Summary
L'obiettivo di questo protocollo è dimostrare come preparare campioni di cristallografia seriale per la raccolta dei dati su un iniettore ad alto viscoso, Lipidico, recentemente commissionato al sincrotrone australiano.
Abstract
Presso il sincrotrone australiano è stata sviluppata una struttura per l'esecuzione di misurazioni seriali della cristallografia. Questa struttura incorpora un iniettore ad alta viscosità appositamente costruito, Lipidico, come parte della linea di fascio di cristallografia macromolecolare (MX2) per misurare un gran numero di piccoli cristalli a temperatura ambiente. L'obiettivo di questa tecnica è quello di consentire la produzione/trasferimento di cristalli su siringhe di vetro da utilizzare direttamente nell'iniettore per la raccolta dei dati della cristallografia seriale. I vantaggi di questo iniettore includono la capacità di rispondere rapidamente alle variazioni della portata senza interruzione del flusso. Esistono diverse limitazioni per questo iniettore ad alta viscosità (HVI) che includono una restrizione sulle viscosità del campione consentite a >10 Pa.s. La stabilità del flusso può anche essere potenzialmente un problema a seconda delle proprietà specifiche del campione. Qui viene presentato un protocollo dettagliato su come impostare i campioni e utilizzare l'iniettore per le misurazioni della cristallografia seriale presso il sincrotrone australiano. Il metodo dimostra la preparazione del campione, incluso il trasferimento di cristalli di glisozima in un supporto ad alta viscosità (grasso siliconico) e il funzionamento dell'iniettore per la raccolta dei dati a MX2.
Introduction
La cristallografia seriale (SX) è una tecnica sviluppata inizialmente nel contesto dei laser a elettroni liberi a raggi X (XFEL)1,2,3,4. Sebbene gli approcci target fissi possano essere utilizzati per SX5,6,7, in genere, i sistemi di iniettori vengono utilizzati per fornire cristalli in un flusso continuo al fascio di raggi X. Poiché combina i dati di un gran numero di cristalli, SX evita la necessità di qualsiasi allineamento cristallino durante l'esperimento e consente di raccogliere dati a temperaturaambiente 8,9. Con l'aiuto di un iniettore adatto, i cristalli vengono trasmessi uno per uno nell'area di interazione a raggi X e i dati di diffrazione risultanti vengono raccolti su un rilevatore di area9,10. Ad oggi, SX è riuscita a risolvere un certo numero di strutture proteiche1,11,12,13 compresii cristalli troppo piccoli per misurare usando la cristallografia convenzionale. Ha anche fornito nuove informazioni sulla dinamica molecolare risolta nel tempo sfruttando la durata dell'impulso del femtosecondo dell'XFEL. Avviando reazioni pompa-sonda con sorgenti laser ottiche, sono stati effettuati studi approfonditi sul fotosistema II14,15, proteina gialla fotoattiva16,17, citocromo C ossidasi18, nonché batteriorhodopsina19,20,21. Questi studi hanno sondato la dinamica di trasferimento degli elettroni che si verifica dopo l'attivazione della luce dimostrando il significativo potenziale della cristallografia seriale per comprendere i processi biologici risolti nel tempo.
Lo sviluppo della cristallografia seriale sta diventando sempre più diffuso anche nelle sorgenti di sincrotrone9,12,20,22,23,24. L'SX a base di sincrotrone consente di misurare in modo efficiente un gran numero di singoli cristalli a temperatura ambiente utilizzando un sistema di iniettore appropriato. Questo approccio è adatto per cristalli più piccoli, quindi, oltre a richiedere un rilevatore di frame-rate veloce per raccogliere i dati, è richiesto anche un fascio micro-focalizzato. Rispetto alla cristallografia convenzionale, SX non comporta il montaggio e l'allineamento di singoli cristalli nel fascio di raggi X. Poiché i dati provenienti da un gran numero di singoli cristalli vengono fusi, la dose di radiazioni ricevuta da ciascun cristallo può essere sostanzialmente ridotta rispetto alla cristallografia convenzionale. Synchrotron SX può anche essere applicato allo studio di reazioni risolte nel tempo, anche fino al regime millisecondo, a condizione che sia disponibile un rilevatore con una frequenza fotogrammi sufficientemente elevata (ad esempio, 100 Hz o più). Diversi esperimenti di cristallografia seriale sono stati effettuati presso il sincrotrone utilizzando iniettori che sono stati inizialmente sviluppati a sorgenti XFEL20,22,23. I due tipi più comuni di iniettore sono l'ugello virtuale dinamico a gas (GDVN)25 e l'iniettore ad alta viscosità (HVI)9,24,26,27,28. Il GDVN è ideale per iniettare bassa viscosità, campioni liquidi, ma richiede elevate portate per ottenere flussi stabili, il che a sua volta porta ad alti tassi di consumo del campione. Al contrario, gli HVI sono adatti per campioni ad alta viscosità che consentono la generazione di un flusso stabile a portate molto più basse, portando a un consumo di campioni molto più basso. L'iniettore HVI, quindi, favorisce la consegna di campioni in cui è preferibile un vettore viscoso (ad esempio, a base lipidica per proteine di membrana) e / o grandi quantità di campione non sono disponibili. Gli iniettori SX sono generalmente difficili da usare e richiedono un'ampia formazione per funzionare. Essi comportano anche lunghi protocolli di trasferimento del campione, in quanto il campione deve essere caricato in un serbatoio specializzato, il che presenta generalmente un alto rischio associato alla perdita del campione nel "volume morto" o tramite perdite nelle connessioni. Pertanto, è auspicabile ottimizzare il design dell'iniettore per mitigare eventuali perdite prima che il campione raggiunga il fascio di raggi X.
