10, чтобы замедлить поток, но при этом поддерживать стабильный поток. Для силиконовой смазки использовалось значение 30 об/мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Типичный диапазон об / мин варьируется от 30 до 100 об / мин (1 - 4 nL/s) в зависимости от характеристик выборки и рентгеновского времени экспозиции. В целом, об/ мин должны быть настроены для получения самой медленной скорости потока (чтобы свести к минимуму потребление выборки) при сохранении стабильного потока.
- Управление примером потока, который не течет хорошо.
- Продолжайте увеличивать значение настройки об/мин с шагом в 10 до тех пор, пока поток не станет более прямым. Если поток не стабилизируется, даже после увеличения значения rpm Setting Value до максимального значения 100 об/мин попробуйте улучшить стабильность, реализуя один из двух методов, описанных ниже.
- Первый метод: Вставьте полистирол образца зрелище под образец потока, чтобы помочь направлять образец. Этот метод хорошо работает для высоко заряженных потоков образцов.
- Второй метод: Вставьте воронку всасывания в образец зрелище. Для подачи воздуха в воронку подключите его к трубе розетки, расположенной в загоне. Этот метод может помочь в направлении и стабилизации потока выборки независимо от заряда потока.
- Продолжайте увеличивать значение настройки об/мин с шагом в 10 до тех пор, пока поток не станет более прямым. Если поток не стабилизируется, даже после увеличения значения rpm Setting Value до максимального значения 100 об/мин попробуйте улучшить стабильность, реализуя один из двух методов, описанных ниже.
- Как только будет достигнут постоянный и устойчивый поток, начните сбор данных и оптимизируйте расстояние детектора в соответствии с обычным экспериментом рентгеновской кристаллографии.
ПРИМЕЧАНИЕ: об / мин преобразуется в скорость потока с помощью предоставленной таблицы преобразования в дополнительной информации, 'Липидико калькулятор устройств. Введите значение об/мин, диаметр иглы и объемы шприцев для расчета скорости потока с помощью этого калькулятора.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lipidico является HVI построен в качестве альтернативной системы доставки для использования на MX2 (Рисунок 1). Он идеально подходит для SX, где кристаллы либо выращиваются в липидной кубической фазе, либо передаются в высоковязкие инертные средства массовой информации.
Для демонстрации применения инжектора силиконовая смазка, смешанная с кристаллами лизозима, использовалась для сбора данных SX на линии пучка MX2 в австралийском синхротроне. Для установки инжектора на линии луча MX2 криогенная сопла удаляется и заменяется инжектором, как показано на рисунке 1. Образцы шприца устанавливаются непосредственно на инжектор и крепятся с помощью O-колец(рисунок 1B). Сбор данных может быть инициирован в течение нескольких минут после изменения выборки. Инжектор предназначен для быстрого управления образцом с простой настройкой, которая проста в эксплуатации для пользователей, которые не знакомы с SX.
Рисунок 1: Изображения Lipidico, вязкий инжектор, используемый в австралийском синхротроне для экспериментов SX. (A) Показывает фотографию Lipidico включены в MX2. Красная стрелка указывает направление рентгеновского луча. (B)Более близкий взгляд региона держателя образца на Lipidico. Шприц проводится на месте двумя O-кольцами и образец собирается в зрелище. (D) крупным планом вид образца потока, показывающего иглы инжектора и образец отходов зрелище, которое может быть изменено, чтобы включить полистирол / Вентури всасывания зрелище видели подиглойв ( ). Цифра была адаптирована из Berntsen et. al. 201923 с разрешения AIP Publishing. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Инжектор совместим с различными типами высоковязких носителей. Оптимальная скорость работы образца для инжектора имеет решающее значение для стабильности потока, слишком медленно вызовет керлинг эффект / расширение потока и слишком быстро приведет к распаду потока. Оптимальная скорость будет варьироваться в зависимости от используемой несущей системы. На рисунке 2 и рисунке 3 посмотреть силиконовую смазку, протестированную на различных скоростях инжектора, и демонстрирует, как поведение потока может меняться. Медленная скорость потока(рисунок 2A, 2.3 nL/s) приводит к расширению силиконовой смазки, выдавленной из инжектора, в то время как болеебыстрая скорость потока (рисунок 2C, 6.6 nL/s) производит более тонкий поток. Регулярно наблюдается керлинг вязкого медиа-потока(рисунок 3A). Для преодоления этой проблемы были опробованы два инновационных решения: ловец полистирола и воронка всасывания вентури под иглой. Ловец полистирола вводит слабую электростатическую силу и лучше всего работает на высоко заряженных образцах, как в случае с силиконовой смазкой(рисунок 3B),в то время как воронка всасывания вентури помогает направлять поток вертикально вниз к ловцу, независимо от выборки зарядки. В зависимости от характеристик образца любой вариант может быть успешно использован.
