Summary
Aqui descrevemos e demonstramos um protocolo para o isolamento da célula endotelial do fígado do camundongo primário (LSEC). O protocolo é baseado na perfusão da colagem hepática, purificação celular não parenquimal por centrifugação de baixa velocidade e seleção de contas magnéticas CD146. Também fenótipo e caracterizamos esses LSECs isolados usando citometria de fluxo e microscopia eletrônica de varredura.
Abstract
As células endoteliais sinusoidais hepáticas (LSECs) são células endoteliais especializadas localizadas na interface entre a circulação e o parênquim hepático. Os LSECs têm uma morfologia distinta caracterizada pela presença de fenestrae e pela ausência de membrana do porão. Os LSECs desempenham papéis essenciais em muitas doenças patológicas no fígado, incluindo desregulação metabólica, inflamação, fibrose, angiogênese e carcinogênese. No entanto, pouco foi publicado sobre o isolamento e caracterização dos LSECs. Aqui, este protocolo discute o isolamento do LSEC de camundongos saudáveis e não alcoólicos da doença hepática gordurosa (NAFLD). O protocolo é baseado na perfusão de colagenase do fígado do rato e contas magnéticas seleção positiva de células nãoparambiais para purificar LSECs. Este estudo caracteriza os LSECs usando marcadores específicos por citometria de fluxo e identifica as características fenotípicas características através da microscopia eletrônica de varredura. Os LSECs isolados seguindo este protocolo podem ser usados para estudos funcionais, incluindo ensaios de adesão e permeabilidade, bem como estudos a jusante para um determinado caminho de interesse. Além disso, esses LSECs podem ser agrupados ou usados individualmente, permitindo a geração de dados multi-omics, incluindo RNA-seq em massa ou célula única, proteômica ou fosfo-proteômica, e Ensaio para Chromatina Acessível transposase usando sequenciamento (ATAC-seq), entre outros. Este protocolo será útil para os pesquisadores que estudam a comunicação dos LSECs com outras células hepáticas em saúde e doenças e permitirá uma compreensão aprofundada do papel dos LSECs nos mecanismos patogênicos de lesões hepáticas agudas e crônicas.
Introduction
As células endoteliais sinusoidais hepáticos (LSECs) alinham as paredes sinusoides hepáticas e são as células não parambiais mais abundantes no fígado1. Os LSECs distinguem-se de outras células endoteliais capilares em outros lugares do corpo pela presença de fenestrae e pela falta de uma membrana clássica do porão ou um diafragma 2,3. Assim, os LSECs possuem características fenotípicas e estruturais distintas que aumentam sua permeabilidade e capacidade endócítica para eliminar uma variedade de macromoléculas circulantes, incluindo lipídios e lipoproteínas. Os LSECs desempenham um papel fundamental no crosstalk entre células parenchymal e não parenquiais, como células estelares e células imunes. Os LSECs são fundamentais na manutenção da homeostase hepática mantendo as células estelares e as células Kupffer em um estado quiescente4. Os LSECs modulam a composição das populações de células imunes hepáticas mediando a adesão e a migração trans-endotelial de leucócitos circulantes 5,6. Durante a lesão hepática aguda e crônica7, incluindo lesão isquemia-reperfusão (IRI)8, esteatohepatite não alcoólica (NASH)9, e carcinoma hepatocelular (HCC), os LSECs sofrem alterações fenotípicas conhecidas como capilarização caracterizada pela defenestração e formação da membrana do porão10. Essas alterações fenotípicas nos LSECs estão associadas à disfunção dos LSECs e à aquisição de propriedades protombolíticas, proinflammatórias e profibrogênicas.
Vários métodos para o isolamento de LSECs do fígado de rato foram desenvolvidos11. Algumas técnicas dependem da separação de células não parambientais e parínicas seguidas pela centrifugação gradiente de densidade para purificar os LSECs de frações não parambiais. A limitação deste método é a presença de macrófagos contaminados nas etapas finais do isolamento das LSECs, o que poderia afetar a pureza dos LSECsisolados 12. Este protocolo é baseado na perfusão de colagenase do fígado do camundongo e contas magnéticas CD146+ seleção positiva de células não equiquiais para purificar LSECs. LSECs isolados usando este método mostram alta pureza e morfologia preservada e viabilidade. Estes LSECs são ótimos para estudos funcionais, incluindo permeabilidade e ensaio de adesão, bem como estudos a jusante para caminhos de interesse. Além disso, com o crescente interesse em gerar grandes conjuntos de dados tanto na pesquisa clínica quanto na ciência da descoberta, esses LSECs de alta qualidade isolados de fígados saudáveis e doentes com esteatohepatite não alcoólica (NASH) ou outras condições podem ser agrupados ou usados individualmente, permitindo a geração de dados multi-omics e comparação entre saúde e doença13,14 . Além disso, os LSECs isolados podem ser empregados para desenvolver modelos in vitro tridimensionais, bem como tridimensionais, como organoides para decifrar a via de sinalização ativada em LSECs e sua comunicação intercelular com outras células hepáticas sob diferentes estímulos nocivos e em resposta a várias intervenções terapêuticas.
