Summary
هنا نوجز ونوضح بروتوكولا لعزل الخلايا البطانية الجيبية الأولية لكبد الفأر (LSEC). يعتمد البروتوكول على تروية كولاجيناز الكبد ، وتنقية الخلايا غير المتنية عن طريق الطرد المركزي منخفض السرعة ، واختيار الخرزة المغناطيسية CD146. نحن أيضا النمط الظاهري ونوصيف هذه LSECs المعزولة باستخدام قياس التدفق الخلوي والمجهر الإلكتروني الماسح.
Abstract
الخلايا البطانية الجيبية الكبدية (LSECs) هي خلايا بطانية متخصصة تقع في الواجهة بين الدورة الدموية وحمة الكبد. LSECs لها مورفولوجيا متميزة تتميز بوجود fenestrae وغياب الغشاء السفلي. تلعب LSECs أدوارا أساسية في العديد من الاضطرابات المرضية في الكبد ، بما في ذلك خلل التنظيم الأيضي ، والالتهابات ، والتليف ، وتكوين الأوعية الدموية ، والتسرطن. ومع ذلك ، لم يتم نشر سوى القليل حول عزل وتوصيف LSECs. هنا ، يناقش هذا البروتوكول عزل LSEC عن كل من الفئران الصحية وغير الكحولية لمرض الكبد الدهني (NAFLD). يعتمد البروتوكول على تروية الكولاجيناز لكبد الفأر والخرز المغناطيسي والاختيار الإيجابي للخلايا غير المتنية لتنقية LSECs. تميز هذه الدراسة LSECs باستخدام علامات محددة عن طريق قياس التدفق الخلوي وتحدد السمات الظاهرية المميزة عن طريق المسح المجهري الإلكتروني. يمكن استخدام LSECs المعزولة بعد هذا البروتوكول للدراسات الوظيفية ، بما في ذلك اختبارات الالتصاق والنفاذية ، بالإضافة إلى الدراسات النهائية لمسار معين من الاهتمام. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تجميع هذه LSECs أو استخدامها بشكل فردي ، مما يسمح بتوليد بيانات متعددة omics بما في ذلك RNA-seq السائبة أو خلية واحدة ، والبروتينات أو الفوسفو ، وفحص الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه باستخدام التسلسل (ATAC-seq) ، من بين أمور أخرى. سيكون هذا البروتوكول مفيدا للباحثين الذين يدرسون اتصال LSECs مع خلايا الكبد الأخرى في الصحة والمرض ويسمح بفهم متعمق لدور LSECs في الآليات المسببة للأمراض لإصابات الكبد الحادة والمزمنة.
Introduction
تبطن الخلايا البطانية الجيبية الكبدية (LSECs) جدران الجيوب الأنفية الكبدية وهي الخلايا غير المتنية الأكثر وفرة في الكبد1. تتميز LSECs عن الخلايا البطانية الشعرية الأخرى في أماكن أخرى من الجسم بوجود fenestrae وعدم وجود غشاء قبو كلاسيكي أو غشاء 2,3. وبالتالي ، تمتلك LSECs خصائص مظهرية وهيكلية مميزة تعزز نفاذيتها وقدرتها على الخلايا الداخلية للقضاء على مجموعة متنوعة من الجزيئات الكبيرة المتداولة ، بما في ذلك الدهون والبروتينات الدهنية. تلعب LSECs دورا محوريا في التداخل بين الخلايا المتنية وغير المتنية ، مثل الخلايا النجمية والخلايا المناعية. LSECs هي المفتاح في الحفاظ على توازن الكبد عن طريق الحفاظ على الخلايا النجمية وخلايا كوبفر في حالة هادئة4. تقوم LSECs بتعديل تكوين مجموعات الخلايا المناعية الكبدية عن طريق التوسط في الالتصاق والهجرة عبر البطانية لكريات الدم البيضاء المتداولة 5,6. أثناء إصابة الكبد الحادة والمزمنة7 ، بما في ذلك إصابة نقص التروية (IRI) 8 ، والتهاب الكبد الدهني غير الكحولي (NASH)9 ، وسرطان الخلايا الكبدية (HCC) ، تخضع LSECs لتغيرات في النمط الظاهري تعرف باسم الشعيرات الدموية التي تتميز بنزع الشعر وتشكيل الغشاء السفلي10. ترتبط هذه التغيرات المظهرية في LSECs بخلل LSECs واكتساب خصائص prothrombotic و proinflammatory و profibrogenic.
