Summary
Her skisserer og demonstrerer vi en protokoll for primær muslever sinusformet endotelcelle (LSEC) isolasjon. Protokollen er basert på lever kollagenalisere perfusjon, nonparenchymal celle rensing ved lavhastighets sentrifugering, og CD146 magnetisk perle utvalg. Vi fenotype og karakteriserer også disse isolerte LSECene ved hjelp av strømningscytometri og skanning av elektronmikroskopi.
Abstract
Lever sinusformede endotelceller (LSECs) er spesialiserte endotelceller som ligger i grensesnittet mellom sirkulasjonen og leverparenchyma. LSECs har en distinkt morfologi preget av tilstedeværelsen av fenestrae og fravær av kjellermembran. LSECer spiller viktige roller i mange patologiske lidelser i leveren, inkludert metabolsk dysregulering, betennelse, fibrose, angiogenese og karsinogenese. Det er imidlertid lite publisert om isolasjon og karakterisering av LSECene. Her diskuterer denne protokollen isolering av LSEC fra både sunne og ikke-alkoholholdige fettleversykdom (NAFLD) mus. Protokollen er basert på kollagenalisperfusjon av muselever og magnetiske perler positivt utvalg av ikke-fettceller for å rense LSECer. Denne studien karakteriserer LSEC ved hjelp av spesifikke markører ved strømningscytometri og identifiserer de karakteristiske fenotypiske egenskapene ved å skanne elektronmikroskopi. LSECer isolert etter denne protokollen kan brukes til funksjonelle studier, inkludert vedheft og permeabilitetsanalyser, samt nedstrømsstudier for en bestemt interessevei. I tillegg kan disse LSECene samles eller brukes individuelt, slik at multi-omics datagenerering inkludert RNA-seq bulk eller enkeltcelle, proteomisk eller fosfor-proteomikk, og Analyse for Transposase-Accessible Chromatin ved hjelp av sekvensering (ATAC-seq), blant andre. Denne protokollen vil være nyttig for etterforskere som studerer LSECs kommunikasjon med andre leverceller i helse og sykdom og tillater en grundig forståelse av LSECs rolle i de patogene mekanismene for akutt og kronisk leverskade.
Introduction
Lever sinusformede endotelceller (LSECs) linje leveren sinusoid vegger og er de mest tallrike nonparenchymale cellene i leveren1. LSEC skiller seg fra andre kapillære endotelceller andre steder i kroppen ved tilstedeværelse av fenestrae og mangel på en klassisk kjellermembran eller en membran 2,3. Derfor har LSECene særegne fenotypiske og strukturelle egenskaper som forbedrer deres permeabilitet og endokytiske kapasitet for å eliminere en rekke sirkulerende makromolekyler, inkludert lipider og lipoproteiner. LSECer spiller en sentral rolle i krysstale mellom parenchymale og nonparenchymale celler, for eksempel stellate celler og immunceller. LSECer er nøkkelen til å opprettholde lever homeostase ved å holde stellate celler og Kupffer celler i en passiv status4. LSECer modulerer sammensetningen av leverimmuncellepopulasjoner ved å formidle vedheft og trans-endotelial migrasjon av sirkulerende leukocytter 5,6. Under akutt og kronisk leverskade7, inkludert iskemi-reperfusjonsskade (IRI)8, nonalcoholic steatohepatitis (NASH)9, og hepatocellulært karsinom (HCC), gjennomgår LSEC fenotypiske endringer kjent som kapillarisering preget av defenestrasjon og dannelse av kjellermembran10. Disse fenotypiske endringene i LSECs er forbundet med LSECs dysfunksjon og oppkjøpet av protrombotiske, proinflammatoriske og profibrogene egenskaper.
Flere metoder for isolering av LSEC fra muselever er utviklet11. Noen teknikker er avhengige av å skille ikke-parenchymale og parenchymale celler etterfulgt av tetthet gradient sentrifugering for å rense LSECene fra ikke-parenchymale brøker. Begrensningen av denne metoden er tilstedeværelsen av forurensende makrofager i de siste trinnene i LSECs isolasjon, noe som kan påvirke renheten til de isolerte LSECene12. Denne protokollen er basert på kollagenalisperfusjon av muselever og CD146+ magnetiske perler positivt utvalg av ikke-parenchymale celler for å rense LSECer. LSECer isolert ved hjelp av denne metoden viser høy renhet og bevart morfologi og levedyktighet. Disse LSECene er optimale for funksjonelle studier, inkludert permeabilitet og adhesjonsanalyse, samt nedstrømsstudier for interesseveier. Videre, med den økende interessen for å generere stordatasett i både klinisk forskning og oppdagelsesvitenskap, kan disse høykvalitets LSECene isolert fra både sunne og sykelever med ikke-alkoholholdig steatohepatitt (NASH) eller andre forhold samles eller brukes individuelt, slik at multi-omics datagenerering og sammenligning mellom helse og sykdom13,14 . I tillegg kan de isolerte LSECene brukes til å utvikle todimensjonale så vel som tredimensjonale in vitro-modeller som organoider for å dechiffrere den aktiverte signalveien i LSECs og deres intercellulære kommunikasjon med andre leverceller under forskjellige skadelige stimuli og som svar på ulike terapeutiske inngrep.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreprotokoller ble utført som godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Mayo Clinic. Åtte uker gamle C57BL/6J hannmus ble kjøpt fra Jackson Laboratory. Mus ble plassert i et temperaturkontrollert 12:12-timers lys-mørk syklusanlegg med fri tilgang til kosthold.
