Summary
Ici, nous décrivons et démontrons un protocole pour l’isolement des cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques primaires (LSEC) de souris. Le protocole est basé sur la perfusion de collagénase hépatique, la purification des cellules non parenchymateuses par centrifugation à basse vitesse et la sélection de billes magnétiques CD146. Nous phénotypons et caractérisons également ces LSTEC isolés à l’aide de la cytométrie en flux et de la microscopie électronique à balayage.
Abstract
Les cellules endothéliales sinusoïdales du foie (CSL) sont des cellules endothéliales spécialisées situées à l’interface entre la circulation et le parenchyme hépatique. Les CSLS ont une morphologie distincte caractérisée par la présence de fenestrae et l’absence de membrane basale. Les CSL JOUENT UN RÔLE ESSENTIEL DANS DE NOMBREUX TROUBLES PATHOLOGIQUES DU FOIE, NOTAMMENT LA DÉRÉGULATION MÉTABOLIQUE, L’INFLAMMATION, LA FIBROSE, L’ANGIOGENÈSE ET LA CANCÉROGENÈSE. Cependant, peu de choses ont été publiées sur l’isolement et la caractérisation des CSLS. Ici, ce protocole traite de l’isolement du LSEC chez les souris saines et non alcooliques de la stéatose hépatique (NAFLD). Le protocole est basé sur la perfusion de collagénase du foie de souris et la sélection positive de billes magnétiques de cellules non parenchymateuses pour purifier les CSL. Cette étude caractérise les LSEC à l’aide de marqueurs spécifiques par cytométrie en flux et identifie les caractéristiques phénotypiques caractéristiques par microscopie électronique à balayage. Les CSLS isolés selon ce protocole peuvent être utilisés pour des études fonctionnelles, y compris des essais d’adhérence et de perméabilité, ainsi que des études en aval pour une voie d’intérêt particulière. En outre, ces LSTEC peuvent être regroupés ou utilisés individuellement, ce qui permet la génération de données multi-omiques, y compris l’ARN-seq en vrac ou à cellule unique, la protéomique ou la phospho-protéomique, et le test pour la chromatine accessible à la transposase en utilisant le séquençage (ATAC-seq), entre autres. Ce protocole sera utile pour les chercheurs qui étudient la communication des CSL avec d’autres cellules hépatiques dans les domaines de la santé et de la maladie et permettra une compréhension approfondie du rôle des CSLS dans les mécanismes pathogènes des lésions hépatiques aiguës et chroniques.
Introduction
Les cellules endothéliales sinusoïdales du foie (CSL) tapissent les parois sinusoïdales hépatiques et sont les cellules non parenchymateuses les plus abondantes dans le foie1. Les CSL SE distinguent des autres cellules endothéliales capillaires ailleurs dans le corps par la présence de fenestrae et l’absence d’une membrane basale classique ou d’un diaphragme 2,3. Par conséquent, les CSLS possèdent des caractéristiques phénotypiques et structurelles distinctives qui améliorent leur perméabilité et leur capacité endocytaire à éliminer une variété de macromolécules circulantes, y compris les lipides et les lipoprotéines. Les CSL JOUENT UN RÔLE CENTRAL DANS LA DIAPHONIE entre les cellules parenchymateuses et non parenchymateuses, telles que les cellules stellaires et les cellules immunitaires. Les CSLS sont essentiels au maintien de l’homéostasie hépatique en maintenant les cellules stellaires et les cellules de Kupffer dans un état de repos4. Les CSL modulent la composition des populations de cellules immunitaires hépatiques en médiant l’adhésion et la migration transendothéliale des leucocytes circulants 5,6. Au cours des lésions hépatiques aiguës et chroniques7, y compris les lésions d’ischémie-reperfusion (IRI)8, la stéatohépatite non alcoolique (NASH)9 et le carcinome hépatocellulaire (CHC), les CSL subissent des changements phénotypiques connus sous le nom de capillarisation caractérisée par la défenestration et la formation de la membrane basale10. Ces changements phénotypiques dans les CSLS sont associés à un dysfonctionnement des CSLS et à l’acquisition de propriétés prothrombotiques, pro-inflammatoires et profibrogéniques.
