Summary
Hier skizzieren und demonstrieren wir ein Protokoll für die Isolierung primärer Lebersinuszellen (LSEC) in der Mausleber. Das Protokoll basiert auf der Perfusion der Leberkollagenase, der nichtparenchymalen Zellreinigung durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit und der Auswahl magnetischer CD146-Perlen. Wir phänotypisieren und charakterisieren diese isolierten LSECs auch mittels Durchflusszytometrie und Rasterelektronenmikroskopie.
Abstract
Lebersinusförmige Endothelzellen (LSECs) sind spezialisierte Endothelzellen, die sich an der Schnittstelle zwischen dem Kreislauf und dem Leberparenchym befinden. LSECs haben eine ausgeprägte Morphologie, die durch das Vorhandensein von Fenestrae und das Fehlen einer Basalmembran gekennzeichnet ist. LSECs spielen eine wesentliche Rolle bei vielen pathologischen Erkrankungen der Leber, einschließlich metabolischer Dysregulation, Entzündungen, Fibrose, Angiogenese und Karzinogenese. Über die Isolierung und Charakterisierung der LSECs wurde jedoch wenig veröffentlicht. Hier diskutiert dieses Protokoll die Isolierung von LSEC von gesunden und nichtalkoholischen Fettlebererkrankungen (NAFLD) Mäusen. Das Protokoll basiert auf der Kollagenase-Perfusion der Mausleber und der positiven Auswahl von nichtparenchymalen Zellen zur Reinigung von LSECs. Diese Studie charakterisiert LSECs unter Verwendung spezifischer Marker durch Durchflusszytometrie und identifiziert die charakteristischen phänotypischen Merkmale durch Rasterelektronenmikroskopie. LSECs, die nach diesem Protokoll isoliert wurden, können für funktionelle Studien, einschließlich Adhäsions- und Permeabilitätsassays, sowie für nachgelagerte Studien für einen bestimmten Signalweg von Interesse verwendet werden. Darüber hinaus können diese LSECs gepoolt oder einzeln verwendet werden, was unter anderem die Generierung von Multi-Omics-Daten ermöglicht, einschließlich RNA-seq-Bulk oder Einzelzell-, Proteomik- oder Phospho-Proteomik und Assay für Transposase-zugängliches Chromatin unter Verwendung von Sequenzierung (ATAC-seq). Dieses Protokoll wird für Forscher nützlich sein, die die Kommunikation von LSECs mit anderen Leberzellen in Gesundheit und Krankheit untersuchen und ein tiefes Verständnis der Rolle von LSECs bei den pathogenen Mechanismen akuter und chronischer Leberschäden ermöglichen.
Introduction
Lebersinusförmige Endothelzellen (LSECs) säumen die hepatischen Sinuswände und sind die am häufigsten vorkommenden nichtparenchymalen Zellen in der Leber1. LSECs unterscheiden sich von anderen kapillaren Endothelzellen an anderer Stelle im Körper durch das Vorhandensein von Fenestrae und das Fehlen einer klassischen Basalmembran oder eines Zwerchfells 2,3. Daher besitzen die LSECs charakteristische phänotypische und strukturelle Eigenschaften, die ihre Permeabilität und endozytäre Fähigkeit zur Beseitigung einer Vielzahl von zirkulierenden Makromolekülen, einschließlich Lipiden und Lipoproteinen, verbessern. LSECs spielen eine zentrale Rolle im Crosstalk zwischen parenchymalen und nichtparenchymalen Zellen, wie Sternzellen und Immunzellen. LSECs sind der Schlüssel zur Aufrechterhaltung der Leberhomöostase, indem sie die Sternzellen und Kupffer-Zellen in einem Ruhezustandhalten 4. LSECs modulieren die Zusammensetzung der Populationen hepatischer Immunzellen, indem sie Adhäsion und transendotheliale Migration von zirkulierenden Leukozyten vermitteln 5,6. Während der akuten und chronischen Leberschädigung7, einschließlich Ischämie-Reperfusionsverletzung (IRI)8, nichtalkoholischer Steatohepatitis (NASH)9 und hepatozellulärem Karzinom (HCC), unterliegen LSECs phänotypischen Veränderungen, die als Kapillarisierung bekannt sind und durch Defenestration und Bildung der Basalmembran10 gekennzeichnet sind. Diese phänotypischen Veränderungen in LSECs sind mit LSEC-Dysfunktion und dem Erwerb prothrombotischer, proinflammatorischer und profibrogener Eigenschaften verbunden.