1. Tilberedning av kollagenbelagt kulturrett eller tallerken
- For å lage 50 ml 0,02 mol/l eddiksyre, tilsett 0,6 ml issyre til 49,4 ml H2O.
- Lag 50 μg/ml kollagen type I i 0,02 mol/l eddiksyre. Fortynning avhenger av konsentrasjonen av tomten.
- Frakk 10 cm kulturretter med 3 ml kollagenoppløsning. Inkuber ved romtemperatur (RT) i 1 time.
MERK: Ved bruk av en annen tallerken eller tallerken for kultur, må volumet av beleggløsning justeres basert på kulturområde, bruk vanligvis 6-10 μg / cm2. - Fjern overflødig væske fra den belagte overflaten, og vask med fosfatbufret saltvann (PBS) 3 ganger. La oppvasken lufttørke.
- Hvis kollagenoppløsningen ikke er steril, steriliser kollagenbelagte retter ved eksponering for ultrafiolett (UV) lys i 10 minutter i en steril vevskulturhette.
2. Oppsett av utstyr
- Sett opp det oppvarmede og fuktede resirkuleringsapparatet som vist på figur 1B.
- Skyll perfusjonssystemet med 10% blekemiddel i 5 minutter etterfulgt av sterilt vann i ytterligere 10 minutter.
- Tøm skyllevæsken så mye som mulig før du forfører kollagenoppløsningen.
- Tilsett kollagenoppløsning gjennom perfusjonssystemet (som vist i figur 1B) for å prewarm det ved 37 °C. Still inn pumpehastigheten med hastighet 1 som vist på hastighetskontrollhjulet (lik 40 ml/min).
- Hold denne hastigheten den samme gjennom hele prosedyren. Gjenbruk kollagenoppløsningen i en lukket krets på dagen for LSEC-isolasjonen.
MERK: Pumpehastigheten er festet til 1 for å unngå mekanisk trykk som kan gjennomsyre LSECs biologiske tilstand.
3. Kirurgisk prosedyre
- Vei musen.
- Injiser 90 mg/kg kroppsvekt av ketamin og 10 mg/kg kroppsvekt av xylazin intraperitonealt (IP).
- Når musen er ikke-aktiv til smertefulle stimuli, fest musen til den kirurgiske overflaten, som vist i figur 1B.
- Spray musens underliv med 70% etanol. Bruk kirurgisk saks, gjør et snitt på ~ 5 cm lang fra underdelen av magen opp til xiphoid-prosessen.
- Deretter gjør du to laterale kutt ved hjelp av liten irissaks på hver side av magen for å eksponere bukorganene fullt ut.
- Plasser hylsen på det intravenøse (IV) kateteret under dyrets rygg for å løfte og jevne magen.
- Bruk en vanlig buet dressing tang, trekk tarmene og magen forsiktig til venstre for dyret.
- Plasser en 5-0 kirurgisk sutur under den dårligere vena cava (IVC) like under den eksponerte venstre nyre. Bind en løs tilhengerfeste i suturen.
- Plasser en annen 5-0 kirurgisk sutur rundt leverportalvenen (PV) like over den spleniske venegreningspunktet av leveren PV. Bind en løs tilhengerfeste i suturen.
- Bruk PV-suturen som spenning, sett inn 20 G IV-kateteret i leveren PV 1 cm under der den forgrener seg til høyre og venstre lever PV.
- Skyv kateteret opp venen, men hold det under forgreningsområdet. La blodet bevege seg nedover kateteret til det begynner å dryppe ut.
- Med noe av buffer A (tabell 1) i en intravenøs (IV) flaske plassert over operasjonsområdet, bruk en IV-linje og fest den til kateteret. Skyll leveren med denne løsningen samtidig som du unngår luftinngang i systemet.
- Bind av suturen rundt den dårligere vena cava under nyrene. Dette vil tillate leveren å retro perfuse.
- Klipp IVC under suturen slik at dyret kan blø ut.