تم تطوير عدة طرق لعزل LSECs من كبد الفأر11. تعتمد بعض التقنيات على فصل الخلايا غير المتنية والخلايا المتنية متبوعة بالطرد المركزي بتدرج الكثافة لتنقية LSECs من الكسور غير المتني. الحد من هذه الطريقة هو وجود البلاعم الملوثة في الخطوات النهائية لعزل LSECs ، والتي يمكن أن تؤثر على نقاء LSECs المعزولة12. يعتمد هذا البروتوكول على تروية الكولاجيناز لكبد الفأر و CD146 + الخرز المغناطيسي الاختيار الإيجابي للخلايا غير المتنية لتنقية LSECs. تظهر LSECs المعزولة باستخدام هذه الطريقة نقاء عاليا ومورفولوجيا محفوظة وقابلية للحياة. هذه LSECs هي الأمثل للدراسات الوظيفية ، بما في ذلك اختبار النفاذية والالتصاق ، وكذلك الدراسات النهائية للمسارات ذات الاهتمام. علاوة على ذلك ، مع الاهتمام المتزايد بتوليد مجموعات البيانات الضخمة في كل من الأبحاث السريرية وعلوم الاكتشاف ، يمكن تجميع أو استخدام هذه LSECs عالية الجودة المعزولة من كل من الكبد الدهني الصحي والمريضة مع التهاب الكبد الدهني غير الكحولي (NASH) أو غيرها من الحالات بشكل فردي ، مما يسمح بتوليد بيانات متعددة الأوميكس والمقارنة بين الصحة والمرض13,14 . بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام LSECs المعزولة لتطوير نماذج ثنائية الأبعاد وكذلك ثلاثية الأبعاد في المختبر مثل المواد العضوية لفك شفرة مسار الإشارات المنشط في LSECs واتصالها بين الخلايا مع خلايا الكبد الأخرى تحت محفزات ضارة مختلفة واستجابة لمختلف التدخلات العلاجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء البروتوكولات الحيوانية على النحو المعتمد من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) في Mayo Clinic. تم شراء الفئران الذكور C57BL / 6J البالغة من العمر ثمانية أسابيع من مختبر جاكسون. تم وضع الفئران في منشأة دورة الضوء والظلام التي يتم التحكم في درجة حرارتها في الساعة 12:12 مع حرية الوصول إلى النظام الغذائي.
1. إعداد طبق أو طبق ثقافة مغلف بالكولاجين
- لصنع 50 مل من 0.02 مول / لتر من حمض الخليك ، أضف 0.6 مل من حمض الخليك الجليدي إلى 49.4 مل من H2O.
- اصنع 50 ميكروغرام / مل كولاجين من النوع الأول في 0.02 مول / لتر من حمض الخليك. يعتمد التخفيف على تركيز الكثير.
- قم بتغطية أطباق الثقافة 10 سم مع 3 مل من محلول الكولاجين. احتضان في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 1 ساعة.
ملاحظة: عند استخدام طبق أو طبق مختلف للاستزراع ، يجب تعديل حجم محلول الطلاء بناء على مساحة الاستزراع ، وعادة ما يستخدم 6-10 ميكروغرام / سم2. - إزالة السوائل الزائدة من السطح المطلي، وغسل مع المالحة العازلة بالفوسفات (PBS) 3 مرات. اترك الأطباق لتجف في الهواء.
- إذا لم يكن محلول الكولاجين معقما ، فقم بتعقيم الأطباق المغلفة بالكولاجين عن طريق التعرض للأشعة فوق البنفسجية (UV) لمدة 10 دقائق في غطاء زراعة الأنسجة المعقم.
2. إعداد المعدات
- قم بإعداد جهاز إعادة التدوير المسخن والرطب كما هو موضح في الشكل 1B.
- شطف نظام التروية باستخدام 10٪ من المبيض لمدة 5 دقائق تليها المياه المعقمة لمدة 10 دقائق أخرى.
- صفي سائل الشطف قدر الإمكان قبل استخدام محلول الكولاجيناز.
- غرس محلول الكولاجيناز من خلال نظام التروية (كما هو موضح في الشكل 1B) لتسخينه عند 37 درجة مئوية. اضبط معدل المضخة على السرعة 1 كما هو موضح في قرص التحكم في السرعة (يساوي 40 ملليلتر/دقيقة).
- حافظ على هذه السرعة كما هي طوال الإجراء بأكمله. أعد استخدام محلول الكولاجيناز الذي يعمل في دائرة مغلقة خلال يوم عزل LSEC.
ملاحظة: يتم تثبيت سرعة المضخة عند 1 لتجنب الضغط الميكانيكي الذي يمكن أن يزعج الحالة البيولوجية LSECs.
3. الإجراء الجراحي
- وزن الماوس.
- حقن 90 مغ/كغ من وزن الجسم من الكيتامين و 10 مغ/كغ من وزن الجسم من الزيلازين داخل الصفاق (IP).
- بمجرد أن يكون الماوس غير متفاعل مع المحفزات المؤلمة ، قم بتأمين الماوس على السطح الجراحي ، كما هو موضح في الشكل 1B.
- رش بطن الفأر بنسبة 70٪ من الإيثانول. باستخدام مقص جراحي ، قم بعمل شق بطول ~ 5 سم بدءا من الجزء السفلي من البطن حتى عملية الخنازير.
- بعد ذلك ، قم بإجراء قطعتين جانبيتين باستخدام مقص قزحية صغير على كل جانب من البطن لفضح أعضاء البطن بالكامل.
- ضع غمد القسطرة الوريدية (IV) تحت ظهر الحيوان لرفع البطن وتسويته.
- باستخدام ملقط ضمادة منحني منتظم ، اسحب الأمعاء والمعدة بلطف إلى يسار الحيوان.
- ضع خياطة جراحية 5-0 تحت الوريد الأجوف السفلي (IVC) أسفل الكلى اليسرى المكشوفة مباشرة. اربط وصلة فضفاضة في الخياطة.
- ضع خياطة جراحية أخرى 5-0 حول الوريد البابي الكبدي (PV) فوق نقطة تفرع الوريد الطحالي مباشرة قبالة الكهروضوئية الكبدية. اربط وصلة فضفاضة في الخياطة.
- باستخدام الخيط الكهروضوئي كشد ، أدخل قسطرة 20 G IV في الكهروضوئية الكبدية 1 سم أدناه حيث تتفرع إلى اليمين واليسار الكهروضوئية الكبدية.