Recentemente, i primi risultati SX sono stati pubblicati utilizzando Lipidico23 con un bersaglio di lisozima, utilizzando un rilevatore Eiger 16M. Questa progettazione dell'iniettore limita lo spreco di campioni riducendo al minimo il numero di passaggi necessari per andare dalla cristallizzazione iniziale al trasferimento dei cristalli nell'iniettore seguito dalla consegna del campione al fascio di raggi X. Questo manoscritto descrive e illustra la procedura di trasferimento del campione a partire dalla preparazione del campione, passando al processo di iniezione e infine alla raccolta dei dati, utilizzando lo stesso contenitore di cristallizzazione. Viene descritto anche il funzionamento dell'iniettore.
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Protocol
1. Preparazione di cristalli in un mezzo ad alta viscosità utilizzando siringhe di vetro
- Centrifugare delicatamente la soluzione cristallina (~1.000 x g,~10 min a 22 °C) per formare un pellet di cristallo morbido e rimuovere il tampone in eccesso. Ciò si tradurrà in un'alta concentrazione di cristalli nel pellet che possono essere utilizzati per la raccolta dei dati.
NOTA: Per evitare la diluizione del supporto viscoso aumentare la concentrazione cristallina in questa fase. Ottimizzare il rapporto tra media viscoso e volume cristallino per ogni campione per ottenere un'alta concentrazione di cristalli mantenendo un'elevata viscosità per il supporto. Centrifugare la soluzione cristallina per formare un pellet e rimuovere il tampone in eccesso per aumentare la concentrazione di cristalli nella soluzione, come descritto in Darmanin et. al.29. - Impostare due siringhe da 100 μL con un accoppiatore.
- Fissare l'accoppiatore alla fine della prima siringa e aggiungere 28 μL di soluzione cristallina alla parte superiore della siringa. Lentamente, inserire lo stantuffo nella parte superiore della siringa e spingere delicatamente la soluzione fino all'estremità della punta dell'accoppiatore, rimuovendo eventuali bolle d'aria che si formano. Fallo seguendo uno dei due metodi discussi di seguito.
NOTA: Il volume dei cristalli da aggiungere al supporto ad alta viscosità può essere variato se non cambia significativamente la viscosità del campione complessivo.- Primo metodo: utilizzare rapidi cambi di pressione per far scoppiare le bolle d'aria.
- Posizionare con cura un dito guantato sulla parte superiore del punto dell'ago dell'accoppiatore smussato e (molto delicatamente) applicare la pressione per creare una guarnizione. Non applicare troppa pressione in quanto ciò potrebbe causare una lesione del bastone dell'ago.
- Ora tira indietro lo stantuffo per allontanare la soluzione dal punto dell'ago, questo genererà un accumulo di pressione nella siringa.
- Rilasciare rapidamente la pressione nella parte superiore della siringa rimuovendo il dito guantato dalla punta smussata dell'ago. Fai attenzione, se il campione è troppo vicino alla punta quando il dito viene rimosso, potrebbe spruzzare con conseguente perdita di campione. Il rapido cambiamento di pressione all'interno della siringa farà scoppiare le bolle d'aria. Ripetere fino a quando tutte le bolle sono state rimosse.
- Secondo metodo: utilizzare la "centrifuga umana" per rimuovere le bolle d'aria.
- Posizionare la siringa in una mano con l'ago rivolto verso l'alto e lo stantuffo incastrato tra due dita, in modo che non possa muoversi.
- Ruotare rapidamente il braccio tenendo la siringa in una direzione 2-3 volte, la forza centrifuga risultante sul campione costringerà eventuali bolle d'aria fuori dalla siringa. Fai attenzione, se fatto troppo lentamente il campione può andare perso.
- Ispezionare la siringa alla ricerca di bolle d'aria, se rimangono bolle, ripetere i passaggi da 1.3.2.1 a 1.3.2.2 fino a rimuovere tutte le bolle d'aria.
