Summary
L’objectif de ce protocole est de démontrer comment préparer des échantillons de cristallographie en série pour la collecte de données sur un injecteur visqueux élevé, Lipidico, récemment commandé au synchrotron australien.
Abstract
Une installation pour effectuer des mesures de cristallographie en série a été développée au synchrotron australien. Cette installation intègre un injecteur visqueux élevé construit à cet effet, Lipidico, dans le cadre de la cristallographie macromoléculaire (MX2) beamline pour mesurer un grand nombre de petits cristaux à température ambiante. L’objectif de cette technique est de permettre aux cristaux d’être cultivés/transférés dans des seringues en verre pour être utilisés directement dans l’injecteur pour la collecte de données de cristallographie en série. Les avantages de cet injecteur comprennent la capacité de réagir rapidement aux changements dans le débit sans interruption du flux. Plusieurs limitations pour cet injecteur de viscosité élevée (HVI) existent qui incluent une restriction sur les viscosités autorisées d’échantillon à >10 Pa.s. La stabilité du flux peut également être un problème en fonction des propriétés spécifiques de l’échantillon. Un protocole détaillé sur la façon de mettre en place des échantillons et d’utiliser l’injecteur pour les mesures de cristallographie en série au synchrotron australien est présenté ici. La méthode démontre la préparation de l’échantillon, y compris le transfert de cristaux de lysozyme dans un média visqueux élevé (graisse de silicone), et le fonctionnement de l’injecteur pour la collecte de données à MX2.
Introduction
La cristallographie en série (SX) est une technique qui a été développée initialement dans le contexte des lasers à électrons libres à rayons X (XFELs)1,2,3,4. Bien que les approches à cibles fixes puissent être utilisées pour SX5,6,7, généralement, les systèmes d’injection sont utilisés pour livrer des cristaux dans un flux continu au faisceau de rayons X. Parce qu’il combine les données d’un grand nombre de cristaux, SX évite la nécessité d’un alignement de cristal pendant l’expérience, et permet de recueillir des données à températureambiante 8,9. À l’aide d’un injecteur approprié, les cristaux sont diffusés un par un dans la zone d’interaction aux rayons X et les données de diffraction qui en résultent sont recueillies sur un détecteur dezone 9,10. À ce jour, SX a réussi à résoudre un certain nombre de structures protéiques1,11,12,13, y compris les cristaux trop petits pour être mesurer à l’aide de la cristallographie conventionnelle. Il a également fourni de nouvelles perspectives sur la dynamique moléculaire résolue dans le temps en exploitant la durée de l’impulsion femtoseconde du XFEL. En lançant des réactions pompe-sonde avec des sources laser optiques, des études approfondies ont été menées sur le photosystème II14,15, protéine jaune photoactive16,17, cytochrome C oxidase18, ainsi que la bactériorhodopsine19,20,21. Ces études ont sondé la dynamique de transfert d’électrons qui se produit après l’activation de la lumière démontrant le potentiel significatif de la cristallographie en série pour comprendre les processus biologiques résolus dans le temps.
Le développement de la cristallographie en série est également de plus en plus répandu aux sources synchrotron9,12,20,22,23,24. Le SX à base de synchrotron permet de mesurer efficacement un grand nombre de cristaux individuels à température ambiante à l’aide d’un système d’injection approprié. Cette approche convient aux cristaux plus petits, donc, en plus d’exiger un détecteur rapide de taux d’image pour recueillir les données, un faisceau micro-focalisé est également nécessaire. Par rapport à la cristallographie conventionnelle, SX n’implique pas le montage et l’alignement des cristaux individuels dans le faisceau de rayons X. Étant donné que les données d’un grand nombre de cristaux individuels sont fusionnées, la dose de rayonnement reçue par chaque cristal peut être considérablement réduite par rapport à la cristallographie conventionnelle. Synchrotron SX peut également être appliqué à l’étude des réactions résolues dans le temps, même jusqu’au régime milliseconde, à condition qu’un détecteur avec un taux d’image suffisamment élevé est disponible (par exemple, 100 Hz ou plus). Plusieurs expériences de cristallographie en série ont été réalisées au synchrotron à l’aide d’injecteurs initialement développés aux sources XFEL20,22,23. Les deux types les plus communs d’injecteur sont la buse virtuelle dynamique de gaz (GDVN)25 et l’injecteur visqueux élevé (HVI)9,24,26,27,28. Le GDVN est idéal pour injecter de faibles viscosités, des échantillons liquides, mais nécessite des débits élevés pour atteindre des débits stables, ce qui conduit à des taux élevés de consommation d’échantillons. En revanche, les HVI conviennent aux échantillons de viscosité élevée qui permettent la production d’un flux stable à des débits beaucoup plus faibles, ce qui entraîne une consommation d’échantillons beaucoup plus faible. L’injecteur HVI favorise donc la livraison d’échantillons lorsqu’un porteur visqueux est préférable (p. ex., à base de lipides pour les protéines membranaires) et/ou que de grandes quantités d’échantillons ne sont pas disponibles. Les injecteurs SX sont généralement difficiles à utiliser et nécessitent une formation approfondie pour fonctionner. Il s’agit également de protocoles de transfert d’échantillons longs, car l’échantillon doit être chargé dans un réservoir spécialisé, ce qui comporte généralement un risque élevé associé à la perte d’échantillons dans le « volume mort » ou par des fuites dans les connexions. Par conséquent, il est souhaitable d’optimiser la conception de l’injecteur pour atténuer les pertes avant que l’échantillon n’atteigne le faisceau de rayons X.
