Summary
Hier schetsen en demonstreren we een protocol voor primaire muis lever sinusoïdale endotheelcel (LSEC) isolatie. Het protocol is gebaseerd op levercollageaseperfusie, niet-parenchymale celzuivering door centrifugeren met lage snelheid en CD146 magnetische kraalselectie. We fenotyperen en karakteriseren deze geïsoleerde LSEC's ook met behulp van flowcytometrie en scanning elektronenmicroscopie.
Abstract
Lever sinusoïdale endotheelcellen (LSEC's) zijn gespecialiseerde endotheelcellen op het grensvlak tussen de circulatie en het leverparenchym. LSEC's hebben een duidelijke morfologie die wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van fenestrae en de afwezigheid van keldermembraan. LSEC's spelen een essentiële rol bij veel pathologische aandoeningen in de lever, waaronder metabole ontregeling, ontsteking, fibrose, angiogenese en carcinogenese. Er is echter weinig gepubliceerd over de isolatie en karakterisering van de LSEC's. Hier bespreekt dit protocol de isolatie van LSEC van zowel gezonde als niet-alcoholische leververvetting (NAFLD) muizen. Het protocol is gebaseerd op collagenaseperfusie van de lever van de muis en magnetische kralen positieve selectie van niet-parenchymale cellen om LSEC's te zuiveren. Deze studie karakteriseert LSEC's met behulp van specifieke markers door flowcytometrie en identificeert de karakteristieke fenotypische kenmerken door scanning elektronenmicroscopie. LSEC's die volgens dit protocol zijn geïsoleerd, kunnen worden gebruikt voor functionele studies, waaronder adhesie- en permeabiliteitstests, evenals downstreamstudies voor een bepaald interessetraject. Bovendien kunnen deze LSEC's worden samengevoegd of afzonderlijk worden gebruikt, waardoor multi-omics gegevens kunnen worden gegenereerd, waaronder RNA-seq bulk of eencellig, proteomisch of fosfo-proteomics en assay voor Transposase-Toegankelijk Chromatine met behulp van sequencing (ATAC-seq), onder anderen. Dit protocol zal nuttig zijn voor onderzoekers die de communicatie van LSEC's met andere levercellen in gezondheid en ziekte bestuderen en een diepgaand begrip mogelijk maken van de rol van LSEC's in de pathogene mechanismen van acute en chronische leverbeschadiging.
Introduction
Lever sinusoïdale endotheelcellen (LSEC's) langs de hepatische sinusoïde wanden en zijn de meest voorkomende niet-parenchymale cellen in de lever1. LSEC's onderscheiden zich van andere capillaire endotheelcellen elders in het lichaam door de aanwezigheid van fenestrae en het ontbreken van een klassiek keldermembraan of een diafragma 2,3. Vandaar dat de LSEC's onderscheidende fenotypische en structurele kenmerken bezitten die hun permeabiliteit en endocytische capaciteit verbeteren om een verscheidenheid aan circulerende macromoleculen, waaronder lipiden en lipoproteïnen, te elimineren. LSEC's spelen een cruciale rol in de kruisverwijzing tussen parenchymale en niet-parenchymale cellen, zoals stellaatcellen en immuuncellen. LSEC's zijn de sleutel tot het handhaven van leverhomeostase door de stellaatcellen en Kupffer-cellen in een rustige statuste houden 4. LSEC's moduleren de samenstelling van hepatische immuuncellenpopulaties door adhesie en trans-endotheelmigratie van circulerende leukocyten te bemiddelen 5,6. Tijdens acute en chronische leverbeschadiging7, waaronder ischemie-reperfusieletsel (IRI)8, niet-alcoholische steatohepatitis (NASH)9 en hepatocellulair carcinoom (HCC), ondergaan LSEC's fenotypische veranderingen die bekend staan als capillarisatie gekenmerkt door defenestratie en vorming van keldermembraan10. Deze fenotypische veranderingen in LSEC's zijn geassocieerd met LSEC-disfunctie en de verwerving van protrombotische, pro-inflammatoire en profibrogene eigenschappen.