- Primo metodo: utilizzare rapidi cambi di pressione per far scoppiare le bolle d'aria.
- Utilizzando una spatola fine, aggiungere ~42 μL di grasso siliconico ad alto vuoto direttamente nella parte superiore della seconda siringa. Spingere lo stantuffo fino alla fine, rimuovendo tutte le bolle d'aria e assicurandosi che non vi sia spazio d'aria alla fine della siringa.
NOTA: La composizione precisa del grasso siliconico non è critica in quanto agisce come un supporto inerte. Un valore di viscosità di >10 Pa.s o un rapporto di circa 60:40 grasso siliconico in soluzione cristallina è ottimale per l'iniezione, tuttavia, è possibile che questo possa variare a seconda delle caratteristiche esatte del campione. Regolare il volume della soluzione cristallina aggiunta al grasso siliconico per ottimizzare la concentrazione cristallina nella miscela, come delineato nella discussione. I mezzi ad alta viscosità diversi dal grasso siliconico possono essere utilizzati purché siano compatibili con ilcampione 30,31,32,33. - Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria in una delle due siringhe e attaccare le siringhe insieme utilizzando l'accoppiatore. Tenere le siringhe verticalmente afferrando solo l'estremità della siringa poiché riscaldare la siringa a causa del calore generato dalle dita può influenzare il campione.
- Mescolare il campione deprimendo delicatamente lo stantuffo sul lato della soluzione cristallina in modo che si mescoli nel grasso siliconico e quindi spingere lo stantuffo sul lato del grasso siliconico, in modo che spingi il campione verso il lato della soluzione cristallina. Ripetere delicatamente questo processo da 50 a 100 volte in modo che il campione sia miscelato accuratamente e sembri omogeneo.
NOTA: Se i cristalli vengono coltivati direttamente in mezzi altamente viscosi (ad esempio, fase cubica lipidica, LCP), non sono necessari passaggi 1.1-1.6. Protocolli per la coltivazione di cristalli all'interno delle siringhe possono essere trovati in Liu et.al. 34di35. Seguire questo protocollo fino al consolidamento del campione, passaggio 10, in cui tutto il campione è ora contenuto in una siringa e il buffer di cristallizzazione viene rimosso. L'aggiunta di 7.9MAG non è necessaria per questo protocollo. Invece, rimuovere tutto il liquido in eccesso dalla siringa spingendo delicatamente lo stantuffo verso il basso nel campione fino a quando non rimane più liquido nella siringa. - Visualizzare i cristalli al microscopio ottico attraverso la siringa o, per ottenere i migliori risultati, estrarre una piccola quantità (~1 μL) su uno scivolo di vetro e posizionare uno scivolo di copertura sulla parte superiore.
- Controllare la concentrazione del cristallo.
- Determinare la concentrazione cristallina nel grasso siliconico contando il numero di cristalli in un'area specifica utilizzando le immagini del microscopio ottico. Per ottenere i migliori risultati, un'alta densità di cristalli erogati uniformemente su tutto il supporto è ideale (>106 cristalli/mL) per ottenere un'elevata velocità di colpo di cristallo.
- Regolare la concentrazione cristallina nella siringa modificando il rapporto tra cristalli e mezzi viscosi nei passaggi 1.3 e 1.4.
- Per diminuire la concentrazione cristallina, diluire i cristalli nella siringa aumentando la quantità di grasso siliconico/mezzi HV al passaggio 1.4 o diluire il pellet di cristallo in soluzione con il tampone di cristallizzazione prima di impostare le siringhe nel passaggio 1.1.
- Per aumentare la concentrazione cristallina, diminuire la quantità di grasso siliconico nel passaggio 1.4 ma fare attenzione a non ridurre la viscosità al di sotto di 10 Pa.s.
NOTA: La concentrazione di cristalli qui riportata è stata ottimizzata per questo campione specifico e le dimensioni del cristallo. Tuttavia, la concentrazione cristallina ideale dipenderà dalle dimensioni del cristallo, dalle dimensioni del fascio, dal diametro interno dell'ago (I.D.) e dal flusso di raggi X incidente. Questo può essere determinato dal tasso di hit con un tasso di successo ottimale di ~ 30% considerato "buono". In pratica, la concentrazione di cristallo deve essere ottimizzata per diversi campioni durante il tempo del fascio per ottenere la velocità di colpo desiderata. Inizia con un'alta concentrazione di cristalli, 109 cristalli / mL. La procedura per regolare la concentrazione cristallina è data in Liu et.al. 35 .
- Il protocollo può essere messo in pausa qui fino a quando l'iniettore non è pronto per la raccolta dei dati.
- Se i cristalli vengono coltivati in LCP, sigillarli e lasciarli rimanere nelle siringhe per un massimo di alcuni giorni a temperatura ambiente.
