Summary
Здесь мы описываем и демонстрируем протокол первичной изоляции синусоидальных эндотелиальных клеток печени мыши (LSEC). Протокол основан на перфузии коллагеназы печени, непаренхимальной очистке клеток низкоскоростной центрифугированием и выборе магнитных шариков CD146. Мы также фенотипируем и характеризуем эти изолированные ЛСЭК с помощью проточной цитометрии и сканирующей электронной микроскопии.
Abstract
Синусоидальные эндотелиальные клетки печени (LSECs) представляют собой специализированные эндотелиальные клетки, расположенные на границе между кровообращением и паренхимой печени. ЛСЭС имеют отчетливую морфологию, характеризующуюся наличием фенестрат и отсутствием базальной мембраны. ЛСЭС играют важную роль во многих патологических расстройствах печени, включая метаболическую дисрегуляцию, воспаление, фиброз, ангиогенез и канцерогенез. Тем не менее, мало что было опубликовано об изоляции и характеристике LSEC. Здесь в этом протоколе обсуждается изоляция LSEC как от здоровых, так и от неалкогольных мышей с жировой болезнью печени (НАЖБП). Протокол основан на перфузии коллагеназы печени мыши и магнитном отборе непаренхимальных клеток для очистки ЛСЭС. Это исследование характеризует ЛСЭС с использованием специфических маркеров с помощью проточной цитометрии и идентифицирует характерные фенотипические особенности с помощью сканирующей электронной микроскопии. ЛСЭС, выделенные в соответствии с этим протоколом, могут использоваться для функциональных исследований, включая анализы адгезии и проницаемости, а также для последующих исследований для конкретного пути, представляющего интерес. Кроме того, эти ЛСЭС могут быть объединены или использованы по отдельности, что позволяет генерировать мультиомные данные, включая объемную или одноклеточную РНК-seq, протеомную или фосфопротеомику и анализ на транспозазно-доступный хроматин с использованием секвенирования (ATAC-seq), среди прочих. Этот протокол будет полезен для исследователей, изучающих связь LSECs с другими клетками печени в области здоровья и болезни, и позволит глубоко понять роль LSECs в патогенных механизмах острого и хронического повреждения печени.
Introduction
Синусоидальные эндотелиальные клетки печени (LSECs) выстилают стенки синусоиды печени и являются наиболее распространенными непаренхимальными клетками в печени1. ЛСЭС отличаются от других капиллярных эндотелиальных клеток в других частях тела наличием фенестр и отсутствием классической базальной мембраны или диафрагмы 2,3. Следовательно, ЛСЭС обладают отличительными фенотипическими и структурными характеристиками, которые повышают их проницаемость и эндоцитарную способность устранять различные циркулирующие макромолекулы, включая липиды и липопротеины. LSECs играют ключевую роль в перекрестных помехах между паренхиматозными и непаренхимальными клетками, такими как звездчатые клетки и иммунные клетки. ЛСЭС играют ключевую роль в поддержании гомеостаза печени, сохраняя звездчатые клетки и клетки Купфера в состоянии покоя4. ЛСЭС модулируют состав популяций печеночных иммунных клеток, опосредуя адгезию и трансэндотелиальную миграцию циркулирующих лейкоцитов 5,6. Во время острого и хронического повреждения печени7, включая ишемию-реперфузионное повреждение (IRI)8, неалкогольный стеатогепатит (НАСГ)9 и гепатоцеллюлярную карциному (ГЦК), ЛСЭС подвергаются фенотипическим изменениям, известным как капилляризация, характеризующаяся дефенестрацией и образованием базальной мембраны10. Эти фенотипические изменения в ЛСЭС связаны с дисфункцией ЛСЭС и приобретением протромботических, провоспалительных и профиброгенных свойств.
Было разработано несколько методов выделения ЛСЭС из печени мышей11. Некоторые методы зависят от разделения непаренхимальных и паренхиматозных клеток с последующим центрифугированием градиента плотности для очистки LSECs от непаренхимальных фракций. Ограничением этого метода является наличие загрязняющих макрофагов на заключительных этапах выделения ЛСЭС, что может повлиять на чистоту изолированных ЛСЭС12. Этот протокол основан на перфузии коллагеназы печени мыши и положительном отборе магнитных шариков CD146+ непаренхимальных клеток для очистки ЛСЭС. ЛСЭС, выделенные с помощью этого метода, демонстрируют высокую чистоту и сохраненную морфологию и жизнеспособность. Эти ЛСЭС являются оптимальными для функциональных исследований, включая анализ проницаемости и адгезии, а также для последующих исследований интересующих путей. Кроме того, с растущим интересом к созданию больших наборов данных как в клинических исследованиях, так и в науке об открытиях, эти высококачественные ЛСЭС, выделенные как из здоровой, так и из больной печени с неалкогольным стеатогепатитом (НАСГ) или другими состояниями, могут объединяться или использоваться индивидуально, что позволяет генерировать мультиомические данные и сравнивать здоровье и заболевание13,14 . Кроме того, изолированные ЛСЭС могут быть использованы для разработки двумерных, а также трехмерных моделей in vitro, таких как органоиды, для расшифровки активированного сигнального пути в ЛСЭС и их межклеточной связи с другими клетками печени при различных вредных стимулах и в ответ на различные терапевтические вмешательства.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протоколы для животных были проведены в соответствии с одобрением Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) клиники Майо. Восьминедельные самцы мышей C57BL/6J были приобретены в лаборатории Джексона. Мышей помещали в 12:12-часовой цикл со свободным доступом к диете с контролируемой температурой.