Рисунок 2: Эффект высокого вязкого потока носителя с использованием различных скоростей инжектора. 100% силиконовая смазка была протестирована на различных скоростях образца для оценки его характеристик потока. (A) . 2,3 нл/с (30 об/мин),(B) 3,5 нл/с (90 об/мин) и(С)6,6 н/с (170 об/мин). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Поток поведение 100% силиконовой смазки демонстрации керлинг вязких средств массовой информации. (A) Керлинг эффект на 2,3 нл / с (30 об /мин)( B ) Эффект добавления полистирола зрелище образца держателя отходов с инжекторной скоростью, работающей на 2,3 нл / с (30 об / мин). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Стеклянный шприц, содержащий 26 мкл кристаллов лизозима (хрустальный размер 10 мкм х 10 мкм х 20 мкм), подвешенный в силиконовой смазке, был использован(рисунок 4A). Липидико генерируется постоянный образец потока, используя 108 мкм иглы I.D., со средней скоростью потока 1,14 нл/с (с двигателем установлен до 30 об / мин). Алгоритм пикового поиска36 был использован для оценки скорости попадания, и достаточное количество данных (всего 224 200 изображений) было собрано в течение 38 минут времени сбора данных, что позволило получить структуру (PDB код 6M'V). Таблица 1 содержит сводку статистики сбора данных, а на рисунке 4B показано репрезентативное изображение карты плотности электронов, окружающей одну из дисульфидных связей в структурелизозима 20.
Рисунок 4: Lysozyme изображения. (A)Оптические изображения кристаллов лизозима в силиконовой смазке. Перекрестное поляризованное (40x увеличение) изображение кристаллов лизозима, смешанных с высоким вязким сми, силиконовым жиром, изображенным с помощью видимого светового микроскопа. Размер кристаллов варьируется от 15 до 20 мкм и(B) Репрезентативное изображение карты плотности электронов (2Fo-Fc, 1 ") окружающих дисульфидные связи лизозима. Цифра была адаптирована из Berntsen et. al. 201923 с разрешения AIP Publishing. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная информация. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Таблица 1: Сводная таблица, показывающая статистику данных SX от Lipidico. Кристаллы лисозима смешивались с высоким вязким сминым смилом, силиконовой смазкой и текли через область рентгеновского взаимодействия луча MX2. Это резюме полной таблицы результатов, опубликованной в Berntsen et. эл.23. Таблица адаптирована здесь с разрешения AIP Publishing.
| Статистика данных | Липидико, луч MX2 |
| детектор | Dectris EIGER X 16M, |
| частота кадров | 100 Гц |
| Расстояние детектора образца (мм) | 300 |
| Рентгеновская энергия (KeV) | 13 |
| Размер луча (WxH) (мкм) | 12x22 |
| Лол кадров | 224200 |
| Ставка попадания (%) | 2.95 |
| Лол индексировать кадры | 4852 |
| Разрешение (к) | 17.74-1.83 |
| полнота | 99.44 |
| Космическая группа | P43212 |
| элементарная ячейка | |
| a, b, c (к) | 78.68, 78.68, 34.48 |
| α, β, γ (°) | 90, 90, 90 |
| I/σ (I) | 5.08 |
| избыточность | 73.97 |
| CC1/2 | 0.96 |
| Rработа/Rбесплатно | 0.18/0.26 |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Разработан альтернативный HVI, идеально подходит для проведения экспериментов SX на синхротронных источниках. Он имеет два ключевых преимущества по сравнению с существующими HVIs. Во-первых, легко установить на балку, позволяющую быстро переключаться между обычной кристаллографией и SX, для установки и выравнивания на MX2 требуется всего 30 минут. Во-вторых, образцы шприцев, используемых для выращивания кристаллов, могут быть непосредственно использованы в качестве резервуаров для инъекций, ограничивая потери во время передачи образца. Протокол об изменении образцов был описан и продемонстрирован. Конструкция устраняет необходимость в сложном газовом потоке для управления струей по сравнению с другими HVIs. Был продемонстрирован простой процесс изменения скорости потока инжектора, который может быть скорректирован без задержки ответа.
