Summary
Her skitserer og demonstrerer vi en protokol for primær muselever sinusformet endotelcelle (LSEC) isolering. Protokollen er baseret på leverkollagennaseperfusion, ikke-parenkymal cellerensning ved centrifugering ved lavhastighedscentrifugering og CD146 magnetisk perlevalg. Vi fænotype og karakteriserer også disse isolerede LDC'er ved hjælp af flowcytometri og scanningselektronmikroskopi.
Abstract
Lever sinusformede endotelceller (LDC'er) er specialiserede endotelceller placeret ved grænsefladen mellem cirkulationen og leverparenchymen. LSDC'er har en særskilt morfologi karakteriseret ved tilstedeværelsen af fenestrae og fraværet af kældermembran. LDC'er spiller væsentlige roller i mange patologiske lidelser i leveren, herunder metabolisk dysregulering, inflammation, fibrose, angiogenese og carcinogenese. Der er dog ikke offentliggjort meget om isolationen og karakteriseringen af LDC'erne. Her diskuterer denne protokol isoleringen af LSEC fra både sunde og ikke-alkoholiske fedtleversygdomme (NAFLD) mus. Protokollen er baseret på kollagenaseperfusion af museleveren og magnetiske perler positiv selektion af ikke-parenkymale celler for at rense LDC'er. Denne undersøgelse karakteriserer LDC'er ved hjælp af specifikke markører ved flowcytometri og identificerer de karakteristiske fænotypiske træk ved scanning af elektronmikroskopi. LDC'er isoleret efter denne protokol kan bruges til funktionelle undersøgelser, herunder adhæsions- og permeabilitetsassays, samt downstream-undersøgelser for en bestemt vej af interesse. Derudover kan disse LDC'er samles eller anvendes individuelt, hvilket muliggør multi-omics-datagenerering, herunder RNA-seq bulk eller enkeltcelle, proteomisk eller phospho-proteomik og assay til transposase-tilgængelig kromatin ved hjælp af sekventering (ATAC-seq), blandt andre. Denne protokol vil være nyttig for efterforskere, der studerer LDC'ers kommunikation med andre leverceller inden for sundhed og sygdom og giver en dybdegående forståelse af LDC'ernes rolle i de patogene mekanismer for akut og kronisk leverskade.
Introduction
Lever sinusformede endotelceller (LDC'er) linjer leverens sinusoidvægge og er de mest rigelige ikke-parenkymale celler i leveren1. LDC'er adskiller sig fra andre kapillære endotelceller andre steder i kroppen ved tilstedeværelsen af fenestrae og manglen på en klassisk kældermembran eller en membran 2,3. Derfor har LDC'erne karakteristiske fænotypiske og strukturelle egenskaber, der forbedrer deres permeabilitet og endocytiske kapacitet til at eliminere en række cirkulerende makromolekyler, herunder lipider og lipoproteiner. LSDC'er spiller en central rolle i krydstalen mellem parenkymale og ikke-parenkymale celler, såsom stellatceller og immunceller. LSDC'er er nøglen til at opretholde leverhomeostase ved at holde stellatcellerne og Kupffer-cellerne i en hvilende status4. LDC'er modulerer sammensætningen af leverimmuncellepopulationer ved at formidle vedhæftning og transendotelmigration af cirkulerende leukocytter 5,6. Under akut og kronisk leverskade7, herunder iskæmi-reperfusionsskade (IRI)8, ikke-alkoholisk steatohepatitis (NASH)9 og hepatocellulært carcinom (HCC), gennemgår LDC'er fænotypiske ændringer kendt som kapillarisering karakteriseret ved defenestration og dannelse af kældermembran10. Disse fænotypiske ændringer i LDC'er er forbundet med LSECs dysfunktion og erhvervelse af protrombotiske, proinflammatoriske og profibrogene egenskaber.