- حرك القسطرة لأعلى الوريد ولكن احتفظ بها أسفل منطقة التفرع. اسمح للدم بالانتقال إلى أسفل القسطرة حتى يبدأ في التنقيط.
- مع وضع بعض المخزن المؤقت A (الجدول 1) في زجاجة وريدية (IV) فوق المنطقة الجراحية، استخدم خطا وريديا، وقم بإرفاقه بالقسطرة. اغسل الكبد بهذا المحلول مع تجنب دخول الهواء إلى النظام.
- اربط الخيط حول الوريد الأجوف السفلي أسفل الكلى. هذا سيسمح للكبد بأداء الرجعية.
- قطع IVC تحت خياطة للسماح للحيوان أن ينزف.
ملاحظة: يجب تنفيذ هذه الخطوة بسرعة لتجنب احتقان الكبد. - قم بتأمين القسطرة الوريدية باستخدام الخياطة الكهروضوئية.
- بمجرد التعطير ، قم بقطع المعدة والأمعاء والطحال والأحشاء الأخرى المرتبطة بالكبد.
- قطع الحجاب الحاجز والأوعية الرئيسية من التجويف الصدري. إزالة الكبد من الحيوان ووضعه على صينية التروية.
- قم بإزالة الخط الوريدي بعناية وقم بتوصيل محلول الكولاجيناز في غرفة إعادة التدوير.
ملاحظة: يجب القيام بالخطوات 3.16-3.18 في غضون 5 دقائق ، لذلك لن يتم اختراق الكبد لفترة طويلة جدا باستخدام Buffer A. كن حريصا جدا على عدم السماح لأي فقاعات هواء بالدخول إلى الكبد. - اسمح للكبد بالانتفاخ حتى تصبح الكبسولة مرقشة وتبدو طرية (10-15 دقيقة أو أكثر ، تختلف الفترة اعتمادا على الكميات المختلفة من الكولاجيناز).
- أثناء وجود الكبد في التروية ، تأكد من وفاة الحيوان قبل التخلص منه في كيس نخر.
- بمجرد هضمه ، قم بإزالة الكبد من الغرفة وضعه في طبق بتري 10 سم مع حوالي 20 مل من Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) الخالي من المصل.
- اختر الكبد بلطف مع اثنين من نصائح الماصة وتخلص من الشجرة الصفراوية.
- قم بتصفية تعليق الكبد من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر إلى أنبوب مخروطي 50 مل.
- جهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 50 × g لمدة 2 دقيقة في RT. جمع supernatant الذي يحتوي على خلايا كبدية غير متني.
ملاحظة: يتم ترسيب خلايا الكبد في الكريات ، والتي يمكن تنقيتها بشكل أكبر باستخدام الطرد المركزي المتدرج كما هو موضح سابقا15.
4. فصل الخلايا الكبدية غير المتنية وتنقية LSECs
ملاحظة: قم بتنقية أقراص CD146+ LSECs باستخدام الخرز المناعي المغناطيسي، باتباع تعليمات المصنع.
- جهاز الطرد المركزي الفائق عند 300 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- اجمع حبيبة الخلية وأعد تعليقها في 1 مل من المخزن المؤقت للعزل (الجدول 1)، وحدد رقم الخلية باستخدام عداد خلية تلقائي باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
- جهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 300 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وشفط supernatant تماما.
- أعد تعليق الكريات مع 90 ميكرولتر من العازلة العازلة لكل 107 خلايا إجمالية.
- أضف 10 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي CD146 لكل 107 خلايا إجمالية. تخلط جيدا وتحضن لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
- لغسل الخلايا ، أضف 1-2 مل من العازلة لكل 107 خلايا ، وأجهزة طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق ، ثم استنشق السوبرنات تماما.
- أعد تعليق ما يصل إلى 109 خلايا في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعزل (الجدول 1).
ملاحظة: بالنسبة لأرقام الخلايا الأعلى، قم بزيادة حجم المخزن المؤقت وفقا لذلك. - قم بإعداد عمود الفصل ، وشطفه ب 3 مل من المخزن المؤقت للعزل.
- ضع تعليق الخلية على العمود المكدس بمرشحات ما قبل الفصل بمقدار 70 ميكرومتر.
- اغسل العمود باستخدام 3 مل من العزل المؤقت 3 مرات.
ملاحظة: عند غسل العمود، يجب إضافة المخزن المؤقت للعزل بمجرد إفراغ خزان العمود. - قم بإزالة العمود من الفاصل وضعه على أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. ماصة 5 مل من العزل العازل على العمود.
- لاستعادة الخرز المغناطيسي المسمى الخلايا ، ادفع المكبس بقوة إلى العمود لطرد الخلايا.
- جهاز طرد مركزي عند 300 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
5. LSECs التنميط المناعي وتقييم النقاء عن طريق قياس التدفق الخلوي
- حدد أرقام خلايا LSECs المعزولة باستخدام عداد خلايا تلقائي باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
- الطرد المركزي للخلايا في 300 × غرام لمدة 5 دقائق، وشفط supernatant تماما.
- خذ 1 × 106 خلايا / أنبوب وأعد تعليقه باستخدام 90 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ (الجدول 1).
- أضف 10 ميكرولتر / أنبوب من كتلة FcR للماوس و 1 ميكرولتر من صبغة الجدوى ، واحتضان عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
- قم بتلطيخ الخلايا بمزيج من الأجسام المضادة CD45 و CD146 و stabilin-2 المخففة في الساعة 1:50 مع مخزن مؤقت للتلطيخ. تحضن في 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.