Mehrere Methoden zur Isolierung von LSECs aus der Mausleber wurden entwickelt11. Einige Techniken hängen von der Trennung von nichtparenchymalen und parenchymalen Zellen ab, gefolgt von einer Dichtegradientenzentrifugation, um die LSECs von nichtparenchymalen Fraktionen zu reinigen. Die Einschränkung dieser Methode ist das Vorhandensein von kontaminierenden Makrophagen in den letzten Schritten der LSEC-Isolierung, die die Reinheit der isolierten GVECsbeeinflussen könnten 12. Dieses Protokoll basiert auf der Kollagenase-Perfusion der Mausleber und der positiven Auswahl von nichtparenchymalen Zellen durch CD146 + -Magnetkügelchen, um LSECs zu reinigen. Mit dieser Methode isolierte LSECs zeigen eine hohe Reinheit und konservierte Morphologie und Lebensfähigkeit. Diese LSECs sind optimal für funktionelle Studien, einschließlich Permeabilitäts- und Adhäsionsassays, sowie für nachgelagerte Studien für Pfade von Interesse. Mit dem wachsenden Interesse an der Generierung großer Datensätze sowohl in der klinischen Forschung als auch in der Entdeckungswissenschaft können diese hochwertigen LSECs, die sowohl aus gesunden als auch aus erkrankten Lebern mit nichtalkoholischer Steatohepatitis (NASH) oder anderen Erkrankungen isoliert wurden, gepoolt oder einzeln verwendet werden, was die Generierung von Multi-Omics-Daten und den Vergleich zwischen Gesundheit und Krankheit ermöglicht13,14 . Darüber hinaus können die isolierten LSECs verwendet werden, um sowohl zweidimensionale als auch dreidimensionale In-vitro-Modelle wie Organoide zu entwickeln, um den aktivierten Signalweg in LSECs und ihre interzelluläre Kommunikation mit anderen Leberzellen unter verschiedenen schädlichen Reizen und als Reaktion auf verschiedene therapeutische Interventionen zu entschlüsseln.
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Protocol
Tierprotokolle wurden durchgeführt, wie vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Mayo Clinic genehmigt. Acht Wochen alte männliche C57BL/6J-Mäuse wurden vom Jackson Laboratory gekauft. Die Mäuse wurden in einer temperaturgesteuerten 12:12-Stunden-Hell-Dunkel-Zyklusanlage mit freiem Zugang zur Ernährung untergebracht.
1. Zubereitung einer kollagenbeschichteten Kulturschale oder eines Tellers
- Um 50 ml 0,02mol/lEssigsäure herzustellen, fügen Sie 0,6 ml Eisessigsäure zu 49,4 ml H2 O hinzu.
- 50 μg/ml Kollagen Typ I in 0,02 mol/L Essigsäure herstellen. Die Verdünnung hängt von der Konzentration der Partie ab.
- 10 cm Kulturgeschirr mit 3 ml Kollagenlösung bestreichen. Bei Raumtemperatur (RT) für 1 h inkubieren.
HINWEIS: Wenn Sie eine andere Schale oder Platte für die Kultur verwenden, muss das Volumen der Beschichtungslösung basierend auf der Kulturfläche angepasst werden, im Allgemeinen 6-10 μg / cm2 verwenden. - Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit von der beschichteten Oberfläche und waschen Sie sie 3 Mal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Lassen Sie das Geschirr an der Luft trocknen.
- Wenn die Kollagenlösung nicht steril ist, sterilisieren Sie das kollagenbeschichtete Geschirr unter Einwirkung von ultraviolettem (UV) Licht für 10 min in einer sterilen Gewebekulturhaube.
2. Geräteeinrichtung
- Die beheizte und befeuchtete zirkulierende Perfusionsvorrichtung ist wie in Abbildung 1B dargestellt aufzustellen.
- Spülen Sie das Perfusionssystem mit 10% Bleichmittel für 5 Minuten ab, gefolgt von sterilem Wasser für weitere 10 Minuten.
- Lassen Sie die Spülflüssigkeit so weit wie möglich abtropfen, bevor Sie die Kollagenaselösung durchbluten.
- Kollagenaselösung durch das Perfusionssystem infundiert (wie in Abbildung 1B gezeigt), um sie bei 37 °C vorzuwärmen. Stellen Sie die Pumpenrate auf Geschwindigkeit 1 ein, wie auf dem Einstellrad angezeigt (entspricht 40 ml/min).
- Halten Sie diese Geschwindigkeit während des gesamten Vorgangs gleich. Wiederverwendung der Kollagenaselösung, die während des Tages der LSEC-Isolierung in einem geschlossenen Kreislauf ausgeführt wird.
HINWEIS: Die Pumpendrehzahl ist auf 1 festgelegt, um mechanischen Druck zu vermeiden, der den biologischen Zustand der LSECs stören könnte.
3. Chirurgischer Eingriff
- Wiegen Sie die Maus.