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Protocol
Os protocolos animais foram conduzidos conforme aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Clínica Mayo. Camundongos machos C57BL/6J de oito semanas foram comprados do Laboratório Jackson. Os ratos estavam alojados em uma instalação de ciclo claro-escuro de 12:12 h controlada pela temperatura com livre acesso à dieta.
1. Preparação de prato ou prato de cultura revestido de colágeno
- Para fazer 50 mL de ácido acético mol/L de 0,02, adicione 0,6 mL de ácido acético glacial a 49,4 mL de H2O.
- Faça 50 μg/mL de colágeno tipo I em ácido acético mol/L de 0,02. A diluição depende da concentração do lote.
- Cubra pratos de cultura de 10 cm com 3 mL de solução de colágeno. Incubar em temperatura ambiente (RT) por 1h.
NOTA: Ao usar um prato ou placa diferente para cultura, o volume da solução de revestimento precisa ser ajustado com base na área de cultura, geralmente use 6-10 μg/cm2. - Remova o excesso de fluido da superfície revestida e lave com soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) 3 vezes. Deixe os pratos secarem.
- Se a solução de colágeno não for estéril, esterilize os pratos revestidos de colágeno por exposição à luz ultravioleta (UV) por 10 minutos em uma capa de cultura tecidual estéril.
2. Configuração do equipamento
- Configure o aparelho de perfusão aquecido e umidificado, conforme mostrado na Figura 1B.
- Enxágüe o sistema de perfusão usando 10% de alvejante por 5 minutos seguido de água estéril por mais 10 minutos.
- Escorra o líquido de lavagem o máximo possível antes de perfumar a solução de colagemnase.
- Infundir a solução de colagem através do sistema de perfusão (como mostrado na Figura 1B) para pré-aniá-la a 37 °C. Coloque a taxa da bomba na velocidade 1, conforme mostrado no mostrador de controle de velocidade (igual a 40 mL/min).
- Mantenha essa velocidade igual durante todo o procedimento. Reutilizar a solução de colagenase em um circuito fechado durante o dia do isolamento LSEC.
NOTA: A velocidade da bomba é fixada em 1 para evitar pressão mecânica que poderia perturbar a condição biológica dos LSECs.
3. Procedimento cirúrgico
- Pesar o rato.
- Injete 90 mg/kg de peso corporal de cetamina e 10 mg/kg de peso corporal de xilazina intraperitoneal (IP).
- Uma vez que o rato não seja reativo a estímulos dolorosos, fixe o mouse na superfície cirúrgica, como mostrado na Figura 1B.
- Pulverize o abdômen do rato com 70% de etanol. Usando uma tesoura cirúrgica, faça uma incisão de ~5 cm de comprimento, começando da parte inferior do abdômen até o processo xifoide.
- Em seguida, faça dois cortes laterais usando uma pequena tesoura de íris em cada lado do abdômen para expor totalmente os órgãos abdominais.
- Coloque a baia do cateter intravenoso (IV) sob as costas do animal para levantar e nivelar o abdômen.
- Usando um fórceps curvos regulares, puxe suavemente os intestinos e o estômago para a esquerda do animal.
- Coloque uma sutura cirúrgica de 5-0 sob a veia cava inferior (IVC) logo abaixo do rim esquerdo exposto. Amarre um engate solto na sutura.
- Coloque outra sutura cirúrgica 5-0 ao redor da veia do portal hepático (PV) logo acima do ponto de ramificação da veia esplênica fora do PV hepático. Amarre um engate solto na sutura.
- Utilizando a sutura PV como tensão, insira o cateter de 20 G IV no PV hepático 1 cm abaixo de onde se ramifica para o PV hepático direito e esquerdo.