Er zijn verschillende methoden ontwikkeld voor de isolatie van LSEC's van muizenlever11. Sommige technieken zijn afhankelijk van het scheiden van niet-parenchymale en parenchymale cellen gevolgd door dichtheidsgradiëntcentrifugatie om de LSEC's te zuiveren van niet-parenchymale fracties. De beperking van deze methode is de aanwezigheid van contaminerende macrofagen in de laatste stappen van LSEC-isolatie, wat de zuiverheid van de geïsoleerde LSEC's zou kunnen beïnvloeden12. Dit protocol is gebaseerd op collagenaseperfusie van de muizenlever en CD146 + magnetische kralen positieve selectie van niet-parenchymale cellen om LSEC's te zuiveren. LSEC's die met deze methode zijn geïsoleerd, vertonen een hoge zuiverheid en behouden morfologie en levensvatbaarheid. Deze LSEC's zijn optimaal voor functionele studies, waaronder permeabiliteit en adhesietest, evenals downstream studies voor routes van belang. Bovendien, met de groeiende interesse in het genereren van grote datasets in zowel klinisch onderzoek als ontdekkingswetenschap, kunnen deze hoogwaardige LSEC's geïsoleerd uit zowel gezonde als zieke levers met niet-alcoholische steatohepatitis (NASH) of andere aandoeningen worden samengevoegd of afzonderlijk worden gebruikt, waardoor multi-omics gegevens kunnen worden gegenereerd en vergelijking tussen gezondheid en ziekte13,14 . Bovendien kunnen de geïsoleerde LSEC's worden gebruikt om zowel tweedimensionale als driedimensionale in vitro modellen zoals organoïden te ontwikkelen om de geactiveerde signaalroute in LSEC's en hun intercellulaire communicatie met andere levercellen te ontcijferen onder verschillende schadelijke stimuli en als reactie op verschillende therapeutische interventies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dierprotocollen werden uitgevoerd zoals goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Mayo Clinic. Acht weken oude C57BL / 6J mannelijke muizen werden gekocht bij Jackson Laboratory. Muizen werden gehuisvest in een temperatuurgecontroleerde 12:12-uur licht-donkercyclusfaciliteit met gratis toegang tot dieet.
1. Bereiding van met collageen beklede kweekschaal of -plaat
- Om 50 ml 0,02 mol / l azijnzuur te maken, voegt u 0,6 ml ijsazijn toe aan 49,4 ml H2O.
- Maak 50 μg/ml collageen type I in 0,02 mol/l azijnzuur. Verdunning is afhankelijk van de concentratie van de partij.
- Bestrijk 10 cm kweekschalen met 3 ml collageenoplossing. Incubeer bij kamertemperatuur (RT) gedurende 1 uur.
OPMERKING: Bij gebruik van een andere schaal of plaat voor cultuur, moet het volume van de coatingoplossing worden aangepast op basis van het kweekgebied, gebruik over het algemeen 6-10 μg / cm2. - Verwijder overtollig vocht van het gecoate oppervlak en was 3 keer met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Laat de gerechten aan de lucht drogen.
- Als de collageenoplossing niet steriel is, steriliseer dan de met collageen beklede schotels door blootstelling aan ultraviolet (UV) licht gedurende 10 minuten in een steriele weefselkweekkap.
2. Apparatuur instellen
- Stel het verwarmde en bevochtigde recirculatieperfusieapparaat in zoals aangegeven in figuur 1B.
- Spoel het perfusiesysteem gedurende 5 minuten met 10% bleekmiddel, gevolgd door steriel water gedurende nog eens 10 minuten.
- Giet de spoelvloeistof zoveel mogelijk af voordat u de collagenase-oplossing doorlaat.
- Injecteer collagenaseoplossing via het perfusiesysteem (zoals weergegeven in figuur 1B) om het voor te verwarmen bij 37 °C. Stel de pompsnelheid in op snelheid 1 zoals aangegeven op de draaiknop van de snelheidsregeling (gelijk aan 40 ml/min).
- Houd deze snelheid gedurende de hele procedure gelijk. Hergebruik de collagenase-oplossing in een gesloten circuit gedurende de dag van de LSEC-isolatie.
OPMERKING: De pompsnelheid is vastgesteld op 1 om mechanische druk te voorkomen die de biologische toestand van LSEC's zou kunnen verstoren.
3. Chirurgische ingreep
- Weeg de muis.
- Injecteer 90 mg/kg lichaamsgewicht ketamine en 10 mg/kg lichaamsgewicht xylazine intraperitoneaal (IP).
- Zodra de muis niet reageert op pijnlijke stimuli, zet u de muis vast aan het chirurgische oppervlak, zoals weergegeven in figuur 1B.
- Spuit de muizenbuik in met 70% ethanol. Maak met behulp van een chirurgische schaar een incisie van ~ 5 cm lang vanaf het onderste deel van de buik tot aan het xiphoid-proces.
- Maak vervolgens twee zijwaartse sneden met behulp van een kleine irisschaar aan elke kant van de buik om de buikorganen volledig bloot te leggen.
- Plaats de schede van de intraveneuze (IV) katheter onder de rug van het dier om de buik op te tillen en waterpas te zetten.
- Trek met behulp van een gewone gebogen verbandtang voorzichtig de darmen en de maag links van het dier af.
- Plaats een 5-0 chirurgische hechting onder de inferieure vena cava (IVC) net onder de blootgestelde linker nier. Bind een losse trekhaak in de hechtdraad.
- Plaats nog een 5-0 chirurgische hechting rond de hepatische poortader (PV) net boven het vertakkingspunt van de miltader van de lever-PV. Bind een losse trekhaak in de hechtdraad.
- Gebruik de PV-hechting als spanning en plaats de 20 G IV-katheter in de lever-PV 1 cm lager, waar deze zich vertakt naar de rechter en linker lever-PV.
- Schuif de katheter omhoog in de ader, maar houd deze onder het vertakkingsgebied. Laat het bloed door de katheter stromen totdat het begint uit te druipen.