Plusieurs méthodes d’isolement des CSL du foie de souris ont été mises au point11. Certaines techniques dépendent de la séparation des cellules non parenchymateuses et parenchymateuses suivie d’une centrifugation par gradient de densité pour purifier les LSTEC des fractions non parenchymateuses. La limitation de cette méthode est la présence de macrophages contaminants dans les dernières étapes de l’isolement des CSEL, ce qui pourrait affecter la pureté des CSEL isolés12. Ce protocole est basé sur la perfusion de collagénase du foie de souris et la sélection positive des billes magnétiques CD146+ de cellules non parenchymateuses pour purifier les CSLS. Les CSLS isolés à l’aide de cette méthode présentent une grande pureté et une morphologie et une viabilité préservées. Ces CSLS sont optimaux pour les études fonctionnelles, y compris les essais de perméabilité et d’adhérence, ainsi que pour les études en aval des voies d’intérêt. De plus, avec l’intérêt croissant pour la génération de grands ensembles de données dans la recherche clinique et la science de la découverte, ces CSL de haute qualité isolés à partir de foies sains et malades atteints de stéatohépatite non alcoolique (NASH) ou d’autres affections peuvent être regroupés ou utilisés individuellement, ce qui permet la génération de données multi-omiques et la comparaison entre la santé et la maladie13,14 . En outre, les LSTEC isolés peuvent être utilisés pour développer des modèles in vitro bidimensionnels et tridimensionnels tels que des organoïdes pour déchiffrer la voie de signalisation activée dans les LSTEC et leur communication intercellulaire avec d’autres cellules hépatiques sous différents stimuli nocifs et en réponse à diverses interventions thérapeutiques.
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Protocol
Les protocoles pour animaux ont été menés tels qu’approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de la Mayo Clinic. Des souris mâles C57BL/6J âgées de huit semaines ont été achetées au Jackson Laboratory. Les souris ont été logées dans une installation de cycle lumière-obscurité de 12:12 h à température contrôlée avec un accès gratuit à l’alimentation.
1. Préparation d’un plat ou d’une assiette de culture enrobé de collagène
- Pour obtenir 50 mL d’acide acétique 0,02 mol/L, ajouter 0,6 mL d’acide acétique glacial à 49,4 mL deH2O.
- Produire 50 μg/mL de collagène de type I dans 0,02 mol/L d’acide acétique. La dilution dépend de la concentration du lot.
- Enduire les plats de culture de 10 cm avec 3 mL de solution de collagène. Incuber à température ambiante (RT) pendant 1 h.
REMARQUE: Lors de l’utilisation d’un plat ou d’une plaque différent pour la culture, le volume de la solution de revêtement doit être ajusté en fonction de la zone de culture, utilisez généralement 6-10 μg / cm2. - Retirez l’excès de liquide de la surface revêtue et lavez-le avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 3 fois. Laissez sécher la vaisselle à l’air.
- Si la solution de collagène n’est pas stérile, stériliser les plats enrobés de collagène par exposition à la lumière ultraviolette (UV) pendant 10 minutes dans une hotte de culture tissulaire stérile.
2. Configuration de l’équipement
- Installez l’appareil de perfusion à recirculation chauffé et humidifié comme illustré à la figure 1B.
- Rincez le système de perfusion à l’aide de 10% d’eau de Javel pendant 5 min, puis d’eau stérile pendant 10 minutes supplémentaires.
- Égouttez le liquide de rinçage autant que possible avant de perfuser la solution de collagénase.
- Infuser la solution de collagénase à travers le système de perfusion (comme le montre la figure 1B) pour la préchauffer à 37 °C. Réglez le débit de la pompe à la vitesse 1 comme indiqué sur la molette de contrôle de vitesse (égale à 40 mL/min).
- Gardez cette vitesse la même tout au long de la procédure. Réutilisez la solution de collagénase en circuit fermé pendant la journée d’isolement LSEC.
REMARQUE: La vitesse de la pompe est fixée à 1 pour éviter la pression mécanique qui pourrait perturber l’état biologique des CSL.
3. Intervention chirurgicale
- Pesez la souris.
- Injecter 90 mg/kg de poids corporel de kétamine et 10 mg/kg de poids corporel de xylazine par voie intrapéritonéale (IP).