- Injizieren Sie 90 mg/kg Körpergewicht Ketamin und 10 mg/kg Körpergewicht Xylazin intraperitoneal (IP).
- Sobald die Maus nicht auf schmerzhafte Reize reagiert, befestigen Sie die Maus an der Operationsoberfläche, wie in Abbildung 1B dargestellt.
- Besprühen Sie den Mausbauch mit 70% Ethanol. Machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen Schnitt von ~ 5 cm Länge, beginnend mit dem unteren Teil des Abdomens bis zum Xiphoid-Prozess.
- Als nächstes machen Sie zwei seitliche Schnitte mit einer kleinen Irisschere auf jeder Seite des Abdomens, um die Bauchorgane vollständig freizulegen.
- Legen Sie die Hülle des intravenösen (IV) Katheters unter den Rücken des Tieres, um den Bauch anzuheben und auszugleichen.
- Ziehen Sie mit einer normalen gebogenen Verbandszange den Darm und den Magen vorsichtig links vom Tier ab.
- Platzieren Sie eine 5-0 chirurgische Naht unter der unteren Hohlvene (IVC) direkt unter der freiliegenden linken Niere. Binden Sie eine lose Kupplung in die Naht.
- Platzieren Sie eine weitere 5-0-chirurgische Naht um die Leberpfortader (PV) direkt über dem Milzvenenverzweigungspunkt von der Leber-PV. Binden Sie eine lose Kupplung in die Naht.
- Verwenden Sie die PV-Naht als Spannung, und führen Sie den 20 G IV-Katheter in den Leber-PV 1 cm tiefer ein, wo er sich nach rechts und links in die Leber-PV verzweigt.
- Schieben Sie den Katheter die Vene hinauf, aber halten Sie ihn unter dem verzweigten Bereich. Lassen Sie das Blut den Katheter hinunterwandern, bis es heraustropft.
- Wenn ein Teil des Puffers A (Tabelle 1) in einer intravenösen (IV) Flasche über dem Operationsbereich positioniert ist, verwenden Sie eine IV-Leitung und befestigen Sie sie am Katheter. Spülen Sie die Leber mit dieser Lösung, während Sie den Eintritt von Luft in das System vermeiden.
- Binden Sie die Naht um die untere Hohlvene unterhalb der Niere ab. Dies ermöglicht es der Leber, retro perfusionieren.
- Schneiden Sie die IVC unter die Naht, damit das Tier ausbluten kann.
HINWEIS: Dieser Schritt muss schnell durchgeführt werden, um eine Verstopfung der Leber zu vermeiden. - Sichern Sie den IV-Katheter mit der PV-Naht.
- Schneiden Sie nach dem Durchsickern den Magen, den Darm, die Milz und andere an der Leber befestigte Eingeweide ab.
- Schneiden Sie das Zwerchfell und die Hauptgefäße aus der Brusthöhle ab. Entfernen Sie die Leber vom Tier und legen Sie sie auf die Perfusionsschale.
- Entfernen Sie vorsichtig die IV-Leitung und schließen Sie die Kollagenaselösung in der Umwälzkammer an.
HINWEIS: Die Schritte 3.16-3.18 müssen innerhalb von 5 Minuten durchgeführt werden, damit die Leber mit Puffer A nicht zu lange durchblutet wird. - Lassen Sie die Leber perfusionieren, bis die Kapsel fleckig wird und matschig erscheint (10-15 min oder mehr, die Periode variiert je nach den verschiedenen Mengen an Kollagenase).
- Während die Leber in Perfusion ist, stellen Sie sicher, dass das Tier verstorben ist, bevor Sie es in einem Nekropsiebeutel entsorgen.
- Nach der Verdauung die Leber aus der Kammer nehmen und in eine 10 cm große Petrischale mit etwa 20 ml serumfreiem Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) geben.
- Nehmen Sie die Leber vorsichtig mit ein paar Pipettenspitzen auseinander und entsorgen Sie den Gallenbaum.
- Filtern Sie die Lebersuspension durch ein 70 μm Zellsieb in einen 50 ml konischen Schlauch.
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 50 x g für 2 min bei RT. Sammeln Sie den Überstand, der nichtparenchymale Leberzellen enthält.
HINWEIS: Hepatozyten werden im Pellet ausgefällt, das durch Gradientenzentrifugation weiter gereinigt werden kann, wie zuvor beschrieben15.
4. Trennung von nichtparenchymalen Leberzellen und LSEC-Reinigung
HINWEIS: Reinigen Sie die CD146+ LSECs mit den immunmagnetischen Kügelchen gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Zentrifugieren Sie den Überstand bei 300 x g für 5 min bei 4 °C.