1. Приготовление блюда или тарелки для культуры, покрытой коллагеном
- Чтобы получить 50 мл 0,02 моль/л уксусной кислоты, добавьте 0,6 мл ледниковой уксусной кислоты к 49,4 млH2O.
- Получите 50 мкг/мл коллагена I типа в 0,02 моль/л уксусной кислоты. Разбавление зависит от концентрации партии.
- Обмазать 10 см культуральную посуду 3 мл раствора коллагена. Инкубировать при комнатной температуре (РТ) в течение 1 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании другой посуды или тарелки для культивирования объем раствора покрытия необходимо регулировать в зависимости от площади культивирования, обычно используют 6-10 мкг/см2. - Удалите лишнюю жидкость с поверхности, покрытой покрытием, и промыть фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) 3 раза. Дайте посуде высохнуть на воздухе.
- Если раствор коллагена не стерилен, стерилизуйте посуду, покрытую коллагеном, воздействием ультрафиолетового (УФ) света в течение 10 мин в стерильной культуральной вытяжке.
2. Настройка оборудования
- Установите нагретый и увлажненный рециркуляционный перфузионный аппарат, как показано на рисунке 1B.
- Промойте перфузионную систему с использованием 10% отбеливателя в течение 5 минут, а затем стерильной водой еще 10 минут.
- Слейте промывочную жидкость как можно больше перед перфузией раствора коллагеназы.
- Вводят раствор коллагеназы через перфузионную систему (как показано на рисунке 1B) для предварительного нагревания при 37 °C. Установите скорость насоса на скорости 1, как показано на регуляторе скорости (равно 40 мл/мин).
- Держите эту скорость одинаковой на протяжении всей процедуры. Повторно используйте раствор коллагеназы, работающий в замкнутом контуре в течение дня изоляции LSEC.
ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость насоса фиксируется на уровне 1, чтобы избежать механического давления, которое может нарушить биологическое состояние LSECs.
3. Хирургическая процедура
- Взвесьте мышь.
- Вводят 90 мг/кг массы тела кетамина и 10 мг/кг массы тела ксилазина внутрибрюшинно (ИП).
- Как только мышь нереактивна к болевым раздражителям, закрепите мышь на хирургической поверхности, как показано на рисунке 1B.
- Опрыскивайте брюшко мыши 70% этанолом. Используя хирургические ножницы, сделайте разрез длиной ~5 см, начиная от нижней части живота до мечевидного отростка.
- Затем сделайте два боковых разреза, используя небольшие ножницы радужной оболочки с каждой стороны живота, чтобы полностью обнажить органы брюшной полости.
- Поместите оболочку внутривенного (IV) катетера под спину животного, чтобы поднять и выровнять живот.
- Используя обычную изогнутую повязку щипцами, аккуратно оттяните кишечник и желудок влево от животного.
- Поместите хирургический шов 5-0 под нижнюю полую вену (IVC) чуть ниже открытой левой почки. Завяжите свободную сцепку в шов.
- Поместите еще 5-0 хирургический шов вокруг печеночной воротной вены (PV) чуть выше точки ветвления селезеночной вены от печеночной PV. Завяжите свободную сцепку в шов.
- Используя pv шов в качестве натяжения, вставьте катетер 20 G IV в печеночный PV на 1 см ниже, где он разветвляется на правый и левый печеночный PV.
- Сдвиньте катетер вверх по вене, но держите его ниже области ветвления. Позвольте крови пройти вниз по катетеру, пока она не начнет капать.
- С частью буфера А (таблица 1) во внутривенном (IV) флаконе, расположенном над хирургической областью, используйте линию IV и прикрепите ее к катетеру. Промывайте печень этим раствором, избегая попадания воздуха в систему.
- Завяжите шов вокруг нижней полой вены ниже почки. Это позволит печени ретро перфузировать.