Récemment, les premiers résultats SX ont été publiés à l’aide de Lipidico23 avec une cible lysozyme, à l’aide d’un détecteur Eiger 16M. Cette conception d’injecteur limite le gaspillage de l’échantillon en minimisant le nombre d’étapes impliquées dans le fait de passer de la cristallisation initiale au transfert de cristaux dans l’injecteur, suivi de la livraison de l’échantillon au faisceau de rayons X. Ce manuscrit décrit et démontre la procédure de transfert de l’échantillon à partir de la préparation de l’échantillon, du passage au processus d’injection, et enfin de la collecte de données, à l’aide du même récipient de cristallisation. Le fonctionnement de l’injecteur est également décrit.
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Protocol
1. Préparation de cristaux dans un média visqueux élevé à l’aide de seringues en verre
- Centrifugeuse la solution cristalline doucement (~1.000 x g,~10 min à 22 °C) pour former une pastille en cristal souple et enlever l’excès de tampon. Il en résultera une forte concentration de cristaux dans la pastille qui peut être utilisée pour la collecte de données.
REMARQUE : Pour éviter la dilution du média visqueux augmenter la concentration de cristal à cette étape. Optimisez le rapport entre les supports visqueux et le volume cristallin pour chaque échantillon afin d’obtenir une forte concentration de cristaux tout en conservant une viscosité élevée pour les supports. Centrifugeuse la solution cristalline pour former une pastille et enlever l’excès de tampon pour augmenter la concentration de cristal dans la solution, comme décrit dans Darmanin et. al.29. - Installez deux seringues de 100 μL avec un coupler.
- Attachez le coupler à l’extrémité de la première seringue et ajoutez 28 μL de solution cristalline au sommet de la seringue. Lentement, insérez le piston dans le haut de la seringue et poussez doucement la solution vers le bas à l’extrémité de la pointe du coupler, en enlevant toutes les bulles d’air qui se forment. Faites ceci en suivant l’une des deux méthodes discutées ci-dessous.
REMARQUE : Le volume de cristaux à ajouter aux supports visqueux élevés peut être varié s’il ne modifie pas significativement la viscosité de l’échantillon global.- Première méthode : Utilisez des changements de pression rapides pour faire éclater les bulles d’air.
- Placez soigneusement un doigt ganté sur le dessus du point d’aiguille du coupler émoussé et appliquez (très doucement) une pression pour créer un joint. N’appliquez pas trop de pression car cela peut entraîner une blessure par piqûre d’aiguille.
- Maintenant, tirez le piston en arrière pour tirer la solution loin du point d’aiguille, cela va générer une accumulation de pression dans la seringue.
- Relâchez rapidement la pression en haut de la seringue en enlevant le doigt ganté de la pointe émoussée de l’aiguille. Soyez prudent, si l’échantillon est trop près de la pointe lorsque le doigt est enlevé, il peut pulvériser entraînant la perte d’échantillon. Le changement rapide de pression à l’intérieur de la seringue fera éclater les bulles d’air. Répétez l’année jusqu’à ce que toutes les bulles aient été enlevées.
- Deuxième méthode : Utiliser la « centrifugeuse humaine » pour éliminer les bulles d’air.
- Placez la seringue dans une main avec l’aiguille orientée vers le haut et le piston coincé entre deux doigts, de sorte qu’il ne peut pas bouger.
- Faites pivoter rapidement le bras en tenant la seringue dans une direction 2 à 3 fois, la force centrifuge résultante sur l’échantillon forcera toutes les bulles d’air hors de la seringue. Soyez prudent, si fait trop lentement échantillon peut être perdu.
- Inspectez la seringue pour déceiller les bulles d’air, si des bulles demeurent, répétez les étapes 1.3.2.1 – 1.3.2.2 jusqu’à ce que toutes les bulles d’air soient enlevées.
- Première méthode : Utilisez des changements de pression rapides pour faire éclater les bulles d’air.