MERK: Dette trinnet må utføres raskt for å unngå overbelastning av leveren. - Fest IV-kateteret med PV-suturen.
- Når parfyme, kutt bort mage, tarm, milt og andre innvoller festet til leveren.
- Klipp bort membranen og de store karene fra thoraxhulen. Fjern leveren fra dyret og legg den på perfusjonsbrettet.
- Fjern IV-linjen forsiktig og koble til kollagenoppløsningen i resirkuleringskammeret.
MERK: Trinn 3.16-3.18 må gjøres innen 5 min, slik at leveren ikke blir perfundert for lenge med buffer A. Vær veldig forsiktig så du ikke slipper luftbobler inn i leveren. - La leveren parfymere til kapselen blir flettet og virker grøtaktig (10-15 min eller mer, perioden varierer avhengig av de forskjellige mange kollagenene).
- Mens leveren er i perfusjon, må du sørge for at dyret er avdød før du kaster det i en nekropsipose.
- Når den er fordøyd, fjern leveren fra kammeret og legg den i en 10 cm Petri-tallerken med ca. 20 ml serumfri Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM).
- Plukk forsiktig fra hverandre leveren med et par pipettespisser og kast det biliære treet.
- Filtrer leverens suspensjon gjennom en 70 μm cellesil i et 50 ml konisk rør.
- Sentrifuger cellesuspensjonen ved 50 x g i 2 minutter ved RT. Samle supernatanten som inneholder ikke-parenchymale leverceller.
MERK: Hepatocytter utfelles i pelletsen, som kan renses ytterligere ved hjelp av gradient sentrifugering som tidligere beskrevet15.
4. Separasjon av ikke-parenchymale leverceller og LSECs rensing
MERK: Rens CD146+ LSECene ved hjelp av immunomgnetiske perler, i følge produsentens anvisninger.
- Sentrifuger supernatanten ved 300 x g i 5 min ved 4 °C.
- Samle cellepellet og resuspend i 1 ml isolasjonsbuffer (tabell 1), bestem cellenummeret ved hjelp av en automatisk celleteller etter produsentens instruksjoner.
- Sentrifuger cellefjæringen ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C, aspirer supernatanten fullstendig.
- Resuspend pellet med 90 μL isolasjonsbuffer per 107 totale celler.
- Tilsett 10 μL cd146 magnetiske perler per 107 totale celler. Bland godt og inkuber i 15 min ved 4 °C.
- For å vaske cellene, tilsett 1-2 ml isolasjonsbuffer per 107 celler, sentrifuge ved 300 x g i 10 minutter, og aspirer deretter supernatanten helt.
- Resuspend opptil 109 celler i 500 μL isolasjonsbuffer (tabell 1).
MERK: For høyere cellenumre skalerer du opp buffervolumet tilsvarende. - Forbered separasjonskolonnen, skyll den med 3 ml isolasjonsbuffer.
- Bruk celleopphenget på kolonnen stablet med 70 μm forhåndsseparasjonsfiltre.
- Vask kolonnen med 3 ml isolasjonsbuffer 3 ganger.
MERK: Ved vasking av søylen skal isolasjonsbufferen tilsetts så snart søylebeholderen er tom. - Fjern kolonnen fra separatoren og legg den på et 15 ml sentrifugerør. Pipette 5 ml isolasjonsbuffer på kolonnen.
- For å gjenopprette de magnetiske perlene merket celler, skyv stempelet fast inn i kolonnen for å skylle ut cellene.
- Sentrifuge ved 300 x g i 5 min ved 4 °C. LSEC er klare for mikroskopisk undersøkelse og nedstrømsanalyse.
5. LSECs immunofenotyping og renhetsvurdering ved strømningscytometri
- Finn cellenumrene til isolerte LSECer ved hjelp av en automatisk celleteller i henhold til produsentens instruksjoner.
- Sentrifuger cellene på 300 x g i 5 minutter, aspirer supernatanten helt.
- Ta 1 x 106 celler/rør og resuspend med 90 μL fargebuffer (tabell 1).
- Tilsett 10 μL/rør med mus FcR blokk og 1 μL levedyktighet fargestoff, inkuber ved 4 °C i 10 min.
- Flekk cellene med en kombinasjon av CD45, CD146 og stabilin-2 antistoffer fortynnet ved 1:50 med fargebuffer. Inkuber ved 4 °C i 20 minutter.
- Vask cellene med 5 ml fargebuffer og sentrifuge ved 300 x g i 10 minutter, og aspirer deretter supernatanten helt.
- Resuspend cellene med 300 μL farging buffer og løpe gjennom strømning cytometeret.
