Summary
在这里，我们概述并演示了原代小鼠肝脏正弦内皮细胞（LSEC）分离方案。该方案基于肝胶原酶灌注、低速离心纯化非实质细胞和CD146磁珠选择。我们还使用流式细胞术和扫描电子显微镜对这些分离的LSECs进行表型和表征。
Abstract
肝正弦内皮细胞（LSECs）是位于循环和肝实质之间界面的特化内皮细胞。LSECs具有独特的形态，其特征在于存在开窗和没有基底膜。LSECs在肝脏的许多病理性疾病中起着至关重要的作用，包括代谢失调，炎症，纤维化，血管生成和癌变。然而，关于LSEC的分离和表征的出版物很少。在这里，该协议讨论了从健康和非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）小鼠中分离LSAC。该方案基于小鼠肝脏的胶原酶灌注和磁珠阳性选择非实质细胞以纯化LSECs。本研究通过流式细胞术使用特异性标记物表征LSECs，并通过扫描电子显微镜鉴定特征性表型特征。按照该协议分离的LSECs可用于功能研究，包括粘附和渗透性测定，以及特定目标途径的下游研究。此外，这些LSECs可以合并或单独使用，允许多组学数据生成，包括RNA-seq本体或单细胞，蛋白质组学或磷酸 - 蛋白质组学，以及使用测序（ATAC-seq）进行转座酶可及染色质的测定等。该方案对于研究LSECs与其他肝细胞在健康和疾病中的通讯的研究者非常有用，并允许深入了解LSECs在急性和慢性肝损伤致病机制中的作用。
Introduction
肝正弦内皮细胞（LSECs）排列在肝窦壁上，是肝脏中最丰富的非实质细胞1。LSECs与身体其他毛细血管内皮细胞的区别在于存在开窗和缺乏经典的基底膜或隔膜2，3。因此，LSECs具有独特的表型和结构特征，可增强其通透性和内吞能力，以消除各种循环大分子，包括脂质和脂蛋白。LSECs在实质细胞和非实质细胞（如星状细胞和免疫细胞）之间的串扰中起着关键作用。LSECs通过保持星状细胞和Kupffer细胞处于静止状态来维持肝脏稳态的关键4。LSECs通过介导循环白细胞的粘附和经内皮迁移来调节肝免疫细胞群的组成5，6。在急性和慢性肝损伤7 期间，包括缺血再灌注损伤 （IRI）8、非酒精性脂肪性肝炎 （NASH）9 和肝细胞癌 （HCC），LSECs 会发生表型改变，称为毛细血管形成，其特征为防御和基底膜10 形成。LSECs 的这些表型变化与 LSECs 功能障碍以及获得血栓前、促炎和促纤维化特性有关。
已经开发了几种从小鼠肝脏中分离LSECs的方法11。一些技术依赖于分离非实质和实质细胞，然后进行密度梯度离心以从非实质部分纯化LSECs。该方法的局限性在于LSECs分离的最后步骤中存在污染巨噬细胞，这可能会影响分离的LSECs12的纯度。该方案基于小鼠肝脏的胶原酶灌注和CD146 + 磁珠阳性选择非实质细胞以纯化LSECs。使用这种方法分离的LSECs显示出高纯度和保留的形态和活力。这些 LSEC 是功能研究的最佳选择，包括渗透性和粘附测定，以及目标途径的下游研究。此外，随着人们对在临床研究和发现科学中生成大数据集的兴趣日益浓厚，这些从患有非酒精性脂肪性肝炎（NASH）或其他疾病的健康和患病肝脏中分离出来的高质量LSECs可以合并或单独使用，从而可以生成多组学数据并比较健康与疾病13，14.此外，分离的LSECs可用于开发二维和三维体外模型，如类器官，以破译LSECs中激活的信号通路及其在不同有害刺激下与其他肝细胞的细胞间通讯，并响应各种治疗干预。
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Protocol
动物协议是经梅奥诊所的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的。从杰克逊实验室购买了八周龄的C57BL / 6J雄性小鼠。将小鼠饲养在温度控制的12：12-h明暗循环设施中，并可自由获得饮食。
1.胶原包被培养皿或培养盘的制备
- 要制成50 mL 0.02 mol/L乙酸，在49.4 mL H2O中加入0.6 mL冰醋酸。
- 在0.02摩尔/升乙酸中制作50μg/ mL I型胶原蛋白。稀释取决于批次的浓度。
- 用3毫升胶原蛋白溶液涂覆10厘米培养皿。在室温（RT）下孵育1小时。
注意：当使用不同的培养皿或板进行培养时，需要根据培养面积调整包衣溶液的体积，通常使用6-10μg/ cm2。 - 从涂层表面除去多余的液体，并用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤3次。让盘子风干。