- À l’aide d’une spatule fine, ajouter environ 42 μL de graisse de silicone sous vide élevée directement sur le dessus de la deuxième seringue. Poussez le piston jusqu’à la fin, en enlevant toutes les bulles d’air et en veillant à ce qu’il n’y ait pas de trou d’air au bout de la seringue.
REMARQUE : La composition précise de la graisse de silicone n’est pas critique car elle agit comme un transporteur inerte. Une valeur de viscosité de >10 Pa.s ou un rapport d’environ 60:40 graisse de silicone à la solution cristalline est optimale pour l’injection, cependant, il est possible que cela puisse varier en fonction des caractéristiques exactes de l’échantillon. Ajustez le volume de solution cristalline ajouté à la graisse de silicone pour optimiser la concentration de cristaux dans le mélange, comme indiqué dans la discussion. Les supports à visqueux autres que la graisse de silicone peuvent être utilisés tant qu’ils sont compatibles avecl’échantillon 30,31,32,33. - Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air dans l’une ou l’autre des deux seringues et attachez les seringues ensemble à l’aide du coupler. Tenez les seringues verticalement en griping juste l’extrémité de la seringue pendant que réchauffer la seringue due à la chaleur produite des doigts peut affecter l’échantillon.
- Mélanger l’échantillon en déprimant doucement le piston du côté de la solution cristalline afin qu’il se mélange à la graisse de silicone, puis pousser le piston sur le côté graisse de silicone, de sorte qu’il pousse l’échantillon vers le côté solution cristalline. Doucement, répétez ce processus 50 à 100 fois afin que l’échantillon soit mélangé à fond et semblehomogène.
REMARQUE : Si les cristaux sont cultivés directement dans des supports très visqueux (p. ex., phase cubique lipidique, LCP), les étapes 1.1-1.6 ne sont pas nécessaires. Des protocoles pour la culture des cristaux dans les seringues peuvent être trouvés dans Liu et.al. 34,35. Suivez ce protocole jusqu’à la consolidation de l’échantillon, étape 10, où tout l’échantillon est maintenant contenu dans une seringue et le tampon de cristallisation est supprimé. L’ajout de 7.9MAG n’est pas nécessaire pour ce protocole. Au lieu de cela, retirez tout excès de liquide de la seringue en poussant doucement le piston vers le bas dans l’échantillon jusqu’à ce qu’il ne reste plus de liquide dans la seringue. - Visualisez les cristaux au microscope optique soit à travers la seringue, soit, pour de meilleurs résultats, extrayez une petite quantité (~1 μL) sur une lame de verre et placez un glissement de couverture sur le dessus.
- Vérifiez la concentration de cristaux.
- Déterminez la concentration de cristaux dans la graisse de silicone en comptant le nombre de cristaux dans une zone spécifique à l’aide des images au microscope optique. Pour de meilleurs résultats, une forte densité de cristaux uniformément distribués dans les médias est idéale (>106 cristaux/mL) afin d’obtenir un taux élevé de cristal-frappé.
- Ajustez la concentration de cristaux dans la seringue en modifiant le rapport cristaux/supports visqueux dans les étapes 1.3 et 1.4.
- Pour diminuer la concentration en cristaux, diluer les cristaux dans la seringue en augmentant la quantité de graisse de silicone/HV à l’étape 1.4 ou en diluant la pastille de cristal en solution avec le tampon de cristallisation avant de mettre en place les seringues à l’étape 1.1.
- Pour augmenter la concentration en cristal, diminuer la quantité de graisse de silicone à l’étape 1.4, mais n’oubliez pas de ne pas réduire la viscosité en dessous de 10 Pa.s.
REMARQUE : La concentration de cristaux signalée ici a été optimisée pour cet échantillon spécifique et la taille du cristal. Toutefois, la concentration de cristal idéale dépendra de la taille du cristal, de la taille du faisceau, du diamètre interne de l’aiguille (D.I.) et du flux de rayons X incident. Cela peut être déterminé à partir du taux de réussite avec un taux de réussite optimal d’environ 30% considéré comme « bon ». Dans la pratique, la concentration en cristaux doit être optimisée pour différents échantillons pendant le temps de faisceau pour obtenir le taux de frappe désiré. Commencez par une forte concentration de cristaux, 109 cristaux/mL. La procédure d’ajustement de la concentration en cristal est donnée dans Liu et.al. 35.
- Le protocole peut être mis en pause ici jusqu’à ce que l’injecteur soit prêt pour la collecte de données.
- Si les cristaux sont cultivés en LCP, scellez-les et laissez-les rester dans des seringues jusqu’à quelques jours à température ambiante.