- Gebruik een deel van de buffer A (tabel 1) in een intraveneuze (IV) fles boven het operatiegebied een infuuslijn en bevestig deze aan de katheter. Spoel de lever met deze oplossing terwijl u vermijdt dat er lucht in het systeem komt.
- Bind de hechting rond de inferieure vena cava onder de nier af. Hierdoor kan de lever retro perfuseren.
- Snijd de IVC onder de hechting om het dier te laten bloeden.
OPMERKING: Deze stap moet snel worden uitgevoerd om congestie van de lever te voorkomen. - Zet de IV-katheter vast met de PV-hechting.
- Eenmaal doordrenkt, snijdt u de maag, darmen, milt en andere ingewanden weg die aan de lever zijn bevestigd.
- Snijd het diafragma en de grote vaten weg uit de thoracale holte. Verwijder de lever van het dier en plaats deze op de perfusiebak.
- Verwijder voorzichtig de infuuslijn en sluit de collagenase-oplossing aan in de recirculatiekamer.
OPMERKING: Stap 3.16-3.18 moet binnen 5 minuten worden uitgevoerd, zodat de lever niet te lang wordt doordrenkt met Buffer A. Pas op dat u geen luchtbellen in de lever toelaat. - Laat de lever perfuseren totdat de capsule gevlekt wordt en papperig lijkt (10-15 min of meer, periode varieert afhankelijk van de verschillende partijen collagenase).
- Terwijl de lever in perfusie is, moet u ervoor zorgen dat het dier is overleden voordat u het in een obductiezak gooit.
- Eenmaal verteerd, verwijder de lever uit de kamer en plaats het in een petrischaaltje van 10 cm met ongeveer 20 ml serumvrije Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM).
- Haal de lever voorzichtig uit elkaar met een paar pipetpunten en gooi de galboom weg.
- Filtreer de leversuspensie door een celzeef van 70 μm in een conische buis van 50 ml.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 50 x g gedurende 2 minuten bij RT. Verzamel het supernatant dat niet-parenchymale levercellen bevat.
OPMERKING: Hepatocyten worden neergeslagen in de pellet, die verder kan worden gezuiverd met behulp van gradiëntcentrifugatie zoals eerder beschreven15.
4. Scheiding van niet-parenchymale levercellen en LSEC-zuivering
OPMERKING: Zuiver de CD146+ LSECs met behulp van de immunomagnetische kralen, volgens de instructies van de fabrikant.
- Centrifugeer het supernatant bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Verzamel de celkorrel en resuspend in 1 ml isolatiebuffer (tabel 1), bepaal het celnummer met behulp van een automatische celteller volgens de instructies van de fabrikant.
- Centrifugeer de celsuspensie gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 300 x g en zuig het supernatant volledig op.
- Resuspend de pellet met 90 μL isolatiebuffer per 107 totale cellen.
- Voeg 10 μL CD146 magnetische kralen toe per 107 totale cellen. Meng goed en incubeer gedurende 15 min bij 4 °C.
- Om de cellen te wassen, voegt u 1-2 ml isolatiebuffer per 107 cellen toe, centrifugeert u gedurende 10 minuten bij 300 x g en zuigt u het supernatant volledig op.
- Resuspend tot 109 cellen in 500 μL isolatiebuffer (tabel 1).
OPMERKING: Voor hogere celnummers kunt u het buffervolume dienovereenkomstig opschalen. - Bereid de scheidingskolom voor, spoel deze af met 3 ml isolatiebuffer.
- Breng de celsuspensie aan op de kolom gestapeld met voorscheidingsfilters van 70 μm.
- Was de kolom 3 keer met de 3 ml isolatiebuffer.
OPMERKING: Bij het wassen van de kolom moet de isolatiebuffer worden toegevoegd zodra het kolomreservoir leeg is. - Verwijder de kolom uit de separator en plaats deze op een centrifugebuis van 15 ml. Pipetteer 5 ml isolatiebuffer op de kolom.
- Om de magnetische kralen gelabelde cellen te herstellen, duwt u de zuiger stevig in de kolom om de cellen weg te spoelen.
- Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. LSEC's zijn klaar voor microscopisch onderzoek en downstream-analyse.
5. LSEC-immunofenotypering en zuiverheidsbeoordeling door flowcytometrie
- Bepaal het celaantal van geïsoleerde LSEC's met behulp van een automatische celteller volgens de instructies van de fabrikant.
- Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 300 x g , zuig het supernatant volledig op.
- Neem 1 x 106 cellen/buis en resuspend met 90 μL kleuringsbuffer (tabel 1).
- Voeg 10 μL/buisje muis-FcR-blok en 1 μL levensvatbaarheidskleurstof toe, incubeer bij 4 °C gedurende 10 minuten.
- Kleur de cellen met een combinatie van CD45, CD146 en stabiline-2 antilichamen verdund op 1:50 met kleuringsbuffer. Incubeer bij 4 °C gedurende 20 min.
- Was de cellen met 5 ml kleurbuffer en centrifugeer gedurende 10 minuten op 300 x g en zuig het supernatant vervolgens volledig op.