- Une fois que la souris n’est pas réactive aux stimuli douloureux, fixez-la à la surface chirurgicale, comme le montre la figure 1B.
- Vaporisez l’abdomen de la souris avec 70% d’éthanol. À l’aide de ciseaux chirurgicaux, faites une incision d’environ 5 cm de long à partir de la partie inférieure de l’abdomen jusqu’au processus xiphoïde.
- Ensuite, faites deux coupes latérales à l’aide de petits ciseaux à iris de chaque côté de l’abdomen pour exposer complètement les organes abdominaux.
- Placez la gaine du cathéter intraveineux (IV) sous le dos de l’animal pour soulever et niveler l’abdomen.
- À l’aide d’une pince de pansement incurvée régulière, retirez doucement les intestins et l’estomac vers la gauche de l’animal.
- Placez une suture chirurgicale 5-0 sous la veine cave inférieure (IVC) juste en dessous du rein gauche exposé. Attachez un attelage lâche dans la suture.
- Placez une autre suture chirurgicale 5-0 autour de la veine porte hépatique (PV) juste au-dessus du point de ramification de la veine splénique de la PV hépatique. Attachez un attelage lâche dans la suture.
- En utilisant la suture PV comme tension, insérez le cathéter IV 20 G dans le PV hépatique 1 cm en dessous où il se ramifie vers le PV hépatique droit et gauche.
- Faites glisser le cathéter vers le haut de la veine, mais gardez-le sous la zone de ramification. Laissez le sang circuler le long du cathéter jusqu’à ce qu’il commence à s’égoutter.
- Avec une partie du tampon A (tableau 1) dans un flacon intraveineux (IV) placé au-dessus de la zone chirurgicale, utilisez une ligne IV et fixez-la au cathéter. Rincez le foie avec cette solution tout en évitant l’entrée d’air dans le système.
- Attachez la suture autour de la veine cave inférieure sous le rein. Cela permettra au foie de percuser rétro.
- Coupez la CIV sous la suture pour permettre à l’animal de saigner.
REMARQUE: Cette étape doit être effectuée rapidement pour éviter la congestion du foie. - Fixez le cathéter IV avec la suture PV.
- Une fois perfusé, coupez l’estomac, les intestins, la rate et les autres entrailles attachées au foie.
- Coupez le diaphragme et les principaux vaisseaux de la cavité thoracique. Retirez le foie de l’animal et placez-le sur le plateau de perfusion.
- Retirez soigneusement la ligne IV et branchez la solution de collagénase dans la chambre de recirculation.
REMARQUE: Les étapes 3.16-3.18 doivent être effectuées dans les 5 minutes, de sorte que le foie ne sera pas perfusé trop longtemps avec le tampon A. Faites très attention à ne pas laisser de bulles d’air dans le foie. - Laissez le foie perfuser jusqu’à ce que la capsule devienne tachetée et apparaisse pâteuse (10-15 min ou plus, la période varie en fonction des différents lots de collagénase).
- Pendant que le foie est en perfusion, assurez-vous que l’animal est décédé avant de le jeter dans un sac de nécropsie.
- Une fois digéré, retirez le foie de la chambre et placez-le dans une boîte de Petri de 10 cm avec environ 20 mL de milieu d’aigle modifié (DMEM) de Dulbecco sans sérum.
- Séparez délicatement le foie avec quelques pointes de pipette et jetez l’arbre biliaire.
- Filtrer la suspension hépatique à travers une passoire cellulaire de 70 μm dans un tube conique de 50 mL.
- Centrifuger la suspension cellulaire à 50 x g pendant 2 min à TA. Prélever le surnageant contenant des cellules hépatiques non parenchymateuses.
REMARQUE: Les hépatocytes sont précipités dans la pastille, qui peut être purifiée à l’aide de la centrifugation par gradient comme décrit précédemment15.
4. Séparation des cellules hépatiques non parenchymateuses et purification des CSLS
REMARQUE: Purifier les CD146+ LSEC à l’aide des billes immunomagnétiques, en suivant les instructions du fabricant.
- Centrifuger le surnageant à 300 x g pendant 5 min à 4 °C.