- Se i cristalli sono stati trasferiti su un diverso supporto ad alta viscosità (ad esempio, grasso siliconico), prima della misurazione deve essere eseguita una prova di stabilità dei cristalli nel tempo. Questo determinerà per quanto tempo i cristalli sono stabili nei supporti inerti (idealmente > 8 h) e il limite di tempo per la raccolta dei dati. Qui, i cristalli di lisozima erano stabili per giorni nel grasso siliconico e non mostravano segni di dissoluzione quando ispezionati utilizzando un microscopio ottico.
- Spostare tutto il campione in un'unica siringa prima di scollegare l'accoppiatore. Scollegare l'accoppiatore dalla siringa e attaccare l'ago di iniezione. Avvitare saldamente l'ago nella base della siringa e assicurarsi che sia fissato saldamente per evitare perdite. Per questo esperimento è stato utilizzato un ago I.D. da 108 μm (lunghezza dell'ago 13 mm, stile punto 3). A seconda delle dimensioni del cristallo e della dimensione del fascio, fissare un ago I.D. da 51 μm o 108 μm.
NOTA: È necessario pre-test del flusso del campione prima del tempo del fascio per poter selezionare la dimensione corretta dell'ago dell'iniettore. A seconda delle caratteristiche del campione (cioè viscosità, carica, composizione tampone) e dell'I.D. dell'ago, i campioni fluiranno in modo diverso. Pertanto, si consiglia di testare una varietà di dimensioni degli aghi per produrre il flusso più stabile con il più piccolo ago di I.D. possibile per massimizzare il rapporto segnale-rumore durante la raccolta dei dati. - Se l'iniettore è già montato e allineato sulla linea del fascio, spostarsi nella sezione 3 e montare la siringa campione direttamente sull'iniettore.
NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
2. Montaggio e controllo dell'iniettore
- Montare l'iniettore sulla linea di fascio. Rimuovere l'ugello criogenico sulla linea di fascio MX2 e sostituirlo con l'iniettore. Allentare la vite di bloccaggio che tiene l'ugello criogenico e fissarlo alla staffa situata accanto allo stadio motorizzato.
- Sollevare l'iniettore dal carrello tenendo la maniglia nera e posizionarla sul palco motorizzato.
- Per fissare l'iniettore allo stadio motorizzato; stringere a mano la manopola della vite di bloccaggio nero.
- Montare una siringa vuota sull'iniettore
- Nell'interfaccia di controllo del computer dell'iniettore (ad esempio, il software di controllo della posizione EPOS), selezionare Modalità homing in Strumenti nel menu software. Quindi selezionare Negative Limit Switch e Start Homing, lasciare funzionare il software fino a quando la vite non viene ritrasferita a sufficienza affinché la siringa si adatti sotto la vite. Se lasciato per funzionare senza supervisione, l'interruttore limite arresta automaticamente la vite.
- Montare una siringa vuota ('fittizia') sull'iniettore inserendo l'ago attraverso la fessura nel supporto della siringa. Allineare la siringa contro la staffa.
- Fissare la siringa con due O-ring.
- Avvolgere il primo O-ring attraverso la sezione centrale della siringa attaccandolo ai ganci su entrambi i lati della siringa.
- Eseguire il ciclo del secondo O-ring attorno ai ganci sulla sezione superiore della siringa, quindi mettere una parte dell'O-ring sulla parte superiore della siringa di vetro, come mostrato nella dimostrazione e nella figura 1B.
- Allineare l'iniettore al fascio di raggi X
- Spostare lo stadio motorizzato con l'iniettore verso il punto di interazione a raggi X tramite il software di controllo della linea di fascio. Questo può essere visualizzato utilizzando la fotocamera in linea. Le dimensioni e la posizione del fascio sono denotati da una croce rossa sullo schermo e lo stadio motorizzato può essere spostato per allineare l'ago con la regione di interazione a raggi X.
- Regolare la posizione x e y del palco per allineare l'ago con la croce rossa.
- Regolare la posizione z fino a quando la punta dell'ago non entra a fuoco.
- Verificare visivamente l'allineamento della punta dell'ago e del fascio di raggi X verificando che la punta della siringa soddisfi i mirini visibili nell'immagine del microscopio ottico generata dalla telecamera beamline.
- Una volta allineata la punta dell'ago, spostare la punta sopra i peli incrociati ~ 100 μm. Ciò elimina la dispersione dei raggi X dalla punta dell'ago.
NOTA: Il montaggio e l'allineamento dell'iniettore sulla linea di fascio MX2 sul sincrotrone deve essere effettuato dagli scienziati della linea di fascio e può essere completato in meno di 30 minuti.
3. Montaggio della siringa campione
- Sostituire la siringa vuota con la siringa campione seguendo il passaggio 2.3.