- Отрежьте IVC ниже шва, чтобы животное истекало кровью.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен быть выполнен быстро, чтобы избежать застойных явлений в печени. - Закрепите внутривенный катетер швом PV.
- После перфузии отрежьте желудок, кишечник, селезенку и другие внутренности, прикрепленные к печени.
- Отрежьте диафрагму и крупные сосуды от грудной полости. Извлеките печень у животного и поместите ее на перфузионный лоток.
- Осторожно удалите внутривенную линию и подключите раствор коллагеназы в рециркуляционную камеру.
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 3.16-3.18 должны быть выполнены в течение 5 минут, чтобы печень не была перфузирована слишком долго с буфером А. Будьте очень осторожны, чтобы не допустить пузырьков воздуха в печень. - Дайте печени перфузиться до тех пор, пока капсула не станет пятнистой и не появится кашицеобразной (10-15 мин или более, период варьируется в зависимости от разных партий коллагеназы).
- Пока печень находится в перфузии, убедитесь, что животное умерло, прежде чем утилизировать его в мешок для некропсии.
- После переваривания извлеките печень из камеры и поместите ее в чашку Петри размером 10 см с примерно 20 мл безымянного Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM).
- Аккуратно разберите печень парой кончиков пипетки и выбросьте билиарное дерево.
- Фильтруйте суспензию печени через клеточный ситечко 70 мкм в коническую трубку объемом 50 мл.
- Центрифугируют клеточную суспензию при 50 х г в течение 2 мин при РТ. Собирают супернатант, содержащий непаренхимальные печеночные клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гепатоциты осаждаются в грануле, которая может быть дополнительно очищена с использованием градиентного центрифугирования, как описано ранее15.
4. Разделение непаренхимальных печеночных клеток и очистка ЛСЭС
ПРИМЕЧАНИЕ: Очистите CD146+ ЛСЭК с помощью иммуномагнитных шариков, следуя инструкциям производителя.
- Центрифугировать супернатант при 300 х г в течение 5 мин при 4 °C.
- Соберите гранулу ячейки и повторно суспендируйте в 1 мл изоляционного буфера (табл. 1), определите номер ячейки с помощью автоматического счетчика ячеек в соответствии с инструкциями производителя.
- Центрифугируют клеточную суспензию при 300 х г в течение 10 мин при 4 °С, полностью аспирируют супернатант.
- Повторно суспендировать гранулу с 90 мкл изоляционного буфера на 107 общих клеток.
- Добавьте 10 мкл магнитных шариков CD146 на 107 общих ячеек. Хорошо перемешать и инкубировать в течение 15 мин при 4 °C.
- Для промывки клеток добавляют 1-2 мл изоляционного буфера на 107 клеток, центрифугу при 300 х г в течение 10 мин, а затем полностью аспирируют супернатант.
- Повторное суспендирование до 109 клеток в 500 мкл изоляционного буфера (табл. 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для более высоких чисел ячеек соответственно увеличьте объем буфера. - Подготовьте разделительную колонну, промойте ее 3 мл изоляционного буфера.
- Нанесите суспензию ячейки на колонну, уложенную фильтрами предварительного разделения 70 мкм.
- Промыть колонну 3 мл изоляционного буфера 3 раза.
ПРИМЕЧАНИЕ: При промывке колонны изоляционный буфер должен быть добавлен, как только резервуар колонны опустеет. - Извлеките колонну из сепаратора и поместите ее на трубку центрифуги объемом 15 мл. Пипетка 5 мл изоляционного буфера на колонку.
- Чтобы восстановить магнитные шарики, помеченные ячейками, плотно протолкните поршень в колонну, чтобы промыть ячейки.
- Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин при 4 °C. ЛСЭС готовы к микроскопическому исследованию и последующему анализу.
5. Иммунофенотипирование и оценка чистоты ЛСЭС методом проточной цитометрии
- Определите номера ячеек изолированных ЛСЭС с помощью автоматического счетчика ячеек в соответствии с инструкциями производителя.
- Центрифугируйте клетки при 300 х г в течение 5 мин, полностью аспирируйте супернатант.
- Взять 1 х 106 клеток/пробирку и повторно суспендировать с 90 мкл окрашивающего буфера (таблица 1).
- Добавьте 10 мкл/пробирку мышиного блока FcR и 1 мкл красителя жизнеспособности, инкубируют при 4 °C в течение 10 мин.
- Окрашивают клетки комбинацией антител CD45, CD146 и стабилина-2, разведенных в 1:50 с буфером окрашивания. Инкубировать при 4 °C в течение 20 мин.
- Промыть клетки 5 мл окрашивающего буфера и центрифуги при 300 х г в течение 10 мин, затем полностью аспирировать супернатант.