Flere metoder til isolering af LDC'er fra muselever er blevet udviklet11. Nogle teknikker afhænger af adskillelse af ikke-parenkymale og parenkymale celler efterfulgt af densitetsgradientcentrifugering for at rense LDC'erne fra ikke-parenkymale fraktioner. Begrænsningen af denne metode er tilstedeværelsen af forurenende makrofager i de sidste trin af LSEC's isolering, hvilket kan påvirke renheden af de isolerede LDC'er12. Denne protokol er baseret på kollagenaseperfusion af museleveren og CD146+ magnetiske perler positiv selektion af ikke-parenkymale celler til rensning af LDC'er. LDC'er isoleret ved hjælp af denne metode viser høj renhed og bevaret morfologi og levedygtighed. Disse LDC'er er optimale til funktionelle undersøgelser, herunder permeabilitet og vedhæftningsassay, samt downstream-undersøgelser for veje af interesse. Med den stigende interesse for at generere store datasæt inden for både klinisk forskning og opdagelsesvidenskab kan disse LDC'er af høj kvalitet, der er isoleret fra både sunde og syge lever med ikke-alkoholisk steatohepatitis (NASH) eller andre tilstande, desuden samles eller bruges individuelt, hvilket muliggør multi-omics datagenerering og sammenligning mellem sundhed og sygdom13,14 . Derudover kan de isolerede LDC'er anvendes til at udvikle todimensionelle såvel som tredimensionelle in vitro-modeller som organoider til at dechiffrere den aktiverede signalvej i LDC'er og deres intercellulære kommunikation med andre leverceller under forskellige skadelige stimuli og som reaktion på forskellige terapeutiske interventioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreprotokoller blev udført som godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) fra Mayo Clinic. Otte uger gamle C57BL/6J hanmus blev købt fra Jackson Laboratory. Mus blev anbragt i et temperaturkontrolleret 12:12-timers lys-mørkt cyklusanlæg med fri adgang til kost.
1. Tilberedning af kollagenbelagt kulturskål eller tallerken
- For at fremstille 50 ml 0,02 mol /l eddikesyre tilsættes 0,6 ml iseddike til 49,4 mlH20.
- Lav 50 μg / ml kollagen type I i 0,02 mol / l eddikesyre. Fortynding afhænger af koncentrationen af partiet.
- Frakke 10 cm kulturretter med 3 ml kollagenopløsning. Inkuber ved stuetemperatur (RT) i 1 time.
BEMÆRK: Når du bruger en anden skål eller tallerken til dyrkning, skal volumenet af belægningsopløsning justeres baseret på kulturområde, brug generelt 6-10 μg /cm2. - Fjern overskydende væske fra den overtrukne overflade, og vask med fosfatbufret saltvand (PBS) 3 gange. Lad opvasken lufttørre.
- Hvis kollagenopløsningen ikke er steril, steriliseres de kollagenbelagte fade ved udsættelse for ultraviolet (UV) lys i 10 minutter i en steril vævskulturhætte.
2. Opsætning af udstyr
- Det opvarmede og befugtede recirkulerende perfusionsapparat opsættes som vist i figur 1B.
- Skyl perfusionssystemet med 10% blegemiddel i 5 minutter efterfulgt af sterilt vand i yderligere 10 minutter.
- Tøm skyllevæsken så meget som muligt, før collagenaseopløsningen perfuseres.
- Kollagenopløsningen tilføres gennem perfusionssystemet (som vist i figur 1B) for at forvarme den ved 37 °C. Indstil pumpehastigheden til hastighed 1 som vist på hastighedskontrolhjulet (svarende til 40 ml/min).
- Hold denne hastighed den samme under hele proceduren. Genbrug kollagenaseopløsningen, der køres i et lukket kredsløb i løbet af dagen for LSEC-isoleringen.
BEMÆRK: Pumpehastigheden er fastsat til 1 for at undgå mekanisk tryk, der kan forstyrre LSS biologisk tilstand.
3. Kirurgisk procedure
- Vej musen.
- 90 mg/kg legemsvægt ketamin og 10 mg/kg legemsvægt af xylazin intraperitonealt (IP).
- Når musen ikke er reaktiv over for smertefulde stimuli, skal musen fastgøres til den kirurgiske overflade, som vist i figur 1B.
- Sprøjt musens mave med 70% ethanol. Brug kirurgisk saks til at lave et snit på ~ 5 cm langt startende fra den nederste del af maven op til xiphoid-processen.
- Lav derefter to laterale snit ved hjælp af en lille irissaks på hver side af maven for fuldt ud at udsætte abdominale organer.
- Placer kappen af det intravenøse (IV) kateter under dyrets ryg for at løfte og udjævne maven.
- Brug en regelmæssig buet dressing tang, træk forsigtigt tarmene og maven ud til venstre for dyret.
- Placer en 5-0 kirurgisk sutur under den ringere vena cava (IVC) lige under den udsatte venstre nyre. Bind et løst træk i suturen.
- Placer en anden 5-0 kirurgisk sutur omkring leverportalvenen (PV) lige over miltvenens forgreningspunkt ud for lever-PV'en. Bind et løst træk i suturen.
- Brug PV-suturen som spænding til at indsætte 20 G IV-kateteret i lever-PV'en 1 cm under, hvor den forgrener sig til højre og venstre lever-PV.
- Skub kateteret op ad venen, men hold det under forgreningsområdet. Lad blodet bevæge sig ned i kateteret, indtil det begynder at dryppe ud.
- Med noget af buffer A (tabel 1) i en intravenøs (IV) flaske placeret over det kirurgiske område skal du bruge en IV-linje og fastgøre den til kateteret. Skyl leveren med denne opløsning, samtidig med at du undgår luftindtrængning i systemet.