- Deslize o cateter até a veia, mas mantenha-o abaixo da área de ramificação. Deixe o sangue viajar pelo cateter até que comece a escorrer.
- Com parte do Buffer A (Tabela 1) em uma garrafa intravenosa (IV) posicionada acima da área cirúrgica, use uma linha IV e conecte-a ao cateter. Lave o fígado com esta solução, evitando a entrada de ar no sistema.
- Amarre a sutura ao redor da veia cava inferior abaixo do rim. Isso permitirá que o fígado retro perfume.
- Corte o IVC abaixo da sutura para permitir que o animal sangre.
NOTA: Esta etapa deve ser realizada rapidamente para evitar o congestionamento do fígado. - Fixar o cateter IV com a sutura PV.
- Uma vez perfumado, corte o estômago, intestinos, baço e outras entranhas presas ao fígado.
- Corte o diafragma e os principais vasos da cavidade torácica. Retire o fígado do animal e coloque-o na bandeja de perfusão.
- Remova cuidadosamente a linha IV e conecte a solução de colagem na câmara de recirculação.
NOTA: As etapas 3.16-3.18 precisam ser feitas dentro de 5 minutos, para que o fígado não fique perfumado por muito tempo com buffer A. Tenha muito cuidado para não permitir bolhas de ar no fígado. - Deixe o fígado perfundir até que a cápsula fique manchada e pareça mole (10-15 min ou mais, o período varia dependendo dos diferentes lotes de colagemnase).
- Enquanto o fígado está em perfusão, certifique-se de que o animal está morto antes de descartá-lo em um saco de necropsia.
- Uma vez digerido, remova o fígado da câmara e coloque-o em uma placa de Petri de 10 cm com cerca de 20 mL de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM).
- Desmonte suavemente o fígado com algumas pontas de pipeta e descarte a árvore biliar.
- Filtre a suspensão hepática através de um coador de células de 70 μm em um tubo cônico de 50 mL.
- Centrifugar a suspensão celular a 50 x g por 2 min na RT. Colecione o supernatante contendo células hepáticas nãoparambiais.
NOTA: Os hepatócitos são precipitados na pelota, que pode ser purificada ainda mais usando centrifugação gradiente como descrito anteriormente15.
4. Separação de células hepáticas não oparambimais e purificação de LSECs
NOTA: Purifique os LSECs CD146+ utilizando as contas imunomagnéticas, seguindo as instruções da fabricação.
- Centrifugar o supernante a 300 x g por 5 min a 4 °C.
- Coletar a pelota da célula e resuspend em 1 mL de tampão de isolamento (Tabela 1), determinar o número da célula usando um contador automático de células seguindo as instruções do fabricante.
- Centrifugar a suspensão celular a 300 x g por 10 min a 4 °C, aspirar o supernatante completamente.
- Resuspende a pelota com 90 μL de tampão de isolamento por 107 células totais.
- Adicione 10 μL de contas magnéticas CD146 por 107 células totais. Misture bem e incubar por 15 min a 4 °C.
- Para lavar as células, adicione 1-2 mL de tampão de isolamento por 107 células, centrífuga a 300 x g por 10 minutos e, em seguida, aspire o supernadente completamente.
- Resuspend até 109 células em 500 μL de tampão de isolamento (Tabela 1).
NOTA: Para maiores números de células, aumente o volume do buffer de acordo. - Prepare a coluna de separação, enxágue-a com 3 mL de tampão de isolamento.
- Aplique a suspensão da célula na coluna empilhada com filtros de pré-separação de 70 μm.
- Lave a coluna com 3 mL de tampão de isolamento 3 vezes.
NOTA: Ao lavar a coluna, o tampão de isolamento deve ser adicionado assim que o reservatório da coluna estiver vazio. - Retire a coluna do separador e coloque-a em um tubo de centrífuga de 15 mL. Pipeta 5 mL de tampão de isolamento na coluna.
- Para recuperar as contas magnéticas rotuladas células, empurre firmemente o êmbolo para dentro da coluna para lavar as células.
- Centrifuuga a 300 x g para 5 min a 4 °C. Os LSECs estão prontos para exame microscópico e análise a jusante.
5. LSECs imunofenoftipagem e avaliação da pureza por citometria de fluxo
- Determine os números de células de LSECs isolados usando um contador automático de células seguindo as instruções do fabricante.