- Повторно суспендируйте клетки с 300 мкл окрашивающего буфера и пропустите через проточный цитометр.
6. Культура и экспертиза LSECs
- Семена 1 х 106 клеток / хорошо в 6-луночной пластине и культивируют ее средой роста эндотелиальных клеток, состоящей из 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% добавки для роста эндотелиальных клеток и 1% раствора примоцина.
- Исследуйте изолированные ЛСЭС с помощью световой микроскопии. Получайте изображения яркого поля с 10-кратным увеличением.
7. Морфология ЛСЭС и исследование фенестр методом сканирующей электронной микроскопии
- Предварительно обмазывайте вставки клеточной культуры (размер пор 3 мкм) раствором коллагена.
- Культивируют изолированные ЛСЭС (120 000 клеток) на вставке с эндотелиальными клетками питательной среды в 24-луночной пластине при 37 °C теплой и увлажненной атмосфере. Дайте клеткам отстояться и прилипнуть в течение 2 ч.
- Для фиксации клеток добавьте эквивалентный объем предварительно расплавленного при 37 °C фиксатора Трампа к среде клеточной культуры.
- После инкубации в течение 10 минут замените 50% разбавленного фиксатора Трампа на неразбавленный фиксатор Трампа.
- Зафиксируйте клетки в фиксаторе Трампа в течение 2 ч, затем инкубируйте в течение 1 ч в 1% тетроксидов осмия.
- Приступайте к обезвоживанию образцов, сушке в сушильном устройстве критической точки, монтажу, напылению покрытия и исследованию с помощью сканирующего электронного микроскопа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Экспериментальные схемы и наладка оборудования:
В этом протоколе печень мыши переваривали с помощью замкнутого перфузионного контура, затем непаренхимальные клетки и гепатоциты отделяли низкоскоростным центрифугированием при 50 х г в течение 2 мин. Первичные ЛСЭС были выделены с использованием отбора магнитных шариков CD146 из непаренхимальной фракции. Экспериментальные схемы показаны на рисунке 1А. Канюлю помещали через PV, в то время как нижняя полая вена была связана, чтобы обеспечить однонаправленную перфузию коллагеназы через печень (рисунок 1B). Собственная перфузионная камера оснащена системой отопления и увлажнения для обеспечения теплого и увлажненного воздуха аппарата при температуре 37-40 °C. Перфузированная коллагеназа циркулирует через закрытую систему и может быть повторно использована для двух или трех мышей в течение дня изоляции, чтобы сделать изоляцию более экономически эффективной.
Оценка чистоты изолированных ЛСЭС и поверхностных маркеров методом проточной цитометрии:
Чистоту изолированных ЛСЭС оценивали с использованием хорошо охарактеризованных специфических поверхностных маркеров LSEC CD146 и стабилина-2 16,17,18. Окрашенные клетки анализировали на проточном цитометре; данные анализировались с помощью программного обеспечения FlowJo.
Население LSEC было закрыто (рисунок 2A) и проанализировано синглеты для следующей стратегии гастинга; жизнеспособные клетки определяли с использованием окрашивания красителем жизнеспособности перед маркировкой клеток специфическими маркерами (рисунок 2B). Затем CD45-популяция была закрыта, чтобы исключить любое загрязнение иммунными клетками. Изолированные ЛСЭС достигли жизнеспособности 94,8% (рисунок 2C). Процент CD45-клеток составил 89,7% (Рисунок 2D), а 92,3% клеток были CD146 и стабилин-2 с двойным положительным (CD45-CD146+стабилин-2+) ЛСЭК (Рисунок 2Е).
Морфология выделенных ЛСЭС:
Изолированные ЛСЭС высевали в 6-луночную пластину при 1 х 106 клетках/лунке, культивировали в полной питательной среде и исследовали с помощью световой микроскопии через 6 ч культуры (рисунок 3А). ЛСЭС были покрыты на 3-мкм поровой культуральной вставке для визуализации фенестр LSECs с помощью сканирующего электронного микроскопа (SEM). После фиксации и обработки фенестры были идентифицированы, как показано на рисунке 3B. Как сообщалось ранее, ЛСЭК теряют свои фенестры в культуре в одночасье19; следовательно, рекомендуется обрабатывать клетки как можно скорее после выделения для последующих исследований, чтобы избежать дедифференциации in vitro.