- Bind suturen omkring den ringere vena cava under nyren. Dette vil gøre det muligt for leveren at retro perfuse.
- Skær IVC under suturen for at lade dyret bløde ud.
BEMÆRK: Dette trin skal udføres hurtigt for at undgå overbelastning af leveren. - Fastgør IV-kateteret med PV-suturen.
- Når perfusing, skære væk maven, tarmene, milten og andre indvolde, der er fastgjort til leveren.
- Skær membranen og de store kar væk fra brysthulen. Fjern leveren fra dyret og læg den på perfusionsbakken.
- Fjern forsigtigt IV-linjen og tilslut kollagenaseopløsningen i recirkulationskammeret.
BEMÆRK: Trin 3.16-3.18 skal udføres inden for 5 minutter, så leveren ikke bliver perfuseret for længe med buffer A. Vær meget forsigtig med ikke at tillade luftbobler i leveren. - Lad leveren perfuse, indtil kapslen bliver plettet og fremstår grødet (10-15 min eller mere, perioden varierer afhængigt af de forskellige partier af collagenase).
- Mens leveren er i perfusion, skal du sørge for, at dyret er dødt, før du bortskaffer det i en obduktionspose.
- Når den er fordøjet, skal du fjerne leveren fra kammeret og placere den i en 10 cm petriskål med ca. 20 ml serumfri Dulbeccos modified Eagle Medium (DMEM).
- Pluk forsigtigt leveren fra hinanden med et par pipettespidser og kassér galdetræet.
- Filtrer leversuspensionen gennem en 70 μm cellesil i et 50 ml konisk rør.
- Centrifugering af cellesuspensionen ved 50 x g i 2 minutter ved RT. Opsaml supernatanten indeholdende ikke-parenkymale leverceller.
BEMÆRK: Hepatocytter udfældes i pelleten, som kan renses yderligere ved hjælp af gradientcentrifugering som tidligere beskrevet15.
4. Adskillelse af ikke-parenkymale leverceller og LDC-oprensning
BEMÆRK: Rens CD146+ LDC'erne ved hjælp af de immunmagnetiske perler efter producentens anvisninger.
- Centrifugering af supernatanten ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Saml cellepillen og resuspender i 1 ml isolationsbuffer (tabel 1), bestem cellenummeret ved hjælp af en automatisk celletæller efter producentens anvisninger.
- Centrifugering af cellesuspensionen ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C, aspirer supernatanten fuldstændigt.
- Resuspend pellet med 90 μL isolationsbuffer pr. 107 celler i alt.
- Tilsæt 10 μL CD146 magnetiske perler pr. 107 celler i alt. Bland godt og inkuber i 15 minutter ved 4 °C.
- For at vaske cellerne tilsættes 1-2 ml isolationsbuffer pr. 107 celler, centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter og aspireres derefter supernatanten fuldstændigt.
- Resuspend op til 109 celler i 500 μL isolationsbuffer (tabel 1).
BEMÆRK: For højere celletal skal du opskalere buffervolumen i overensstemmelse hermed. - Forbered separationskolonnen, skyl den med 3 ml isolationsbuffer.
- Påfør cellesuspensionen på søjlen stablet med 70 μm præseparationsfiltre.
- Vask søjlen med 3 ml isolationsbuffer 3 gange.
BEMÆRK: Ved vask af søjlen skal isolationsbufferen tilføjes, så snart søjlebeholderen er tom. - Fjern søjlen fra separatoren, og anbring den på et 15 ml centrifugerør. Pipette 5 ml isolationsbuffer på søjlen.
- For at gendanne de magnetiske perler mærket celler skal du skubbe stemplet fast i søjlen for at skylle cellerne ud.
- Centrifuge ved 300 x g i 5 min ved 4 °C. LDC'er er klar til mikroskopisk undersøgelse og downstreamanalyse.
5. LDC'er immunophenotyping og renhedsvurdering ved flowcytometri
- Bestem cellenumrene på isolerede LDC'er ved hjælp af en automatisk celletæller efter producentens anvisninger.
- Centrifuger cellerne ved 300 x g i 5 min, aspirer supernatanten fuldstændigt.
- Tag 1 x 106 celler/rør og resupend med 90 μL farvningsbuffer (tabel 1).
- Tilsæt 10 μL/rør af mus FcR-blok og 1 μL levedygtighedsfarvestof, inkuber ved 4 °C i 10 minutter.
- Plet cellerne med en kombination af CD45, CD146 og stabilin-2 antistoffer fortyndet ved 1:50 med farvningsbuffer. Inkuber ved 4 °C i 20 minutter.
- Vask cellerne med 5 ml farvningsbuffer og centrifuge ved 300 x g i 10 minutter, og aspirer derefter supernatanten helt.