- Centrifugar as células a 300 x g por 5 min, aspirar o supernante completamente.
- Pegue 1 x 106 células/tubo e resuspend com 90 μL de tampão de coloração (Tabela 1).
- Adicione 10 μL/tubo de bloco FcR do mouse e 1 μL de corante de viabilidade, incubar a 4 °C por 10 min.
- Colora as células com uma combinação de anticorpos CD45, CD146 e stabilin-2 diluídos à 1:50 com tampão de coloração. Incubar a 4 °C por 20 min.
- Lave as células com 5 mL de tampão de coloração e centrífuga a 300 x g por 10 minutos, depois aspire completamente o sobrenante.
- Resuspende as células com 300 μL de tampão de coloração e passe pelo citômetro de fluxo.
6. Cultura e exame LSECs
- Semente 1 x 106 células/bem em uma placa de 6 poços e cultuá-lo com meio de crescimento de células endoteliais consistindo de 5% de soro bovino fetal (FBS), 1% suplemento de crescimento de células endoteliais e 1% solução de primocina.
- Examine os LSECs isolados por microscopia leve. Adquira imagens de campo brilhante com uma ampliação de 10x.
7. Morfologia LSECs e exame de fenestrae por meio da microscopia eletrônica de varredura
- Pré-reveste as pastilhas de cultura celular (tamanho de poros de 3 μm) com solução de colágeno.
- Cultura isolou LSECs (120.000 células) na inserção com células endoteliais meio de crescimento em uma placa de 24 poços a 37 °C atmosfera quente e umidificada. Permita que as células se acalmem e aderam por 2h.
- Para fixação celular, adicione um volume equivalente de pré-armado a 37 °C de fixação de Trump à mídia de cultura celular.
- Após a incubação por 10 minutos, substitua 50% da fixação diluída de Trump por fixação não diluída de Trump.
- Fixar as células em Trump fixação por 2 h, em seguida, incubar por 1 h em 1% tetroxidas de ósmio.
- Prossiga com a desidratação das amostras, secando em um dispositivo de secagem de ponto crítico, montagem, revestimento de sputter e exame usando um microscópio eletrônico de varredura.
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Representative Results
Esquemas experimentais e equipamentos configurados:
Neste protocolo, o fígado de rato foi digerido usando um circuito de perfusão fechado, então células não parêquias e hepatócitos foram separados por centrifugação de baixa velocidade a 50 x g por 2 min. Os LSECs primários foram isolados usando a seleção de contas magnéticas CD146 da fração não equiquial. Os esquemas experimentais são mostrados na Figura 1A. A cânula foi colocada através do PV enquanto a veia cava inferior foi amarrada para garantir a perfusão unidirecional de colagem através do fígado (Figura 1B). A câmara de perfusão interna é equipada com um sistema de aquecimento e umidificação para garantir um ar de aparelho quente e umidificado de 37-40 °C. A colagem perfundida circula através de um sistema fechado e pode ser reutilizada para dois ou três ratos durante o dia do isolamento para tornar o isolamento mais econômico.
Avaliação da pureza isolada dos LSECs e marcadores de superfície por citometria de fluxo:
A pureza dos LSECs isolados foi avaliada utilizando marcadores de superfície LSEC bem caracterizados CD146 e stabilin-2 16,17,18. As células manchadas foram analisadas em um citômetro de fluxo; os dados foram analisados usando o software FlowJo.
A população da LSEC foi fechada (Figura 2A) e analisou singlets para a seguinte estratégia de gating; as células viáveis foram definidas utilizando-se a coloração de corante viabilidade antes de rotular células com marcadores específicos (Figura 2B). Em seguida, a população cd45 foi fechada para excluir qualquer contaminação de células imunes. As LSECs isoladas atingiram 94,8% de viabilidade (Figura 2C). O percentual de células CD45 foi de 89,7% (Figura 2D), e 92,3% das células foram CD146 e stabilin-2 duplo-positivo (CD45-CD146+stabilin-2+) LSECs (Figura 2E).
Morfologia dos LSECs isolados:
Os LSECs isolados foram semeados em uma placa de 6 poços em 1 x 106 células/bem, cultivados em um meio de crescimento completo, e examinados por microscopia leve após 6h de cultura (Figura 3A). Os LSECs foram banhados em uma inserção de cultura do tamanho de um poro de 3 μm para visualizar o fenestrae LSECs por meio da varredura do microscópio eletrônico (SEM). Após fixação e processamento, foram identificados os fenestrae, conforme mostrado na Figura 3B. Como relatado anteriormente, os LSECs perdem seu fenestrae na cultura durante a noitede 19; portanto, recomenda-se processar as células o mais rápido possível após o isolamento de estudos a jusante para evitar a desdiferenciação in vitro.