Рисунок 1: Экспериментальные схемы и настройка оборудования. (A) Экспериментальные схемы были разработаны с использованием Bio render. (B) Настройка и обработка оборудования. Печень собирали и перфузировали в закрытом перфузионном аппарате коллагеназы. Затем печень перекладывали в блюдо и диссоциировали. Была собрана суспензия печени. Фракцию непаренхимальных клеток отделяли центрифугированием при 50 х г в течение 2 мин. ЛСЭС очищали с помощью магнитных шариков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Оценка чистоты изолированных ЛСЭС и поверхностных маркеров методом проточной цитометрии. Анализ данных и стратегия измерения, как показано на рисунке, (A) закрытые ЛСЭК и (В) синглеты на основе прямого рассеяния (FSC)/бокового рассеяния (SSC). Изолированные ЛСЭС окрашивали красителем жизнеспособности и комбинацией антител CD45, CD146 и стабилина-2. Синглеты были закрыты и проанализированы, (C) жизнеспособные LSECs были закрыты на (D) популяции CD45 и проанализированы на (E) CD146 и экспрессию стабилина-2. Все затворы определялись флуоресценцией минус один (FMO). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Морфология изолированных ЛСЭС. (А) Яркая полевая картина культивируемых ЛСЭС. Изолированные ЛСЭС культивировали в полной питательной среде в течение 6 ч и исследовали с помощью световой микроскопии (шкала бара 100 мкм). (B) LSEC исследовали с помощью сканирующего электронного микроскопа (SEM). Белыми стрелками обозначены фенестры LSEC (шкала, левая панель 5 мкм, правая панель 1 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Стоковое решение KRH (10x) | |
| Реагентов | Концентрация |
| НаКл | 1.15 млн |
| HEPES (свободная кислота) | 0.2 млн |
| ККл | 0.05 млн |
| KH2PO4 | 0.01 млн |
| Буфер A | |
| Реагентов | Концентрация |
| Раствор КРХ, PH=7,4 | в 1 раз |
| ЭГТА | 0,5 мМ |
| Отрегулируйте рН до 7,4, фильтруйте через фильтр 0,2 мкм перед использованием. | |
| Хранить при комнатной температуре до 6 месяцев. | |
| Буфер B | |
| Раствор КРХ, PH=7,4 | в 1 раз |
| КаКл2 | 1 мМ |
| Отрегулируйте рН до 7,4, фильтруйте через фильтр 0,2 мкм перед использованием. | |
| Хранить при комнатной температуре до 6 месяцев. | |
| Раствор коллагеназы | |
| Реагентов | Концентрация |
| Буфер B, PH=7.4 | 125 мл |
| Коллагеназа | 35–40 мг, добавьте BSA до 100 мг |
| Решение Перколла | |
| Реагентов | Концентрация |
| Перколл | 22.5 мл |
| ПБС (10x), PH=7.4 | 2,5 мл |
| Буфер изоаляции/окрашивания | |
| Реагентов | Концентрация |
| Буфер промывки MACS | 1250 мл |
| Акции BSA | 125 мл |
Таблица 1: Рецепт буферов. Таблица содержит состав буферов и растворов, используемых в данном исследовании.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В текущей рукописи мы описываем протокол изоляции LSEC из печени мыши, состоящий из двухступенчатой перфузии коллагеназы и последующей магнитно-активированной сортировки клеток (MACS). Этот протокол состоит из следующих трех этапов: (1) перфузия через PV с буфером без кальция с последующим буфером, содержащим коллагеназу, для достижения дисперсии клеток печени; 2) исключение гепатоцитов при низкоскоростном центрифугировании; и (3) положительный отбор ЛСЭС на основе MACS из непаренхимальных клеток (NPC) с использованием магнитных шариков против CD146. Вся процедура может быть завершена в течение 3 часов. Кроме того, стоимость этой процедуры, включая все расходные материалы, составляет около 150 долларов США за мышь, что говорит о том, что этот метод изоляции LSEC является в целом эффективным и экономичным. Мы также используем шаги (1) и (2) для выделения первичных гепатоцитов мыши, что выходит за рамки текущей рукописи.
Существует несколько критических этапов в портальной канюляции и перфузии печени: (i) Позиционирование катетера: кончик катетера должен быть размещен не менее чем на 3 мм дистально к ПВ-бифуркации взрослой мыши, которая обычно идентифицируется в хилуме печени. Глубокое размещение наконечника катетера в PV поставит под угрозу перфузию некоторых долей печени. Плохая перфузия доли проявляется отсутствием изменения цвета доли и может быть исправлена, если сразу заметить незначительное перепозиционирование катетера в дистальный PV. Этот маневр может оптимизировать перфузию долей. ii) Пузырьки воздуха: инфузионный путь между насосом и фотоэлектрическим элементом должен быть полностью свободен от пузырьков воздуха. Минутное попадание воздуха в PV может вызвать воздушную эмболию, что приводит к неполной перфузии печени. Чтобы устранить воздух в катетере после удаления внутренней иглы, буфер А вводится шприцем проксимально к пузырьку, чтобы вытеснить любой воздух перед подключением линии инфузии к катетеру. (iii) Прочность коллагеназы: Для поддержания активности коллагеназы во время перфузии важно обеспечить, чтобы буфер B, вводимый в PV, имел точную концентрацию коллагеназы и рН и поддерживался на уровне приблизительно 37 °C. Как показано на рисунке 1, индивидуальная камера используется для поддержания всей перфузионной системы в теплой и увлажненной атмосфере при температуре 37 °C; кроме того, снабжение кислородом поддерживается во время перфузии коллагеназы для достижения полного пищеварения. Альтернативный вариант включает водяную баню для предварительного нагрева раствора коллагеназы20 и открытую систему перфузии коллагеназы in situ, где раствор коллагеназы стекает из печени через разрезанный IVC21.