- Sammeln Sie das Zellpellet und resuspendieren Sie es in 1 ml Isolationspuffer (Tabelle 1), bestimmen Sie die Zellnummer mithilfe eines automatischen Zellzählers gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Zentrifen Sie die Zellsuspension bei 300 x g für 10 min bei 4 °C, saugen Sie den Überstand vollständig ab.
- Resuspendiert das Pellet mit 90 μL Isolationspuffer pro 107 Gesamtzellen.
- Fügen Sie 10 μL CD146-Magnetkügelchen pro 107 Gesamtzellen hinzu. Gut mischen und 15 min bei 4 °C inkubieren.
- Um die Zellen zu waschen, fügen Sie 1-2 ml Isolationspuffer pro 107 Zellen hinzu, zentrifugieren Sie bei 300 x g für 10 min und saugen Sie dann den Überstand vollständig ab.
- Resuspendieren Sie bis zu 109 Zellen in 500 μL Isolationspuffer (Tabelle 1).
HINWEIS: Bei höheren Zellzahlen sollten Sie das Puffervolumen entsprechend erhöhen. - Bereiten Sie die Trennsäule vor und spülen Sie sie mit 3 ml Isolationspuffer ab.
- Tragen Sie die Zellsuspension auf die Säule auf, die mit 70-μm-Vorabscheidefiltern gestapelt ist.
- Waschen Sie die Säule 3 Mal mit dem 3 ml Isolationspuffer.
HINWEIS: Beim Waschen der Spalte sollte der Isolationspuffer hinzugefügt werden, sobald das Säulenreservoir leer ist. - Entfernen Sie die Säule aus dem Trennzeichen und legen Sie sie auf ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. Pipette 5 ml Isolationspuffer auf die Säule.
- Um die mit Magnetperlen beschrifteten Zellen wiederherzustellen, drücken Sie den Kolben fest in die Säule, um die Zellen auszuspülen.
- Zentrifuge bei 300 x g für 5 min bei 4 °C. LSECs sind bereit für mikroskopische Untersuchungen und nachgelagerte Analysen.
5. Immunphänotypisierung von LSECs und Reinheitsbewertung durch Durchflusszytometrie
- Ermitteln Sie die Zellnummern isolierter LSECs mithilfe eines automatischen Zellzählers gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Zentrifen Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min, saugen Sie den Überstand vollständig ab.
- Nehmen Sie 1 x 106 Zellen/Röhrchen und resuspendieren Sie mit 90 μL Färbepuffer (Tabelle 1).
- 10 μL/Röhrchen Maus-FcR-Block und 1 μL Viability-Farbstoff zugeben, bei 4 °C für 10 min inkubieren.
- Färben Sie die Zellen mit einer Kombination aus CD45-, CD146- und Stabilin-2-Antikörpern, die bei 1:50 mit Färbepuffer verdünnt wurden. 20 min bei 4 °C inkubieren.
- Waschen Sie die Zellen mit 5 ml Färbepuffer und zentrifugieren Sie sie bei 300 x g für 10 min, dann saugen Sie den Überstand vollständig ab.
- Resuspendieren Sie die Zellen mit 300 μL Färbepuffer und laufen Sie durch das Durchflusszytometer.
6. Kultur und Prüfung der GVEC
- Samen Sie 1 x 10 6 Zellen / Well in einer 6-Well-Platte und kultivieren Sie es mit Endothelzellen-Wachstumsmedium, bestehend aus 5% fetalem Rinderserum (FBS), 1% Endothelzellen-Wachstumsergänzung und 1% Primocin-Lösung.
- Untersuchen Sie die isolierten LSECs mittels Lichtmikroskopie. Erfassen Sie Hellfeldbilder mit einer 10-fachen Vergrößerung.
7. LSEC-Morphologie und Fenestrae-Untersuchung mittels Rasterelektronenmikroskopie
- Beschichten Sie die Zellkultureinsätze (3 μm Porengröße) mit Kollagenlösung vor.
- Kulturisolierte LSECs (120.000 Zellen) auf dem Insert mit Endothelzellen-Wachstumsmedium in einer 24-Well-Platte bei 37 °C warmer und befeuchteter Atmosphäre. Lassen Sie die Zellen sich beruhigen und für 2 Stunden haften.
- Für die Zellfixierung fügen Sie ein äquivalentes Volumen des bei 37 ° C vorgewärmten Trump-Fixiermittels zu den Zellkulturmedien hinzu.
- Ersetzen Sie nach der Inkubation für 10 min 50% verdünntes Trump-Fixiermittel durch unverdünntes Trump-Fixiermittel.
- Fixieren Sie die Zellen in Trump-Fixiermittel für 2 h und inkubieren Sie dann für 1 h in 1% Osmium-Tetroxiden.