- اغسل الخلايا ب 5 مل من المخزن المؤقت للتلطيخ وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × g لمدة 10 دقائق ، ثم قم بشفط supernatant تماما.
- أعد تعليق الخلايا باستخدام 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ وقم بتشغيله عبر مقياس التدفق الخلوي.
6. ثقافة LSECs وفحصها
- البذور 1 × 10 6 خلايا / بئر في لوحة من6 آبار وزراعتها مع وسط نمو الخلايا البطانية التي تتكون من 5 ٪ مصل البقر الجنين (FBS) ، 1 ٪ ملحق نمو الخلايا البطانية ، و 1 ٪ محلول البريموسين.
- فحص LSECs المعزولة عن طريق المجهر الضوئي. احصل على صور ذات مجال ساطع باستخدام تكبير 10x.
7. مورفولوجيا LSECs وفحص fenestrae عن طريق المجهر الإلكتروني الماسح
- قبل طلاء إدراج مزرعة الخلايا (حجم المسام 3 ميكرومتر) بمحلول الكولاجين.
- استزراع LSECs المعزولة (120000 خلية) على الإدراج مع وسط نمو الخلايا البطانية في صفيحة من 24 بئرا عند 37 درجة مئوية من الجو الدافئ والرطب. اسمح للخلايا بالاستقرار والالتصاق لمدة 2 ساعة.
- لتثبيت الخلايا، أضف حجما مكافئا من الاحترار المسبق عند 37 درجة مئوية مثبت ترامب على وسائط زراعة الخلايا.
- بعد الحضانة لمدة 10 دقائق ، استبدل 50٪ من مثبت ترامب المخفف بمثبت ترامب غير المخفف.
- إصلاح الخلايا في ترامب المثبت لمدة 2 ساعة ، ثم احتضان لمدة 1 ساعة في 1 ٪ من رابع أكسيد الأوزميوم.
- تابع أخذ عينات الجفاف، والتجفيف في جهاز تجفيف النقاط الحرجة، والتركيب، وطلاء النتوءات، والفحص باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
المخططات التجريبية والمعدات التي تم إعدادها:
في هذا البروتوكول ، تم هضم كبد الفأر باستخدام دائرة تروية مغلقة ، ثم تم فصل الخلايا غير المتنية وخلايا الكبد عن طريق الطرد المركزي منخفض السرعة عند 50 × g لمدة 2 دقيقة. تم عزل LSECs الأولية باستخدام اختيار الخرز المغناطيسي CD146 من الكسر غير المتني. وترد المخططات التجريبية في الشكل 1 ألف. تم وضع القنية من خلال PV بينما تم ربط الوريد الأجوف السفلي لضمان تروية أحادية الاتجاه للكولاجيناز عبر الكبد (الشكل 1B). تم تجهيز غرفة التروية الداخلية بنظام تدفئة وترطيب لضمان هواء جهاز دافئ ورطب 37-40 درجة مئوية. يدور الكولاجيناز المنصهر من خلال نظام مغلق ويمكن إعادة استخدامه لاثنين أو ثلاثة من الفئران خلال يوم العزل لجعل العزل أكثر فعالية من حيث التكلفة.
تقييم نقاء LSECs المعزولة وعلامات السطح بواسطة قياس التدفق الخلوي:
تم تقييم نقاء LSECs المعزولة من خلال استخدام علامات سطح LSEC محددة مميزة جيدا CD146 و stabilin-216,17,18. تم تحليل الخلايا الملطخة على مقياس التدفق الخلوي. تم تحليل البيانات باستخدام برنامج FlowJo.
تم وضع بوابات لسكان LSEC (الشكل 2 A) وتحليل المفردات لاستراتيجية البوابات التالية ؛ تم تعريف الخلايا القابلة للحياة باستخدام صبغة قابلة للحياة قبل وضع علامات على الخلايا بعلامات محددة (الشكل 2B). ثم تم إغلاق CD45- السكان لاستبعاد أي تلوث للخلايا المناعية. وبلغت نسبة بقاء ال LSECs المعزولة 94.8 في المائة (الشكل 2C). كانت النسبة المئوية لخلايا CD45 89.7٪ (الشكل 2D) ، وكانت 92.3٪ من الخلايا CD146 و stabilin-2 مزدوجة الإيجابية (CD45-CD146 + stabilin-2 +) LSECs (الشكل 2E).
مورفولوجيا LSECs المعزولة:
تم زرع LSECs المعزولة في صفيحة من 6 آبار في 1 × 10 6 خلايا / بئر ، وزرعت في وسط نمو كامل ، وفحصها بواسطة المجهر الضوئي بعد6 ساعات من الثقافة (الشكل 3A)". تم طلاء LSECs على إدراج مزرعة بحجم 3 ميكرومتر بحجم المسام لتصور LSECs fenestrae بواسطة المجهر الإلكتروني الماسح (SEM). بعد التثبيت والمعالجة ، تم تحديد fenestrae ، كما هو موضح في الشكل 3B. كما ذكر سابقا ، تفقد LSECs fenestrae في الثقافة بين عشية وضحاها19 ؛ وبالتالي ، يوصى بمعالجة الخلايا في أقرب وقت ممكن بعد العزل للدراسات النهائية لتجنب إزالة التمييز في المختبر.