- 如果胶原蛋白溶液不是无菌的，通过在无菌组织培养罩中暴露于紫外线（UV）光下对胶原蛋白涂层的培养皿进行灭菌10分钟。
2. 设备设置
- 设置加热加湿的再循环灌注装置，如图 1B所示。
- 使用10%漂白剂冲洗灌注系统5分钟，然后用无菌水再冲洗10分钟。
- 在灌注胶原酶溶液之前，请尽可能多地沥干冲洗液。
- 通过灌注系统注入胶原酶溶液（如图 1B所示）以在37°C下预热。 将泵速设置为速度 1，如速度控制拨盘上所示（等于 40 mL/min）。
- 在整个过程中保持此速度不变。在LSEC分离的白天，重复使用在闭合回路中运行的胶原酶溶液。
注：泵转速固定在 1，以避免可能扰乱 LSECs 生物条件的机械压力。
3. 外科手术
- 称量鼠标重量。
- 腹膜注射90毫克/千克体重的氯胺酮和10毫克/千克体重的甲苯噻嗪（IP）。
- 一旦小鼠对疼痛刺激无反应，将小鼠固定在手术表面上，如图 1B所示。
- 用70%乙醇喷洒小鼠腹部。使用手术剪刀，从腹部下部开始到xiphoid过程，做一个约5厘米长的切口。
- 接下来，在腹部两侧使用小虹膜剪刀进行两次横向切口，以完全暴露腹部器官。
- 将静脉注射（IV）导管的鞘放在动物的背部下方，以抬起并平整腹部。
- 使用常规的弯曲敷料镊子，轻轻地将肠道和胃拉到动物的左侧。
- 将5-0手术缝线放在暴露的左肾正下方的下腔静脉（IVC）下。在缝合线中系上松散的挂钩。
- 在肝门静脉 （PV） 周围放置另一个 5-0 手术缝合线，该缝线正好位于肝 PV 的脾静脉分支点上方。在缝合线中系上松散的挂钩。
- 使用PV缝合线作为张力，将20G静脉导管插入肝PV下方1厘米处，使其向右和左肝PV分支。
- 将导管向上滑动静脉，但将其保持在分支区域下方。让血液沿着导管向动，直到它开始滴出。
- 将一些缓冲液A（表1）放在手术区域上方的静脉注射（IV）瓶中，使用IV线，并将其连接到导管上。用这种溶液冲洗肝脏，同时避免空气进入系统。
- 将缝合线绑在肾脏下方的下腔静脉周围。这将使肝脏向后灌注。
- 将IVC切入缝合线下方，让动物流血。
注意：此步骤必须快速执行，以避免肝脏充血。 - 用PV缝合线固定静脉导管。
- 灌注后，切除胃，肠，脾脏和附着在肝脏上的其他内脏。
- 从胸腔切除隔膜和主要血管。从动物身上取出肝脏并将其放在灌注盘上。
- 小心地取出静脉输液管线，并将胶原酶溶液连接到再循环室中。
注意：步骤3.16-3.18需要在5分钟内完成，因此缓冲液A不会灌注肝脏太长时间。 - 让肝脏灌注，直到胶囊变得斑驳并出现糊状（10-15分钟或更长时间，周期因胶原酶的不同而变化）。
- 当肝脏灌注时，确保动物已经死亡，然后再将其放入尸检袋中。
- 消化后，从腔室中取出肝脏并将其置于10厘米的培养皿中，其中含有约20毫升无血清的Dulbecco改良鹰培养基（DMEM）。
- 用几个移液器吸头轻轻挑开肝脏，丢弃胆道树。
- 通过70μm细胞过滤器将肝脏悬浮液过滤到50mL锥形管中。
- 在室温下以50× g 离心细胞悬浮液2分钟，收集含有非实质肝细胞的上清液。
注意：肝细胞沉淀在沉淀中，其可以使用梯度离心进一步纯化，如前所述15。
4. 非实质肝细胞的分离和LSECs的纯化
注意：按照制造商的说明，使用免疫磁珠纯化CD146 + LSECs。
- 在4°C下以300× g 离心上清液5分钟。
- 收集细胞沉淀并重悬于1 mL分离缓冲液中（表1），按照制造商的说明使用自动细胞计数器测定细胞数。
- 在4°C下以300× g 离心细胞悬浮液10分钟，完全吸出上清液。
- 用每10个7 个总细胞中90μL分离缓冲液重悬沉淀。
- 每10个7 个细胞中加入10μLCD146磁珠。充分混合并在4°C下孵育15分钟。
- 洗涤细胞，每10个7 个细胞加入1-2mL分离缓冲液，以300× g 离心10分钟，然后完全吸出上清液。
- 在500μL分离缓冲液中重悬多达10个9 个细胞（表1）。
注意：对于更高的细胞数量，请相应地增加缓冲液体积。 - 准备分离柱，用3 mL分离缓冲液冲洗。
- 将细胞悬浮液施加到与70μm预分离过滤器堆叠的柱上。
- 用3 mL分离缓冲液洗涤色谱柱3次。
注意：洗涤色谱柱时，一旦色谱柱储液槽为空，应立即添加隔离缓冲液。 - 从分离器中取出色谱柱，并将其放在 15 mL 离心管上。将5 mL分离缓冲液移液到色谱柱上。