- Fahren Sie mit der Dehydratisierung der Proben, der Trocknung in einem kritischen Punkttrocknungsgerät, der Montage, der Sputterbeschichtung und der Untersuchung mit einem Rasterelektronenmikroskop fort.
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Representative Results
Experimentelle Schaltpläne und Aufbau der Ausrüstung:
In diesem Protokoll wurde die Mausleber mit einem geschlossenen Perfusionskreislauf verdaut, dann wurden nichtparenchymale Zellen und Hepatozyten durch langsame Zentrifugation bei 50 x g für 2 min getrennt. Primäre LSECs wurden unter Verwendung der Auswahl von CD146-Magnetperlen aus der nichtparenchymalen Fraktion isoliert. Die experimentellen Schaltpläne sind in Abbildung 1A dargestellt. Die Kanüle wurde durch die PV gelegt, während die untere Hohlvene gebunden wurde, um eine unidirektionale Perfusion der Kollagenase durch die Leber sicherzustellen (Abbildung 1B). Die hauseigene Perfusionskammer ist mit einem Heiz- und Befeuchtungssystem ausgestattet, um eine 37-40 °C warme und befeuchtete Geräteluft zu gewährleisten. Die perfundierte Kollagenase zirkuliert durch ein geschlossenes System und kann während des Isolationstages für zwei oder drei Mäuse wiederverwendet werden, um die Isolierung kostengünstiger zu machen.
Bewertung der Reinheit isolierter GVECs und Oberflächenmarker durch Durchflusszytometrie:
Die Reinheit der isolierten LSECs wurde unter Verwendung der gut charakterisierten spezifischen LSEC-Oberflächenmarker CD146 und Stabilin-216,17,18 bewertet. Gefärbte Zellen wurden auf einem Durchflusszytometer analysiert; Die Daten wurden mit der FlowJo-Software analysiert.
Die LSEC-Population wurde eingezäunt (Abbildung 2A) und analysierte Singlets für die folgende Gating-Strategie; Lebensfähige Zellen wurden unter Verwendung einer Viabilitätsfarbstofffärbung definiert, bevor Zellen mit spezifischen Markern markiert wurden (Abbildung 2B). Dann wurde die CD45-Population eingezäunt, um jegliche Kontamination mit Immunzellen auszuschließen. Die isolierten GVECs erreichten eine Rentabilität von 94,8 % (Abbildung 2C). Der Prozentsatz der CD45-Zellen betrug 89,7% (Abbildung 2D), und 92,3% der Zellen waren CD146 und Stabilin-2 doppelt positiv (CD45-CD146 + Stabilin-2+) LSECs (Abbildung 2E).
Morphologie der isolierten LSECs:
Die isolierten LSECs wurden in einer 6-Well-Platte bei 1 x 10 6 Zellen/Well gesät, in einem vollständigen Wachstumsmedium kultiviert und nach6 h Kultur lichtmikroskopisch untersucht (Abbildung 3A). LSECs wurden auf einem porengroßen Kultureinsatz von 3 μm plattiert, um die Fenestrae der LSECs mit einem Rasterelektronenmikroskop (REM) zu visualisieren. Nach der Fixierung und Verarbeitung wurden die Fenestrae identifiziert, wie in Abbildung 3B dargestellt. Wie bereits berichtet, verlieren LSECs ihre Fenestrae in Kulturüber Nacht 19; Daher wird empfohlen, die Zellen so schnell wie möglich nach der Isolierung für nachgelagerte Studien zu verarbeiten, um eine Dedifferenzierung in vitro zu vermeiden.