- Recueillir la pastille de cellule et la remettre en suspension dans 1 mL de tampon d’isolement (tableau 1), déterminer le numéro de cellule à l’aide d’un compteur de cellules automatique en suivant les instructions du fabricant.
- Centrifuger la suspension de la cellule à 300 x g pendant 10 min à 4 °C, aspirer complètement le surnageant.
- Remettre en suspension la pastille avec 90 μL de tampon d’isolement pour 107 cellules au total.
- Ajouter 10 μL de billes magnétiques CD146 pour 107 cellules au total. Bien mélanger et incuber pendant 15 min à 4 °C.
- Pour laver les cellules, ajoutez 1 à 2 mL de tampon d’isolement pour 107 cellules, centrifugez à 300 x g pendant 10 min, puis aspirez complètement le surnageant.
- Remettre en suspension jusqu’à 109 cellules dans un tampon d’isolement de 500 μL (tableau 1).
REMARQUE: Pour un nombre de cellules plus élevé, augmentez le volume de la mémoire tampon en conséquence. - Préparez la colonne de séparation, rincez-la avec 3 mL de tampon d’isolement.
- Appliquez la suspension de la cellule sur la colonne empilée avec des filtres de pré-séparation de 70 μm.
- Lavez la colonne avec les 3 mL de tampon d’isolation 3 fois.
REMARQUE: Lors du lavage de la colonne, le tampon d’isolation doit être ajouté dès que le réservoir de la colonne est vide. - Retirez la colonne du séparateur et placez-la sur un tube de centrifugeuse de 15 mL. Pipette 5 mL de tampon d’isolation sur la colonne.
- Pour récupérer les cellules marquées par des billes magnétiques, poussez fermement le piston dans la colonne pour débusquer les cellules.
- Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Les CSLS sont prêts pour l’examen microscopique et l’analyse en aval.
5. Immunophénotypage et évaluation de la pureté des CSL par cytométrie en flux
- Déterminez le nombre de cellules des LSTEC isolés à l’aide d’un compteur de cellules automatique en suivant les instructions du fabricant.
- Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 5 min, aspirer complètement le surnageant.
- Prélever 1 x 106 cellules/tube et remettre en suspension avec 90 μL de tampon de coloration (tableau 1).
- Ajouter 10 μL/tube de bloc FcR de souris et 1 μL de colorant de viabilité, incuber à 4 °C pendant 10 min.
- Colorez les cellules avec une combinaison d’anticorps CD45, CD146 et stabilin-2 dilués à 1:50 avec un tampon de coloration. Incuber à 4 °C pendant 20 min.
- Lavez les cellules avec 5 mL de tampon de coloration et centrifugez à 300 x g pendant 10 min, puis aspirez complètement le surnageant.
- Remettez en suspension les cellules avec 300 μL de tampon de coloration et faites passer le cytomètre en flux.
6. Culture et examen des CSL
- Semer 1 x 106 cellules / puits dans une plaque de 6 puits et le cultiver avec un milieu de croissance de cellules endothéliales composé de 5% de sérum bovin fœtal (FBS), de 1% de supplément de croissance de cellules endothéliales et de solution de primocine à 1%.
- Examiner les CSL isolés par microscopie optique. Obtenez des images en champ lumineux avec un grossissement de 10x.
7. Morphologie des CSL et examen des fenestrae par microscopie électronique à balayage
- Pré-enduire les inserts de culture cellulaire (taille des pores de 3 μm) avec une solution de collagène.
- Cultiver des CSLSE isolés (120 000 cellules) sur l’insert avec un milieu de croissance de cellules endothéliales dans une plaque de 24 puits à 37 °C atmosphère chaude et humidifiée. Laissez les cellules s’installer et adhérer pendant 2 h.
- Pour la fixation cellulaire, ajoutez un volume équivalent de fixateur préavertissé à 37 °C de Trump au milieu de culture cellulaire.
- Après une incubation de 10 minutes, remplacez le fixateur de Trump dilué à 50% par le fixateur de Trump non dilué.
- Fixer les cellules dans le fixateur trump pendant 2 h, puis incuber pendant 1 h dans des tétroxydes d’osmium à 1%.