6. LSECs kultur og eksamen
- Frø 1 x 106 celler / brønn i en 6-brønns plate og kultur det med endotelceller vekstmedium bestående av 5% foster bovint serum (FBS), 1% endotelceller veksttilskudd, og 1% primocin løsning.
- Undersøk de isolerte LSECene ved lett mikroskopi. Skaff deg bilder med lyse felt med en forstørrelse på 10x.
7. LSECs morfologi og fenestrae undersøkelse ved skanning elektronmikroskopi
- Forbelegg cellekulturinnsatsene (3 μm porestørrelse) med kollagenoppløsning.
- Kulturisolerte LSECer (120.000 celler) på innsatsen med endotelceller vekstmedium i en 24-brønns plate ved 37 °C varm og fuktet atmosfære. La cellene slå seg ned og holde seg i 2 timer.
- For cellefiksering, legg til et tilsvarende volum av forhåndsvarslet ved 37 °C Trumps fiksering til cellekulturmediene.
- Etter inkubasjon i 10 minutter, erstatt 50% fortynnet Trumps fiksering med ufortynnet Trumps fiksering.
- Fest cellene i Trump fixative i 2 timer, og inkuber deretter i 1 time i 1% osmium tetroxides.
- Fortsett med prøvedehydrering, tørking i en kritisk tørkeenhet, montering, sputterbelegg og undersøkelse ved hjelp av et skanningselektronmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eksperimentelle skjemaer og utstyr satt opp:
I denne protokollen ble muselever fordøyd ved hjelp av en lukket perfusjonskrets, da ble ikke-fettceller og hepatocytter skilt av lavhastighets sentrifugering ved 50 x g i 2 minutter. Primære LSECer ble isolert ved hjelp av CD146 magnetiske perler utvalg fra den nonparenchymal brøkdel. De eksperimentelle skjemaene vises i figur 1A. Kanylen ble plassert gjennom PV mens den dårligere vena cava var bundet opp for å sikre enveis perfusjon av kollagenal gjennom leveren (figur 1B). Det interne perfusjonskammeret er utstyrt med et varme- og fuktingssystem for å sikre en 37-40 °C varm og fuktet apparatluft. Den perfused kollagennasen sirkulerer gjennom et lukket system og kan gjenbrukes for to eller tre mus i løpet av isolasjonsdagen for å gjøre isolasjonen mer kostnadseffektiv.
Vurdering av isolerte LSECs renhets- og overflatemarkører ved strømningscytometri:
Renheten til de isolerte LSECene ble vurdert ved å bruke godt karakteriserte spesifikke LSEC-overflatemarkører CD146 og stabilin-2 16,17,18. Fargede celler ble analysert på et strømningscytometer; data ble analysert ved hjelp av FlowJo-programvare.
LSEC-populasjonen ble inngjerdet (figur 2A) og analysert singlets for følgende gatingstrategi; levedyktige celler ble definert ved hjelp av farging av levedyktighetsfarge før merking av celler med bestemte markører (figur 2B). Da ble CD45-populasjonen inngjerdet for å utelukke forurensning av immunceller. De isolerte LSECene nådde 94,8 % levedyktighet (figur 2C). Prosentandelen av CD45-celler var 89,7 % (figur 2D), og 92,3 % av cellene var CD146 og stabilin-2 dobbeltpositive (CD45-CD146+stabilin-2+) LSECer (figur 2E).
Morfologi av de isolerte LSECene:
De isolerte LSECene ble sådd i en 6-brønnsplate ved 1 x 106 celler/brønn, dyrket i et komplett vekstmedium og undersøkt ved lett mikroskopi etter 6 timers kultur (figur 3A). LSECer ble belagt på en 3 μm pore-størrelse kulturinnsats for å visualisere LSECs fenestrae ved å skanne elektronmikroskop (SEM). Etter fiksering og behandling ble fenestraen identifisert, som vist i figur 3B. Som tidligere rapportert, mister LSECs sin fenestrae i kultur over natten19; Derfor anbefales det å behandle cellene så snart som mulig etter isolasjonen for nedstrømsstudier for å unngå dedifferentiation in vitro.