- Posizionare il cappuccio dell'iniettore sulla testa dello stantuffo della siringa campione.
- Spostare la vite di azionamento nella parte superiore del cappuccio.
- Nel software di controllo dell'iniettore selezionare Modalità velocità.
- Immettere 3000 giri/min (~115 nL/s) come valore di impostazione e premere Applica valore di impostazione.
- Quando la vite di azionamento tocca il cappuccio sulla testa dello stantuffo della siringa, arrestare il motore.
- Impostare il valore rpm su zero nel software di controllo dell'iniettore modificando il valore di impostazione su '0' man mano che la vite si avvicina al cappuccio.
- Una volta effettuato il contatto, attivare il valore preimpostato premendo Applica valore di impostazione per arrestare immediatamente la vite.
- Muovere delicatamente il cappuccio per assicurarsi che sia saldamente tenuto in posizione.
NOTA: ogni volta che un nuovo valore impostato viene immesso nella casella Valore impostazione nel software di controllo, viene attivato solo dopo aver premuto Applica valore di impostazione.
4. Esecuzione dell'iniettore
- Dopo che la vite di azionamento del tappo ha avuto un contatto fermo con la parte superiore dello stantuffo, modificare il valore di impostazione del numero di giri su 100. Questo è equivalente a ~ 4 nL/s.
- Ispezionare visivamente la punta dell'ago quando il campione esce per la prima volta o guardare l'immagine della telecamera beamline dell'ago da osservare quando il campione inizia a estrudere dalla punta dell'ago.
- Eseguire una ricerca dell'hutch, chiudere la porta dell'hutch e accendere il fascio di raggi X. Da questo punto l'iniettore deve essere azionato a distanza dall'esterno dell'hutch.
- Sintonizzare il numero di giri/min fino a generare un flusso stabile.
- Ridurre il valore di impostazione del numero di giri/min su 90.
- Ripetere il passaggio 4.4.1, riducendo il valore di impostazione del numero di giri in incrementi pari a 10, per rallentare il flusso ma mantenere comunque un flusso stabile. Per il grasso di silicone è stato utilizzato un valore di 30 giri/min.
NOTA: La tipica gamma di giri/min varia tra 30 e 100 giri/min (1 - 4 nL/s) a seconda delle caratteristiche del campione e del tempo di esposizione ai raggi X. In generale, i giri/min devono essere sintonizzati per produrre la portata più lenta (per ridurre al minimo il consumo del campione) mantenendo un flusso stabile.
- Gestione di un flusso di esempio che non scorre bene.
- Continua ad aumentare il valore di impostazione rpm con incrementi di 10 fino a quando il flusso non diventa più dritto. Se il flusso non si stabilizza, anche dopo aver aumentato il valore di impostazione rpm al valore massimo di 100 rpm, provare a migliorare la stabilità implementando uno dei due metodi descritti di seguito.
- Primo metodo: inserire un ricevitore di campioni di polistirolo sotto il flusso di esempio per guidare l'esempio. Questo metodo funziona bene per flussi di campioni altamente carichi.
- Secondo metodo: inserire un imbuto di aspirazione venturi nel catcher del campione. Per fornire aria all'imbuto, collegarla al tubo di uscita dell'aria situato nell'hutch. Questo metodo può aiutare a dirigere e stabilizzare il flusso del campione indipendentemente dalla carica del flusso.
- Continua ad aumentare il valore di impostazione rpm con incrementi di 10 fino a quando il flusso non diventa più dritto. Se il flusso non si stabilizza, anche dopo aver aumentato il valore di impostazione rpm al valore massimo di 100 rpm, provare a migliorare la stabilità implementando uno dei due metodi descritti di seguito.
- Una volta raggiunto un flusso costante e costante, avviare la raccolta dei dati e ottimizzare la distanza del rivelatore secondo un normale esperimento di cristallografia a raggi X.
NOTA: Il numero di giri/min viene convertito in portata utilizzando la tabella di conversione fornita nelle informazioni supplementari ,'Lipidico Device Calculator'. Immettere il valore rpm, i diametri dell'ago e i volumi delle siringhe per calcolare la portata utilizzando questo calcolatore.
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Representative Results
Lipidico è un HVI costruito come sistema di erogazione alternativo per l'uso su MX2 (Figura 1). È ideale per SX dove i cristalli vengono coltivati in fase cubica lipidica o trasferiti su un supporto inerte ad alta viscosità.
Per dimostrare l'applicazione dell'iniettore è stato utilizzato grasso siliconico miscelato con cristalli di lisozima per raccogliere dati SX sulla linea di fascio MX2 presso il sincrotrone australiano. Per montare l'iniettore sulla linea di fascio MX2, l'ugello criogenico viene rimosso e sostituito dall'iniettore, come mostrato nella figura 1. I campioni di siringa sono montati direttamente sull'iniettore e fissati utilizzando o-ring (Figura 1B). La raccolta dei dati può essere avviata pochi minuti dopo una modifica di esempio. L'iniettore è progettato per il controllo rapido del campione con una configurazione semplice e facile da usare per gli utenti che non hanno familiarità con SX.