Наиболее важными шагами для успешного сбора данных SX являются оптимизация кристаллической концентрации, получение однородной смеси высоких вязких средств массовой информации и создание стабильного потока для сбора данных. Оптимальная концентрация кристалла и однородность могут быть достигнуты путем центрифугирования кристаллов до гранул и добавления более высокой концентрации кристаллов в носителях, гарантируя, что образец тщательно смешивается в парной системе. Как только концентрация кристалла оптимизирована, скорость потока инжектора может быть легко скорректирована во время луча, чтобы получить стабильный поток. Керлинг вязкого потока обычно наблюдается с высокими вязкими образцами. Представлены два решения: использование ловца образцов полистирола для заряженных образцов или добавление воронки всасывания вентуры, действующей в качестве ловца. Это было успешным в контроле потока в первоначальных тестах, но при различных условиях образца керлинг потока может привести к прилипания образца к точке иглы. Вполне возможно, что это может быть преодолено путем изменения свойств поверхностного заряда иглы путем добавления специальных покрытий. Иглы, покрытые различными химическими веществами (т.е. силиконом), ранее были успешно адаптированы для использования с жидкостными роботами обработки и могут быть изготовлены по заказу производителей в соответствии сошприцем 37.
Инжектор не ограничивается силиконовой смазкой и может использоваться с другими высоковязкими жидкостями. Несколько различных альтернатив были продемонстрированы23, которые могут быть успешно использованы для инъекций кристалла и описаныв ряде других публикаций 22,30,33. Верхний предел вязкости образца, используя этот HVI все еще находится под следствием, однако вязкость образца до 25 Pa.s (используя 100% силиконовую смазку) привела к стабильному потоку. Однако, когда вязкость образца была уменьшена до Lt;10 Pa.s (с использованием 70% образца силиконовой смазки), надежный поток не мог быть произведен. Таким образом, 10 Pa.s представляет собой текущий нижний предел вязкости выборки для инъекций с помощью этого HVI. Игольчатое И.Д. также является важным соображением. Несмотря на то, что 51 МКМ I.D. был успешно протестирован во время инъекций различных носителей без каких-либо кристаллов, введение кристаллов нарушает поток образца. Таким образом, в зависимости от их размера, с кристаллами введены в матрицу, есть гораздо более высокая вероятность блокировки при использовании 51 МКМ I.D. иглы по сравнению с большим размером иглы. Когда происходит блокировка критического накопления давления может произойти, в других инжекторов это может привести к поломке шприца. Тем не менее, конструкция этого HVI включает в себя механизм безопасности, где механика привода будет отходить от поршеня шприца, если давление становится слишком высоким, пока переключатель деактивации не включен. Это приводит к остановлению привода и предотвращает разрыв стеклянного шприца.
Существует несколько ограничений для этого инжектора. Инжектор специально разработан для высоковязких образцов, поэтому жидкость, как образцы не могут быть использованы непосредственно для доставки образца. Чтобы преодолеть это ограничение, кристаллы, выращенные в буферных системах, могут быть смешаны с подходящими инертными средствами массовой информации, как описано в шаге 1, однако, есть вероятность того, что кристалл может стать нестабильным. Таким образом, скрининг различных инертныхсредств массовой информации 26,27,28,29 должны быть исследованы в первую очередь для обеспечения стабильности выборки поддерживается. Во-вторых, размер кристалла и качество кристаллической упаковки повлияют на качество дифракции. Луч MX2 работает при оптимальном размере пучка 22 х 12 мкм (H x W) и потоке 1012 фотон/с. Оптимальный размер кристалла для выполнения SX на MX2 составляет 10 мкм и, как было показано, дает высокий коэффициент сигнала к шуму. Тем не менее, можно собирать данные о более мелких кристаллов, если они хорошо упорядочены и диффракт с высоким разрешением. Существует возможность разрезать размер пучка на этой линии луча до 7,5 мкм, однако, это происходит на стоимость, поскольку она уменьшает поток инцидентов, которые должны быть рассмотрены в ходе эксперимента.