Figura 1: Esquemas experimentais e equipamentos montados. (A) Os esquemas experimentais foram projetados utilizando a renderização bio. (B) Configuração e processo do equipamento. O fígado foi colhido e perfusado em um aparelho de perfusão de colagem fechado. O fígado foi então transferido para um prato e dissociado. A suspensão do fígado foi recolhida. A fração de células não equiquimais foi separada por centrifugação a 50 x g por 2 min. LSECs foram purificados usando contas magnéticas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Avaliação da pureza isolada dos LSECs e marcadores de superfície por citometria de fluxo. Análise de dados e estratégia de gating como mostrado, (A) LSECs fechados e (B) singlets com base em dispersão para a frente (FSC)/dispersão lateral (SSC). LSECs isolados foram manchados com um corante de viabilidade e uma combinação de anticorpos CD45, CD146 e stabilin-2. Os singlets foram fechados e analisados, (C) LSECs viáveis foram fechados na população (D) CD45 e analisados para (E) CD146 e expressão stabilin-2. Todos os portões foram determinados por fluorescência menos um (FMO). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Morfologia de LSECs isolados. (A) Imagem de campo brilhante de LSECs cultivados. Os LSECs isolados foram cultivados no meio de crescimento completo por 6h e examinados por microscopia leve (barra de escala 100 μm). (B) A LSEC foi examinada pelo microscópio eletrônico de varredura (SEM). As setas brancas indicam fenestrae LSEC (Barra de escala, painel esquerdo 5 μm, painel direito 1 μm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Solução de ações KRH (10x) | |
| Reagentes | Concentração |
| NaCl | 1,15 M |
| HEPES (ácido livre) | 0,2 M |
| Kcl | 0,05 M |
| KH2PO4 | 0,01 M |
| Tampão A | |
| Reagentes | Concentração |
| Solução KRH, PH=7.4 | 1x |
| EGTA | 0,5 mM |
| Ajuste PH para 7.4, filtre através de um filtro de 0,2 μm antes de usar. | |
| Armazenado em temperatura ambiente por até 6 meses. | |
| Tampão B | |
| Solução KRH, PH=7.4 | 1x |
| CaCl2 | 1 mM |
| Ajuste PH para 7.4, filtre através de um filtro de 0,2 μm antes de usar. | |
| Armazenado em temperatura ambiente por até 6 meses. | |
| Solução de colagenase | |
| Reagentes | Concentração |
| Buffer B, PH=7.4 | 125 mL |
| Colagenase | 35-40 mgs, adicione BSA até 100 mgs |
| Solução percoll | |
| Reagentes | Concentração |
| Percoll | 22,5 mL |
| PBS (10x), PH=7,4 | 2,5 mL |
| Tampão de isoalção/coloração | |
| Reagentes | Concentração |
| Tampão de lavagem MACS | 1250 mL |
| Ações da BSA | 125 mL |
Tabela 1: Receita de buffers. A tabela compreende a composição dos buffers e soluções utilizadas neste estudo.
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Discussion
No manuscrito atual, descrevemos um protocolo para o isolamento do LSEC do fígado de rato consistindo de perfusão de colagem de duas etapas e posterior classificação celular ativada por magnético (MACS). Este protocolo consiste nas seguintes três etapas: (1) Perfusão através do PV com um buffer livre de cálcio seguido de um tampão contendo colagem para alcançar a dispersão das células hepáticas; (2) Exclusão de hepatócitos com centrifugação de baixa velocidade; e (3) seleção positiva baseada em MACS de LSECs de células nãoparambientas (NPCs) usando contas magnéticas anti-CD146. Todo o procedimento poderia ser concluído dentro de 3h. Além disso, o custo para este procedimento, incluindo todos os suprimentos de consumo, é de cerca de 150 USD por mouse, sugerindo que este método de isolamento LSEC é globalmente eficiente e econômico. Utilizamos etapas (1) e (2) para isolamento de hepatócitos de camundongos primários também, o que está além do escopo do manuscrito atual.