الشكل 1: إعداد المخططات التجريبية والمعدات. (أ) تم تصميم المخططات التجريبية باستخدام العرض الحيوي. (ب) إعداد المعدات ومعالجتها. تم حصاد الكبد ودمجه في جهاز تروية كولاجيناز مغلق. ثم تم نقل الكبد إلى طبق وفصله. تم جمع تعليق الكبد. تم فصل جزء الخلية غير المتنية عن طريق الطرد المركزي عند 50 × g لمدة 2 دقيقة ، وتم تنقية LSECs باستخدام الخرز المغناطيسي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تقييم نقاء LSECs المعزولة وعلامات السطح بواسطة قياس التدفق الخلوي. تحليل البيانات واستراتيجية البوابات كما هو موضح ، (أ) LSECs المسورة و (ب) المفردات القائمة على التشتت الأمامي (FSC) / التشتت الجانبي (SSC). تم تلطيخ LSECs المعزولة بصبغة قابلة للحياة ومزيج من الأجسام المضادة CD45 و CD146 و stabilin-2. تم وضع بوابات وتحليل مفردات ، (C) تم إغلاق LSECs القابلة للحياة على (D) CD45 السكان وتحليلها ل (E) CD146 وتعبير stabilin-2. تم تحديد جميع البوابات بواسطة التألق ناقص واحد (FMO). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مورفولوجيا LSECs المعزولة. (أ) صورة حقل ساطع ل LSECs المستزرعة. تم استزراع LSECs المعزولة في وسط النمو الكامل لمدة 6 ساعات وفحصها بواسطة المجهر الضوئي (شريط المقياس 100 ميكرومتر). (ب) تم فحص LSEC بواسطة المجهر الإلكتروني الماسح (SEM). تشير الأسهم البيضاء إلى LSEC fenestrae (شريط المقياس ، اللوحة اليسرى 5 ميكرومتر ، اللوحة اليمنى 1 ميكرومتر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| KRH حل الأسهم (10x) | |
| الكواشف | تركيز |
| كلوريد الصوديوم | 1.15 م |
| هيبس (حمض حر) | 0.2 م |
| كيه سي ال | 0.05 م |
| KH2PO4 | 0.01 م |
| المخزن المؤقت A | |
| الكواشف | تركيز |
| محلول KRH ، PH = 7.4 | 1x |
| EGTA | 0.5 مللي متر |
| اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 ، وقم بالتصفية من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر قبل الاستخدام. | |
| تخزينها في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 6 أشهر. | |
| المخزن المؤقت B | |
| محلول KRH ، PH = 7.4 | 1x |
| كاكل2 | 1 مللي متر |
| اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 ، وقم بالتصفية من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر قبل الاستخدام. | |
| تخزينها في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 6 أشهر. | |
| محلول الكولاجيناز | |
| الكواشف | تركيز |
| المخزن المؤقت B، PH = 7.4 | 125 مل |
| كولاجيناز | 35-40 ملغ ، إضافة BSA تصل إلى 100 ملغ |
| حل بيركول | |
| الكواشف | تركيز |
| بيركول | 22.5 مل |
| PBS (10x) ، درجة الحموضة = 7.4 | 2.5 مل |
| عازل / تلطيخ | |
| الكواشف | تركيز |
| مخزن مؤقت لشطف MACS | 1250 مل |
| أسهم BSA | 125 مل |
الجدول 1: وصفة المخازن المؤقتة. يتضمن الجدول تكوين المخازن المؤقتة والحلول المستخدمة في هذه الدراسة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في المخطوطة الحالية ، نصف بروتوكولا لعزل LSEC عن كبد الفأر يتكون من تروية الكولاجيناز المكونة من خطوتين وفرز الخلايا المنشط مغناطيسيا اللاحق (MACS). يتكون هذا البروتوكول من الخطوات الثلاث التالية: (1) التروية من خلال الكهروضوئية مع مخزن مؤقت خال من الكالسيوم يليه مخزن مؤقت يحتوي على الكولاجيناز لتحقيق تشتت خلايا الكبد. (2) استبعاد خلايا الكبد ذات الطرد المركزي المنخفض السرعة؛ و (3) الاختيار الإيجابي القائم على MACSs من LSECs من الخلايا غير المتنية (NPCs) باستخدام الخرز المغناطيسي المضاد ل CD146. يمكن إكمال الإجراء بأكمله في غضون 3 ساعات. علاوة على ذلك ، تبلغ تكلفة هذا الإجراء ، بما في ذلك جميع اللوازم الاستهلاكية ، حوالي 150 دولارا أمريكيا لكل ماوس ، مما يشير إلى أن طريقة عزل LSEC هذه فعالة وفعالة من حيث التكلفة بشكل عام. نحن نستخدم الخطوتين (1) و (2) لعزل خلايا الكبد الأولية للفئران أيضا، وهو ما يتجاوز نطاق المخطوطة الحالية.