- Si les cristaux ont été transférés dans un autre média visqueux élevé (p. ex., la graisse de silicone), un test de stabilité des cristaux au fil du temps devrait être effectué avant la mesure. Cela déterminera combien de temps les cristaux sont stables dans le média inerte (idéalement > 8 h) et le délai pour la collecte de données. Ici, les cristaux de lysozyme ont été stables pendant des jours dans la graisse de silicone et n’ont pas montré de signes de dissolution lorsqu’ils ont été inspectés à l’aide d’un microscope optique.
- Déplacez tout l’échantillon dans une seringue avant de débrancher le coupler. Déconnecter le coupler de la seringue et fixer l’aiguille d’injection. Vissez fermement l’aiguille dans la base de la seringue et assurez-vous qu’elle est bien attachée pour éviter toute fuite. Une aiguille i.D. de 108 μm (longueur d’aiguille de 13 mm, style point 3) a été utilisée pour cette expérience. Selon la taille du cristal et la taille du faisceau, fixez une aiguille d’I.D. de 51 μm ou de 108 μm.
REMARQUE : Le pré-test du flux d’échantillons avant l’heure du faisceau est nécessaire pour être en mesure de sélectionner la taille correcte de l’aiguille injecteur. Selon les caractéristiques de l’échantillon (c.-à-vis de la viscosité, de la charge, de la composition tampon) et de l’i.D. de l’aiguille, les échantillons circuleront différemment. Par conséquent, il est recommandé de tester une variété de tailles d’aiguilles pour produire le flux le plus stable avec la plus petite aiguille d’i.d. possible afin de maximiser le rapport signal-bruit lors de la collecte de données. - Si l’injecteur est déjà monté et aligné sur la ligne de faisceau, déplacez-vous vers la section 3 et montez la seringue de l’échantillon directement sur l’injecteur.
REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici.
2. Montage et contrôle d’injecteur
- Montez l’injecteur sur la ligne de faisceau. Retirez la buse cryogénique sur la ligne de faisceau MX2 et remplacez-la par l’injecteur. Desserrez la vis de serrage qui maintient la buse cryogénique et fixez-la au support situé à côté de la scène motorisée.
- Soulevez l’injecteur de son chariot en tenant la poignée noire et placez-la sur la scène motorisée.
- Attacher l’injecteur au stade motorisé; main serrer le bouton de vis à serrant noir.
- Monter une seringue vide sur l’injecteur
- Dans l’interface de contrôle informatique injecteur (c.-à-d. le logiciel de contrôle de position EPOS), sélectionnez le mode Homing sous outils dans le menu logiciel. Ensuite, sélectionnez Commutateur limite négative, et Démarrer Homing, laissez le logiciel s’exécuter jusqu’à ce que la vis est rétractée suffisamment pour la seringue pour s’adapter sous la vis. S’il n’est pas surveillé, l’interrupteur limite arrête automatiquement la vis.
- Montez une seringue vide (« factice ») sur l’injecteur en insérant l’aiguille à travers la fente dans le porte-seringue. Alignez la seringue contre le support.
- Attachez la seringue avec deux anneaux O.
- Enroulez le premier anneau O sur la partie médiane de la seringue en l’attachant aux crochets de chaque côté de la seringue.
- Bouclez le deuxième anneau O autour des crochets sur la partie supérieure de la seringue, puis placez une partie de l’anneau O sur le dessus de la seringue en verre comme le montrent la démonstration et la figure 1B.
- Aligner l’injecteur sur le faisceau de rayons X
- Déplacez l’étape motorisée avec l’injecteur vers le point d’interaction aux rayons X via le logiciel de commande de la ligne de faisceau. Cela peut être visualisé à l’aide de la caméra en ligne. La taille et la position du faisceau sont indiquées par une croix rouge sur l’écran et le stade motorisé peut être déplacé pour aligner l’aiguille avec la région d’interaction aux rayons X.
- Ajustez la position x et y de la scène pour aligner l’aiguille avec la croix rouge.
- Ajustez la position z jusqu’à ce que la pointe de l’aiguille soit mise au point.
- Vérifiez visuellement l’alignement de la pointe de l’aiguille et du faisceau de rayons X en vérifiant que la pointe de seringue rencontre le réticule qui sont visibles dans l’image du microscope optique générée par la caméra beamline.
- Une fois que la pointe de l’aiguille est alignée déplacer la pointe au-dessus des poils croisés ~ 100 μm. Cela élimine la dispersion des rayons X de la pointe de l’aiguille.
REMARQUE : Le montage et l’alignement de l’injecteur sur la ligne de faisceau MX2 au synchrotron doivent être effectués par les scientifiques de la ligne de faisceau et peuvent être complétés en moins de 30 minutes.
3. Montage de la seringue d’échantillon
- Remplacer la seringue vide par la seringue de l’échantillon en suivant l’étape 2.3.