Existem alguns passos críticos na cannulação do portal e perfusão hepática: (i) Posicionamento do cateter: a ponta do cateter deve ser colocada não menos que 3 mm distal à bifurcação pv de um rato adulto, que geralmente é identificada no hilum do fígado. A colocação profunda da ponta do cateter no PV comprometerá a perfusão de alguns lóbulos do fígado. A má perfusão de um lobo se manifesta como ausência de uma mudança de cor do lobo e pode ser retificada se notada imediatamente por um leve reposicionamento do cateter no PV distal. Esta manobra poderia otimizar a perfusão do lobo. (ii) Bolhas de ar: a rota de infusão entre a bomba e o PV deve ser mantida completamente livre de bolhas de ar. A entrada de ar no PV pode causar uma embolia de ar, o que resulta em perfusão hepática incompleta. Para eliminar o ar no cateter depois de remover a agulha interna, o Buffer A é injetado com uma seringa proximal à bolha para expelir qualquer ar antes de conectar a linha de infusão ao cateter. (iii) Força de colagenase: Para manter a atividade de colagem durante a perfusão, é essencial garantir que o Buffer B infundido no PV tenha a concentração precisa de colagenase e pH e seja mantido a aproximadamente 37 °C. Como mostrado na Figura 1, uma câmara personalizada é usada para manter todo o sistema de perfusão em uma atmosfera quente e umidificada de 37 °C; além disso, o suprimento de oxigênio é mantido durante a perfusão da colagemnase para alcançar a digestão completa. Uma opção alternativa inclui um banho de água para pré-aquecer a solução decolagemnase 20, e um sistema aberto de perfusão de colagenase in situ onde a solução de colagem drenase drenar do fígado através do IVC21 cortado.
Embora o protocolo use cateteres relativamente ousados (20 G) para garantir um fluxo adequado de perfusão, um cateter mais fino também funcionará bem com base em relatórios anteriores 22,23,24. No entanto, às vezes é difícil cannutar com sucesso o PV especialmente quando os camundongos são usados para modelos específicos de doenças ou se eles têm anomalias FOTOVOLTAICAs. Se a cannulação fotovoltaica falhar, a digestão hepática mecânica e enzimática usando um kit de enzima e dissociador de tecido suave é um método alternativo para etapas (1) e (2) para obter suspensão de células não equiquimal (NPC). Confirmamos que o rendimento e a viabilidade celular neste método alternativo de dissociação sem perfusão hepática era comparável ao método original (dados não mostrados). A perfusão da veia portal para digestão hepática tem sido empregada por outros e por nós 13,16,20. Além disso, este método evita o risco teórico de alterações fenotípicas ou funcionais induzidas pela força mecânica durante a digestão hepática. Portanto, o uso do método baseado em perfusão PV retratado neste protocolo é até agora altamente recomendado.
Aqui, o ótimo rendimento lsec e pureza ao empregar o protocolo atual são mostrados. Obtivemos aproximadamente 2-5 x 106 células por camundongos de camundongos e camundongos saudáveis com NASH induzido por dieta usando o protocolo atual. Quanto à pureza, a positividade do mesmo marcador de superfície usado para a separação imunomagnética (CD146) suporta a precisão de nossa técnica de isolamento. Além disso, existem vários marcadores de superfície LSEC bem reconhecidos, como o receptor de ácido hialurônico linfático 1 (LYVE-1), CD32b e stabilin-2. Controvérsias ainda existem em torno desses marcadores; por exemplo, i) LYVE-1 está presente também em células endoteliais linfáticas, e ii) LSECs em uma área periportal carece de expressão CD32b18. Assim, para examinar a pureza desses LSECs isolados com citometria de fluxo, a stabilin-2 foi empregada como um marcador LSEC específico estabelecido, além do CD146. Utilizando essa metodologia, confirmamos que as LSECs isoladas tinham >94% de viabilidade e >90% de pureza (Figura 2). O fenótipo específico do LSEC das células isoladas foi confirmado ainda utilizando-se de SEM, onde a maioria das células possui fenestra (Figura 3B), característica morfológica dos LSECs.