- Resuspend cellerne med 300 μL farvningsbuffer og løb gennem flowcytometeret.
6. LDC's kultur og undersøgelse
- Frø 1 x 106 celler/ brønd i en 6-brønds plade og kultur det med endotelceller vækstmedium bestående af 5% føtalt kvægserum (FBS), 1% endotelceller væksttilskud og 1% primocinopløsning.
- Undersøg de isolerede LCC'er ved lysmikroskopi. Få lyse feltbilleder med en 10x forstørrelse.
7. LSDC'er morfologi og fenestrae undersøgelse ved scanning elektronmikroskopi
- Forbetræk cellekulturindsatserne (3 μm porestørrelse) med kollagenopløsning.
- Kulturisolerede LDC'er (120.000 celler) på indsatsen med endotelceller vækstmedium i en 24-brønds plade ved 37 ° C varm og befugtet atmosfære. Lad cellerne slå sig ned og klæbe i 2 timer.
- Til cellefiksering skal du tilføje et tilsvarende volumen af forvarmet ved 37 ° C Trumps fikseringsmiddel til cellekulturmediet.
- Efter inkubation i 10 minutter erstattes 50% fortyndet Trumps fikseringsmiddel med ufortyndet Trumps fikseringsmiddel.
- Fastgør cellerne i Trump-fikseringsmiddel i 2 timer, og inkuber derefter i 1 time i 1% osmiumtetroxider.
- Fortsæt med prøver dehydrering, tørring i en kritisk punkttørringsanordning, montering, sputterbelægning og undersøgelse ved hjælp af et scanningselektronmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eksperimentelle skemaer og opsætning af udstyr:
I denne protokol blev muselever fordøjet ved hjælp af et lukket perfusionskredsløb, hvorefter ikke-parenkymale celler og hepatocytter blev adskilt ved centrifugering ved lav hastighed ved 50 x g i 2 minutter. Primære LDC'er blev isoleret ved hjælp af CD146 magnetiske perler udvælgelse fra den ikke-parenkymale fraktion. De eksperimentelle skemaer er vist i figur 1A. Kanylen blev anbragt gennem PV, mens den ringere vena cava blev bundet op for at sikre ensrettet perfusion af kollagenase gennem leveren (figur 1B). Det interne perfusionskammer er udstyret med et varme- og befugtningssystem for at sikre en 37-40 ° C varm og befugtet apparatluft. Den perfuserede kollagenase cirkulerer gennem et lukket system og kan genbruges til to eller tre mus i løbet af isolationsdagen for at gøre isoleringen mere omkostningseffektiv.
Vurdering af isolerede LDC'er renhed og overflademarkører ved flowcytometri:
Renheden af de isolerede LDC'er blev vurderet ved at anvende velkarakterierede specifikke LSEC-overflademarkører CD146 og stabilin-2 16,17,18. Farvede celler blev analyseret på et flowcytometer; data blev analyseret ved hjælp af FlowJo-software.
LSEC-populationen blev gated (figur 2A) og analyserede singlets for følgende gating-strategi; levedygtige celler blev defineret ved hjælp af farvning af levedygtighedsfarvestof, før celler blev mærket med specifikke markører (figur 2B). Derefter blev CD45-populationen lukket for at udelukke enhver immuncelleforurening. De isolerede LDC'er nåede 94,8% levedygtighed (figur 2C). Procentdelen af CD45-celler var 89,7% (figur 2D), og 92,3% af cellerne var CD146 og stabilin-2 dobbeltpositive (CD45-CD146 + stabilin-2+) LDC'er (figur 2E).
Morfologi af de isolerede LDC'er:
De isolerede LDC'er blev podet i en 6-brønds plade ved 1 x 106 celler/brønd, dyrket i et komplet vækstmedium og undersøgt ved lysmikroskopi efter 6 timers dyrkning (figur 3A). LSDC'er blev belagt på en 3 μm porestørrelse kulturindsats for at visualisere LDC'erne fenestrae ved at scanne elektronmikroskop (SEM). Efter fiksering og behandling blev fenestrae identificeret, som vist i figur 3B. Som tidligere rapporteret mister LDC'er deres fenestrae i kultur natten over19; Det anbefales derfor at behandle cellerne så hurtigt som muligt efter isolationen til downstream-undersøgelser for at undgå dedifferentiering in vitro.