- Resuspend de cellen met 300 μL kleuringsbuffer en loop door de flowcytometer.
6. LSEC-cultuur en -onderzoek
- Zaad 1 x 106 cellen/put in een 6-well plaat en kweek het met endotheelcellen groeimedium bestaande uit 5% foetaal runderserum (FBS), 1% endotheelcellen groeisupplement en 1% primocine-oplossing.
- Onderzoek de geïsoleerde LSEC's door middel van lichtmicroscopie. Verkrijg helderveldbeelden met een vergroting van 10x.
7. Morfologie en fenestrae-onderzoek van LSEC's door scanning elektronenmicroscopie
- Pre-coat de celkweek inserts (3 μm poriegrootte) met collageenoplossing.
- Kweekgeïsoleerde LSEC's (120.000 cellen) op de insert met groeimedium voor endotheelcellen in een 24-putplaat bij 37 °C warme en bevochtigde atmosfeer. Laat cellen bezinken en hecht gedurende 2 uur.
- Voeg voor celfixatie een equivalent volume voorgewarmd bij 37 °C Trumps fixatief toe aan de celkweekmedia.
- Vervang na incubatie gedurende 10 minuten het fixeermiddel van 50% verdund door het fixatief van onverdunde Trump.
- Fixeer de cellen in Trump-fixatief gedurende 2 uur en incubeer vervolgens gedurende 1 uur in 1% osmiumtetroxiden.
- Ga verder met het uitdrogen van monsters, drogen in een droogapparaat met kritieke punten, montage, sputtercoating en onderzoek met behulp van een scanning-elektronenmicroscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Experimentele schema's en uitrustingsopstelling:
In dit protocol werd de lever van de muis verteerd met behulp van een gesloten perfusiecircuit, waarna niet-parenchymale cellen en hepatocyten werden gescheiden door centrifugering met lage snelheid bij 50 x g gedurende 2 minuten. Primaire LSEC's werden geïsoleerd met behulp van CD146 magnetische kralenselectie uit de niet-parenchymale fractie. De experimentele schema's zijn weergegeven in figuur 1A. De canule werd door de PV geplaatst terwijl de inferieure vena cava werd vastgebonden om een unidirectionele perfusie van collagenase door de lever te garanderen (figuur 1B). De eigen perfusiekamer is uitgerust met een verwarmings- en bevochtigingssysteem om een warme en bevochtigde lucht van 37-40 °C te garanderen. Het geperfuseerde collagenase circuleert door een gesloten systeem en kan tijdens de isolatiedag worden hergebruikt voor twee of drie muizen om de isolatie kosteneffectiever te maken.
Beoordeling van de zuiverheid van geïsoleerde LSEC's en oppervlaktemarkers door middel van flowcytometrie:
De zuiverheid van de geïsoleerde LSEC's werd beoordeeld door gebruik te maken van goed gekarakteriseerde specifieke LSEC-oppervlaktemarkers CD146 en stabiline-2 16,17,18. Gekleurde cellen werden geanalyseerd op een flowcytometer; gegevens werden geanalyseerd met behulp van FlowJo-software.
De LSEC-populatie werd gated (figuur 2A) en analyseerde singlets voor de volgende gating-strategie; levensvatbare cellen werden gedefinieerd met behulp van levensvatbaarheidskleurstofkleuring voordat cellen met specifieke markers werden geëtiketteerd (figuur 2B). Vervolgens werd de CD45-populatie afgesloten om elke besmetting van immuuncellen uit te sluiten. De geïsoleerde LSEC's bereikten een levensvatbaarheid van 94,8% (figuur 2C). Het percentage CD45-cellen was 89,7% (figuur 2D) en 92,3% van de cellen waren CD146 en stabiline-2 dubbelpositief (CD45-CD146+stabiline-2+) LSECs (figuur 2E).
Morfologie van de geïsoleerde LSEC's:
De geïsoleerde LSEC's werden gezaaid in een 6-well plaat op 1 x 106 cellen/put, gekweekt in een volledig groeimedium en onderzocht door lichtmicroscopie na 6 uur cultuur (figuur 3A). LSEC's werden op een 3 μm poriegrote kweekinzet geplateerd om de LSEC's fenestrae te visualiseren met behulp van scanning elektronenmicroscoop (SEM). Na fixatie en verwerking werden de fenestrae geïdentificeerd, zoals weergegeven in figuur 3B. Zoals eerder gemeld, verliezen LSEC's hun fenestrae in cultuur van de ene op de andere dag19; daarom wordt aanbevolen om de cellen zo snel mogelijk na de isolatie te verwerken voor downstream-onderzoeken om dedifferentiatie in vitro te voorkomen.