Разработка этого инжектора делает SX легко доступным для основных кристаллографов. Успешная работа Lipidico, открывает двери для быстрого и простого метода для сбора данных SX в самых разнообразных источниках синхротрона. Это позволяет сбор данных о комнатной температуре на кристаллах, которые 10 мкм или меньше на MX2, ограничивая воздействие радиационного ущерба для отдельных кристаллов. Он также предоставляет новую возможность в Австралии для выполнения миллисекундного времени решен SX, который является текущим состоянии современных для кристаллографов. Будущие применения этой инжекторной системы распространяются на рентгеновую характеристику высоковязких материалов с использованием малого угла рентгеновского рассеяния (SAXS), что позволяет легко адаптировать инжектор к другим лучам австралийского синхротрона.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
МК работает на Kusel конструкций. Kusel Design, разработчик пользовательских лабораторных устройств, был вовлечен д-ром Питером Бенценом (Peter Bentsen) из Университета Ла Троб и д-ром Томом Карадоком-Дэвисом (Tom Caradoc-Davies) из ANSTO и разработкой недорогого устройства, позволяющего проводить высокие вязкие исследования в линии пучка MX2 в Австралийском синхротроне. Устройство было разработано в тесном контакте с доктором Карадок-Дэвис. У авторов нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Австралийским исследовательским советом Центр передового опыта в области передовой молекулярной визуализации (CE140100011) (http://www.imagingcoe.org/). Это исследование было проведено частично с использованием луча MX2 в Австралийском синхротроне, входя в состав ANSTO, и использовало детектор Австралийского фонда исследований рака (ACRF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hen eggwhite lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | Used to grow crystals for testing the injector and the crystals are transferred into silicon grease. https://www.sigmaaldrich.com/ |
| High vacuum silicon grease | Dow Corning | Z273554-1EA | Used for testing of injector. https://www.sigmaaldrich.com/ |
| Injector needle (108 µm ID) | Hamilton | part No: 7803-05 | www.hamiltoncompany.com |
| Glass gas-tight syringes, 100 µl | Hamilton | part no: 7656-01 | Syringes used for sample injection. www.hamiltoncompany.com |
| LCP syringe coupler | Formulatrix | 209526 | Syringe coupler to mix the samples |
| Lipidico injector | La Trobe Univerity/ANSTO | This is a specific piece of equipment that can be accessed through La Trobe University / ANSTO Australian Synchrotron Facility |
References
- Boutet, S., et al. High-resolution protein structure determination by serial femtosecond crystallography. Science. 337 (6092), 362-364 (2012).
- Spence, J. C. H., Weierstall, U., Chapman, H. N. X-ray lasers for structural and dynamic biology. Reports on Progress in Physics. 75 (10), 102601 (2012).
- Aquila, A., et al. Time-resolved protein nanocrystallography using an X-ray free-electron laser. Optics Express. 20 (3), 2706-2716 (2012).
- Schlichting, I. Serial femtosecond crystallography: the first five years. International Union of Crystallography. 2, 246-255 (2015).
- Lee, D., et al. Nylon mesh-based sample holder for fixed-target serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 9, 6971 (2019).
- Martin, A. V., et al. Fluctuation X-ray diffraction reveals three-dimensional nanostructure and disorder in self-assembled lipid phases. Communications Materials. 1 (1), 1-8 (2020).
- Roedig, P., et al. High-speed fixed-target serial virus crystallography. Nature Methods. 14 (8), 805 (2017).
- Chapman, H. N., et al.
- Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nature Communications. 5, 3309 (2014).