Figur 1: Eksperimentelle skemaer og opsætning af udstyr. (A) Eksperimentelle skemaer blev designet ved hjælp af Bio render. (B) Opsætning og proces af udstyr. Leveren blev høstet og perfuseret i et lukket kollagenaseperfusionsapparat. Leveren blev derefter overført til en skål og dissocieret. Leversuspensionen blev indsamlet. Den ikke-parenkymale cellefraktion blev adskilt ved centrifugering ved 50 x g i 2 min. LDC'er blev renset ved hjælp af magnetiske perler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Vurdering af isolerede LDC'ers renhed og overflademarkører ved flowcytometri. Dataanalyse og gating-strategi som vist, (A) gated LSEC'er og (B) singlets baseret på forward scatter (FSC)/side scatter (SSC). Isolerede LDC'er blev farvet med et levedygtighedsfarvestof og en kombination af CD45-, CD146- og stabilin-2-antistoffer. Singlets blev gated og analyseret, (C) levedygtige LDC'er blev gated på (D) CD45-population og analyseret for (E) CD146 og stabilin-2-ekspression. Alle porte blev bestemt af fluorescens minus en (FMO). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Morfologi af isolerede LDC'er. (A) Lyst feltbillede af dyrkede LDC'er. Isolerede LDC'er blev dyrket i det komplette vækstmedium i 6 timer og undersøgt ved lysmikroskopi (Skalabjælke 100 μm). (B) LSEC blev undersøgt ved scanning af elektronmikroskop (SEM). Hvide pile angiver LSEC fenestrae (Skalabjælke, venstre panel 5 μm, højre panel 1 μm). Klik her for at se en større version af denne figur.
| KRH-stamopløsning (10x) | |
| Reagenser | Koncentration |
| NaCl | 1,15 m |
| HEPES (fri syre) | 0,2 m |
| KCl | 0,05 m |
| KH2PO4 | 0,01 m |
| Buffer A | |
| Reagenser | Koncentration |
| KRH-opløsning, PH=7,4 | 1x |
| EGTA | 0,5 mM |
| Juster PH til 7,4, filtrer gennem et 0,2 μm filter før brug. | |
| Opbevares ved stuetemperatur i op til 6 måneder. | |
| Buffer B | |
| KRH-opløsning, PH=7,4 | 1x |
| CaCl2 | 1 mM |
| Juster PH til 7,4, filtrer gennem et 0,2 μm filter før brug. | |
| Opbevares ved stuetemperatur i op til 6 måneder. | |
| Collagenase løsning | |
| Reagenser | Koncentration |
| Buffer B, PH=7,4 | 125 ml |
| Kollagenase | 35-40 mg, tilsæt BSA op til 100 mg |
| Percoll-opløsning | |
| Reagenser | Koncentration |
| Percoll | 22,5 ml |
| PBS (10x), PH=7,4 | 2,5 ml |
| Isoaltion/farvningsbuffer | |
| Reagenser | Koncentration |
| MACS skyllebuffer | 1250 ml |
| BSA-lager | 125 ml |
Tabel 1: Buffers opskrift. Tabellen omfatter sammensætningen af de buffere og opløsninger, der er anvendt i denne undersøgelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I det nuværende manuskript beskriver vi en protokol for LSEC-isolering fra muselever bestående af to-trins kollagenaseperfusion og efterfølgende magnetisk aktiveret cellesortering (MACS). Denne protokol består af følgende tre trin: (1) Perfusion gennem PV med en calciumfri buffer efterfulgt af en kollagenaseholdig buffer for at opnå levercelledispersion; 2) Udelukkelse af hepatocytter med centrifugering ved lav hastighed og (3) MACS-baseret positiv selektion af LDC'er fra ikke-parenkymale celler (NPC'er) ved hjælp af anti-CD146 magnetiske perler. Hele proceduren kunne afsluttes inden for 3 timer. Desuden er omkostningerne ved denne procedure, herunder alle forbrugsstoffer, omkring 150 USD pr. mus, hvilket tyder på, at denne metode til LSEC-isolering generelt er effektiv og omkostningseffektiv. Vi bruger også trin (1) og (2) til isolering af primære musehpatocytter, hvilket ligger uden for rammerne af det nuværende manuskript.
Der er et par kritiske trin i portal kanylering og leverperfusion: (i) Kateter positionering: Kateterspidsen skal placeres ikke mindre end 3 mm distal til PV bifurcation af en voksen mus, som normalt identificeres i leverens hilum. Dyb placering af kateterspidsen i PV vil kompromittere perfusionen af nogle leverlapper. Dårlig perfusion af en lap manifesterer sig som et fravær af en farveændring af lappen og kan afhjælpes, hvis den straks bemærkes ved en lille omplacering af kateteret i den distale PV. Denne manøvre kunne muligvis optimere lobe perfusion. ii) Luftbobler: Infusionsvejen mellem pumpen og pv'en skal holdes helt fri for luftbobler. Minutiøst luftindtrængen i PV kan forårsage en luftemboli, hvilket resulterer i ufuldstændig leverperfusion. For at fjerne luft i kateteret efter fjernelse af den indre nål injiceres buffer A med en sprøjte, der er proksimal til boblen for at udvise luft, før infusionsledningen tilsluttes kateteret. iii) Kollagenasestyrke: For at opretholde kollagenaseaktiviteten under perfusionen er det vigtigt at sikre, at buffer B, der infunderes i PV'et, har den nøjagtige koncentration af kollagenase og pH og holdes på ca. 37 °C. Som vist i figur 1 anvendes et tilpasset kammer til at holde hele perfusionssystemet i en 37 °C varm og befugtet atmosfære; Derudover opretholdes iltforsyningen under kollagenaseperfusion for at opnå fuldstændig fordøjelse. En alternativ mulighed omfatter et vandbad til forvarmning af kollagenaseopløsningen20 og et åbent collagenaseperfusionssystem in situ, hvor kollagenaseopløsningen dræner ud af leveren gennem den skårne IVC21.