Abbildung 1: Experimentelle Schaltpläne und Geräteaufbau. (A) Experimentelle Schaltpläne wurden mit Bio-Render entworfen. (B) Einrichtung und Verarbeitung der Ausrüstung. Die Leber wurde in einem geschlossenen Kollagenase-Perfusionsapparat geerntet und perfundiert. Die Leber wurde dann in eine Schale überführt und dissoziiert. Die Lebersuspension wurde gesammelt. Die nichtparenchymale Zellfraktion wurde durch Zentrifugation bei 50 x g für 2 min getrennt. LSECs wurden mit magnetischen Kügelchen gereinigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Bewertung der Reinheit isolierter LSECs und Oberflächenmarker mittels Durchflusszytometrie. Datenanalyse und Gating-Strategie wie gezeigt, (A) Gated LSECs und (B) Singlets basierend auf Forward Scatter (FSC) / Side Scatter (SSC). Isolierte LSECs wurden mit einem Lebensfähigkeitsfarbstoff und einer Kombination aus CD45-, CD146- und Stabilin-2-Antikörpern gefärbt. Singlets wurden eingezäunt und analysiert, (C) lebensfähige LSECs wurden auf (D) CD45-Population eingezäunt und auf (E) CD146- und Stabilin-2-Expression analysiert. Alle Gates wurden durch Fluoreszenz minus eins (FMO) bestimmt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Morphologie isolierter LSECs . (A) Hellfeldbild von kultivierten LSECs. Isolierte LSECs wurden im kompletten Wachstumsmedium für 6 h kultiviert und mittels Lichtmikroskopie (Scale bar 100 μm) untersucht. (B) LSEC wurde mit einem Rasterelektronenmikroskop (REM) untersucht. Weiße Pfeile zeigen LSEC Fenestrae an (Maßstabsleiste, linkes Feld 5 μm, rechtes Feld 1 μm). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| KRH Lagerlösung (10x) | |
| Reagenzien | Konzentration |
| NaCl | 1,15 m |
| HEPES (freie Säure) | 0,2 Mio. |
| Kcl | 0,05 m |
| KH2PO4 | 0,01 Mio. |
| Puffer A | |
| Reagenzien | Konzentration |
| KRH-Lösung, PH=7,4 | 1x |
| EGTA | 0,5 mM |
| Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein, filtern Sie vor Gebrauch durch einen 0,2-μm-Filter. | |
| Bis zu 6 Monate bei Raumtemperatur gelagert. | |
| Puffer B | |
| KRH-Lösung, PH=7,4 | 1x |
| CaCl2 | 1 mM |
| Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein, filtern Sie vor Gebrauch durch einen 0,2-μm-Filter. | |
| Bis zu 6 Monate bei Raumtemperatur gelagert. | |
| Kollagenase-Lösung | |
| Reagenzien | Konzentration |
| Puffer B, PH=7,4 | 125 ml |
| Kollagenase | 35–40 mg, BSA bis zu 100 mg hinzufügen |
| Percoll-Lösung | |
| Reagenzien | Konzentration |
| Percoll | | 22,5 ml |
| PBS (10x), PH=7,4 | 2,5 ml |
| Isolier-/Färbepuffer | |
| Reagenzien | Konzentration |
| MACS-Spülpuffer | 1250 ml |
| BSA-Bestand | 125 ml |
Tabelle 1: Rezept für Puffer Die Tabelle enthält die Zusammensetzung der in dieser Studie verwendeten Puffer und Lösungen.
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Discussion
Im aktuellen Manuskript beschreiben wir ein Protokoll zur LSEC-Isolierung aus der Mausleber, bestehend aus zweistufiger Kollagenase-Perfusion und anschließender magnetisch aktivierter Zellsortierung (MACS). Dieses Protokoll besteht aus den folgenden drei Schritten: (1) Perfusion durch die PV mit einem kalziumfreien Puffer, gefolgt von einem kollagenasehaltigen Puffer, um eine Leberzelldispersion zu erreichen; (2) Ausschluss von Hepatozyten mit langsamer Zentrifugation; und (3) MACS-basierte positive Selektion von LSECs aus nichtparenchymalen Zellen (NPCs) unter Verwendung von Anti-CD146-Magnetkügelchen. Der gesamte Vorgang konnte innerhalb von 3 Stunden abgeschlossen werden. Darüber hinaus belaufen sich die Kosten für dieses Verfahren, einschließlich aller Verbrauchsmaterialien, auf rund 150 USD pro Maus, was darauf hindeutet, dass diese Methode der LSEC-Isolierung insgesamt effizient und kostengünstig ist. Wir verwenden die Schritte (1) und (2) auch zur Isolierung von primären Maushepatozyten, was über den Rahmen des aktuellen Manuskripts hinausgeht.
Es gibt einige kritische Schritte bei der Portalkanülierung und Leberperfusion: (i) Katheterpositionierung: Die Katheterspitze sollte nicht weniger als 3 mm distal zur PV-Bifurkation einer erwachsenen Maus platziert werden, die normalerweise im Hilum der Leber identifiziert wird. Eine tiefe Platzierung der Katheterspitze in der PV beeinträchtigt die Durchblutung einiger Leberlappen. Eine schlechte Durchblutung eines Lappens manifestiert sich als Fehlen einer Farbänderung des Lappens und kann behoben werden, wenn sie sofort durch eine leichte Neupositionierung des Katheters in die distale PV bemerkt wird. Dieses Manöver könnte möglicherweise die Lappendurchblutung optimieren. (ii) Luftblasen: Der Infusionsweg zwischen der Pumpe und der PV sollte vollständig frei von Luftblasen gehalten werden. Winziger Lufteintritt in die PV kann eine Luftembolie verursachen, die zu einer unvollständigen Leberdurchblutung führt. Um nach dem Entfernen der inneren Nadel Luft im Katheter zu entfernen, wird Puffer A mit einer Spritze proximal zur Blase injiziert, um Luft auszustoßen, bevor die Infusionsleitung an den Katheter angeschlossen wird. (iii) Kollagenasestärke: Um die Kollagenaseaktivität während der Perfusion aufrechtzuerhalten, muss sichergestellt werden, dass Puffer B, der in die PV infundiert wird, die genaue Konzentration von Kollagenase und pH-Wert aufweist und bei etwa 37 ° C gehalten wird. Wie in Abbildung 1 gezeigt, wird eine kundenspezifische Kammer verwendet, um das gesamte Perfusionssystem in einer warmen und befeuchteten Atmosphäre von 37 °C zu halten. Darüber hinaus wird die Sauerstoffversorgung während der Kollagenase-Perfusion aufrechterhalten, um eine vollständige Verdauung zu erreichen. Eine alternative Option umfasst ein Wasserbad zum Vorwärmen der Kollagenaselösung20 und ein offenes Kollagenase-Perfusionssystem in situ, bei dem die Kollagenaselösung durch den Schnitt IVC21 aus der Leber abfließt.