- Procéder à la déshydratation des échantillons, au séchage dans un dispositif de séchage aux points critiques, au montage, au revêtement par pulvérisation et à l’examen à l’aide d’un microscope électronique à balayage.
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Representative Results
Schémas expérimentaux et équipements mis en place :
Dans ce protocole, le foie de souris a été digéré à l’aide d’un circuit de perfusion fermé, puis les cellules non parenchymateuses et les hépatocytes ont été séparés par centrifugation à basse vitesse à 50 x g pendant 2 min. Les CSL PRIMAIRES ont été isolés à l’aide de la sélection de billes magnétiques CD146 à partir de la fraction non parenchymateuse. Les schémas expérimentaux sont illustrés à la figure 1A. La canule a été placée à travers le PV tandis que la veine cave inférieure a été attachée pour assurer la perfusion unidirectionnelle de la collagénase à travers le foie (Figure 1B). La chambre de perfusion interne est équipée d’un système de chauffage et d’humidification pour assurer un air chaud et humidifié de 37 à 40 °C. La collagénase perfusée circule dans un système fermé et peut être réutilisée pour deux ou trois souris pendant la journée d’isolement pour rendre l’isolement plus rentable.
Évaluation de la pureté et des marqueurs de surface des CSL isolés par cytométrie en flux :
La pureté des CSL isolés a été évaluée en utilisant des marqueurs de surface LSEC spécifiques bien caractérisés CD146 et stabilin-2 16,17,18. Les cellules colorées ont été analysées sur un cytomètre en flux; les données ont été analysées à l’aide du logiciel FlowJo.
La population LSEC a été fermée (figure 2A) et a analysé les singlets pour la stratégie de contrôle suivante; les cellules viables ont été définies à l’aide d’une coloration de colorant de viabilité avant de marquer les cellules avec des marqueurs spécifiques (figure 2B). Ensuite, la population CD45- a été fermée pour exclure toute contamination des cellules immunitaires. Les CSL isolés ont atteint une viabilité de 94,8 % (figure 2C). Le pourcentage de cellules CD45- était de 89,7 % (figure 2D), et 92,3 % des cellules étaient CD146 et stabilin-2 double positif (CD45-CD146+stabilin-2+) LSEC (Figure 2E).
Morphologie des CSL isolés :
Les CSL isolés ont été ensemencés dans une plaque de 6 puits à 1 x 106 cellules/puits, cultivés dans un milieu de croissance complet et examinés par microscopie optique après 6 h de culture (Figure 3A). Les CSLS ont été plaqués sur un insert de culture de la taille d’un pore de 3 μm pour visualiser les fenestrae des CSL au microscope électronique à balayage (MEB). Après fixation et traitement, les fenestrae ont été identifiées, comme le montre la figure 3B. Comme indiqué précédemment, les LSTEC perdent leur fenestrae en culture du jour au lendemain19; par conséquent, il est recommandé de traiter les cellules dès que possible après l’isolement pour les études en aval afin d’éviter la dédifférenciation in vitro.