هناك بعض الخطوات الحاسمة في تعليب البوابة وتروية الكبد: (i) تحديد موضع القسطرة: يجب وضع طرف القسطرة على مسافة لا تقل عن 3 مم بعيدا عن التشعب الكهروضوئي للفأر البالغ ، والذي يتم تحديده عادة في هيلوم الكبد. إن الوضع العميق لطرف القسطرة في الكهروضوئية سيضر بتروية بعض فصوص الكبد. يظهر ضعف تروية الفص على أنه عدم وجود تغيير في لون الفص ويمكن تصحيحه إذا لوحظ على الفور عن طريق إعادة وضع طفيفة للقسطرة في الكهروضوئية البعيدة. هذه المناورة يمكن أن تحسن تروية الفص. (ii) فقاعات الهواء: يجب أن يبقى طريق التسريب بين المضخة والكهروضوئية خاليا تماما من فقاعات الهواء. يمكن أن يسبب دخول الهواء الدقيق إلى الكهروضوئية انسدادا هوائيا ، مما يؤدي إلى تروية الكبد غير المكتملة. للقضاء على الهواء في القسطرة بعد إزالة الإبرة الداخلية ، يتم حقن Buffer A بحقنة قريبة من الفقاعة لطرد أي هواء قبل توصيل خط التسريب بالقسطرة. (iii) قوة الكولاجيناز: للحفاظ على نشاط الكولاجيناز أثناء التروية ، من الضروري التأكد من أن المخزن المؤقت B المحمل في الكهروضوئية يحتوي على التركيز الدقيق للكولاجيناز والرقم الهيدروجيني ويتم الاحتفاظ به عند حوالي 37 درجة مئوية. وكما هو مبين في الشكل 1، تستخدم حجرة مخصصة للحفاظ على نظام التروية بأكمله في جو دافئ ورطب تبلغ درجة حرارته 37 درجة مئوية؛ بالإضافة إلى ذلك ، يتم الحفاظ على إمدادات الأكسجين أثناء تروية الكولاجيناز لتحقيق الهضم الكامل. يتضمن الخيار البديل حماما مائيا لتسخين محلول الكولاجيناز20 مسبقا ، ونظام تروية الكولاجيناز المفتوح في الموقع حيث يستنزف محلول الكولاجيناز من الكبد من خلال IVC21 المقطوع.
على الرغم من أن البروتوكول يستخدم قسطرة جريئة نسبيا (20 جم) لتأمين تدفق تروية كاف ، إلا أن القسطرة الأرق ستعمل أيضا بشكل جيد بناء على التقارير السابقة22،23،24. ومع ذلك ، من الصعب في بعض الأحيان تقليب الكهروضوئية بنجاح خاصة عندما يتم استخدام الفئران لنماذج أمراض محددة أو إذا كان لديهم شذوذ كهروضوئي. إذا فشلت القنية الكهروضوئية ، فإن هضم الكبد الميكانيكي والإنزيمي باستخدام مجموعة إنزيم ومفكك لطيف للأنسجة هو طريقة بديلة للخطوتين (1) و (2) للحصول على تعليق الخلايا غير المتنية (NPC). لقد أكدنا أن إنتاجية الخلايا وقابليتها للحياة في هذه الطريقة البديلة للتفكك دون تروية الكبد كانت قابلة للمقارنة مع الطريقة الأصلية (البيانات غير معروضة). تم استخدام تروية الوريد البابي لهضم الكبد من قبل الآخرين ولنا13،16،20. علاوة على ذلك ، تتجنب هذه الطريقة المخاطر النظرية للتغيرات الظاهرية أو الوظيفية LSECs الناجمة عن القوة الميكانيكية أثناء هضم الكبد. لذلك ، يوصى بشدة باستخدام الطريقة القائمة على التروية الكهروضوئية الموضحة في هذا البروتوكول حتى الآن.
هنا ، يتم عرض عائد LSEC الأمثل والنقاء عند استخدام البروتوكول الحالي. حصلنا على ما يقرب من 2-5 × 106 خلايا لكل فأر من كل من الفئران السليمة والفئران مع NASH الناجم عن النظام الغذائي باستخدام البروتوكول الحالي. أما بالنسبة للنقاء ، فإن إيجابية نفس علامة السطح المستخدمة للفصل المناعي المغناطيسي (CD146) تدعم دقة تقنية العزل لدينا. بالإضافة إلى ذلك ، هناك العديد من علامات سطح LSEC المعترف بها جيدا ، مثل مستقبلات حمض الهيالورونيك البطانية للأوعية اللمفاوية 1 (LYVE-1) و CD32b و stabilin-2. لا تزال الخلافات قائمة حول هذه العلامات. على سبيل المثال ، i) LYVE-1 موجود أيضا في الخلايا البطانية اللمفاوية ، و ii) LSECs في منطقة حول البوابة تفتقر إلى تعبير CD32b18. وبالتالي ، لفحص نقاء هذه LSECs المعزولة مع قياس التدفق الخلوي ، تم استخدام stabilin-2 كعلامة LSEC محددة ثابتة بالإضافة إلى CD146. باستخدام هذه المنهجية ، أكدنا أن LSECs المعزولة لديها قابلية >94٪ ونقاء >90٪ (الشكل 2). تم تأكيد النمط الظاهري الخاص ب LSEC للخلايا المعزولة باستخدام SEM ، حيث تحتوي معظم الخلايا على fenestrae (الشكل 3B) ، وهي السمة المورفولوجية المميزة ل LSECs.