Figur 1: Eksperimentelle skjemaer og oppsett av utstyr. (A) Eksperimentelle skjemaer ble designet ved hjelp av Bio render. (B) Utstyrsoppsett og -prosess. Leveren ble høstet og perfundert i et lukket kollagenalisseperfusjonsapparat. Leveren ble deretter overført til en tallerken og dissosiert. Leverens suspensjon ble samlet inn. Den nonparenchymale cellefraksjonen ble skilt av sentrifugering ved 50 x g i 2 min. LSEC ble renset ved hjelp av magnetiske perler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Vurdering av isolerte LSECs renhets- og overflatemarkører etter strømningscytometri. Dataanalyse og gating strategi som vist, (A) gated LSECs og (B) singlets basert på forward scatter (FSC)/side scatter (SSC). Isolerte LSECer ble farget med et levedyktig fargestoff og en kombinasjon av CD45, CD146 og stabilin-2 antistoffer. Singlets ble inngjerdet og analysert, (C) levedyktige LSECer ble inngjerdet på (D) CD45 populasjon og analysert for (E) CD146 og stabilin-2 uttrykk. Alle porter ble bestemt av fluorescens minus en (FMO). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Morfologi av isolerte LSECer. (A) Lysfeltbilde av kultiverte LSECer. Isolerte LSECer ble dyrket i hele vekstmediet i 6 timer og undersøkt av lett mikroskopi (Skala bar 100 μm). (B) LSEC ble undersøkt ved skanning av elektronmikroskop (SEM). Hvite piler indikerer LSEC fenestrae (Skalalinje, venstre panel 5 μm, høyre panel 1 μm). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| KRH lagerløsning (10x) | |
| Reagenser | Konsentrasjon |
| NaCl | 1,15 M |
| HEPES (fri syre) | 0,2 M |
| KCl | 0,05 M |
| KH2Po4 | 0,01 M |
| Buffer A | |
| Reagenser | Konsentrasjon |
| KRH-løsning, PH=7,4 | 1x |
| EGTA | 0,5 mM |
| Juster PH til 7,4, filtrer gjennom et 0,2 μm filter før bruk. | |
| Oppbevares ved romtemperatur i opptil 6 måneder. | |
| Buffer B | |
| KRH-løsning, PH=7,4 | 1x |
| CaCl2 | 1 mM |
| Juster PH til 7,4, filtrer gjennom et 0,2 μm filter før bruk. | |
| Oppbevares ved romtemperatur i opptil 6 måneder. | |
| Collagenase-løsning | |
| Reagenser | Konsentrasjon |
| Buffer B, PH=7,4 | 125 ml |
| Kollagenaliser | 35–40 mg, tilsett BSA opptil 100 mg |
| Percoll-løsning | |
| Reagenser | Konsentrasjon |
| Percoll | 22,5 ml |
| PBS (10x), PH=7,4 | 2,5 ml |
| Isoaliserings-/fargebuffer | |
| Reagenser | Konsentrasjon |
| MACS-skyllebuffer | 1250 ml |
| BSA-lager | 125 ml |
Tabell 1: Oppskrift på buffere. Tabellen består av sammensetningen av bufferne og løsningene som brukes i denne studien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I det nåværende manuskriptet beskriver vi en protokoll for LSEC-isolasjon fra muselever som består av totrinns kollagenalisseperfusjon og påfølgende magnetisk aktivert cellesortering (MACS). Denne protokollen består av følgende tre trinn: (1) Perfusjon gjennom PV med en kalsiumfri buffer etterfulgt av en kollagenholdig buffer for å oppnå levercelledispersjon; (2) Utelukkelse av hepatocytter med lavhastighets sentrifugering; og (3) MACS-baserte positive utvalg av LSECer fra ikke-fettceller (NPCer) ved hjelp av anti-CD146 magnetiske perler. Hele prosedyren kan fullføres innen 3 timer. Videre er kostnaden for denne prosedyren, inkludert alle forbruksvarer, rundt 150 USD per mus, noe som tyder på at denne metoden for LSEC-isolasjon er generelt effektiv og kostnadseffektiv. Vi bruker trinn (1) og (2) for isolering av primære musehpopatocytter også, som er utenfor omfanget av det nåværende manuskriptet.
Det er noen få kritiske trinn i portalkannasjon og leverperfusjon: (i) Kateters posisjonering: Kateterspissen skal plasseres ikke mindre enn 3 mm distal til PV-bifurkasjonen av en voksen mus, som vanligvis identifiseres i leverens hilum. Dyp plassering av kateterspissen i PV vil kompromittere perfusjonen av noen lober i leveren. Dårlig perfusjon av en lobe manifesterer seg som fravær av en fargeendring av loben og kan rettes opp hvis det blir lagt merke til umiddelbart ved en liten omplassering av kateteret til distal PV. Denne manøveren kan muligens optimalisere lobe perfusjon. (ii) Luftbobler: Infusjonsruten mellom pumpen og PV skal holdes helt fri for luftbobler. Minuttluftinngang i PV kan forårsake luftemboli, noe som resulterer i ufullstendig leverperfusjon. For å eliminere luft i kateteret etter at du har fjernet den indre kanylen, injiseres buffer A med en sprøyte proksimal til boblen for å utvise luft før du kobler infusjonslinjen til kateteret. (iii) Kollagennasstyrke: For å opprettholde kollagenalens aktivitet under perfusjonen, er det viktig å sikre at buffer B infundert i PV har den nøyaktige konsentrasjonen av kollagen og pH og holdes ved ca. 37 °C. Som vist i figur 1, brukes et tilpasset kammer for å holde hele perfusjonssystemet i en 37 ° C varm og fuktet atmosfære; I tillegg opprettholdes oksygentilførselen under kollagenalsperfusjon for å oppnå fullstendig fordøyelse. Et alternativt alternativ inkluderer et vannbad for å forvarme kollagenalinsløsningen20, og et åpent kollagenalisseperfusjonssystem in situ der kollagenoppløsningen drenerer ut av leveren gjennom kuttet IVC21.