- Placez le bouchon d’injecteur sur la tête du piston de seringue de l’échantillon.
- Déplacez la vis d’entraînement vers le haut du bouchon.
- Dans le logiciel de contrôle injecteur sélectionnez le mode Velocity.
- Entrée 3000 rpm (~115 nL/s) comme valeur de réglage et appuyez sur Appliquer la valeur de réglage.
- Lorsque la vis d’entraînement touche le bouchon sur la tête du piston de seringue, arrêtez le moteur.
- Réglez la valeur du régime à zéro dans le logiciel de contrôle de l’injecteur en changeant la valeur de réglage à « 0 » à mesure que la vis s’approche du bouchon.
- Une fois le contact effectué, activez la valeur prédéfinise en appuyant sur Appliquer la valeur de réglage pour arrêter la vis instantanément.
- Agiter doucement le bouchon pour s’assurer qu’il est fermement maintenu en place.
REMARQUE : Chaque fois qu’une nouvelle valeur définie est entrée dans la boîte de valeur de réglage dans le logiciel de contrôle, elle n’est activée qu’après avoir appuyé sur la valeur de réglage d’application.
4. Exécution de l’injecteur
- Une fois que la vis d’entraînement du bouchon a pris contact ferme avec le haut du piston, changez la valeur de réglage du régime à 100. Cela équivaut à ~ 4 nL/s.
- Inspectez visuellement la pointe de l’aiguille lorsque l’échantillon sort ou regardez l’image de la caméra beamline de l’aiguille pour observer quand l’échantillon commence à extruder de la pointe de l’aiguille.
- Effectuez une fouille du clapier, fermez la porte de la huche et allumez le faisceau de rayons X. À partir de ce point, l’injecteur doit être actionné à distance de l’extérieur du clapier.
- Réglez le régime jusqu’à ce qu’un flux stable soit généré.
- Réduire la valeur de réglage du régime à 90.
- Répétez l’étape 4.4.1, en diminuant la valeur de réglage du régime par incréments de 10, pour ralentir le flux tout en maintenant un flux stable. Pour la graisse de silicone une valeur de 30 rpm a été utilisée.
REMARQUE : La plage typique du régime varie entre 30 et 100 rpm (1 à 4 nL/s) selon les caractéristiques de l’échantillon et le temps d’exposition aux rayons X. En général, le régime doit être réglé pour produire le débit le plus lent (afin de minimiser la consommation d’échantillons) tout en maintenant un flux stable.
- Gestion d’un flux d’échantillons qui ne coule pas bien.
- Continuez d’augmenter la valeur de réglage du régime par incréments de 10 jusqu’à ce que le flux soit plus droit. Si le flux ne se stabilise pas, même après avoir augmenté la valeur de réglage du régime à la valeur maximale de 100 rpm, essayez d’améliorer la stabilité en implémentant l’une des deux méthodes décrites ci-dessous.
- Première méthode : Insérez un échantillonneur de polystyrène sous le flux d’échantillons pour aider à guider l’échantillon. Cette méthode fonctionne bien pour les flux d’échantillons hautement chargés.
- Deuxième méthode : Insérez un entonnoir d’aspiration venturi à l’échantillonneur. Pour fournir de l’air à l’entonnoir, connectez-le au tube de sortie d’air situé dans le clapier. Cette méthode peut aider à diriger et stabiliser le flux d’échantillons indépendamment de la charge du flux.
- Continuez d’augmenter la valeur de réglage du régime par incréments de 10 jusqu’à ce que le flux soit plus droit. Si le flux ne se stabilise pas, même après avoir augmenté la valeur de réglage du régime à la valeur maximale de 100 rpm, essayez d’améliorer la stabilité en implémentant l’une des deux méthodes décrites ci-dessous.
- Une fois qu’un flux constant et régulier est atteint, commencez la collecte de données et optimisez la distance du détecteur selon une expérience normale de cristallographie aux rayons X.
REMARQUE : Le régime est converti en débit à l’aide de la table de conversion fournie dans l’information supplémentaire, « Calculateur d’appareils Lipidico ». Entrez la valeur du régime, le diamètre des aiguilles et les volumes de seringues pour calculer le débit à l’aide de cette calculatrice.
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Representative Results
Lipidico est un HVI construit comme un système de livraison alternatif pour une utilisation sur MX2 (Figure 1). Il est idéal pour SX où les cristaux sont soit cultivés en phase cubique lipidique ou transférés à un média inerte visqueux élevé.