من بين منهجيات عزل LSECs ، يعد اختيار الخرز المغناطيسي المناعي هو التقنية الأكثر استخداما لعزل LSECs عن جزء NPC 24،25،26،27. في المقابل ، تشمل الطرق الأخرى الطرد المركزي والفصل الانتقائي القائم على الالتصاق 22،28،29. وقد ثبت أن الطرق غير المناعية المغناطيسية توفر غلة عالية من LSECs (حوالي 9 × 106 خلايا لكل ماوس)11. وبالتالي ، فإن العائد المنخفض نسبيا من LSECs المعزولة يمكن أن يكون قيدا على البروتوكول الحالي. من ناحية أخرى ، تتطلب الطرق القائمة على الانتقاء غير المناعي المغناطيسي خبرة تقنية عالية وتظهر أحيانا نتائج غير متسقة على غلة الخلايا ونقاءها11 ، في حين أن الطريقة القائمة على الانتقاء المناعي المغناطيسي تتمتع بميزة العائد والنقاء الثابتين على الطرق الأخرى الحالية. علاوة على ذلك ، بالنسبة لعزل الخلايا القائم على اختيار الخرز المناعي ، فإن خصوصية علامات سطح الخلية المستخدمة هي دائما مسألة مثيرة للقلق. على سبيل المثال ، يتم التعبير عن CD31 ، الذي تم استخدامه سابقا كعلامة لفصل LSEC المناعي المغناطيسي ، بشكل مهيمن على البطانة الكهروضوئية و LSECs3 الشعرية. على الرغم من أنه تم الإبلاغ عن CD146 أيضا على الخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا النجمية الكبدية 30,31 ، إلا أن النقاء العالي ل LSECs المعزولة باستخدام هذا البروتوكول يخفف من المخاوف المتعلقة بخصوصية العلامة البطانية CD146. تتم مناقشة مقارنة إيجابيات وسلبيات المنهجيات المختلفة لعزل LSEC في مكان آخر11،18،32. إن مقارنة غلة الخلايا ونقائها بين الطرق الأخرى وهذه الطريقة خارج نطاق المخطوطة الحالية وتستدعي إجراء تحقيقات مستقبلية.
في الختام ، نقدم بروتوكول عزل LSEC الأساسي للماوس استنادا إلى أحد أكثر الأساليب استخداما وقبولا. تعرض LSECs المعزولة نقاء عاليا ووظيفة محفوظة. علاوة على ذلك ، فإن هذا البروتوكول فعال وقابل للتطبيق على كبد الفأر السليم وكذلك الكبد من نماذج الفئران المختلفة للأمراض. يمكن استخدام LSECs عالية الجودة من هذه الفئران لتوليد مجموعة بيانات multiomics13,14. وبالتالي ، يسهل هذا النهج تحديد الآليات الجزيئية التي تنظم وظيفة LSEC ويحسن فهمنا لأدوارها في التواصل بين الخلايا في الكبد في الصحة والمرض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
جميع المؤلفين ليس لديهم أي تضارب للكشف عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى التابع للمعاهد الوطنية للصحة (1RO1DK122948 إلى SHI) وآلية منح NIH Silvio O. Conte Digestive Diseases Research Core Centers P30 (DK084567). كما تم تقديم الدعم إلى KF من قبل زمالات البحوث الخارجية للجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JSPS). نود أيضا أن نشيد بالدكتور غريغوري ج. غوريس وستيفن برونك على تصميمهما الأصلي وتحسينهما لجهاز تروية الكولاجيناز.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.0-inch 20 G Intra Venous (IV) catheter | Terumo, SOmerset, NJ, USA | SR-OX2051CA | |
| 2–3-inch perfuion tray with a hole in the center | customized; made in house | ||
| 405/520 viability dye | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-205 | |
| 4-inch regular curved dressing forceps | Fisher Brand | FS16-100-110 | |
| 5-0 Perma-Hand silk suture | Ethicon, Raritan, NJ, USA | A182H | |
| Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluorà 488 | MBL International, Woburn, MA, USA | D317-A48 | |
| BSA stock | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
| Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-118-407 | |
| CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-007 | |
| Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-803 | |
| Collagen type I | Corning, Corning, NY, USA | 354236 | |
| Collagenase II | Gibco, Waltham, MA, USA | 17101-015 | |
| Endothelial cells growth medium | ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA | 211-500 | |
| FcR blocking reagent, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-575 | |
| FlowJo software, version 10.6 | Becton, Dickinson and Company | ||
| Hardened Fine scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14091-11 | |
| Heated (37 °C) and humidified recirculating perfusion apparatus equipped with Oxygen injection at a rate of 10psi. | customized; made in house | ||
| Hitachi S 4700 scanning electron microscope | Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA | SEM096 | |
| LS columns | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-401 | |
| MACS pre-separation filters (70 μm) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-095-823 | |
| MACS rinsing buffer | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
| MACS Smart Strainer (70 μm) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-098-462 | |
| MACSQunt flow cytometer | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | ||
| Millicell Cell Culture Insert | Millipore Sigma, Burlington, MA, USA | PITP01250 | |
| Nexcelom cell counter | Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, USA | Cellometer Auto T4 Plus | |
| Percoll | GE Healthcare, Chicago, IL, USA | 17-0891-01 | |
| Surgical scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14001-12 | |
| Very small curved dressing forceps | F.S.T, Foster city, CA, USA | 11063-07 |
References
- Morin, O., Goulet, F., Normand, C. Liver sinusoidal endothelial cells: isolation, purification, characterization and interaction with hepatocytes. Revisiones Sobre Biologia Celular: RBC. 15, 1-85 (1988).
- Ibrahim, S. H. Sinusoidal endotheliopathy in nonalcoholic steatohepatitis: therapeutic implications. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 321 (1), 67-74 (2021).
- Poisson, J., et al. Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases. Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).
- Marrone, G., Shah, V. H., Gracia-Sancho, J. Sinusoidal communication in liver fibrosis and regeneration. Journal of Hepatology. 65 (3), 608-617 (2016).