Figura 1: Immagini di Lipidico, un iniettore viscoso utilizzato al sincrotrone australiano per esperimenti SX. (A) Mostra una foto di Lipidico incorporata in MX2. La freccia rossa indica la direzione del fascio di raggi X. (B) Una visione più ravvicinata della regione portacampioni su Lipidico. La siringa è tenuta in posizione da due O-ring e il campione viene raccolto nel ricevitore. (D) Una visione ravvicinata del flusso del campione che mostra l'ago dell'iniettore e il deprezzatore di campioni che può essere modificato per incorporare un ricevitore di aspirazione polistirolo/venturi visto sotto l'ago in (A). La cifra è stata adattata da Berntsen et. al. 201923 con il permesso di AIP Publishing. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
L'iniettore è compatibile con vari tipi di portatori altamente viscosi. La velocità di corsa ottimale del campione per l'iniettore è fondamentale per la stabilità del flusso, troppo lenta causerà un effetto di curling / espansione del flusso e troppo velocemente si tradurrà nella rottura del flusso. La velocità ottimale varierà a seconda del sistema di trasporto utilizzato. La figura 2 e la figura 3 mostrano il grasso siliconico testato a diverse velocità dell'iniettore e dimostrano come il comportamento del flusso può variare. Una portata lenta(Figura 2A, 2.3 nL/s) si traduce in un'espansione del grasso siliconico estruso dall'iniettore, mentre una portata più veloce(Figura 2C, 6.6 nL/s) produce un flusso più sottile. Il curling del flusso di supporti viscosi è stato osservato regolarmente (Figura 3A). Per superare questo problema sono state testate due soluzioni innovative: un ricevitore in polistirolo e un imbuto di aspirazione venturi sotto l'ago. Il ricevitore in polistirolo introduce una debole forza elettrostatica e funziona meglio su campioni altamente carichi, come nel caso del grasso siliconico (Figura 3B), mentre l'imbuto di aspirazione venturi aiuta a guidare il flusso verticalmente verso il basso verso il ricevitore, indipendentemente dalla carica del campione. A seconda delle caratteristiche del campione, entrambe le opzioni possono essere utilizzate correttamente.
Figura 2: L'effetto di un flusso portante viscoso elevato utilizzando diverse velocità dell'iniettore. Il grasso di silicone al 100% è stato testato a diverse velocità del campione per valutarne le caratteristiche di flusso. ( A )La commissione per l'agricoltura, la . 2,3 nL/s (30 giri/min), (B) 3,5 nl/s (90 giri/min) e (C) 6,6 n/s (170 giri/min). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Comportamento del flusso di grasso siliconico al 100% che dimostra il curling del supporto viscoso. ( A ) Effetto curlinga2,3 nl/s (30 giri/min) (B) L'effetto dell'aggiunta del ricevitore in polistirolo al detentore di rifiuti del campione con la velocità dell'iniettore che opera a 2,3 nL/s (30 giri/min). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
È stata utilizzata una siringa di vetro contenente 26 μL di cristalli di lisozima (formato cristallo 10 μm x 10 μm x 20 μm) sospesa nel grasso siliconico(figura 4A). Lipidico ha generato un flusso di campioni costante, utilizzando l'i.D. dell'ago da 108 μm, con una portata media di 1,14 nL/s (con il motore impostato a 30 giri/min). Un algoritmo di ricercadi picco 36 è stato utilizzato per valutare la hit rate e una quantità sufficiente di dati (totale di 224.200 immagini) è stata raccolta entro 38 minuti dal tempo di raccolta dei dati, consentendo il recupero della struttura (codice PDB 6MQV). La tabella 1 fornisce un riassunto delle statistiche sulla raccolta dei dati e la figura 4B mostra un'immagine rappresentativa della mappa della densità degli elettroni che circonda uno dei legami di solfuro nella struttura del lisozima20.
Figura 4: Immagini di Lysozyme. (A) Immagini ottiche dei cristalli di lysozima nel grasso siliconico. Un'immagine polarizzata a croce (ingrandimento 40x) di cristalli di lisozima mescolati con un alto supporto viscoso, grasso siliconico, immaginato utilizzando un microscopio a luce visibile. La dimensione dei cristalli varia tra 15 e 20 μm e (B) Un'immagine rappresentativa della mappa di densità degli elettroni (2Fo-Fc, 1σ) che circonda i legami disolfuro del lisozima. La cifra è stata adattata da Berntsen et. al. 201923 con il permesso di AIP Publishing. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Informazioni supplementari. Clicca qui per scaricare questo file.