Entre as metodologias de isolamento do LSECs, a seleção de contas imunomagnéticas é a técnica mais utilizada para isolar os LSECs da fração NPC 24,25,26,27. Em contraste, outros métodos incluem elutriação centrífuga e separação seletiva baseada em adesão 22,28,29. Os métodos não imunomagnéticos têm sido mostrados para fornecer altos rendimentos de LSECs (aproximadamente 9 x 106 células por mouse)11. Assim, um rendimento relativamente menor de LSECs isolados pode ser uma limitação do protocolo atual. Por outro lado, os métodos não-imunomagnéticos baseados em seleção exigem alta experiência técnica e às vezes mostram resultados inconsistentes sobre rendimentos e purezascelulares 11, enquanto o método baseado em seleção imunomagnética tem a vantagem de rendimento e pureza consistentes em relação a outros métodos existentes. Além disso, para o isolamento celular baseado em contas imunomagnéticas, a especificidade dos marcadores de superfície celular utilizados é sempre uma questão de preocupação. Por exemplo, o CD31, que já foi usado anteriormente como um marcador para a separação imunomagnética do LSEC, é predominantemente expresso no endotélio PV e LSECs capilarizados3. Embora o CD146 tenha sido relatado como expresso também em células assassinas naturais e células estelares hepáticas 30,31, a alta pureza dos LSECs isolados usando este protocolo atenua preocupações quanto à especificidade do marcador endotelial CD146. A comparação dos prós e contras de várias metodologias para o isolamento da LSEC é discutida em outros lugares 11,18,32. A comparação de rendimentos celulares e purezas entre outros métodos e este método está além do escopo do manuscrito atual e garante futuras investigações.
Em conclusão, apresentamos um protocolo primário de isolamento LSEC do mouse baseado em uma das abordagens mais utilizadas e aceitas. LSECs isolados apresentam alta pureza e função preservada. Além disso, este protocolo é eficiente e aplicável ao fígado de camundongo saudável, bem como ao fígado de diferentes modelos de camundongos da doença. LSECs de alta qualidade desses camundongos podem ser empregados para a geração de conjunto de dados multiômica13,14. Assim, essa abordagem facilita a identificação de mecanismos moleculares que regulam a função da LSEC e melhora nossa compreensão de seus papéis na comunicação intercelular no fígado em saúde e doença.
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Disclosures
Todos os autores não têm conflitos para revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais do NIH (1RO1DK122948 a SHI) e pelo mecanismo de concessão do NIH Silvio O. Conte Digestive Diseases Core Centers P30 (DK084567). O apoio também foi prestado à KF pela Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Overseas Research Fellowships. Também gostaríamos de reconhecer o Dr. Gregory J. Gores e Steven Bronk por seu projeto original e otimização do aparelho de perfusão de colagenase.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.0-inch 20 G Intra Venous (IV) catheter | Terumo, SOmerset, NJ, USA | SR-OX2051CA | |
| 2–3-inch perfuion tray with a hole in the center | customized; made in house | ||
| 405/520 viability dye | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-205 | |
| 4-inch regular curved dressing forceps | Fisher Brand | FS16-100-110 | |
| 5-0 Perma-Hand silk suture | Ethicon, Raritan, NJ, USA | A182H | |
| Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluorà 488 | MBL International, Woburn, MA, USA | D317-A48 | |
| BSA stock | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
| Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-118-407 | |
| CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-007 | |
| Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-803 | |
| Collagen type I | Corning, Corning, NY, USA | 354236 | |
| Collagenase II | Gibco, Waltham, MA, USA | 17101-015 | |
| Endothelial cells growth medium | ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA | 211-500 | |
| FcR blocking reagent, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-575 | |
| FlowJo software, version 10.6 | Becton, Dickinson and Company | ||
| Hardened Fine scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14091-11 | |
| Heated (37 °C) and humidified recirculating perfusion apparatus equipped with Oxygen injection at a rate of 10psi. | customized; made in house | ||
| Hitachi S 4700 scanning electron microscope | Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA | SEM096 | |
| LS columns | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-401 | |
| MACS pre-separation filters (70 μm) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-095-823 | |
| MACS rinsing buffer | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
| MACS Smart Strainer (70 μm) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-098-462 | |
| MACSQunt flow cytometer | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | ||
| Millicell Cell Culture Insert | Millipore Sigma, Burlington, MA, USA | PITP01250 | |
| Nexcelom cell counter | Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, USA | Cellometer Auto T4 Plus | |
| Percoll | GE Healthcare, Chicago, IL, USA | 17-0891-01 | |
| Surgical scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14001-12 | |
| Very small curved dressing forceps | F.S.T, Foster city, CA, USA | 11063-07 |
References
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