Summary
Qui delineiamo e dimostriamo un protocollo per l'isolamento primario delle cellule endoteliali sinusoidali epatiche del topo (LSEC). Il protocollo si basa sulla perfusione di collagenasi epatica, sulla purificazione delle cellule non parenchimali mediante centrifugazione a bassa velocità e sulla selezione magnetica delle perline CD146. Abbiamo anche fenotipo e caratterizzato questi LSECs isolati utilizzando la citometria a flusso e la microscopia elettronica a scansione.
Abstract
Le cellule endoteliali sinusoidali epatiche (LSECs) sono cellule endoteliali specializzate situate all'interfaccia tra la circolazione e il parenchima epatico. Le LSEC hanno una morfologia distinta caratterizzata dalla presenza di fenestrae e dall'assenza di membrana basale. Le LSEC svolgono un ruolo essenziale in molti disturbi patologici del fegato, tra cui la disregolazione metabolica, l'infiammazione, la fibrosi, l'angiogenesi e la carcinogenesi. Tuttavia, poco è stato pubblicato sull'isolamento e la caratterizzazione delle LSEC. Qui, questo protocollo discute l'isolamento di LSEC da topi sani e non alcolici di steatosi epatica (NAFLD). Il protocollo si basa sulla perfusione di collagenasi del fegato di topo e sulla selezione positiva di perline magnetiche di cellule non parenchimali per purificare le LSECs. Questo studio caratterizza le LSEC utilizzando marcatori specifici mediante citometria a flusso e identifica le caratteristiche fenotipiche caratteristiche mediante microscopia elettronica a scansione. Le LSEC isolate seguendo questo protocollo possono essere utilizzate per studi funzionali, compresi saggi di adesione e permeabilità, nonché studi a valle per una particolare via di interesse. Inoltre, questi LSEC possono essere raggruppati o utilizzati singolarmente, consentendo la generazione di dati multi-omica tra cui RNA-seq bulk o singola cellula, proteomica o fosfo-proteomica e Assay for Transposase-Accessible Chromatin utilizzando il sequenziamento (ATAC-seq), tra gli altri. Questo protocollo sarà utile per i ricercatori che studiano la comunicazione delle LSEC con altre cellule epatiche in salute e malattia e consentirà una comprensione approfondita del ruolo delle LSEC nei meccanismi patogenetici del danno epatico acuto e cronico.
Introduction
Le cellule endoteliali sinusoidali epatiche (LSECs) rivestono le pareti sinusoidi epatiche e sono le cellule non parenchimali più abbondanti nel fegato1. Le LSEC si distinguono dalle altre cellule endoteliali capillari in altre parti del corpo per la presenza di fenestrae e la mancanza di una membrana basale classica o di un diaframma 2,3. Quindi, le LSEC possiedono caratteristiche fenotipiche e strutturali distintive che migliorano la loro permeabilità e capacità endocitica di eliminare una varietà di macromolecole circolanti, inclusi lipidi e lipoproteine. Le LSEC svolgono un ruolo fondamentale nella diafonia tra cellule parenchimali e non parenchimali, come le cellule stellate e le cellule immunitarie. Le LSEC sono fondamentali per mantenere l'omeostasi epatica mantenendo le cellule stellate e le cellule di Kupffer in uno stato quiescente4. Le LSECs modulano la composizione delle popolazioni di cellule immunitarie epatiche mediando l'adesione e la migrazione trans-endoteliale dei leucociti circolanti 5,6. Durante il dannoepatico acuto e cronico 7, tra cui il danno da ischemia-riperfusione (IRI)8, la steatoepatite non alcolica (NASH)9 e il carcinoma epatocellulare (HCC), le LSECs subiscono cambiamenti fenotipici noti come capillarizzazione caratterizzati da defenestrazione e formazione della membrana basale10. Questi cambiamenti fenotipici nelle LSEC sono associati alla disfunzione delle LSECs e all'acquisizione di proprietà protrombotiche, proinfiammatorie e profibrogeniche.
Sono stati sviluppati diversi metodi per l'isolamento delle LSEC dal fegato di topo11. Alcune tecniche dipendono dalla separazione delle cellule non parenchimali e parenchimali seguita dalla centrifugazione a gradiente di densità per purificare le LSEC dalle frazioni non parenchimali. Il limite di questo metodo è la presenza di macrofagi contaminanti nelle fasi finali dell'isolamento delle LSECs, che potrebbero influenzare la purezza delle LSECsisolate 12. Questo protocollo si basa sulla perfusione di collagenasi del fegato di topo e sulla selezione positiva di cellule non parenchimali CD146+ magnetiche per purificare le LSECs. Le LSEC isolate con questo metodo mostrano un'elevata purezza e morfologia e vitalità preservate. Questi LSEC sono ottimali per studi funzionali, compresi i test di permeabilità e adesione, nonché studi a valle per i percorsi di interesse. Inoltre, con il crescente interesse nel generare grandi set di dati sia nella ricerca clinica che nella scienza della scoperta, questi LSEC di alta qualità isolati da fegati sani e malati con steatoepatite non alcolica (NASH) o altre condizioni possono essere raggruppati o utilizzati individualmente, consentendo la generazione di dati multi-omici e il confronto tra salute e malattia13,14 . Inoltre, le LSEC isolate possono essere impiegate per sviluppare modelli in vitro bidimensionali e tridimensionali come gli organoidi per decifrare la via di segnalazione attivata nelle LSEC e la loro comunicazione intercellulare con altre cellule epatiche sotto diversi stimoli nocivi e in risposta a vari interventi terapeutici.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I protocolli sugli animali sono stati condotti come approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Mayo Clinic. I topi maschi C57BL / 6J di otto settimane sono stati acquistati dal Jackson Laboratory. I topi sono stati alloggiati in una struttura a temperatura controllata 12: 12-h di ciclo chiaro-buio con libero accesso alla dieta.