- 要恢复标记的磁珠细胞，请用力将柱塞推入柱中以冲洗出细胞。
- 在4°C下以300× g 离心5分钟，LSECs准备好进行显微镜检查和下游分析。
5. 液态细胞免疫表型和流式细胞术纯度评估
- 按照制造商的说明，使用自动电池计数器确定隔离液化EC的电池数量。
- 将细胞以300× g 离心5分钟，完全吸出上清液。
- 取1×106 个细胞/管，用90μL染色缓冲液重悬（表1）。
- 加入10μL/管小鼠FcR块和1μL活性染料，在4°C下孵育10分钟。
- 用CD45，CD146和稳定素-2抗体的组合用染色缓冲液在1：50稀释细胞。在4°C下孵育20分钟。
- 用5mL染色缓冲液洗涤细胞，并以300× g 离心10分钟，然后完全吸出上清液。
- 用300μL染色缓冲液重悬细胞并通过流式细胞仪。
6. 伦敦经济交流中心培养和考试
- 将1×106 个细胞/孔接种在6孔板中，并用由5%胎牛血清（FBS），1%内皮细胞生长补充剂和1%白蛋白溶液组成的内皮细胞生长培养基培养。
- 通过光学显微镜检查分离的LSECs。以 10 倍放大倍率采集明场图像。
7. LSECs形态学和开窗扫描电镜检查
- 用胶原蛋白溶液预涂覆细胞培养插入物（3μm孔径）。
- 在37°C温暖和加湿气氛的24孔板中用内皮细胞生长培养基在插入片段上培养分离的LSECs（120，000个细胞）。让细胞沉降并粘附2小时。
- 对于细胞固定，在37°C下加入等量的预热特朗普固定剂到细胞培养基中。
- 孵育10分钟后，用未稀释的特朗普固定剂代替50%稀释的特朗普固定剂。
- 将细胞固定在特朗普固定剂中2小时，然后在1%四氧化二锇中孵育1小时。
- 继续进行样品脱水，在临界点干燥装置中干燥，安装，溅射涂层，并使用扫描电子显微镜进行检查。
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Representative Results
实验示意图及设备设置：
在该方案中，使用封闭的灌注回路消化小鼠肝脏，然后通过以50× g 低速离心2分钟分离非实质细胞和肝细胞。使用从非实质部分选择的CD146磁珠分离原代LSECs。实验原理图如图 1A所示。套管通过PV放置，而下腔静脉被绑起来以确保胶原酶通过肝脏的单向灌注（图1B）。内部灌注室配有加热和加湿系统，以确保37-40°C的温暖和加湿设备空气。灌注的胶原酶通过封闭系统循环，并且可以在隔离日内重复用于两到三只小鼠，以使分离更具成本效益。
通过流式细胞术评估分离的 LSECs 纯度和表面标志物：
通过使用表征良好的特异性LSEC表面标记CD146和稳定素-2 16，17，18来评估分离的LSECs的纯度。在流式细胞仪上分析染色细胞;使用FlowJo软件分析数据。
LSEC人群被门控（图2A）并分析了以下门控策略的单胞;在用特定标记物标记细胞之前，使用活性染料染色来定义活细胞（图2B）。然后对CD45-群体进行门控以排除任何免疫细胞污染。分离的LSECs达到94.8%的生存能力（图2C）。CD45-细胞的百分比为89.7%（图2D），92.3%的细胞为CD146和稳定素-2双阳性（CD45-CD146 + 稳定素-2 +）LSECs（图2E）。
分离的 LSECs 的形态学：
将分离的LSECs以1×10 6细胞/孔接种在6孔板中，在完整的生长培养基中培养，并在培养6小时后用光学显微镜检查（图3A）。将LSECs接种在3μm孔径的培养插入物上，通过扫描电子显微镜（SEM）观察LSECs的开窗。固定和处理后，鉴定出开窗，如图3B所示。如前所述，LSECs在培养物中失去了19;因此，建议在分离后尽快处理细胞以进行下游研究，以避免体外去分化。
图1：实验原理图和设备设置。 （A） 实验原理图是使用 Bio 渲染设计的。（二）设备设置和工艺。肝脏被收获并在封闭的胶原酶灌注装置中灌注。然后将肝脏转移到培养皿中并解离。收集肝脏悬浮液。通过以50× g 离心2分钟分离非实质细胞组分，使用磁珠纯化LSECs。 请点击此处查看此图的大图。
图2：通过流式细胞术评估分离的LSECs纯度和表面标志物。 数据分析和门控策略如图所示，（A）门控LSEC和（B）基于前向散射（FSC）/侧散射（SSC）的单线态。用活性染料和CD45，CD146和稳定素-2抗体的组合染色分离的LSECs。对单胞菌进行门控和分析，（C）对（D）CD45群体进行活LSECs门控，并分析（E）CD146和稳定素-2的表达。所有门均由荧光减一（FMO）确定。 请点击此处查看此图的大图。