Figuur 1: Experimentele schema's en opstelling van apparatuur. (A) Experimentele schema's zijn ontworpen met behulp van Bio render. (B) Installatie en proces van apparatuur. De lever werd geoogst en toegediend in een gesloten collagenaseperfusieapparaat. De lever werd vervolgens overgebracht in een schaal en gedissocieerd. De leversuspensie werd verzameld. De niet-parenchymale celfractie werd gescheiden door centrifugatie bij 50 x g gedurende 2 min. LSEC's werden gezuiverd met behulp van magnetische kralen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Beoordeling van de zuiverheid van geïsoleerde LSECs en oppervlaktemarkers door middel van flowcytometrie. Data-analyse en gating strategie zoals getoond, (A) gated LSECs en (B) singlets op basis van forward scatter (FSC)/side scatter (SSC). Geïsoleerde LSEC's werden gekleurd met een levensvatbaarheidskleurstof en een combinatie van CD45-, CD146- en stabiline-2-antilichamen. Singlets werden gated en geanalyseerd, (C) levensvatbare LSEC's werden gated op (D) CD45 populatie en geanalyseerd op (E) CD146 en stabilin-2 expressie. Alle poorten werden bepaald door fluorescentie minus één (FMO). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Morfologie van geïsoleerde LSEC's. (A) Helder veldbeeld van gekweekte LSEC's. Geïsoleerde LSEC's werden gedurende 6 uur in het volledige groeimedium gekweekt en onderzocht met lichtmicroscopie (schaalbalk 100 μm). (B) LSEC werd onderzocht met een scanning elektronenmicroscoop (SEM). Witte pijlen geven LSEC fenestrae aan (Schaalbalk, linkerpaneel 5 μm, rechterpaneel 1 μm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| KRH stock oplossing (10x) | |
| Reagentia | Concentratie |
| NaCl | 1,15 M |
| HEPES (vrij zuur) | 0,2 m |
| Kcl | 0,05 M |
| KH2PO4 | 0,01 M |
| Buffer A | |
| Reagentia | Concentratie |
| KRH-oplossing, PH=7,4 | 1x |
| EGTA | 0,5 mM |
| Stel PH in op 7,4, filter voor gebruik door een filter van 0,2 μm. | |
| Bewaard bij kamertemperatuur gedurende maximaal 6 maanden. | |
| Buffer B | |
| KRH-oplossing, PH=7,4 | 1x |
| CaCl2 Zoekertjes | 1mm |
| Stel PH in op 7,4, filter voor gebruik door een filter van 0,2 μm. | |
| Bewaard bij kamertemperatuur gedurende maximaal 6 maanden. | |
| Collagenase oplossing | |
| Reagentia | Concentratie |
| Buffer B, PH=7,4 | 125 ml |
| Collagenase | 35-40 mg, voeg BSA toe tot 100 mg |
| Percoll oplossing | |
| Reagentia | Concentratie |
| Percoll | 22,5 ml |
| PBS (10x), PH=7,4 | 2,5 ml |
| Isoalisatie/kleuringsbuffer | |
| Reagentia | Concentratie |
| MACS spoelbuffer | 1250 ml |
| BSA voorraad | 125 ml |
Tabel 1: Buffers recept. De tabel bevat de samenstelling van de buffers en oplossingen die in dit onderzoek zijn gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In het huidige manuscript beschrijven we een protocol voor LSEC-isolatie van muizenlever bestaande uit tweestaps collagenaseperfusie en daaropvolgende magnetisch geactiveerde celsortering (MACS). Dit protocol bestaat uit de volgende drie stappen: (1) Perfusie door de PV met een calciumvrije buffer gevolgd door een collagenase-bevattende buffer om leverceldispersie te bereiken; (2) Uitsluiting van hepatocyten met centrifugeren met lage snelheid; en (3) MACS-gebaseerde positieve selectie van LSEC's uit niet-parenchymale cellen (NPC's) met behulp van anti-CD146 magnetische kralen. De hele procedure kon binnen 3 uur worden voltooid. Bovendien bedragen de kosten voor deze procedure, inclusief alle verbruiksartikelen, ongeveer 150 USD per muis, wat suggereert dat deze methode van LSEC-isolatie over het algemeen efficiënt en kosteneffectief is. We gebruiken stappen (1) en (2) ook voor isolatie van primaire muishepatocyten, wat buiten het bestek van het huidige manuscript valt.