Figure 1 : Schémas expérimentaux et mise en place de l’équipement. (A) Les schémas expérimentaux ont été conçus à l’aide du rendu Bio. (B) Configuration et processus de l’équipement. Le foie a été récolté et perfusé dans un appareil de perfusion de collagénase fermé. Le foie a ensuite été transféré dans un plat et dissocié. La suspension hépatique a été recueillie. La fraction cellulaire non parenchymateuse a été séparée par centrifugation à 50 x g pendant 2 min. Les CSLS ont été purifiés à l’aide de billes magnétiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Évaluation de la pureté et des marqueurs de surface des CSL isolés par cytométrie en flux. Analyse des données et stratégie de contrôle, comme illustré, (A) LSEC fermés et (B) singlets basés sur la dispersion vers l’avant (FSC)/la dispersion latérale (SSC). Les CSLS isolés ont été colorés avec un colorant de viabilité et une combinaison d’anticorps CD45, CD146 et stabilin-2. Les singlets ont été fermés et analysés, (C) les CSL viables ont été fermés sur la population de CD45 (D) et analysés pour l’expression de (E) CD146 et stabilin-2. Toutes les portes ont été déterminées par fluorescence moins une (FMO). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Morphologie des CSL isolés. (A) Image en champ lumineux des CSLS cultivés. Les CSLS isolés ont été cultivés dans le milieu de croissance complet pendant 6 h et examinés par microscopie optique (barre d’échelle 100 μm). (B) Le LSEC a été examiné au microscope électronique à balayage (MEB). Les flèches blanches indiquent LSEC fenestrae (barre d’échelle, panneau de gauche 5 μm, panneau de droite 1 μm). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Solution mère KRH (10x) | |
| Réactifs | Concentration |
| NaCl | 1,15 m |
| HEPES (acide libre) | 0,2 M |
| Kcl | 0,05 m |
| KH2PO4 | 0,01 M |
| Tampon A | |
| Réactifs | Concentration |
| Solution KRH, PH =7,4 | 1x |
| L’EGTA | 0,5 mM |
| Ajuster le pH à 7,4, filtrer à travers un filtre de 0,2 μm avant utilisation. | |
| Conservé à température ambiante jusqu’à 6 mois. | |
| Tampon B | |
| Solution KRH, PH =7,4 | 1x |
| CaCl2 | 1 mM |
| Ajuster le pH à 7,4, filtrer à travers un filtre de 0,2 μm avant utilisation. | |
| Conservé à température ambiante jusqu’à 6 mois. | |
| Solution de collagénase | |
| Réactifs | Concentration |
| Tampon B, PH=7,4 | 125 mL |
| Collagènase | 35–40 mg, ajouter BSA jusqu’à 100 mg |
| Solution Percoll | |
| Réactifs | Concentration |
| Percoll | 22,5 mL |
| PBS (10x), PH=7,4 | 2,5 mL |
| Tampon d’isoaltion/coloration | |
| Réactifs | Concentration |
| Tampon de rinçage MACS | 1250 mL |
| Stock BSA | 125 mL |
Tableau 1 : Recette des tampons. Le tableau comprend la composition des tampons et des solutions utilisés dans cette étude.
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Discussion
Dans le présent manuscrit, nous décrivons un protocole d’isolement LSEC du foie de souris consistant en une perfusion de collagénase en deux étapes et un tri cellulaire activé magnétiquement (MACS) ultérieur. Ce protocole comprend les trois étapes suivantes: (1) Perfusion à travers le PV avec un tampon sans calcium suivi d’un tampon contenant de la collagénase pour obtenir une dispersion des cellules hépatiques; (2) Exclusion des hépatocytes avec centrifugation à basse vitesse; et (3) sélection positive basée sur macS de LSEC à partir de cellules non parenchymateuses (NPC) à l’aide de billes magnétiques anti-CD146. L’ensemble de la procédure pourrait être terminé dans les 3 h. En outre, le coût de cette procédure, y compris toutes les fournitures consommables, est d’environ 150 USD par souris, ce qui suggère que cette méthode d’isolation LSEC est globalement efficace et rentable. Nous utilisons également les étapes (1) et (2) pour isoler les hépatocytes primaires de souris, ce qui dépasse le cadre du manuscrit actuel.
Il y a quelques étapes critiques dans la canulation portale et la perfusion hépatique: (i) Positionnement du cathéter: la pointe du cathéter doit être placée à au moins 3 mm distale à la bifurcation PV d’une souris adulte, qui est généralement identifiée dans le hile du foie. La mise en place profonde de l’extrémité du cathéter dans le PV compromettra la perfusion de certains lobes du foie. Une mauvaise perfusion d’un lobe se manifeste par l’absence d’un changement de couleur du lobe et peut être rectifiée si elle est remarquée immédiatement par un léger repositionnement du cathéter dans le PV distal. Cette manœuvre pourrait éventuellement optimiser la perfusion des lobes. ii) Bulles d’air: la voie d’infusion entre la pompe et le PV doit être maintenue complètement exempte de bulles d’air. Une entrée d’air infime dans le PV peut provoquer une embolie de l’air, ce qui entraîne une perfusion hépatique incomplète. Pour éliminer l’air dans le cathéter après avoir retiré l’aiguille interne, le tampon A est injecté avec une seringue proximale à la bulle pour expulser tout air avant de connecter la ligne de perfusion au cathéter. (iii) Force de la collagénase : Pour maintenir l’activité de la collagénase pendant la perfusion, il est essentiel de s’assurer que le tampon B infusé dans le PV a la concentration précise de collagénase et de pH et est maintenu à environ 37 °C. Comme le montre la figure 1, une chambre personnalisée est utilisée pour maintenir l’ensemble du système de perfusion dans une atmosphère chaude et humidifiée à 37 °C; en outre, l’apport en oxygène est maintenu pendant la perfusion de la collagénase pour obtenir une digestion complète. Une autre option comprend un bain-marie pour préchauffer la solution de collagénase20 et un système de perfusion de collagénase ouvert in situ où la solution de collagénase s’écoule du foie par la CIV21 coupée.