- Shetty, S., Lalor, P. F., Adams, D. H. Liver sinusoidal endothelial cells - gatekeepers of hepatic immunity. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 15 (9), 555-567 (2018).
- Smedsrød, B., Pertoft, H., Gustafson, S., Laurent, T. C. Scavenger functions of the liver endothelial cell. Biochemical Journal. 266 (2), 313-327 (1990).
- DeLeve, L. D. Liver sinusoidal endothelial cells in hepatic fibrosis. Hepatology. 61 (5), 1740-1746 (2015).
- Dar, W. A., Sullivan, E., Bynon, J. S., Eltzschig, H., Ju, C. Ischaemia reperfusion injury in liver transplantation: Cellular and molecular mechanisms. Liver International. 39 (5), 788-801 (2019).
- Furuta, K., Guo, Q., Hirsova, P., Ibrahim, S. H. Emerging Roles of Liver Sinusoidal Endothelial Cells in Nonalcoholic Steatohepatitis. Biology. 9 (11), Basel. 395 (2020).
- Wu, L. Q., et al. Phenotypic and functional differences between human liver cancer endothelial cells and liver sinusoidal endothelial cells. Journal of Vascular Research. 45 (1), 78-86 (2008).
- Meyer, J., Gonelle-Gispert, C., Morel, P., Bühler, L. Methods for isolation and purification of murine liver sinusoidal endothelial cells: A systematic review. PLoS One. 11 (3), 0151945 (2016).
- Meyer, J., Lacotte, S., Morel, P., Gonelle-Gispert, C., Buhler, L. An optimized method for mouse liver sinusoidal endothelial cell isolation. Experimental Cell Research. 349 (2), 291-301 (2016).
- Furuta, K., et al. Lipid-induced endothelial vascular cell adhesion molecule 1 promotes nonalcoholic steatohepatitis pathogenesis. Journal of Clinical Investigation. 131 (6), (2021).
- Guo, Q., et al. Integrin β(1)-enriched extracellular vesicles mediate monocyte adhesion and promote liver inflammation in murine NASH. Journal of Hepatology. 71 (1), 1193-1205 (2019).
- Hirsova, P., Ibrahim, S. H., Bronk, S. F., Yagita, H., Gores, G. J. Vismodegib suppresses TRAIL-mediated liver injury in a mouse model of nonalcoholic steatohepatitis. PLoS One. 8 (7), 70599 (2013).
- Schrage, A., et al. Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1. Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).
- Olsavszky, V., et al. Exploring the transcriptomic network of multi-ligand scavenger receptor Stabilin-1- and Stabilin-2-deficient liver sinusoidal endothelial cells. Gene. 768, 145284 (2021).
- DeLeve, L. D., Maretti-Mira, A. C. Liver sinusoidal endothelial cell: An update. Seminars in Liver Disease. 37 (4), 377-387 (2017).
- DeLeve, L. D., Wang, X., Hu, L., McCuskey, M. K., McCuskey, R. S. Rat liver sinusoidal endothelial cell phenotype is maintained by paracrine and autocrine regulation. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 287 (4), 757-763 (2004).
- Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
- Ishiguro, K., Yan, I. K., Patel, T. Isolation of tissue extracellular vesicles from the liver. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e58649 (2019).
- Topp, S. A., Upadhya, G. A., Strasberg, S. M. Cold preservation of isolated sinusoidal endothelial cells in MMP 9 knockout mice: effect on morphology and platelet adhesion. Liver Transplantation. 10 (8), 1041-1048 (2004).
- Katz, S. C., Pillarisetty, V. G., Bleier, J. I., Shah, A. B., DeMatteo, R. P. Liver sinusoidal endothelial cells are insufficient to activate T cells. Journal of Immunology. 173 (1), 230-235 (2004).
- Liu, W., et al. Sample preparation method for isolation of single-cell types from mouse liver for proteomic studies. Proteomics. 11 (17), 3556-3564 (2011).
- Do, H., Healey, J. F., Waller, E. K., Lollar, P. Expression of factor VIII by murine liver sinusoidal endothelial cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (28), 19587-19592 (1999).
- Schrage, A., et al. Enhanced T cell transmigration across the murine liver sinusoidal endothelium is mediated by transcytosis and surface presentation of chemokines. Hepatology. 48 (4), 1262-1272 (2008).
- Chou, C. H., et al. Lysophosphatidic acid alters the expression profiles of angiogenic factors, cytokines, and chemokines in mouse liver sinusoidal endothelial cells. PLoS One. 10 (3), 0122060 (2015).
- Deleve, L. D. Dacarbazine toxicity in murine liver cells: a model of hepatic endothelial injury and glutathione defense. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 268 (3), 1261-1270 (1994).
- Smedsrød, B., Pertoft, H., Eggertsen, G., Sundström, C. Functional and morphological characterization of cultures of Kupffer cells and liver endothelial cells prepared by means of density separation in Percoll, and selective substrate adherence. Cell and Tissue Research. 241 (3), 639-649 (1985).
- Despoix, N., et al. Mouse CD146/MCAM is a marker of natural killer cell maturation. European Journal of Immunology. 38 (10), 2855-2864 (2008).
- Strauss, O., Phillips, A., Ruggiero, K., Bartlett, A., Dunbar, P. R. Immunofluorescence identifies distinct subsets of endothelial cells in the human liver. Scientific Reports. 7, 44356 (2017).
- Halpern, K. B., et al. Paired-cell sequencing enables spatial gene expression mapping of liver endothelial cells. Nature Biotechnology. 36 (10), 962-970 (2018).