Selvom protokollen bruger relativt fede katetre (20 G) for at sikre en tilstrækkelig perfusionsstrøm, vil et tyndere kateter også fungere godt baseret på tidligere rapporter 22,23,24. Det er dog undertiden vanskeligt at kanyle PV'en med succes, især når mus bruges til specifikke sygdomsmodeller, eller hvis de har PV-anomalier. Hvis PV-kanylering mislykkes, er mekanisk og enzymatisk leverfordøjelse ved hjælp af et enzymsæt og skånsom vævssociator en alternativ metode til trin (1) og (2) for at opnå suspension af ikke-parenkymal celle (NPC). Vi har bekræftet, at celleudbyttet og levedygtigheden i denne alternative dissociationsmetode uden leverperfusion var sammenlignelig med den oprindelige metode (data ikke vist). Portal veneperfusion til leverfordøjelse er blevet anvendt af andre og os 13,16,20. Desuden undgår denne metode den teoretiske risiko for LDC'er fænotypiske eller funktionelle ændringer induceret af mekanisk kraft under leverfordøjelsen. Derfor anbefales det indtil videre stærkt at anvende den PV-perfusionsbaserede metode, der er afbildet i denne protokol.
Her vises det optimale LSEC-udbytte og renhed ved anvendelse af den aktuelle protokol. Vi fik ca. 2-5 x 106 celler pr. mus fra både raske mus og mus med kostinduceret NASH ved hjælp af den nuværende protokol. Med hensyn til renhed understøtter positiviteten af den samme overflademarkør, der anvendes til immunomagnetisk adskillelse (CD146), nøjagtigheden af vores isolationsteknik. Derudover er der flere velkendte LSEC overflademarkører, såsom lymfekar endotelhyaluronsyrereceptor 1 (LYVE-1), CD32b og stabilin-2. Kontroverser eksisterer stadig omkring disse markører; for eksempel er i) LYVE-1 også til stede i lymfeendotelceller, og ii) LDC'er i et periportalområde mangler CD32b-ekspression18. For at undersøge renheden af disse isolerede LDC'er med flowcytometri blev stabilin-2 således anvendt som en etableret specifik LSEC-markør ud over CD146. Ved hjælp af denne metode bekræftede vi, at de isolerede LDC'er havde >94% levedygtighed og >90% renhed (figur 2). Den LSEC-specifikke fænotype af de isolerede celler blev yderligere bekræftet ved hjælp af SEM, hvor de fleste af cellerne har fenestrae (figur 3B), det karakteristiske morfologiske træk ved LSEC'er.
Blandt LSECs isolationsmetoder er valg af immunmagnetiske perler den teknik, der bruges mest til at isolere LDC'erne fra NPC-fraktionen 24,25,26,27. I modsætning hertil omfatter andre metoder centrifugalelutriation og selektiv vedhæftningsbaseret adskillelse 22,28,29. De ikke-immunmagnetiske metoder har vist sig at levere høje udbytter af LDC'er (ca. 9 x 106 celler pr. mus)11. Derfor kan et relativt lavere udbytte af isolerede LDC'er være en begrænsning af den nuværende protokol. På den anden side kræver de ikke-immunmagnetiske selektionsbaserede metoder høj teknisk ekspertise og viser undertiden inkonsekvente resultater på celleudbytter og renhedsgrader11, mens den immunmagnetiske selektionsbaserede metode har fordelen ved ensartet udbytte og renhed i forhold til andre eksisterende metoder. For immunomagnetiske perler selektionsbaseret celleisolering er specificiteten af de anvendte celleoverflademarkører desuden altid et spørgsmål om bekymring. For eksempel udtrykkes CD31, som tidligere er blevet anvendt som markør for immunomagnetisk LSEC-separation, dominerende på PV-endotelet og kapillariserede LSDC'er3. Selvom CD146 er rapporteret at blive udtrykt også på naturlige dræberceller og leverstellatceller 30,31,mindsker den høje renhed af LDC'er isoleret ved hjælp af denne protokol bekymringer vedrørende specificiteten af endotelmarkøren CD146. Sammenligning af fordele og ulemper ved forskellige metoder til LSEC-isolering diskuteres andetsteds 11,18,32. Sammenligning af celleudbytter og -rensninger mellem andre metoder, og denne metode ligger uden for det nuværende manuskripts anvendelsesområde og berettiger fremtidige undersøgelser.