Bien que le protocole utilise des cathéters relativement audacieux (20 G) pour assurer un débit de perfusion adéquat, un cathéter plus mince fonctionnera également bien selon les rapports précédents 22,23,24. Cependant, il est parfois difficile de canuler avec succès le PV, en particulier lorsque les souris sont utilisées pour des modèles de maladies spécifiques ou si elles présentent des anomalies PV. En cas d’échec de la canulation PV, la digestion mécanique et enzymatique du foie à l’aide d’un kit enzymatique et d’un dissociateur tissulaire doux est une méthode alternative pour les étapes (1) et (2) afin d’obtenir une suspension de cellules non parenchymateuses (NPC). Nous avons confirmé que le rendement cellulaire et la viabilité de cette méthode alternative de dissociation sans perfusion hépatique étaient comparables à la méthode originale (données non présentées). La perfusion veineuse portale pour la digestion du foie a été utilisée par d’autres et nous 13,16,20. De plus, cette méthode évite le risque théorique d’altérations phénotypiques ou fonctionnelles des CSL induites par la force mécanique lors de la digestion hépatique. Par conséquent, l’utilisation de la méthode basée sur la perfusion PV décrite dans ce protocole est jusqu’à présent fortement recommandée.
Ici, le rendement LSEC optimal et la pureté lors de l’utilisation du protocole actuel sont affichés. Nous avons obtenu environ 2 à 5 x 106 cellules par souris à partir de souris saines et de souris atteintes de NASH induite par l’alimentation en utilisant le protocole actuel. En ce qui concerne la pureté, la positivité du même marqueur de surface utilisé pour la séparation immunomagnétique (CD146) soutient la précision de notre technique d’isolement. En outre, il existe plusieurs marqueurs de surface LSEC bien reconnus, tels que le récepteur 1 de l’acide hyaluronique endothélial des vaisseaux lymphatiques (LYVE-1), CD32b et stabilin-2. Des controverses existent encore autour de ces marqueurs; par exemple, i) LYVE-1 est également présent dans les cellules endothéliales lymphatiques, et ii) les CSLS dans une région périportale n’ont pas d’expression cd32b18. Ainsi, pour examiner la pureté de ces CSL isolés avec cytométrie en flux, la stabilin-2 a été utilisée comme marqueur LSEC spécifique établi en plus de CD146. À l’aide de cette méthodologie, nous avons confirmé que les CSL isolés avaient une viabilité de >94 % et une pureté >90 % (figure 2). Le phénotype spécifique au LSEC des cellules isolées a été confirmé à l’aide du SEM, où la plupart des cellules ont des fenestrae (Figure 3B), la caractéristique morphologique caractéristique des LSTEC.