Selv om protokollen bruker relativt dristige katetre (20 G) for å sikre en tilstrekkelig perfusjonsstrøm, vil et tynnere kateter også fungere godt basert på tidligere rapporter 22,23,24. Det er imidlertid noen ganger vanskelig å lykkes med å kanylere PV spesielt når mus brukes til spesifikke sykdomsmodeller eller hvis de har PV-anomalier. Hvis PV cannulation svikter, mekanisk og enzymatisk lever fordøyelse ved hjelp av et enzymsett og mild vev dissociator er en alternativ metode for trinn (1) og (2) for å oppnå nonparenchymal celle (NPC) suspensjon. Vi har bekreftet at celleutbyttet og levedyktigheten i denne alternative metoden for dissosiasjon uten leverperfusjon var sammenlignbar med den opprinnelige metoden (data ikke vist). Portal vene perfusjon for lever fordøyelse har vært ansatt av andre og oss 13,16,20. Videre unngår denne metoden den teoretiske risikoen for LSECs fenotypiske eller funksjonelle endringer indusert av mekanisk kraft under lever fordøyelsen. Derfor er bruken av den PV-perfusjonsbaserte metoden som er avbildet i denne protokollen så langt sterkt anbefalt.
Her vises den optimale LSEC-avkastningen og renheten når du bruker den gjeldende protokollen. Vi fikk omtrent 2-5 x 106 celler per mus fra både sunne mus og mus med diettindusert NASH ved hjelp av den nåværende protokollen. Når det gjelder renhet, støtter positiviteten til den samme overflatemarkøren som brukes til immunomagnetisk separasjon (CD146) nøyaktigheten av isolasjonsteknikken vår. I tillegg er det flere anerkjente LSEC-overflatemarkører, for eksempel lymfatiske kar endotelial hyaluronsyrereseptor 1 (LYVE-1), CD32b og stabilin-2. Kontroverser eksisterer fortsatt rundt disse markørene; for eksempel er i) LYVE-1 til stede også i lymfatiske endotelceller, og ii) LSECer i et periportalområde mangler CD32b-uttrykk18. For å undersøke renheten til disse isolerte LSECene med strømningscytometri ble stabilin-2 derfor brukt som en etablert spesifikk LSEC-markør i tillegg til CD146. Ved hjelp av denne metodikken bekreftet vi at de isolerte LSECene hadde >94 % levedyktighet og >90 % renhet (figur 2). Den LSEC-spesifikke fenotypen til de isolerte cellene ble ytterligere bekreftet ved hjelp av SEM, hvor de fleste cellene har fenestrae (figur 3B), det karakteristiske morfologiske trekk ved LSECer.
Blant LSECs isolasjonsmetoder er immunomagnetisk perlevalg teknikken som brukes mest for å isolere LSECene fra NPC-fraksjonen 24,25,26,27. Andre metoder inkluderer derimot sentrifugal elutriasjon og selektiv adhesjonsbasert separasjon 22,28,29. De ikke-immunomagnetiske metodene har vist seg å gi høye utbytter av LSECer (ca. 9 x 106 celler per mus)11. Derfor kan et relativt lavere utbytte av isolerte LSECer være en begrensning i den nåværende protokollen. På den annen side krever de ikke-immunmegnetiske seleksjonsbaserte metodene høy teknisk ekspertise og viser noen ganger inkonsekvente resultater på celleutbytte og renhet11, mens den immunomagnetiske seleksjonsbaserte metoden har fordelen av konsistent utbytte og renhet over andre eksisterende metoder. Videre, for immunomagnetiske perler utvalgsbasert celleisolasjon, er spesifisiteten til celleoverflatemarkører som brukes alltid et spørsmål om bekymring. For eksempel er CD31, som tidligere har blitt brukt som markør for immunomagnetisk LSEC-separasjon, dominerende uttrykt på PV-endotelet og kapillære LSECer3. Selv om CD146 har blitt rapportert å være uttrykt også på naturlige killer celler og lever stellate celler 30,31,den høye renheten av LSECs isolert ved hjelp av denne protokollen reduserer bekymringer angående spesifisiteten av endotelmarkøren CD146. Sammenligning av fordeler og ulemper ved ulike metoder for LSEC-isolasjon diskuteres andre steder 11,18,32. Sammenligning av celleutbytter og renhet mellom andre metoder og denne metoden er utenfor omfanget av det nåværende manuskriptet og garanterer fremtidige undersøkelser.