Er zijn een paar kritieke stappen in portale cannulatie en leverperfusie: (i) Katheterpositionering: de kathetertip moet niet minder dan 3 mm distale worden geplaatst ten opzichte van de PV-bifurcatie van een volwassen muis, die meestal wordt geïdentificeerd in het hilum van de lever. Diepe plaatsing van de kathetertip in de PV zal de perfusie van sommige lobben van de lever in gevaar brengen. Slechte perfusie van een kwab manifesteert zich als een afwezigheid van een kleurverandering van de kwab en kan worden verholpen als deze onmiddellijk wordt opgemerkt door een lichte herpositionering van de katheter in de distale PV. Deze manoeuvre zou mogelijk de kwabperfusie kunnen optimaliseren. ii) Luchtbellen: de infusieroute tussen de pomp en het PV moet volledig vrij van luchtbellen worden gehouden. Minieme luchtinvoer in de PV kan een luchtembolie veroorzaken, wat resulteert in onvolledige leverperfusie. Om lucht in de katheter te verwijderen na het verwijderen van de binnenste naald, wordt Buffer A geïnjecteerd met een spuit proximaal aan de bel om eventuele lucht te verdrijven voordat de infusielijn op de katheter wordt aangesloten. (iii) Collagenasesterkte: Om de collagenase-activiteit tijdens de perfusie te behouden, is het essentieel om ervoor te zorgen dat buffer B geïnfundeerd in de PV de precieze concentratie collagenase en pH heeft en op ongeveer 37 °C wordt gehouden. Zoals te zien is in figuur 1, wordt een aangepaste kamer gebruikt om het hele perfusiesysteem in een warme en bevochtigde atmosfeer van 37 °C te houden; bovendien wordt de zuurstoftoevoer gehandhaafd tijdens collagenaseperfusie om volledige spijsvertering te bereiken. Een alternatieve optie omvat een waterbad om de collagenase-oplossing20 voor te verwarmen en een open collagenaseperfusiesysteem in situ waarbij de collagenase-oplossing uit de lever loopt via de snee IVC21.
Hoewel het protocol relatief gedurfde katheters (20 G) gebruikt om een adequate perfusiestroom te garanderen, zal een dunnere katheter ook goed werken op basis van eerdere rapporten 22,23,24. Het is echter soms moeilijk om de PV met succes te cannuleren, vooral wanneer muizen worden gebruikt voor specifieke ziektemodellen of als ze PV-anomalieën hebben. Als PV-cannulatie faalt, is mechanische en enzymatische leververtering met behulp van een enzymkit en zachte weefseldissociator een alternatieve methode voor stappen (1) en (2) om niet-parenchymale cel (NPC) suspensie te verkrijgen. We hebben bevestigd dat de celopbrengst en levensvatbaarheid in deze alternatieve methode van dissociatie zonder leverperfusie vergelijkbaar was met de oorspronkelijke methode (gegevens niet getoond). Portaladerperfusie voor leververtering is gebruikt door anderen en ons 13,16,20. Bovendien vermijdt deze methode het theoretische risico van fenotypische of functionele veranderingen van LSEC's veroorzaakt door mechanische kracht tijdens de vertering van de lever. Daarom wordt het gebruik van de pv-perfusie-gebaseerde methode die in dit protocol wordt afgebeeld tot nu toe ten zeerste aanbevolen.
Hier worden de optimale LSEC-opbrengst en zuiverheid bij het gebruik van het huidige protocol weergegeven. We verkregen ongeveer 2-5 x 106 cellen per muis van zowel gezonde muizen als muizen met dieet-geïnduceerde NASH met behulp van het huidige protocol. Wat zuiverheid betreft, ondersteunt de positiviteit van dezelfde oppervlaktemarker die wordt gebruikt voor immunomagnetische scheiding (CD146) de nauwkeurigheid van onze isolatietechniek. Daarnaast zijn er verschillende goed erkende LSEC-oppervlaktemarkers, zoals lymfevaten endotheliale hyaluronzuurreceptor 1 (LYVE-1), CD32b en stabiline-2. Er bestaan nog steeds controverses rond deze markeringen; bijvoorbeeld i) LYVE-1 is ook aanwezig in lymfatische endotheelcellen en ii) LSEC's in een periportale gebied missen CD32b-expressie18. Om de zuiverheid van deze geïsoleerde LSEC's met flowcytometrie te onderzoeken, werd stabiline-2 gebruikt als een gevestigde specifieke LSEC-marker naast CD146. Met behulp van deze methodologie bevestigden we dat de geïsoleerde LSEC's >94% levensvatbaarheid en >90% zuiverheid hadden (figuur 2). Het LSEC-specifieke fenotype van de geïsoleerde cellen werd verder bevestigd met behulp van SEM, waarbij de meeste cellen fenestrae hebben (figuur 3B), het karakteristieke morfologische kenmerk van LSEC's.
Onder de isolatiemethoden van LSEC's is immunomagnetische kralenselectie de techniek die het meest wordt gebruikt om de LSEC's te isoleren van de NPC-fractie 24,25,26,27. Andere methoden omvatten daarentegen centrifugale elutriatie en selectieve adhesie-gebaseerde scheiding 22,28,29. Van de niet-immunomagnetische methoden is aangetoond dat ze hoge opbrengsten van LSEC's leveren (ongeveer 9 x 106 cellen per muis)11. Daarom zou een relatief lagere opbrengst van geïsoleerde LSEC's een beperking van het huidige protocol kunnen zijn. Aan de andere kant vereisen de niet-immunomagnetische selectiegebaseerde methoden een hoge technische expertise en vertonen ze soms inconsistente resultaten op celopbrengsten en zuiverheid11, terwijl de op immunomagnetische selectie gebaseerde methode het voordeel heeft van consistente opbrengst en zuiverheid ten opzichte van andere bestaande methoden. Bovendien is voor op immunomagnetische kralenselectie gebaseerde celisolatie altijd de specificiteit van de gebruikte celoppervlakmarkers een punt van zorg. CD31, dat eerder is gebruikt als marker voor immunomagnetische LSEC-scheiding, wordt bijvoorbeeld dominant uitgedrukt op het PV-endotheel en capillarized LSECs3. Hoewel cd146 ook tot expressie is gebracht op natural killer cellen en lever stellaatcellen 30,31,vermindert de hoge zuiverheid van LSEC's geïsoleerd met behulp van dit protocol de bezorgdheid over de specificiteit van de endotheelmarker CD146. Vergelijking van de voor- en nadelen van verschillende methodologieën voor LSEC-isolatie wordt elders besproken 11,18,32. Vergelijking van celopbrengsten en zuiverheid tussen andere methoden en deze methode valt buiten het bestek van het huidige manuscript en rechtvaardigt toekomstig onderzoek.