- Weierstall, U. Liquid sample delivery techniques for serial femtosecond crystallography. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 369 (1647), 20130337 (2014).
- Gati, C., et al. Atomic structure of granulin determined from native nanocrystalline granulovirus using an X-ray free-electron laser. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2247-2252 (2017).
- Nam, K. H. Sample delivery media for serial crystallography. International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1094 (2019).
- Batyuk, A., et al. Native phasing of x-ray free-electron laser data for a G protein-coupled receptor. Science Advances. 2 (9), 1600292 (2016).
- Kern, J., et al. Structures of the intermediates of Kok's photosynthetic water oxidation clock. Nature. 563 (7731), 421 (2018).
- Suga, M., et al. An oxyl/oxo mechanism for oxygen-oxygen coupling in PSII revealed by an x-ray free-electron laser. Science. 366 (6463), 334-338 (2019).
- Tenboer, J., et al. Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein. Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).
- Pande, K., et al. Femtosecond structural dynamics drives the trans/cis isomerization in photoactive yellow protein. Science. 352 (6286), 725-729 (2016).
- Ishigami, I., et al. Snapshot of an oxygen intermediate in the catalytic reaction of cytochrome c oxidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3572-3577 (2019).
- Nango, E., et al. A three-dimensional movie of structural changes in bacteriorhodopsin. Science. 354 (6319), 1552-1557 (2016).
- Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation. International Union of Crystallography. 2, 168-176 (2015).
- Nogly, P., et al. Retinal isomerization in bacteriorhodopsin captured by a femtosecond x-ray laser. Science. 361 (6398), (2018).
- Martin-Garcia, J. M., et al. Serial millisecond crystallography of membrane and soluble protein microcrystals using synchrotron radiation. International Union of Crystallography. 4, 439-454 (2017).
- Berntsen, P., et al. The serial millisecond crystallography instrument at the Australian Synchrotron incorporating the "Lipidico" injector. Review of Scientific Instruments. 90 (8), 085110 (2019).
- Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallographica Section D-Structural Biology. 71, 387-397 (2015).
- DePonte, D. P., Nass, K., Stellato, F., Liang, M., Chapman, H. N. Sample injection for pulsed X-ray sources. Advances in X-Ray Free-Electron Lasers: Radiation Schemes, X-Ray Optics, and Instrumentation: Proceedings of Society of Photo-Optical Instrumentation Engineers. Tschentscher, T., Cocco, D. , Prague, Czech Republic. 8078 (2011).
- Park, S. Y., Nam, K. H. Sample delivery using viscous media, a syringe andasyringe pump for serial crystallography. Journal of Synchrotron Radiation. 26, 1815-1819 (2019).
- Shimazu, Y., et al. High-viscosity sample-injection device for serial femtosecond crystallography at atmospheric pressure. Journal of Applied Crystallography. 52, 1280-1288 (2019).
- Kovacsova, G., et al. Viscous hydrophilic injection matrices for serial crystallography. International Union of Crystallography. 4, 400-410 (2017).
- Darmanin, C., et al. Protein crystal screening and characterization for serial femtosecond nanocrystallography. Scientific Reports. 6, 25345 (2016).
- Conrad, C. E., et al. A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography. International Union of Crystallography. 2, 421-430 (2015).
- Sugahara, M., et al. Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography. Nature Methods. 12 (1), 61-63 (2015).
- Sugahara, M., et al. Oil-free hyaluronic acid matrix for serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 6, 24484 (2016).
- Fromme, R., et al. Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase. International Union of Crystallography. 2, 545-551 (2015).
- Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography. Journal of Visualized Experiments. (115), e54463 (2016).
- Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography. Nature Protocols. 9 (9), 2123-2134 (2014).
- Hadian-Jazi, M., et al. A peak-finding algorithm based on robust statistical analysis in serial crystallography. Journal of Applied Crystallography. 50, 1705-1715 (2017).
- Kong, F. W., Yuan, L., Zheng, Y. F., Chen, W. D. Automatic Liquid Handling for Life Science: A critical review of the current state of the art. Journal of Laboratory Automation. 17 (3), 169-185 (2012).