Obwohl das Protokoll relativ fette Katheter (20 G) verwendet, um einen angemessenen Perfusionsfluss zu gewährleisten, funktioniert ein dünnerer Katheter auch gut, basierend auf früheren Berichten22,23,24. Es ist jedoch manchmal schwierig, die PV erfolgreich zu kanülieren, insbesondere wenn Mäuse für bestimmte Krankheitsmodelle verwendet werden oder wenn sie PV-Anomalien aufweisen. Wenn die PV-Kanülierung fehlschlägt, ist die mechanische und enzymatische Leberverdauung mit einem Enzymkit und einem sanften Gewebedissoziator eine alternative Methode für die Schritte (1) und (2) zur Gewinnung einer Suspension für nichtparenchymale Zellen (NPC). Wir haben bestätigt, dass die Zellausbeute und Lebensfähigkeit in dieser alternativen Dissoziationsmethode ohne Leberperfusion mit der ursprünglichen Methode vergleichbar war (Daten nicht gezeigt). Die Perfusion von Portalvenen für die Leberverdauung wurde von anderen und uns13,16,20 eingesetzt. Darüber hinaus vermeidet diese Methode das theoretische Risiko von phänotypischen oder funktionellen Veränderungen der LSECs, die durch mechanische Kraft während der Leberverdauung induziert werden. Daher wird die Verwendung der in diesem Protokoll dargestellten PV-Perfusionsmethode bisher dringend empfohlen.
Hier werden die optimale LSEC-Ausbeute und -Reinheit unter Verwendung des aktuellen Protokolls gezeigt. Wir erhielten ungefähr 2-5 x 106 Zellen pro Maus sowohl von gesunden Mäusen als auch von Mäusen mit ernährungsinduziertem NASH unter Verwendung des aktuellen Protokolls. Was die Reinheit betrifft, so unterstützt die Positivität desselben Oberflächenmarkers, der für die immunmagnetische Trennung verwendet wird (CD146), die Genauigkeit unserer Isolationstechnik. Darüber hinaus gibt es mehrere anerkannte LSEC-Oberflächenmarker, wie den Lymphgefäß-Endothel-Hyaluronsäure-Rezeptor 1 (LYVE-1), CD32b und Stabilin-2. Um diese Markierungen gibt es immer noch Kontroversen; Zum Beispiel ist i) LYVE-1 auch in lymphatischen Endothelzellen vorhanden, und ii) LSECs in einem periportalen Bereich fehlt CD32b-Expression18. Um die Reinheit dieser isolierten LSECs mit Durchflusszytometrie zu untersuchen, wurde Stabilin-2 neben CD146 als etablierter spezifischer LSEC-Marker eingesetzt. Anhand dieser Methodik bestätigten wir, dass die isolierten GVECs eine Rentabilität von >94 % und eine Reinheit von >90 % aufwiesen (Abbildung 2). Der LSEC-spezifische Phänotyp der isolierten Zellen wurde weiter mit REM bestätigt, wobei die meisten Zellen Fenestrae aufweisen (Abbildung 3B), das charakteristische morphologische Merkmal von LSECs.