Хотя протокол использует относительно смелые катетеры (20 G) для обеспечения адекватного перфузионного потока, более тонкий катетер также будет хорошо работать, основываясь на предыдущих отчетах 22,23,24. Тем не менее, иногда трудно успешно канюлировать PV, особенно когда мыши используются для конкретных моделей заболеваний или если у них есть аномалии PV. Если фотоэлектрическая канюляция не удается, механическое и ферментативное переваривание печени с использованием набора ферментов и мягкого тканевого диссоциатора является альтернативным методом для этапов (1) и (2) получения непаренхимальной клеточной (NPC) суспензии. Мы подтвердили, что выход и жизнеспособность клеток при этом альтернативном методе диссоциации без перфузии печени были сопоставимы с исходным методом (данные не показаны). Портальная перфузия вен для пищеварения печени была использована другими и нами 13,16,20. Кроме того, этот метод позволяет избежать теоретического риска фенотипических или функциональных изменений, вызванных механической силой во время пищеварения печени. Поэтому использование метода на основе перфузии PV, описанного в этом протоколе, до сих пор настоятельно рекомендуется.
Здесь показан оптимальный выход и чистота LSEC при использовании текущего протокола. Мы получили примерно 2-5 х 106 клеток на мышь как от здоровых мышей, так и от мышей с диетическим НАСГ с использованием текущего протокола. Что касается чистоты, позитивность того же поверхностного маркера, используемого для иммуномагнитного разделения (CD146), поддерживает точность нашей техники изоляции. Кроме того, существует несколько хорошо известных поверхностных маркеров LSEC, таких как рецептор эндотелиальной гиалуроновой кислоты лимфатических сосудов 1 (LYVE-1), CD32b и стабилин-2. Вокруг этих маркеров все еще существуют противоречия; например, i) LYVE-1 присутствует также в лимфатических эндотелиальных клетках и ii) LSECs в перипортальной области не имеют экспрессии CD32b18. Таким образом, для изучения чистоты этих изолированных ЛСЭК с помощью проточной цитометрии стабилин-2 был использован в качестве установленного специфического маркера LSEC в дополнение к CD146. Используя эту методологию, мы подтвердили, что изолированные ЛСЭК обладают жизнеспособностью >94% и чистотой >90% (рисунок 2). LSEC-специфический фенотип изолированных клеток был дополнительно подтвержден с использованием SEM, где большинство клеток имеют фенестры (рисунок 3B), характерную морфологическую особенность LSECs.
Среди методологий выделения ЛСЭС выбор иммуномагнитных шариков является методом, наиболее используемым для выделения ЛСЭС из фракции NPC 24,25,26,27. Напротив, другие методы включают центробежное элютриацию и селективное адгезионное разделение 22,28,29. Было показано, что неиммуномагнитные методы обеспечивают высокий выход ЛСЭС (приблизительно 9 х 106 клеток на мышь)11. Следовательно, относительно более низкий выход изолированных ЛСЭС может быть ограничением текущего протокола. С другой стороны, неиммуномагнитные методы отбора требуют высокой технической экспертизы и иногда показывают противоречивые результаты по выходу и чистоте клеток11, в то время как метод, основанный на иммуномагнитном отборе, имеет преимущество последовательного выхода и чистоты по сравнению с другими существующими методами. Кроме того, для изоляции клеток на основе отбора иммуномагнитных шариков специфичность используемых маркеров клеточной поверхности всегда вызывает беспокойство. Например, CD31, который ранее использовался в качестве маркера для иммуномагнитного разделения LSEC, доминантно экспрессируется на PV эндотелии и капилляризированных LSECs3. Хотя cd146, как сообщается, экспрессируется также на естественных клетках-киллерах и печеночных звездчатых клетках 30,31, высокая чистота ЛСЭК, выделенных с использованием этого протокола, смягчает опасения относительно специфичности эндотелиального маркера CD146. Сравнение плюсов и минусов различных методологий изоляции LSEC обсуждается в другом месте 11,18,32. Сравнение выходов и чистоты клеток между другими методами и этим методом выходит за рамки настоящей рукописи и требует будущих исследований.