Til slutt presenterer vi en primærmus LSEC-isolasjonsprotokoll basert på en av de mest brukte og aksepterte tilnærmingene. Isolerte LSECer viser høy renhet og bevart funksjon. Videre er denne protokollen effektiv og gjelder for den sunne muselever samt leveren fra forskjellige sykdomsmusmodeller. LSECer av høy kvalitet fra disse musene kan brukes til multiomics datasett generasjon13,14. Dermed letter denne tilnærmingen identifisering av molekylære mekanismer som regulerer LSEC-funksjonen og forbedrer vår forståelse av deres roller i intercellulær kommunikasjon i leveren i helse og sykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere har ingen konflikter å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases of the NIH (1RO1DK122948 to SHI) og NIH Silvio O. Conte Digestive Diseases Research Core Centers P30 grant mechanism (DK084567). Støtte ble også gitt til KF av Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Overseas Research Fellowships. Vi vil også gjerne anerkjenne Dr. Gregory J. Gores og Steven Bronk for deres opprinnelige design og optimalisering av kollagenalseperfusjonsapparatet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.0-inch 20 G Intra Venous (IV) catheter | Terumo, SOmerset, NJ, USA | SR-OX2051CA | |
| 2–3-inch perfuion tray with a hole in the center | customized; made in house | ||
| 405/520 viability dye | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-205 | |
| 4-inch regular curved dressing forceps | Fisher Brand | FS16-100-110 | |
| 5-0 Perma-Hand silk suture | Ethicon, Raritan, NJ, USA | A182H | |
| Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluorà 488 | MBL International, Woburn, MA, USA | D317-A48 | |
| BSA stock | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
| Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-118-407 | |
| CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-007 | |
| Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-803 | |
| Collagen type I | Corning, Corning, NY, USA | 354236 | |
| Collagenase II | Gibco, Waltham, MA, USA | 17101-015 | |
| Endothelial cells growth medium | ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA | 211-500 | |
| FcR blocking reagent, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-575 | |
| FlowJo software, version 10.6 | Becton, Dickinson and Company | ||
| Hardened Fine scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14091-11 | |
| Heated (37 °C) and humidified recirculating perfusion apparatus equipped with Oxygen injection at a rate of 10psi. | customized; made in house | ||
| Hitachi S 4700 scanning electron microscope | Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA | SEM096 | |
| LS columns | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-401 | |
| MACS pre-separation filters (70 μm) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-095-823 | |
| MACS rinsing buffer | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
| MACS Smart Strainer (70 μm) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-098-462 | |
| MACSQunt flow cytometer | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | ||
| Millicell Cell Culture Insert | Millipore Sigma, Burlington, MA, USA | PITP01250 | |
| Nexcelom cell counter | Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, USA | Cellometer Auto T4 Plus | |
| Percoll | GE Healthcare, Chicago, IL, USA | 17-0891-01 | |
| Surgical scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14001-12 | |
| Very small curved dressing forceps | F.S.T, Foster city, CA, USA | 11063-07 |
References
- Morin, O., Goulet, F., Normand, C. Liver sinusoidal endothelial cells: isolation, purification, characterization and interaction with hepatocytes. Revisiones Sobre Biologia Celular: RBC. 15, 1-85 (1988).
- Ibrahim, S. H. Sinusoidal endotheliopathy in nonalcoholic steatohepatitis: therapeutic implications. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 321 (1), 67-74 (2021).
- Poisson, J., et al. Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases. Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).
- Marrone, G., Shah, V. H., Gracia-Sancho, J. Sinusoidal communication in liver fibrosis and regeneration. Journal of Hepatology. 65 (3), 608-617 (2016).
- Shetty, S., Lalor, P. F., Adams, D. H. Liver sinusoidal endothelial cells - gatekeepers of hepatic immunity. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 15 (9), 555-567 (2018).
- Smedsrød, B., Pertoft, H., Gustafson, S., Laurent, T. C. Scavenger functions of the liver endothelial cell. Biochemical Journal. 266 (2), 313-327 (1990).
- DeLeve, L. D. Liver sinusoidal endothelial cells in hepatic fibrosis. Hepatology. 61 (5), 1740-1746 (2015).
- Dar, W. A., Sullivan, E., Bynon, J. S., Eltzschig, H., Ju, C. Ischaemia reperfusion injury in liver transplantation: Cellular and molecular mechanisms. Liver International. 39 (5), 788-801 (2019).