Parmi les méthodologies d’isolement des CSL, la sélection des billes immunomagnétiques est la technique la plus utilisée pour isoler les CSL de la fractionCNP 24,25,26,27. En revanche, d’autres méthodes comprennent l’élutriation centrifuge et la séparation sélective basée sur l’adhésion 22,28,29. Il a été démontré que les méthodes non immunomagnétiques délivrent des rendements élevés de CSL (environ 9 x 106 cellules par souris)11. Par conséquent, un rendement relativement plus faible de CSL isolés pourrait être une limitation du protocole actuel. D’autre part, les méthodes basées sur la sélection non immunomagnétique nécessitent une grande expertise technique et montrent parfois des résultats incohérents sur les rendements et les puretés cellulaires11, tandis que la méthode basée sur la sélection immunomagnétique présente l’avantage d’un rendement et d’une pureté constants par rapport aux autres méthodes existantes. De plus, pour l’isolement cellulaire basé sur la sélection de billes immunomagnétiques, la spécificité des marqueurs de surface cellulaire utilisés est toujours un sujet de préoccupation. Par exemple, cd31, qui a déjà été utilisé comme marqueur de la séparation immunomagnétique du LSEC, est exprimé de manière dominante sur l’endothélium PV et les LSEC capillarisés3. Bien que CD146 ait été signalé comme étant également exprimé sur des cellules tueuses naturelles et des cellules stellaires hépatiques30,31, la grande pureté des CSL isolés à l’aide de ce protocole atténue les préoccupations concernant la spécificité du marqueur endothélial CD146. La comparaison des avantages et des inconvénients de diverses méthodologies d’isolement LSEC est discutée ailleurs 11,18,32. La comparaison des rendements cellulaires et des puretés entre d’autres méthodes et cette méthode dépasse la portée du manuscrit actuel et justifie des recherches futures.
En conclusion, nous présentons un protocole d’isolement LSEC de souris primaire basé sur l’une des approches les plus largement utilisées et acceptées. Les LSTEC isolés présentent une grande pureté et une fonction préservée. De plus, ce protocole est efficace et applicable au foie de souris sain ainsi qu’au foie de différents modèles murins de maladie. Les LSIC de haute qualité de ces souris peuvent être utilisés pour la génération d’ensembles de données multiomiques13,14. Ainsi, cette approche facilite l’identification des mécanismes moléculaires régulant la fonction du LSEC et améliore notre compréhension de leurs rôles dans la communication intercellulaire dans le foie dans la santé et la maladie.
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Disclosures
Tous les auteurs n’ont aucun conflit à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par l’Institut national du diabète et des maladies digestives et rénales du NIH (1RO1DK122948 à SHI) et le niH Silvio O. Conte Digestive Diseases Research Core Centers P30 grant mechanism (DK084567). Un soutien a également été fourni à KF par les bourses de recherche à l’étranger de la Société japonaise pour la promotion de la science (JSPS). Nous tenons également à remercier le Dr Gregory J. Gores et Steven Bronk pour leur conception originale et l’optimisation de l’appareil de perfusion de collagénase.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.0-inch 20 G Intra Venous (IV) catheter | Terumo, SOmerset, NJ, USA | SR-OX2051CA | |
| 2–3-inch perfuion tray with a hole in the center | customized; made in house | ||
| 405/520 viability dye | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-205 | |
| 4-inch regular curved dressing forceps | Fisher Brand | FS16-100-110 | |
| 5-0 Perma-Hand silk suture | Ethicon, Raritan, NJ, USA | A182H | |
| Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluorà 488 | MBL International, Woburn, MA, USA | D317-A48 | |
| BSA stock | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
| Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-118-407 | |
| CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-007 | |
| Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-803 | |
| Collagen type I | Corning, Corning, NY, USA | 354236 | |
| Collagenase II | Gibco, Waltham, MA, USA | 17101-015 | |
| Endothelial cells growth medium | ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA | 211-500 | |
| FcR blocking reagent, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-575 | |
| FlowJo software, version 10.6 | Becton, Dickinson and Company | ||
| Hardened Fine scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14091-11 | |
| Heated (37 °C) and humidified recirculating perfusion apparatus equipped with Oxygen injection at a rate of 10psi. | customized; made in house | ||
| Hitachi S 4700 scanning electron microscope | Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA | SEM096 | |
| LS columns | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-401 | |
| MACS pre-separation filters (70 μm) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-095-823 | |
| MACS rinsing buffer | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
| MACS Smart Strainer (70 μm) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-098-462 | |
| MACSQunt flow cytometer | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | ||
| Millicell Cell Culture Insert | Millipore Sigma, Burlington, MA, USA | PITP01250 | |
| Nexcelom cell counter | Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, USA | Cellometer Auto T4 Plus | |
| Percoll | GE Healthcare, Chicago, IL, USA | 17-0891-01 | |
| Surgical scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14001-12 | |
| Very small curved dressing forceps | F.S.T, Foster city, CA, USA | 11063-07 |
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