В заключение мы представляем первичный протокол изоляции LSEC мыши, основанный на одном из наиболее широко используемых и принятых подходов. Изолированные ЛСЭС обладают высокой чистотой и сохраненной функцией. Кроме того, этот протокол эффективен и применим к здоровой печени мыши, а также печени от различных моделей мышей. Высококачественные LSECs из этих мышей могут быть использованы для генерации мультиомичных наборов данных13,14. Таким образом, этот подход облегчает идентификацию молекулярных механизмов, регулирующих функцию LSEC, и улучшает наше понимание их роли в межклеточной коммуникации в печени в здоровье и болезни.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У всех авторов нет конфликтов для раскрытия.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным институтом диабета и заболеваний пищеварительной системы и почек NIH (1RO1DK122948 to SHI) и NIH Silvio O. Conte Digestive Diseases Research Core Centers P30 grant mechanism (DK084567). Поддержку КФ оказывали также зарубежные исследовательские стипендии Японского общества содействия развитию науки (JSPS). Мы также хотели бы поблагодарить доктора Грегори Горса и Стивена Бронка за их оригинальный дизайн и оптимизацию аппарата перфузии коллагеназы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.0-inch 20 G Intra Venous (IV) catheter | Terumo, SOmerset, NJ, USA | SR-OX2051CA | |
| 2–3-inch perfuion tray with a hole in the center | customized; made in house | ||
| 405/520 viability dye | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-205 | |
| 4-inch regular curved dressing forceps | Fisher Brand | FS16-100-110 | |
| 5-0 Perma-Hand silk suture | Ethicon, Raritan, NJ, USA | A182H | |
| Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluorà 488 | MBL International, Woburn, MA, USA | D317-A48 | |
| BSA stock | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
| Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-118-407 | |
| CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-007 | |
| Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-803 | |
| Collagen type I | Corning, Corning, NY, USA | 354236 | |
| Collagenase II | Gibco, Waltham, MA, USA | 17101-015 | |
| Endothelial cells growth medium | ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA | 211-500 | |
| FcR blocking reagent, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-575 | |
| FlowJo software, version 10.6 | Becton, Dickinson and Company | ||
| Hardened Fine scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14091-11 | |
| Heated (37 °C) and humidified recirculating perfusion apparatus equipped with Oxygen injection at a rate of 10psi. | customized; made in house | ||
| Hitachi S 4700 scanning electron microscope | Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA | SEM096 | |
| LS columns | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-401 | |
| MACS pre-separation filters (70 μm) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-095-823 | |
| MACS rinsing buffer | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
| MACS Smart Strainer (70 μm) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-098-462 | |
| MACSQunt flow cytometer | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | ||
| Millicell Cell Culture Insert | Millipore Sigma, Burlington, MA, USA | PITP01250 | |
| Nexcelom cell counter | Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, USA | Cellometer Auto T4 Plus | |
| Percoll | GE Healthcare, Chicago, IL, USA | 17-0891-01 | |
| Surgical scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14001-12 | |
| Very small curved dressing forceps | F.S.T, Foster city, CA, USA | 11063-07 |
References
- Morin, O., Goulet, F., Normand, C. Liver sinusoidal endothelial cells: isolation, purification, characterization and interaction with hepatocytes. Revisiones Sobre Biologia Celular: RBC. 15, 1-85 (1988).
- Ibrahim, S. H. Sinusoidal endotheliopathy in nonalcoholic steatohepatitis: therapeutic implications. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 321 (1), 67-74 (2021).
- Poisson, J., et al. Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases. Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).
- Marrone, G., Shah, V. H., Gracia-Sancho, J. Sinusoidal communication in liver fibrosis and regeneration. Journal of Hepatology. 65 (3), 608-617 (2016).
- Shetty, S., Lalor, P. F., Adams, D. H. Liver sinusoidal endothelial cells - gatekeepers of hepatic immunity. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 15 (9), 555-567 (2018).
- Smedsrød, B., Pertoft, H., Gustafson, S., Laurent, T. C. Scavenger functions of the liver endothelial cell. Biochemical Journal. 266 (2), 313-327 (1990).
- DeLeve, L. D. Liver sinusoidal endothelial cells in hepatic fibrosis. Hepatology. 61 (5), 1740-1746 (2015).
- Dar, W. A., Sullivan, E., Bynon, J. S., Eltzschig, H., Ju, C. Ischaemia reperfusion injury in liver transplantation: Cellular and molecular mechanisms. Liver International. 39 (5), 788-801 (2019).