- Furuta, K., Guo, Q., Hirsova, P., Ibrahim, S. H. Emerging Roles of Liver Sinusoidal Endothelial Cells in Nonalcoholic Steatohepatitis. Biology. 9 (11), Basel. 395 (2020).
- Wu, L. Q., et al. Phenotypic and functional differences between human liver cancer endothelial cells and liver sinusoidal endothelial cells. Journal of Vascular Research. 45 (1), 78-86 (2008).
- Meyer, J., Gonelle-Gispert, C., Morel, P., Bühler, L. Methods for isolation and purification of murine liver sinusoidal endothelial cells: A systematic review. PLoS One. 11 (3), 0151945 (2016).
- Meyer, J., Lacotte, S., Morel, P., Gonelle-Gispert, C., Buhler, L. An optimized method for mouse liver sinusoidal endothelial cell isolation. Experimental Cell Research. 349 (2), 291-301 (2016).
- Furuta, K., et al. Lipid-induced endothelial vascular cell adhesion molecule 1 promotes nonalcoholic steatohepatitis pathogenesis. Journal of Clinical Investigation. 131 (6), (2021).
- Guo, Q., et al. Integrin β(1)-enriched extracellular vesicles mediate monocyte adhesion and promote liver inflammation in murine NASH. Journal of Hepatology. 71 (1), 1193-1205 (2019).
- Hirsova, P., Ibrahim, S. H., Bronk, S. F., Yagita, H., Gores, G. J. Vismodegib suppresses TRAIL-mediated liver injury in a mouse model of nonalcoholic steatohepatitis. PLoS One. 8 (7), 70599 (2013).
- Schrage, A., et al. Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1. Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).
- Olsavszky, V., et al. Exploring the transcriptomic network of multi-ligand scavenger receptor Stabilin-1- and Stabilin-2-deficient liver sinusoidal endothelial cells. Gene. 768, 145284 (2021).
- DeLeve, L. D., Maretti-Mira, A. C. Liver sinusoidal endothelial cell: An update. Seminars in Liver Disease. 37 (4), 377-387 (2017).
- DeLeve, L. D., Wang, X., Hu, L., McCuskey, M. K., McCuskey, R. S. Rat liver sinusoidal endothelial cell phenotype is maintained by paracrine and autocrine regulation. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 287 (4), 757-763 (2004).
- Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
- Ishiguro, K., Yan, I. K., Patel, T. Isolation of tissue extracellular vesicles from the liver. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e58649 (2019).
- Topp, S. A., Upadhya, G. A., Strasberg, S. M. Cold preservation of isolated sinusoidal endothelial cells in MMP 9 knockout mice: effect on morphology and platelet adhesion. Liver Transplantation. 10 (8), 1041-1048 (2004).
- Katz, S. C., Pillarisetty, V. G., Bleier, J. I., Shah, A. B., DeMatteo, R. P. Liver sinusoidal endothelial cells are insufficient to activate T cells. Journal of Immunology. 173 (1), 230-235 (2004).
- Liu, W., et al. Sample preparation method for isolation of single-cell types from mouse liver for proteomic studies. Proteomics. 11 (17), 3556-3564 (2011).
- Do, H., Healey, J. F., Waller, E. K., Lollar, P. Expression of factor VIII by murine liver sinusoidal endothelial cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (28), 19587-19592 (1999).
- Schrage, A., et al. Enhanced T cell transmigration across the murine liver sinusoidal endothelium is mediated by transcytosis and surface presentation of chemokines. Hepatology. 48 (4), 1262-1272 (2008).
- Chou, C. H., et al. Lysophosphatidic acid alters the expression profiles of angiogenic factors, cytokines, and chemokines in mouse liver sinusoidal endothelial cells. PLoS One. 10 (3), 0122060 (2015).
- Deleve, L. D. Dacarbazine toxicity in murine liver cells: a model of hepatic endothelial injury and glutathione defense. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 268 (3), 1261-1270 (1994).
- Smedsrød, B., Pertoft, H., Eggertsen, G., Sundström, C. Functional and morphological characterization of cultures of Kupffer cells and liver endothelial cells prepared by means of density separation in Percoll, and selective substrate adherence. Cell and Tissue Research. 241 (3), 639-649 (1985).
- Despoix, N., et al. Mouse CD146/MCAM is a marker of natural killer cell maturation. European Journal of Immunology. 38 (10), 2855-2864 (2008).
- Strauss, O., Phillips, A., Ruggiero, K., Bartlett, A., Dunbar, P. R. Immunofluorescence identifies distinct subsets of endothelial cells in the human liver. Scientific Reports. 7, 44356 (2017).
- Halpern, K. B., et al. Paired-cell sequencing enables spatial gene expression mapping of liver endothelial cells. Nature Biotechnology. 36 (10), 962-970 (2018).