Pour démontrer l’application injecteur, de la graisse de silicone mélangée à des cristaux de lysozyme a été utilisée pour recueillir des données SX à la ligne de faisceau MX2 au synchrotron australien. Pour monter l’injecteur sur la ligne de faisceau MX2, la buse cryogénique est enlevée et remplacée par l’injecteur comme le montre la figure 1. Les échantillons de seringue sont montés directement sur l’injecteur et fixés à l’aide d’anneaux O (figure 1B). La collecte de données peut être initiée en quelques minutes après un changement d’échantillon. L’injecteur est conçu pour le contrôle rapide de l’échantillon avec une configuration simple qui est facile à utiliser pour les utilisateurs qui ne sont pas familiers avec SX.
Figure 1 : Images de Lipidico, un injecteur visqueux utilisé au synchrotron australien pour les expériences SX. (A) Montre une photo de Lipidico incorporée dans MX2. La flèche rouge indique la direction du faisceau de rayons X. (B) Une vue plus proche de la région du détenteur de l’échantillon sur Lipidico. La seringue est maintenue en place par deux anneaux O et l’échantillon est prélevé dans le receveur. (D) Une vue rapprochée du flux d’échantillons montrant l’aiguille de l’injecteur et le receveur de déchets de l’échantillon qui peut être modifié pour incorporer un attrape-aspiration en polystyrène/venturi vu sous l’aiguille dans (A). La figure a été adaptée de Berntsen et. al. 201923 avec la permission d’AIP Publishing. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
L’injecteur est compatible avec différents types de porteurs très visqueux. La vitesse optimale de fonctionnement de l’échantillon pour l’injecteur est cruciale pour la stabilité du flux, trop lente provoquera un effet de curling / expansion du flux et trop rapide se traduira par la rupture du flux. La vitesse optimale varie en fonction du système de support utilisé. Les figures 2 et 3 montrent la graisse de silicone testée à différentes vitesses d’injection et démontrent comment le comportement du flux peut varier. Un débit lent(figure 2A, 2,3 nL/s) entraîne l’expansion de la graisse de silicone extrudée de l’injecteur tandis qu’un débit plus rapide(figure 2C, 6,6 nL/s) produit un flux plus mince. Le curling du flux médiatique visqueux a été régulièrement observé (figure 3A). Pour surmonter ce problème, deux solutions innovantes ont été testées : un receveur de polystyrène et un entonnoir venturi sous l’aiguille. Le receveur de polystyrène introduit une faible force électrostatique et fonctionne mieux sur les échantillons très chargés, comme dans le cas de la graisse de silicone (figure 3B), tandis que l’entonnoir venturi aspiration aide à guider le flux verticalement vers le bas pour le receveur, indépendamment de la charge de l’échantillon. Selon les caractéristiques de l’échantillon, l’une ou l’autre option peut être utilisée avec succès.
Figure 2 : L’effet d’un flux porteur visqueux élevé à l’aide de différentes vitesses d’injection. La graisse 100% silicone a été testée à différentes vitesses d’échantillonnage pour évaluer ses caractéristiques d’écoulement. (A) . 2,3 nL/s (30 rpm), (B) 3,5 nl/s (90 rpm) et (C) 6,6 n/s (170 rpm). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Comportement des cours d’eau de graisse 100 % silicone démontrant le curling des supports visqueux. (A) Effet de curling à 2,3 nl/s (30 rpm) ( B )L’effetde l’ajout du receveur de polystyrène au support de déchets échantillon avec la vitesse d’injecteur fonctionnant à 2,3 nL/s (30 rpm). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Une seringue en verre contenant 26 μL de cristaux de lysozyme (taille cristalline 10 μm x 10 μm x 20 μm) suspendue dans de la graisse de silicone a été utilisée (figure 4A). Lipidico a généré un flux d’échantillons constant, à l’aide de l’aiguille de 108 μm I.D., avec un débit moyen de 1,14 nL/s (avec le moteur réglé à 30 rpm). Un algorithme de recherchede pointe 36 a été utilisé pour évaluer le taux de réussite et une quantité suffisante de données (total de 224 200 images) a été recueillie dans les 38 minutes du temps de collecte de données, permettant la récupération de la structure (code PDB 6MQV). Le tableau 1 fournit un résumé des statistiques de collecte de données et la figure 4B montre une image représentative de la carte de densité électronique entourant l’un des liaisons de di-sulfure dans la structure lysozyme20.