图3：分离的LSECs的形态学 （A）培养的LSECs的明场图。分离的LSECs在完整的生长培养基中培养6小时，并通过光学显微镜（比例尺100μm）检查。（B）LSEC通过扫描电子显微镜（SEM）进行检查。白色箭头表示 LSEC 栅栏（比例尺，左侧面板 5 μm，右侧面板 1 μm）。 请点击此处查看此图的大图。
| KRH库存溶液（10x） | |
| 试剂 | 浓度 |
| 氯化钠 | 1.15 米 |
| 赫皮斯（游离酸） | 0.2 米 |
| 氯化钾 | 0.05 米 |
| KH2PO4 | 0.01 米 |
| 缓冲区 A | |
| 试剂 | 浓度 |
| KRH溶液，PH=7.4 | 1 倍 |
| 断续器 | 0.5 毫米 |
| 将PH值调节至7.4，使用前通过0.2μm过滤器过滤。 | |
| 在室温下储存长达6个月。 | |
| 缓冲区 B | |
| KRH溶液，PH=7.4 | 1 倍 |
| 氯化钙2 | 1 毫米 |
| 将PH值调节至7.4，使用前通过0.2μm过滤器过滤。 | |
| 在室温下储存长达6个月。 | |
| 胶原酶溶液 | |
| 试剂 | 浓度 |
| 缓冲液 B，PH=7.4 | 125 毫升 |
| 胶原 酶 | 35-40毫克，加入BSA至100毫克 |
| 珀科尔解决方案 | |
| 试剂 | 浓度 |
| 佩尔科尔 | 22.5 毫升 |
| PBS （10x）， PH=7.4 | 2.5 毫升 |
| 等盐/染色缓冲液 | |
| 试剂 | 浓度 |
| MACS冲洗缓冲液 | 1250 毫升 |
| 美国国金局股票 | 125 毫升 |
表 1：缓冲液配方。 该表包含本研究中使用的缓冲液和溶液的组成。
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Discussion
在目前的手稿中，我们描述了一种从小鼠肝脏中分离LSEC的方案，包括两步胶原酶灌注和随后的磁活化细胞分选（MACS）。该方案包括以下三个步骤：（1）用无钙缓冲液灌注PV，然后用含胶原酶的缓冲液实现肝细胞分散;（2）低速离心排除肝细胞;和（3）使用抗CD146磁珠从非实质细胞（NPC）中选择性基于MACS的LSECs阳性选择。整个过程可以在3小时内完成。此外，该程序的成本（包括所有耗材）约为每只鼠标150美元，这表明这种LSEC隔离方法总体上是有效且具有成本效益的。我们使用步骤（1）和（2）来分离原代小鼠肝细胞，这超出了当前手稿的范围。
门静脉插管和肝灌注有几个关键步骤：（i）导管定位：导管尖端应放置在成年小鼠PV分叉的远端不少于3mm处，这通常在肝脏的肺门中识别。导管尖端在PV中的深部放置将损害肝脏某些叶的灌注。肺叶灌注不良表现为肺叶无颜色变化，如果通过导管轻微重新定位到远端 PV 中立即注意到，可以纠正。这种操作可能会优化肺叶灌注。（ii）气泡：泵和PV之间的输液路线应保持完全没有气泡。进入PV的微小空气会引起空气栓塞，从而导致肝脏灌注不完全。为了在取出内针后消除导管中的空气，在将输液管连接到导管之前，用靠近气泡的注射器注射器注射缓冲液A以排出任何空气。（iii）胶原酶强度：为了在灌注过程中保持胶原酶活性，必须确保输注到PV中的缓冲液B具有精确浓度的胶原酶和pH值，并保持在约37°C。 如图 1所示，使用定制的腔室将整个灌注系统保持在37°C的温暖和加湿气氛中;此外，在胶原酶灌注期间维持氧气供应以实现完全消化。另一种选择包括水浴以预热胶原酶溶液20，以及原位的开放式胶原酶灌注系统，其中胶原酶溶液通过切割的IVC21排出肝脏。
尽管该方案使用相对大胆的导管（20 G）来确保足够的灌注流量，但根据以前的报告22，23，24，更薄的导管也可以很好地工作。然而，有时很难成功击穿PV，特别是当小鼠用于特定疾病模型或它们有PV异常时。如果 PV 插管失败，使用酶试剂盒和温和的组织解离器进行机械和酶促肝脏消化是步骤 （1） 和 （2） 获得非实质细胞 （NPC） 悬浮液的替代方法。我们已经证实，这种不进行肝灌注的替代解离方法中的细胞产量和活力与原始方法相当（数据未显示）。用于肝脏消化的门静脉灌注已被其他人和我们用于13，16，20。此外，该方法避免了肝脏消化过程中由机械力引起的LSECs表型或功能改变的理论风险。因此，到目前为止，强烈建议使用该协议中描述的基于PV灌注的方法。