Tabella 1: Tabella riassuntiva che mostra le statistiche dei dati SX di Lipidico. I cristalli di lysozima sono stati mescolati con un alto supporto viscoso, grasso siliconico e trasmessi attraverso la regione di interazione a raggi X della linea di fascio MX2. Questa è una sintesi della tabella completa dei risultati pubblicata a Berntsen et. al.23. La tabella è adattata qui con il permesso di AIP Publishing.
| Statistiche dei dati | Lipidico, linea di fascio MX2 |
| rivelatore | Dectris EIGER X 16M, |
| frequenza fotogrammi | 100 Hz |
| Distanza rilevatore di campioni (mm) | 300 |
| Energia a raggi X (KeV) | 13 |
| Dimensioni fascio (WxH) (μm) | 12x22 |
| Lol di telai | 224200 |
| Tasso di hit (%) | 2.95 |
| Lol di fotogrammi indicizzati | 4852 |
| Risoluzione (Å) | 17.74-1.83 |
| completezza | 99.44 |
| Gruppo spaziale | P43212 |
| Cella unitaria | |
| a, b, c (Å) | 78.68, 78.68, 34.48 |
| α, β, γ (°) | 90, 90, 90 |
| I/σ(I) | 5.08 |
| ridondanza | 73.97 |
| CC1/2 | 0.96 |
| Rlavoro/Rgratuito | 0.18/0.26 |
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Discussion
È stato sviluppato un HVI alternativo, ideale per effettuare esperimenti SX a sorgenti di sincrotrone. Ha due vantaggi chiave rispetto agli HVI esistenti. Innanzitutto, è facile da installare sulla linea di fascio consentendo un rapido passaggio tra la cristallografia convenzionale e SX, sono necessari solo ~ 30 minuti per l'installazione e l'allineamento su MX2. In secondo luogo, le siringhe campione utilizzate per coltivare cristalli possono essere utilizzate direttamente come serbatoi per iniezione, limitando gli sprechi durante il trasferimento del campione. Il protocollo per la modifica dei campioni è stato descritto e dimostrato. Il design elimina la necessità di un complicato flusso di gas per controllare il getto rispetto ad altri HVI. È stato dimostrato un semplice processo di modifica della portata dell'iniettore che può essere regolato senza una risposta ritardata.
I passaggi più cruciali per una corretta raccolta dei dati SX sono l'ottimizzazione della concentrazione cristallina, l'ottenimento di una miscela omogenea di supporti ad alta viscosità e la produzione di un flusso stabile per la raccolta dei dati. La concentrazione e l'omogeneità ottimali dei cristalli possono essere ottenute centrifugando i cristalli fino a un pellet e aggiungendo una maggiore concentrazione di cristalli al supporto portante, assicurando che il campione sia accuratamente miscelato nel sistema di attacco. Una volta ottimizzata la concentrazione del cristallo, la portata dell'iniettore può essere facilmente regolata durante il tempo di fascio per ottenere un flusso stabile. Il curling del flusso viscoso è comunemente osservato con campioni ad alta viscosità. Vengono presentate due soluzioni: l'uso di un ricevitore di campioni di polistirolo per campioni caricati o l'aggiunta di un imbuto di aspirazione venturi che funge da catcher. Questo è riuscito a controllare il flusso nei test iniziali, ma in diverse condizioni del campione il curling del flusso può causare l'incollaggio del campione al punto dell'ago. È possibile che ciò possa essere superato modificando le proprietà di carica superficiale dell'ago aggiungendo rivestimenti speciali. Gli aghi rivestiti con diverse sostanze chimiche (cioè silicone) sono stati precedentemente adattati con successo per l'uso con robot di movimentazione dei liquidi e possono essere ordinati su misura dai produttori per adattarsi allasiringa 37.
L'iniettore non è limitato al grasso siliconico e può essere utilizzato con altri liquidi altamente viscosi. Sono state dimostrate diverse alternative23 che possono essere utilizzate con successo per l'iniezione di cristalli e sono descritte in una seriedi altre pubblicazioni 22,30,33. Il limite massimo di viscosità del campione che utilizza questo HVI è ancora in fase di studio, tuttavia le viscosità del campione fino a 25 Pa.s (utilizzando grasso di silicone al 100 %) hanno determinato un flusso stabile. Tuttavia, quando la viscosità del campione è stata ridotta a <10 Pa.s (utilizzando il 70 % di campione di grasso siliconico) non è stato possibile produrre un flusso affidabile. Pertanto, 10 Pa.s rappresenta l'attuale limite inferiore sulla viscosità del campione per iniezione utilizzando questo HVI. Anche l'i.D. dell'ago è una considerazione importante. Sebbene l'I.D. da 51 μm sia stato testato con successo durante l'iniezione di vari portatori senza cristalli, l'introduzione di cristalli interrompe il flusso del campione. Quindi, a seconda delle loro dimensioni, con cristalli introdotti nella matrice, c'è una probabilità molto più alta di blocco quando si utilizza l'ago I.D. da 51 μm rispetto alle dimensioni dell'ago più grandi. Quando si verifica un blocco può verificarsi un accumulo critico di pressione, in altri iniettori ciò potrebbe causare la rottura della siringa. Tuttavia, il design di questo HVI include un meccanismo di sicurezza in cui la meccanica di azionamento si allontanerà dallo stantuffo della siringa se la pressione diventa troppo alta fino a quando non viene abilitato un interruttore di disattivazione. Ciò comporta l'arresto dell'unità e impedisce alla siringa di vetro di rupturing.