Figure 4 : Images de Lysozyme. (A) Images optiques des cristaux de lysozyme dans la graisse de silicone. Une image polarisée croisée (grossissement 40x) de cristaux de lysozyme mélangés à un média visqueux élevé, graisse de silicone, imitée à l’aide d’un microscope à lumière visible. La taille des cristaux varie entre 15 et 20 μm et (B) Une image représentative de la carte de densité électronique (2Fo-Fc, 1ν) entourant les liaisons disulfides du lysozyme. La figure a été adaptée de Berntsen et. al. 201923 avec la permission d’AIP Publishing. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Informations complémentaires. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
Tableau 1 : Tableau sommaire montrant les statistiques des données SX de Lipidico. Les cristaux de lysozyme ont été mélangés avec un média visqueux élevé, de la graisse de silicone, et ont été diffusés à travers la région d’interaction aux rayons X de la ligne de faisceau MX2. Il s’agit d’un résumé du tableau complet des résultats publiés dans Berntsen et. al.23. Le tableau est adapté ici avec la permission d’AIP Publishing.
| Statistiques de données | Lipidico, faisceau MX2 |
| détecteur | Dectris EIGER X 16M, |
| taux d’image | 100Hz |
| Distance du détecteur d’échantillons (mm) | 300 |
| Énergie aux rayons X (KeV) | 13 |
| Taille du faisceau (WxH) (μm) | 12x22 |
| Lol ( Lol ) des cadres | 224200 |
| Taux de réussite (%) | 2.95 |
| Lol ( Lol ) des cadres indexés | 4852 |
| Résolution (Å) | 17.74-1.83 |
| complétude | 99.44 |
| Groupe spatial | P43212 |
| Cellule d’unité | |
| a, b, c (Å) | 78.68, 78.68, 34.48 |
| α, β, γ (°) | 90, 90, 90 |
| I/σ (I) | 5.08 |
| redondance | 73.97 |
| CC1/2 | 0.96 |
| Rtravail/Rgratuit | 0.18/0.26 |
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Discussion
Une alternative HVI a été développée, idéale pour effectuer des expériences SX à des sources synchrotron. Il présente deux avantages clés par rapport aux IDH existants. Tout d’abord, il est facile à installer sur la ligne de faisceau permettant une commutation rapide entre la cristallographie conventionnelle et SX, seulement ~ 30 minutes est nécessaire pour l’installation et l’alignement sur MX2. Deuxièmement, les seringues d’échantillon utilisées pour faire pousser des cristaux peuvent être directement utilisées comme réservoirs d’injection, ce qui limite le gaspillage lors du transfert de l’échantillon. Le protocole de modification des échantillons a été décrit et démontré. La conception élimine la nécessité d’un flux de gaz compliqué pour contrôler le jet par rapport à d’autres IHC. Un processus simple pour changer le débit de l’injecteur a été démontré qui peut être ajusté sans réponse retardée.
Les étapes les plus cruciales pour la collecte réussie de données SX sont l’optimisation de la concentration de cristaux, l’obtention d’un mélange homogène de supports visqueux élevés, et la production d’un flux stable pour la collecte de données. La concentration cristalline optimale et l’homogénéité peuvent être obtenues en centrifugant les cristaux jusqu’à une pastille et en ajoutant une plus grande concentration de cristaux au support, en veillant à ce que l’échantillon soit bien mélangé dans le système de coupler. Une fois la concentration de cristal optimisée, le débit de l’injecteur peut facilement être ajusté pendant le faisceau pour obtenir un flux stable. Le curling du cours d’eau visqueux est généralement observé avec des échantillons visqueux élevés. Deux solutions sont présentées : l’utilisation d’un collecteur d’échantillons de polystyrène pour les échantillons chargés ou l’ajout d’un entonnoir venturi agissant comme receveur. Cela a réussi à contrôler le cours d’eau lors des essais initiaux, mais dans différentes conditions d’échantillon, le curling du cours d’eau peut entraîner le collage de l’échantillon au point d’aiguille. Il est possible que cela puisse être surmonté en changeant les propriétés de charge de surface de l’aiguille en ajoutant des revêtements spéciaux. Les aiguilles recouvertes de différents produits chimiques (c.-à-silicone) ont déjà été adaptées avec succès pour être utilisées avec des robots de manutention liquide et peuvent être commandées sur mesure à partir de fabrications adaptées à la seringue37.
L’injecteur ne se limite pas à la graisse de silicone et peut être utilisé avec d’autres liquides très visqueux. Plusieurs alternatives différentes ont été démontrées23 qui peuvent être utilisées avec succès pour l’injection de cristaux et sont décrites dans un certain nombre d’autres publications22,30,33. La limite supérieure de viscosité de l’échantillon à l’aide de cette IDH est encore à l’étude, mais des viscosités d’échantillon de jusqu’à 25 Pa.s (utilisant 100 % de graisse de silicone) ont abouti à un flux stable. Toutefois, lorsque la viscosité de l’échantillon a été réduite à <10 Pa.s (en utilisant 70 % d’échantillon de graisse de silicone), un flux fiable n’a pas pu être produit. Par conséquent, 10 Pa.s représente la limite inférieure actuelle sur la viscosité de l’échantillon pour l’injection à l’aide de cette IH. L’i.d. d’aiguille est également une considération importante. Bien que l’I.D. de 51 μm ait été testé avec succès lors de l’injection de divers porteurs sans cristaux, l’introduction de cristaux perturbe le flux de l’échantillon. Par conséquent, selon leur taille, avec des cristaux introduits dans la matrice, il y a une probabilité beaucoup plus élevée de blocage lors de l’utilisation de l’aiguille d’i.d. de 51 μm par rapport à la plus grande taille d’aiguille. Lorsqu’un blocage se produit, une accumulation critique de pression peut se produire, chez d’autres injecteurs, ce qui pourrait entraîner une rupture de seringue. Toutefois, la conception de ce HVI comprend un mécanisme de sécurité où la mécanique d’entraînement s’éloignera du piston de seringue si la pression devient trop élevée jusqu’à ce qu’un interrupteur de désactivation soit activé. Il en résulte que le lecteur est arrêté et empêche la seringue en verre de se rompre.