Afslutningsvis præsenterer vi en primær mus LSEC-isolationsprotokol baseret på en af de mest anvendte og accepterede tilgange. Isolerede LDC'er viser høj renhed og bevaret funktion. Desuden er denne protokol effektiv og anvendelig på den sunde muselever såvel som leveren fra forskellige sygdomsmusmodeller. LDC'er af høj kvalitet fra disse mus kan anvendes til multiomics datasæt generation13,14. Denne tilgang letter således identifikationen af molekylære mekanismer, der regulerer LSEC's funktion og forbedrer vores forståelse af deres roller i intercellulær kommunikation i leveren i sundhed og sygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere har ingen konflikter at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases of the NIH (1RO1DK122948 til SHI) og NIH Silvio O. Conte Digestive Diseases Research Core Centers P30 tilskudsmekanisme (DK084567). Der blev også ydet støtte til KF af Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Overseas Research Fellowships. Vi vil også gerne anerkende Dr. Gregory J. Gores og Steven Bronk for deres originale design og optimering af kollagenase perfusionsapparatet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.0-inch 20 G Intra Venous (IV) catheter | Terumo, SOmerset, NJ, USA | SR-OX2051CA | |
| 2–3-inch perfuion tray with a hole in the center | customized; made in house | ||
| 405/520 viability dye | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-205 | |
| 4-inch regular curved dressing forceps | Fisher Brand | FS16-100-110 | |
| 5-0 Perma-Hand silk suture | Ethicon, Raritan, NJ, USA | A182H | |
| Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluorà 488 | MBL International, Woburn, MA, USA | D317-A48 | |
| BSA stock | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
| Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-118-407 | |
| CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-007 | |
| Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-803 | |
| Collagen type I | Corning, Corning, NY, USA | 354236 | |
| Collagenase II | Gibco, Waltham, MA, USA | 17101-015 | |
| Endothelial cells growth medium | ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA | 211-500 | |
| FcR blocking reagent, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-575 | |
| FlowJo software, version 10.6 | Becton, Dickinson and Company | ||
| Hardened Fine scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14091-11 | |
| Heated (37 °C) and humidified recirculating perfusion apparatus equipped with Oxygen injection at a rate of 10psi. | customized; made in house | ||
| Hitachi S 4700 scanning electron microscope | Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA | SEM096 | |
| LS columns | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-401 | |
| MACS pre-separation filters (70 μm) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-095-823 | |
| MACS rinsing buffer | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
| MACS Smart Strainer (70 μm) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-098-462 | |
| MACSQunt flow cytometer | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | ||
| Millicell Cell Culture Insert | Millipore Sigma, Burlington, MA, USA | PITP01250 | |
| Nexcelom cell counter | Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, USA | Cellometer Auto T4 Plus | |
| Percoll | GE Healthcare, Chicago, IL, USA | 17-0891-01 | |
| Surgical scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14001-12 | |
| Very small curved dressing forceps | F.S.T, Foster city, CA, USA | 11063-07 |
References
- Morin, O., Goulet, F., Normand, C. Liver sinusoidal endothelial cells: isolation, purification, characterization and interaction with hepatocytes. Revisiones Sobre Biologia Celular: RBC. 15, 1-85 (1988).
- Ibrahim, S. H. Sinusoidal endotheliopathy in nonalcoholic steatohepatitis: therapeutic implications. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 321 (1), 67-74 (2021).
- Poisson, J., et al. Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases. Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).
- Marrone, G., Shah, V. H., Gracia-Sancho, J. Sinusoidal communication in liver fibrosis and regeneration. Journal of Hepatology. 65 (3), 608-617 (2016).
- Shetty, S., Lalor, P. F., Adams, D. H. Liver sinusoidal endothelial cells - gatekeepers of hepatic immunity. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 15 (9), 555-567 (2018).
- Smedsrød, B., Pertoft, H., Gustafson, S., Laurent, T. C. Scavenger functions of the liver endothelial cell. Biochemical Journal. 266 (2), 313-327 (1990).
- DeLeve, L. D. Liver sinusoidal endothelial cells in hepatic fibrosis. Hepatology. 61 (5), 1740-1746 (2015).
- Dar, W. A., Sullivan, E., Bynon, J. S., Eltzschig, H., Ju, C. Ischaemia reperfusion injury in liver transplantation: Cellular and molecular mechanisms. Liver International. 39 (5), 788-801 (2019).