Unter den LSEC-Isolationsmethoden ist die Auswahl immunomagnetischer Perlen die Technik, die am häufigsten verwendet wird, um die LSECs von der NPC-Fraktion24,25,26,27 zu isolieren. Im Gegensatz dazu umfassen andere Methoden die zentrifugale Elutriation und die selektive haftungsbasierte Trennung22,28,29. Es wurde gezeigt, dass die nicht-immunmagnetischen Methoden hoheAusbeuten an LSECs liefern (ca. 9 x 10 6 Zellen pro Maus)11. Daher könnte eine relativ geringere Ausbeute an isolierten LSECs eine Einschränkung des derzeitigen Protokolls darstellen. Auf der anderen Seite erfordern die nicht-immunmagnetischen Selektionsmethoden eine hohe technische Expertise und zeigen manchmal inkonsistente Ergebnisse bei Zellausbeuten und Reinheiten11, während die immunmagnetische Selektionsmethode den Vorteil einer konsistenten Ausbeute und Reinheit gegenüber anderen bestehenden Methoden bietet. Darüber hinaus ist für die auf der Selektion von immunmagnetischen Perlen basierende Zellisolierung die Spezifität der verwendeten Zelloberflächenmarker immer ein Anliegen. Zum Beispiel wird CD31, das zuvor als Marker für die immunmagnetische LSEC-Trennung verwendet wurde, dominant auf dem PV-Endothel und den kapillarisierten LSECs3 exprimiert. Obwohl berichtet wurde, dass CD146 auch auf natürlichen Killerzellen und hepatischen Sternzellen30,31 exprimiert wird, mildert die hohe Reinheit der mit diesem Protokoll isolierten LSECs Bedenken hinsichtlich der Spezifität des Endothelmarkers CD146. Der Vergleich der Vor- und Nachteile verschiedener Methoden für die LSEC-Isolierung wird an anderer Stellediskutiert 11,18,32. Der Vergleich von Zellausbeuten und Reinheiten zwischen anderen Methoden und dieser Methode würde den Rahmen des aktuellen Manuskripts sprengen und zukünftige Untersuchungen rechtfertigen.
Abschließend stellen wir ein primäres Maus-LSEC-Isolationsprotokoll vor, das auf einem der am weitesten verbreiteten und akzeptierten Ansätze basiert. Isolierte LSECs weisen eine hohe Reinheit und erhaltene Funktion auf. Darüber hinaus ist dieses Protokoll effizient und anwendbar auf die gesunde Mausleber sowie die Leber aus verschiedenen Krankheitsmausmodellen. Hochwertige LSECs dieser Mäuse können für die Multiomics-Datensatzgeneration13,14 eingesetzt werden. Dieser Ansatz erleichtert somit die Identifizierung molekularer Mechanismen, die die Funktion von LSEC regulieren, und verbessert unser Verständnis ihrer Rolle bei der interzellulären Kommunikation in der Leber bei Gesundheit und Krankheit.
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Disclosures
Alle Autoren haben keine Konflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases des NIH (1RO1DK122948 to SHI) und dem NIH Silvio O. Conte Digestive Diseases Research Core Centers P30 Grant Mechanism (DK084567) unterstützt. Unterstützung erhielt KF auch durch die Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Overseas Research Fellowships. Wir möchten auch Dr. Gregory J. Gores und Steven Bronk für ihr ursprüngliches Design und ihre Optimierung des Kollagenase-Perfusionsapparates danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.0-inch 20 G Intra Venous (IV) catheter | Terumo, SOmerset, NJ, USA | SR-OX2051CA | |
| 2–3-inch perfuion tray with a hole in the center | customized; made in house | ||
| 405/520 viability dye | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-205 | |
| 4-inch regular curved dressing forceps | Fisher Brand | FS16-100-110 | |
| 5-0 Perma-Hand silk suture | Ethicon, Raritan, NJ, USA | A182H | |
| Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluorà 488 | MBL International, Woburn, MA, USA | D317-A48 | |
| BSA stock | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
| Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-118-407 | |
| CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-007 | |
| Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-803 | |
| Collagen type I | Corning, Corning, NY, USA | 354236 | |
| Collagenase II | Gibco, Waltham, MA, USA | 17101-015 | |
| Endothelial cells growth medium | ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA | 211-500 | |
| FcR blocking reagent, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-575 | |
| FlowJo software, version 10.6 | Becton, Dickinson and Company | ||
| Hardened Fine scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14091-11 | |
| Heated (37 °C) and humidified recirculating perfusion apparatus equipped with Oxygen injection at a rate of 10psi. | customized; made in house | ||
| Hitachi S 4700 scanning electron microscope | Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA | SEM096 | |
| LS columns | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-401 | |
| MACS pre-separation filters (70 μm) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-095-823 | |
| MACS rinsing buffer | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
| MACS Smart Strainer (70 μm) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-098-462 | |
| MACSQunt flow cytometer | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | ||
| Millicell Cell Culture Insert | Millipore Sigma, Burlington, MA, USA | PITP01250 | |
| Nexcelom cell counter | Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, USA | Cellometer Auto T4 Plus | |
| Percoll | GE Healthcare, Chicago, IL, USA | 17-0891-01 | |
| Surgical scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14001-12 | |
| Very small curved dressing forceps | F.S.T, Foster city, CA, USA | 11063-07 |
References
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