- Furuta, K., Guo, Q., Hirsova, P., Ibrahim, S. H. Emerging Roles of Liver Sinusoidal Endothelial Cells in Nonalcoholic Steatohepatitis. Biology. 9 (11), Basel. 395 (2020).
- Wu, L. Q., et al. Phenotypic and functional differences between human liver cancer endothelial cells and liver sinusoidal endothelial cells. Journal of Vascular Research. 45 (1), 78-86 (2008).
- Meyer, J., Gonelle-Gispert, C., Morel, P., Bühler, L. Methods for isolation and purification of murine liver sinusoidal endothelial cells: A systematic review. PLoS One. 11 (3), 0151945 (2016).
- Meyer, J., Lacotte, S., Morel, P., Gonelle-Gispert, C., Buhler, L. An optimized method for mouse liver sinusoidal endothelial cell isolation. Experimental Cell Research. 349 (2), 291-301 (2016).
- Furuta, K., et al. Lipid-induced endothelial vascular cell adhesion molecule 1 promotes nonalcoholic steatohepatitis pathogenesis. Journal of Clinical Investigation. 131 (6), (2021).
- Guo, Q., et al. Integrin β(1)-enriched extracellular vesicles mediate monocyte adhesion and promote liver inflammation in murine NASH. Journal of Hepatology. 71 (1), 1193-1205 (2019).
- Hirsova, P., Ibrahim, S. H., Bronk, S. F., Yagita, H., Gores, G. J. Vismodegib suppresses TRAIL-mediated liver injury in a mouse model of nonalcoholic steatohepatitis. PLoS One. 8 (7), 70599 (2013).
- Schrage, A., et al. Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1. Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).
- Olsavszky, V., et al. Exploring the transcriptomic network of multi-ligand scavenger receptor Stabilin-1- and Stabilin-2-deficient liver sinusoidal endothelial cells. Gene. 768, 145284 (2021).
- DeLeve, L. D., Maretti-Mira, A. C. Liver sinusoidal endothelial cell: An update. Seminars in Liver Disease. 37 (4), 377-387 (2017).
- DeLeve, L. D., Wang, X., Hu, L., McCuskey, M. K., McCuskey, R. S. Rat liver sinusoidal endothelial cell phenotype is maintained by paracrine and autocrine regulation. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 287 (4), 757-763 (2004).
- Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
- Ishiguro, K., Yan, I. K., Patel, T. Isolation of tissue extracellular vesicles from the liver. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e58649 (2019).
- Topp, S. A., Upadhya, G. A., Strasberg, S. M. Cold preservation of isolated sinusoidal endothelial cells in MMP 9 knockout mice: effect on morphology and platelet adhesion. Liver Transplantation. 10 (8), 1041-1048 (2004).
- Katz, S. C., Pillarisetty, V. G., Bleier, J. I., Shah, A. B., DeMatteo, R. P. Liver sinusoidal endothelial cells are insufficient to activate T cells. Journal of Immunology. 173 (1), 230-235 (2004).
- Liu, W., et al. Sample preparation method for isolation of single-cell types from mouse liver for proteomic studies. Proteomics. 11 (17), 3556-3564 (2011).
- Do, H., Healey, J. F., Waller, E. K., Lollar, P. Expression of factor VIII by murine liver sinusoidal endothelial cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (28), 19587-19592 (1999).
- Schrage, A., et al. Enhanced T cell transmigration across the murine liver sinusoidal endothelium is mediated by transcytosis and surface presentation of chemokines. Hepatology. 48 (4), 1262-1272 (2008).
- Chou, C. H., et al. Lysophosphatidic acid alters the expression profiles of angiogenic factors, cytokines, and chemokines in mouse liver sinusoidal endothelial cells. PLoS One. 10 (3), 0122060 (2015).
- Deleve, L. D. Dacarbazine toxicity in murine liver cells: a model of hepatic endothelial injury and glutathione defense. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 268 (3), 1261-1270 (1994).
- Smedsrød, B., Pertoft, H., Eggertsen, G., Sundström, C. Functional and morphological characterization of cultures of Kupffer cells and liver endothelial cells prepared by means of density separation in Percoll, and selective substrate adherence. Cell and Tissue Research. 241 (3), 639-649 (1985).
- Despoix, N., et al. Mouse CD146/MCAM is a marker of natural killer cell maturation. European Journal of Immunology. 38 (10), 2855-2864 (2008).
- Strauss, O., Phillips, A., Ruggiero, K., Bartlett, A., Dunbar, P. R. Immunofluorescence identifies distinct subsets of endothelial cells in the human liver. Scientific Reports. 7, 44356 (2017).
- Halpern, K. B., et al. Paired-cell sequencing enables spatial gene expression mapping of liver endothelial cells. Nature Biotechnology. 36 (10), 962-970 (2018).