这里显示了采用当前协议时的最佳LSEC产率和纯度。我们使用当前方案从健康小鼠和饮食诱导的NASH小鼠中每只小鼠获得约2-5 x 106 个细胞。至于纯度，用于免疫磁性分离的相同表面标记物（CD146）的积极性支持我们分离技术的准确性。此外，还有几种公认的 LSEC 表面标志物，例如淋巴管内皮透明质酸受体 1 （LYVE-1）、CD32b 和稳定素-2。围绕这些标记仍然存在争议;例如，i）LYVE-1也存在于淋巴内皮细胞中，ii）门周区域的LSECs缺乏CD32b表达18。因此，为了用流式细胞术检查这些分离的LSECs的纯度，除了CD146之外，还使用稳定素-2作为已建立的特异性LSEC标记物。使用这种方法，我们证实分离的LSECs具有>94%的生存能力和>90%的纯度（图2）。使用SEM进一步证实了分离细胞的LSEC特异性表型，其中大多数细胞具有fenestrae（图3B），这是LSEC的特征形态学特征。
在LSECs分离方法中，免疫磁珠选择是用于从鼻咽癌级分24，25，26，27中分离LSECs最多的技术。相反，其它方法包括离心洗脱和基于选择性粘附的分离22，28，29。非免疫磁性方法已被证明可提供高产量的LSECs（每只小鼠约9 x 106个细胞）11。因此，相对较低的隔离式LSEC的产量可能是当前协议的限制。另一方面，基于非免疫磁性选择的方法需要很高的技术专业知识，并且有时在细胞产量和纯度11上显示出不一致的结果，而基于免疫磁性选择的方法比其他现有方法具有一致的产量和纯度的优势。此外，对于基于免疫磁珠选择的细胞分离，所使用的细胞表面标志物的特异性始终是一个值得关注的问题。例如，CD31以前曾被用作免疫磁性LSEC分离的标志物，主要在PV内皮和毛细管化的LSECs3上表达。尽管据报道CD146也在自然杀伤细胞和肝星状细胞30，31上表达，但使用该方案分离的高纯度LSECs减轻了对内皮标志物CD146特异性的担忧。LSEC隔离的各种方法的优缺点比较将在别处讨论11，18，32。其他方法和这种方法之间的细胞产量和纯度的比较超出了当前手稿的范围，需要未来的研究。
总之，我们提出了一种基于最广泛使用和接受的方法之一的主要小鼠LSEC隔离协议。分离的LSECs具有高纯度和保留功能。而且，该方案是有效的，适用于健康的小鼠肝脏以及来自不同疾病小鼠模型的肝脏。来自这些小鼠的高质量LSECs可用于多组学数据集生成13，14。因此，这种方法有助于鉴定调节LSEC功能的分子机制，并提高我们对它们在健康和疾病中肝脏细胞间通讯中的作用的理解。
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Disclosures
所有作者都没有冲突需要披露。
Acknowledgments
这项工作得到了NIH国家糖尿病，消化和肾脏疾病研究所（1RO1DK122948至SHI）和NIH Silvio O. Conte消化系统疾病研究核心中心P30资助机制（DK084567）的支持。日本科学促进会（JSPS）海外研究奖学金也向钦哲基金会提供了支持。我们还要感谢Gregory J. Gores博士和Steven Bronk博士对胶原酶灌注装置的原创设计和优化。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.0-inch 20 G Intra Venous (IV) catheter | Terumo, SOmerset, NJ, USA | SR-OX2051CA | |
| 2–3-inch perfuion tray with a hole in the center | customized; made in house | ||
| 405/520 viability dye | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-205 | |
| 4-inch regular curved dressing forceps | Fisher Brand | FS16-100-110 | |
| 5-0 Perma-Hand silk suture | Ethicon, Raritan, NJ, USA | A182H | |
| Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluorà 488 | MBL International, Woburn, MA, USA | D317-A48 | |