Esistono diverse limitazioni per questo iniettore. L'iniettore è specificamente progettato per campioni altamente viscosi, pertanto i campioni liquidi simili non possono essere utilizzati direttamente per la consegna del campione. Per superare questa limitazione, i cristalli coltivati nei sistemi tampone possono essere mescolati con un supporto inerte adatto come descritto nella fase 1, tuttavia, c'è la possibilità che il cristallo possa diventare instabile. Pertanto, lo screening di una varietà di supporti inerti26,27,28,29 deve essere studiato prima per garantire il mantenimento della stabilità del campione. In secondo luogo, le dimensioni del cristallo e la qualità dell'imballaggio in cristallo influenzeranno la qualità della diffrazione. La linea di fascio MX2 funziona con una dimensione ottimale del fascio di 22 x 12 μm (H x W) e flusso ~1012 fotoni/s. La dimensione ottimale del cristallo per eseguire SX a MX2 è di ~ 10 μm ed è stato dimostrato che produce un elevato rapporto segnale-rumore. Tuttavia, è possibile raccogliere dati su cristalli di dimensioni più piccole se sono ben ordinati e diffract ad alta risoluzione. C'è un'opzione per tagliare la dimensione del fascio a questa linea di fascio a ~ 7,5 μm, tuttavia, questo ha un costo poiché riduce il flusso incidente che deve essere considerato durante l'esperimento.
Lo sviluppo di questo iniettore rende SX facilmente accessibile ai cristallografi tradizionali. Il buon funzionamento di Lipidico, apre le porte a un metodo semplice e veloce per la raccolta dei dati SX in un'ampia varietà di sorgenti di sincrotrone. Consente la raccolta di dati a temperatura ambiente su cristalli di 10 μm o meno a MX2, limitando gli effetti di danno da radiazioni per i singoli cristalli. Offre anche una nuova opportunità in Australia per eseguire SX risolto in millisecondi, che è l'attuale stato dell'arte per i cristallografi. Le applicazioni future di questo sistema di iniettori si estendono alla caratterizzazione a raggi X di materiali altamente viscosi utilizzando lo scattering a raggi X Small Angle (SAXS) permettendo all'iniettore di essere prontamente adattato ad altre linee di fascio presso il sincrotrone australiano.
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Disclosures
MK lavora per progetti Kusel. Kusel Design, uno sviluppatore di dispositivi di laboratorio personalizzato, è stato ingaggiato dal Dr Peter Bentsen della La Trobe University e dal Dr Tom Caradoc-Davies dell'ANSTO e per sviluppare un dispositivo a basso costo per consentire studi ad alta viscosità nella linea di travi MX2 presso l'Australian Synchrotron. Il dispositivo è stato sviluppato in stretta consultazione con il Dr. Caradoc-Davies. Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dall'Australian Research Council Centre of Excellence in Advanced Molecular Imaging (CE140100011) (http://www.imagingcoe.org/). Questa ricerca è stata intrapresa in parte utilizzando la linea di fascio MX2 presso l'Australian Synchrotron, parte dell'ANSTO, e ha fatto uso del rivelatore Australian Cancer Research Foundation (ACRF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hen eggwhite lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | Used to grow crystals for testing the injector and the crystals are transferred into silicon grease. https://www.sigmaaldrich.com/ |
| High vacuum silicon grease | Dow Corning | Z273554-1EA | Used for testing of injector. https://www.sigmaaldrich.com/ |
| Injector needle (108 µm ID) | Hamilton | part No: 7803-05 | www.hamiltoncompany.com |
| Glass gas-tight syringes, 100 µl | Hamilton | part no: 7656-01 | Syringes used for sample injection. www.hamiltoncompany.com |
| LCP syringe coupler | Formulatrix | 209526 | Syringe coupler to mix the samples |
| Lipidico injector | La Trobe Univerity/ANSTO | This is a specific piece of equipment that can be accessed through La Trobe University / ANSTO Australian Synchrotron Facility |
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