- Furuta, K., Guo, Q., Hirsova, P., Ibrahim, S. H. Emerging Roles of Liver Sinusoidal Endothelial Cells in Nonalcoholic Steatohepatitis. Biology. 9 (11), Basel. 395 (2020).
- Wu, L. Q., et al. Phenotypic and functional differences between human liver cancer endothelial cells and liver sinusoidal endothelial cells. Journal of Vascular Research. 45 (1), 78-86 (2008).
- Meyer, J., Gonelle-Gispert, C., Morel, P., Bühler, L. Methods for isolation and purification of murine liver sinusoidal endothelial cells: A systematic review. PLoS One. 11 (3), 0151945 (2016).
- Meyer, J., Lacotte, S., Morel, P., Gonelle-Gispert, C., Buhler, L. An optimized method for mouse liver sinusoidal endothelial cell isolation. Experimental Cell Research. 349 (2), 291-301 (2016).
- Furuta, K., et al. Lipid-induced endothelial vascular cell adhesion molecule 1 promotes nonalcoholic steatohepatitis pathogenesis. Journal of Clinical Investigation. 131 (6), (2021).
- Guo, Q., et al. Integrin β(1)-enriched extracellular vesicles mediate monocyte adhesion and promote liver inflammation in murine NASH. Journal of Hepatology. 71 (1), 1193-1205 (2019).
- Hirsova, P., Ibrahim, S. H., Bronk, S. F., Yagita, H., Gores, G. J. Vismodegib suppresses TRAIL-mediated liver injury in a mouse model of nonalcoholic steatohepatitis. PLoS One. 8 (7), 70599 (2013).
- Schrage, A., et al. Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1. Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).
- Olsavszky, V., et al. Exploring the transcriptomic network of multi-ligand scavenger receptor Stabilin-1- and Stabilin-2-deficient liver sinusoidal endothelial cells. Gene. 768, 145284 (2021).
- DeLeve, L. D., Maretti-Mira, A. C. Liver sinusoidal endothelial cell: An update. Seminars in Liver Disease. 37 (4), 377-387 (2017).
- DeLeve, L. D., Wang, X., Hu, L., McCuskey, M. K., McCuskey, R. S. Rat liver sinusoidal endothelial cell phenotype is maintained by paracrine and autocrine regulation. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 287 (4), 757-763 (2004).
- Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
- Ishiguro, K., Yan, I. K., Patel, T. Isolation of tissue extracellular vesicles from the liver. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e58649 (2019).
- Topp, S. A., Upadhya, G. A., Strasberg, S. M. Cold preservation of isolated sinusoidal endothelial cells in MMP 9 knockout mice: effect on morphology and platelet adhesion. Liver Transplantation. 10 (8), 1041-1048 (2004).
- Katz, S. C., Pillarisetty, V. G., Bleier, J. I., Shah, A. B., DeMatteo, R. P. Liver sinusoidal endothelial cells are insufficient to activate T cells. Journal of Immunology. 173 (1), 230-235 (2004).
- Liu, W., et al. Sample preparation method for isolation of single-cell types from mouse liver for proteomic studies. Proteomics. 11 (17), 3556-3564 (2011).
- Do, H., Healey, J. F., Waller, E. K., Lollar, P. Expression of factor VIII by murine liver sinusoidal endothelial cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (28), 19587-19592 (1999).
- Schrage, A., et al. Enhanced T cell transmigration across the murine liver sinusoidal endothelium is mediated by transcytosis and surface presentation of chemokines. Hepatology. 48 (4), 1262-1272 (2008).
- Chou, C. H., et al. Lysophosphatidic acid alters the expression profiles of angiogenic factors, cytokines, and chemokines in mouse liver sinusoidal endothelial cells. PLoS One. 10 (3), 0122060 (2015).
- Deleve, L. D. Dacarbazine toxicity in murine liver cells: a model of hepatic endothelial injury and glutathione defense. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 268 (3), 1261-1270 (1994).
- Smedsrød, B., Pertoft, H., Eggertsen, G., Sundström, C. Functional and morphological characterization of cultures of Kupffer cells and liver endothelial cells prepared by means of density separation in Percoll, and selective substrate adherence. Cell and Tissue Research. 241 (3), 639-649 (1985).
- Despoix, N., et al. Mouse CD146/MCAM is a marker of natural killer cell maturation. European Journal of Immunology. 38 (10), 2855-2864 (2008).
- Strauss, O., Phillips, A., Ruggiero, K., Bartlett, A., Dunbar, P. R. Immunofluorescence identifies distinct subsets of endothelial cells in the human liver. Scientific Reports. 7, 44356 (2017).
- Halpern, K. B., et al. Paired-cell sequencing enables spatial gene expression mapping of liver endothelial cells. Nature Biotechnology. 36 (10), 962-970 (2018).