Tot slot presenteren we een primair muis LSEC-isolatieprotocol op basis van een van de meest gebruikte en geaccepteerde benaderingen. Geïsoleerde LSEC's vertonen een hoge zuiverheid en behouden functie. Bovendien is dit protocol efficiënt en toepasbaar op de gezonde muizenlever en de lever van verschillende ziektemuismodellen. Hoogwaardige LSEC's van deze muizen kunnen worden gebruikt voor het genereren van multiomicsdatasets 13,14. Deze aanpak vergemakkelijkt dus de identificatie van moleculaire mechanismen die de functie van LSEC reguleren en verbetert ons begrip van hun rol in intercellulaire communicatie in de lever bij gezondheid en ziekte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle auteurs hebben geen conflicten te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases van de NIH (1RO1DK122948 tot SHI) en het NIH Silvio O. Conte Digestive Diseases Research Core Centers P30-subsidiemechanisme (DK084567). Ondersteuning werd ook aan KF verleend door de Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Overseas Research Fellowships. We willen ook Dr. Gregory J. Gores en Steven Bronk bedanken voor hun oorspronkelijke ontwerp en optimalisatie van het collagenase-perfusieapparaat.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.0-inch 20 G Intra Venous (IV) catheter | Terumo, SOmerset, NJ, USA | SR-OX2051CA | |
| 2–3-inch perfuion tray with a hole in the center | customized; made in house | ||
| 405/520 viability dye | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-205 | |
| 4-inch regular curved dressing forceps | Fisher Brand | FS16-100-110 | |
| 5-0 Perma-Hand silk suture | Ethicon, Raritan, NJ, USA | A182H | |
| Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluorà 488 | MBL International, Woburn, MA, USA | D317-A48 | |
| BSA stock | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
| Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-118-407 | |
| CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-007 | |
| Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-803 | |
| Collagen type I | Corning, Corning, NY, USA | 354236 | |
| Collagenase II | Gibco, Waltham, MA, USA | 17101-015 | |
| Endothelial cells growth medium | ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA | 211-500 | |
| FcR blocking reagent, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-575 | |
| FlowJo software, version 10.6 | Becton, Dickinson and Company | ||
| Hardened Fine scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14091-11 | |
| Heated (37 °C) and humidified recirculating perfusion apparatus equipped with Oxygen injection at a rate of 10psi. | customized; made in house | ||
| Hitachi S 4700 scanning electron microscope | Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA | SEM096 | |
| LS columns | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-401 | |
| MACS pre-separation filters (70 μm) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-095-823 | |
| MACS rinsing buffer | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
| MACS Smart Strainer (70 μm) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-098-462 | |
| MACSQunt flow cytometer | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | ||
| Millicell Cell Culture Insert | Millipore Sigma, Burlington, MA, USA | PITP01250 | |
| Nexcelom cell counter | Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, USA | Cellometer Auto T4 Plus | |
| Percoll | GE Healthcare, Chicago, IL, USA | 17-0891-01 | |
| Surgical scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14001-12 | |
| Very small curved dressing forceps | F.S.T, Foster city, CA, USA | 11063-07 |
References
- Morin, O., Goulet, F., Normand, C. Liver sinusoidal endothelial cells: isolation, purification, characterization and interaction with hepatocytes. Revisiones Sobre Biologia Celular: RBC. 15, 1-85 (1988).
- Ibrahim, S. H. Sinusoidal endotheliopathy in nonalcoholic steatohepatitis: therapeutic implications. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 321 (1), 67-74 (2021).
- Poisson, J., et al. Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases. Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).
- Marrone, G., Shah, V. H., Gracia-Sancho, J. Sinusoidal communication in liver fibrosis and regeneration. Journal of Hepatology. 65 (3), 608-617 (2016).
- Shetty, S., Lalor, P. F., Adams, D. H. Liver sinusoidal endothelial cells - gatekeepers of hepatic immunity. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 15 (9), 555-567 (2018).
- Smedsrød, B., Pertoft, H., Gustafson, S., Laurent, T. C. Scavenger functions of the liver endothelial cell. Biochemical Journal. 266 (2), 313-327 (1990).
- DeLeve, L. D. Liver sinusoidal endothelial cells in hepatic fibrosis. Hepatology. 61 (5), 1740-1746 (2015).