Plusieurs limitations existent pour cet injecteur. L’injecteur est spécifiquement conçu pour les échantillons très visqueux, par conséquent, liquide comme les échantillons ne peuvent pas être utilisés directement pour la livraison de l’échantillon. Pour surmonter cette limitation, les cristaux cultivés dans les systèmes tampons peuvent être mélangés avec un média inerte approprié tel que décrit à l’étape 1, cependant, il ya une possibilité que le cristal peut devenir instable. Par conséquent, le dépistage d’une variété de supportsinertes 26,27 , 28,29devraitd’abord fairel’objet d’une étude afin de s’assurer que la stabilité de l’échantillon est maintenue. Deuxièmement, la taille du cristal et la qualité de l’emballage en cristal affecteront la qualité de diffraction. La ligne de faisceau MX2 fonctionne à une taille optimale de faisceau de 22 x 12 μm (H x W) et de flux ~1012 photon/s. La taille optimale du cristal pour effectuer SX à MX2 est ~10 μm et a été montré pour donner un rapport signal-bruit élevé. Toutefois, il est possible de recueillir des données sur les cristaux de plus petite taille s’ils sont bien commandés et diffractés à haute résolution. Il ya une option pour trancher la taille du faisceau à cette ligne de faisceau à ~ 7,5 μm, cependant, cela a un coût car il réduit le flux d’incident qui doit être considéré au cours de l’expérience.
Le développement de cet injecteur rend SX facilement accessible aux cristallographes grand public. Le fonctionnement réussi de Lipidico, ouvre la porte à une méthode rapide et facile pour la collecte de données SX à une grande variété de sources synchrotron. Il permet la collecte de données sur la température ambiante sur les cristaux de 10 μm ou moins au MX2, limitant ainsi les effets des dommages causés par les radiations pour les cristaux individuels. Il offre également une nouvelle occasion en Australie d’effectuer milliseconde temps résolu SX qui est l’état actuel de l’art pour les cristallographes. Les applications futures de ce système d’injecteur s’étendent à la caractérisation aux rayons X de matériaux très visqueux à l’aide de la diffusion par rayons X à petit angle (SAXS) permettant à l’injecteur d’être facilement adapté à d’autres faisceaux au synchrotron australien.
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Disclosures
MK travaille pour les designs Kusel. Kusel Design, un développeur d’appareils de laboratoire personnalisé, a été engagé par le Dr Peter Bentsen de l’Université De La Trobe et le Dr Tom Caradoc-Davies de l’ANSTO et de développer un dispositif à faible coût pour permettre des études visqueuses élevées dans la ligne de faisceau MX2 au Synchrotron australien. Le dispositif a été développé en étroite consultation avec le Dr Caradoc-Davies. Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Ces travaux ont été appuyés par l’Australian Research Council Centre of Excellence in Advanced Molecular Imaging (CE140100011) (http://www.imagingcoe.org/). Cette recherche a été entreprise en partie à l’aide de la ligne de faisceau MX2 au synchrotron australien, qui fait partie de l’ANSTO, et a fait usage du détecteur de l’Australian Cancer Research Foundation (ACRF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hen eggwhite lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | Used to grow crystals for testing the injector and the crystals are transferred into silicon grease. https://www.sigmaaldrich.com/ |
| High vacuum silicon grease | Dow Corning | Z273554-1EA | Used for testing of injector. https://www.sigmaaldrich.com/ |
| Injector needle (108 µm ID) | Hamilton | part No: 7803-05 | www.hamiltoncompany.com |
| Glass gas-tight syringes, 100 µl | Hamilton | part no: 7656-01 | Syringes used for sample injection. www.hamiltoncompany.com |
| LCP syringe coupler | Formulatrix | 209526 | Syringe coupler to mix the samples |
| Lipidico injector | La Trobe Univerity/ANSTO | This is a specific piece of equipment that can be accessed through La Trobe University / ANSTO Australian Synchrotron Facility |
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