| BSA stock | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
| Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-118-407 | |
| CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-007 | |
| Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-803 | |
| Collagen type I | Corning, Corning, NY, USA | 354236 | |
| Collagenase II | Gibco, Waltham, MA, USA | 17101-015 | |
| Endothelial cells growth medium | ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA | 211-500 | |
| FcR blocking reagent, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-575 | |
| FlowJo software, version 10.6 | Becton, Dickinson and Company | ||
| Hardened Fine scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14091-11 | |
| Heated (37 °C) and humidified recirculating perfusion apparatus equipped with Oxygen injection at a rate of 10psi. | customized; made in house | ||
| Hitachi S 4700 scanning electron microscope | Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA | SEM096 | |
| LS columns | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-401 | |
| MACS pre-separation filters (70 μm) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-095-823 | |
| MACS rinsing buffer | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
| MACS Smart Strainer (70 μm) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-098-462 | |
| MACSQunt flow cytometer | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | ||
| Millicell Cell Culture Insert | Millipore Sigma, Burlington, MA, USA | PITP01250 | |
| Nexcelom cell counter | Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, USA | Cellometer Auto T4 Plus | |
| Percoll | GE Healthcare, Chicago, IL, USA | 17-0891-01 | |
| Surgical scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14001-12 | |
| Very small curved dressing forceps | F.S.T, Foster city, CA, USA | 11063-07 |
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