- Dar, W. A., Sullivan, E., Bynon, J. S., Eltzschig, H., Ju, C. Ischaemia reperfusion injury in liver transplantation: Cellular and molecular mechanisms. Liver International. 39 (5), 788-801 (2019).
- Furuta, K., Guo, Q., Hirsova, P., Ibrahim, S. H. Emerging Roles of Liver Sinusoidal Endothelial Cells in Nonalcoholic Steatohepatitis. Biology. 9 (11), Basel. 395 (2020).
- Wu, L. Q., et al. Phenotypic and functional differences between human liver cancer endothelial cells and liver sinusoidal endothelial cells. Journal of Vascular Research. 45 (1), 78-86 (2008).
- Meyer, J., Gonelle-Gispert, C., Morel, P., Bühler, L. Methods for isolation and purification of murine liver sinusoidal endothelial cells: A systematic review. PLoS One. 11 (3), 0151945 (2016).
- Meyer, J., Lacotte, S., Morel, P., Gonelle-Gispert, C., Buhler, L. An optimized method for mouse liver sinusoidal endothelial cell isolation. Experimental Cell Research. 349 (2), 291-301 (2016).
- Furuta, K., et al. Lipid-induced endothelial vascular cell adhesion molecule 1 promotes nonalcoholic steatohepatitis pathogenesis. Journal of Clinical Investigation. 131 (6), (2021).
- Guo, Q., et al. Integrin β(1)-enriched extracellular vesicles mediate monocyte adhesion and promote liver inflammation in murine NASH. Journal of Hepatology. 71 (1), 1193-1205 (2019).
- Hirsova, P., Ibrahim, S. H., Bronk, S. F., Yagita, H., Gores, G. J. Vismodegib suppresses TRAIL-mediated liver injury in a mouse model of nonalcoholic steatohepatitis. PLoS One. 8 (7), 70599 (2013).
- Schrage, A., et al. Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1. Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).
- Olsavszky, V., et al. Exploring the transcriptomic network of multi-ligand scavenger receptor Stabilin-1- and Stabilin-2-deficient liver sinusoidal endothelial cells. Gene. 768, 145284 (2021).
- DeLeve, L. D., Maretti-Mira, A. C. Liver sinusoidal endothelial cell: An update. Seminars in Liver Disease. 37 (4), 377-387 (2017).
- DeLeve, L. D., Wang, X., Hu, L., McCuskey, M. K., McCuskey, R. S. Rat liver sinusoidal endothelial cell phenotype is maintained by paracrine and autocrine regulation. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 287 (4), 757-763 (2004).
- Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
- Ishiguro, K., Yan, I. K., Patel, T. Isolation of tissue extracellular vesicles from the liver. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e58649 (2019).
- Topp, S. A., Upadhya, G. A., Strasberg, S. M. Cold preservation of isolated sinusoidal endothelial cells in MMP 9 knockout mice: effect on morphology and platelet adhesion. Liver Transplantation. 10 (8), 1041-1048 (2004).
- Katz, S. C., Pillarisetty, V. G., Bleier, J. I., Shah, A. B., DeMatteo, R. P. Liver sinusoidal endothelial cells are insufficient to activate T cells. Journal of Immunology. 173 (1), 230-235 (2004).
- Liu, W., et al. Sample preparation method for isolation of single-cell types from mouse liver for proteomic studies. Proteomics. 11 (17), 3556-3564 (2011).
- Do, H., Healey, J. F., Waller, E. K., Lollar, P. Expression of factor VIII by murine liver sinusoidal endothelial cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (28), 19587-19592 (1999).
- Schrage, A., et al. Enhanced T cell transmigration across the murine liver sinusoidal endothelium is mediated by transcytosis and surface presentation of chemokines. Hepatology. 48 (4), 1262-1272 (2008).
- Chou, C. H., et al. Lysophosphatidic acid alters the expression profiles of angiogenic factors, cytokines, and chemokines in mouse liver sinusoidal endothelial cells. PLoS One. 10 (3), 0122060 (2015).
- Deleve, L. D. Dacarbazine toxicity in murine liver cells: a model of hepatic endothelial injury and glutathione defense. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 268 (3), 1261-1270 (1994).
- Smedsrød, B., Pertoft, H., Eggertsen, G., Sundström, C. Functional and morphological characterization of cultures of Kupffer cells and liver endothelial cells prepared by means of density separation in Percoll, and selective substrate adherence. Cell and Tissue Research. 241 (3), 639-649 (1985).
- Despoix, N., et al. Mouse CD146/MCAM is a marker of natural killer cell maturation. European Journal of Immunology. 38 (10), 2855-2864 (2008).
- Strauss, O., Phillips, A., Ruggiero, K., Bartlett, A., Dunbar, P. R. Immunofluorescence identifies distinct subsets of endothelial cells in the human liver. Scientific Reports. 7, 44356 (2017).
- Halpern, K. B., et al. Paired-cell sequencing enables spatial gene expression mapping of liver endothelial cells. Nature Biotechnology. 36 (10), 962-970 (2018).