1. Preparazione del piatto o del piatto di coltura rivestito di collagene
- Per produrre 50 mL di acido acetico 0,02 mol/L, aggiungere 0,6 mL di acido acetico glaciale a 49,4 mL di H2O.
- Produrre 50 μg/mL di collagene di tipo I in acido acetico 0,02 mol/L. La diluizione dipende dalla concentrazione del lotto.
- Rivestire piatti di coltura di 10 cm con 3 ml di soluzione di collagene. Incubare a temperatura ambiente (RT) per 1 ora.
NOTA: quando si utilizza un piatto o una piastra diversa per la coltura, il volume della soluzione di rivestimento deve essere regolato in base all'area di coltura, generalmente utilizzare 6-10 μg / cm2. - Rimuovere il liquido in eccesso dalla superficie rivestita e lavare con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 3 volte. Lasciare asciugare i piatti all'aria.
- Se la soluzione di collagene non è sterile, sterilizzare i piatti rivestiti di collagene mediante esposizione alla luce ultravioletta (UV) per 10 minuti in una cappa di coltura di tessuto sterile.
2. Configurazione dell'apparecchiatura
- Impostare l'apparecchio di perfusione a ricircolo riscaldato e umidificato come mostrato nella Figura 1B.
- Risciacquare il sistema di perfusione con candeggina al 10% per 5 minuti seguita da acqua sterile per altri 10 minuti.
- Scolare il liquido di risciacquo il più possibile prima di perfondere la soluzione di collagenasi.
- Infondere la soluzione di collagenasi attraverso il sistema di perfusione (come mostrato nella Figura 1B) per preriscaldarla a 37 °C. Impostare la velocità della pompa alla velocità 1 come indicato sulla ghiera di controllo della velocità (pari a 40 ml/min).
- Mantieni questa velocità la stessa durante l'intera procedura. Riutilizzare la soluzione di collagenasi eseguita in un circuito chiuso durante il giorno dell'isolamento LSEC.
NOTA: La velocità della pompa è fissata a 1 per evitare pressioni meccaniche che potrebbero perturbare le condizioni biologiche degli LSEC.
3. Procedura chirurgica
- Pesare il mouse.
- Iniettare 90 mg/kg di peso corporeo di ketamina e 10 mg/kg di peso corporeo di xilazina per via intraperitoneale (IP).
- Una volta che il topo non è reattivo agli stimoli dolorosi, fissare il mouse alla superficie chirurgica, come mostrato nella Figura 1B.
- Spruzzare l'addome del topo con il 70% di etanolo. Usando le forbici chirurgiche, fai un'incisione di ~ 5 cm di lunghezza partendo dalla parte inferiore dell'addome fino al processo xifoide.
- Quindi, effettuare due tagli laterali utilizzando piccole forbici dell'iride su ciascun lato dell'addome per esporre completamente gli organi addominali.
- Posizionare la guaina del catetere endovenoso (IV) sotto la schiena dell'animale per sollevare e livellare l'addome.
- Usando una normale pinza da medicazione curva, tirare delicatamente l'intestino e lo stomaco a sinistra dell'animale.
- Posizionare una sutura chirurgica 5-0 sotto la vena cava inferiore (IVC) appena sotto il rene sinistro esposto. Legare un gancio sciolto nella sutura.
- Posizionare un'altra sutura chirurgica 5-0 attorno alla vena porta epatica (PV) appena sopra il punto di ramificazione della vena splenica dal PV epatico. Legare un gancio sciolto nella sutura.
- Utilizzando la sutura PV come tensione, inserire il catetere 20 G IV nel PV epatico 1 cm sotto dove si ramifica a destra e sinistra PV epatico.
- Far scorrere il catetere sulla vena ma tenerlo sotto l'area di ramificazione. Lasciare che il sangue viaggi lungo il catetere fino a quando non inizia a gocciolare.
- Con parte del tampone A (Tabella 1) in un flacone per via endovenosa (IV) posizionato sopra l'area chirurgica, utilizzare una linea IV e collegarla al catetere. Lavare il fegato con questa soluzione evitando l'ingresso di aria nel sistema.
- Legare la sutura intorno alla vena cava inferiore sotto il rene. Ciò consentirà al fegato di retroperfondersi.
- Tagliare l'IVC sotto la sutura per consentire all'animale di sanguinare.
NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito rapidamente per evitare la congestione del fegato. - Fissare il catetere IV con la sutura fotovoltaica.
- Una volta perfuso, tagliare via lo stomaco, l'intestino, la milza e altre interiora attaccate al fegato.
- Tagliare via il diaframma e i vasi principali dalla cavità toracica. Rimuovere il fegato dall'animale e posizionarlo sul vassoio di perfusione.
- Rimuovere con attenzione la linea IV e collegare la soluzione di collagenasi nella camera di ricircolo.
NOTA: I passaggi 3.16-3.18 devono essere eseguiti entro 5 minuti, quindi il fegato non sarà perfuso troppo a lungo con il tampone A. Fare molta attenzione a non consentire bolle d'aria nel fegato. - Lasciare che il fegato si perfonda fino a quando la capsula diventa screziata e appare molle (10-15 minuti o più, il periodo varia a seconda dei diversi lotti di collagenasi).
- Mentre il fegato è in perfusione, assicurarsi che l'animale sia deceduto prima di smaltirlo in una sacca per necroscopia.
- Una volta digerito, rimuovere il fegato dalla camera e metterlo in una capsula di Petri di 10 cm con circa 20 ml di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) senza siero.
- Raccogliere delicatamente il fegato con un paio di punte di pipetta e scartare l'albero biliare.
- Filtrare la sospensione epatica attraverso un filtro cellulare da 70 μm in un tubo conico da 50 ml.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 50 x g per 2 minuti a RT. Raccogliere il surnatante contenente cellule epatiche non parenchimali.
NOTA: Gli epatociti vengono precipitati nel pellet, che può essere ulteriormente purificato utilizzando la centrifugazione a gradiente come descritto in precedenza15.
4. Separazione delle cellule epatiche non parenchimali e purificazione delle LSEC
NOTA: Purificare i CD146+ LSEC utilizzando le perle immunomagnetiche, seguendo le istruzioni del produttore.
- Centrifugare il surnatante a 300 x g per 5 min a 4 °C.
- Raccogliere il pellet di cella e risospesciare in 1 mL di tampone di isolamento (Tabella 1), determinare il numero di cella utilizzando un contatore automatico di celle seguendo le istruzioni del produttore.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per 10 minuti a 4 °C, aspirare completamente il surnatante.
- Risospendare il pellet con 90 μL di tampone di isolamento per 107 celle totali.
- Aggiungere 10 μL di perline magnetiche CD146 per 107 celle totali. Mescolare bene e incubare per 15 minuti a 4 °C.
- Per lavare le cellule, aggiungere 1-2 ml di tampone di isolamento per 107 celle, centrifugare a 300 x g per 10 minuti, quindi aspirare completamente il surnatante.
- Risospendare fino a 109 celle in 500 μL di tampone di isolamento (Tabella 1).
NOTA: per numeri di cella più elevati, aumentare di conseguenza il volume del buffer. - Preparare la colonna di separazione, risciacquarla con 3 ml di tampone di isolamento.
- Applicare la sospensione cellulare sulla colonna impilata con filtri di pre-separazione da 70 μm.
- Lavare la colonna con 3 mL di tampone di isolamento 3 volte.
NOTA: durante il lavaggio della colonna, il buffer di isolamento deve essere aggiunto non appena il serbatoio della colonna è vuoto. - Rimuovere la colonna dal separatore e posizionarla su un tubo centrifugo da 15 ml. Pipetta 5 mL di buffer di isolamento sulla colonna.
- Per recuperare le celle etichettate con perline magnetiche, spingere con decisione lo stantuffo nella colonna per scovare le celle.
- Centrifuga a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. Le LSEC sono pronte per l'esame microscopico e l'analisi a valle.
5. Immunofenotipizzazione delle LSEC e valutazione della purezza mediante citometria a flusso
- Determinare il numero di celle di LSEC isolati utilizzando un contatore di celle automatico seguendo le istruzioni del produttore.
- Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min, aspirare completamente il surnatante.
- Prendere 1 x 106 celle/tubo e risospesciare con 90 μL di tampone di colorazione (Tabella 1).
- Aggiungere 10 μL/tubo di blocco FcR di topo e 1 μL di colorante di vitalità, incubare a 4 °C per 10 min.
- Colorare le cellule con una combinazione di anticorpi CD45, CD146 e stabilina-2 diluiti a 1:50 con tampone di colorazione. Incubare a 4 °C per 20 min.
- Lavare le cellule con 5 mL di tampone colorante e centrifugare a 300 x g per 10 minuti, quindi aspirare completamente il surnatante.
- Risospese le cellule con 300 μL di tampone colorante e scorrere attraverso il citometro a flusso.
6. Cultura ed esame delle LSECs
- Seminare 1 x 106 cellule / pozzetto in una piastra a 6 pozzetti e coltivarlo con un mezzo di crescita delle cellule endoteliali costituito al 5% da siero bovino fetale (FBS), integratore di crescita delle cellule endoteliali all'1% e soluzione di primocina all'1%.
- Esaminare le LSEC isolate al microscopio ottico. Acquisisci immagini in campo luminoso con un ingrandimento di 10x.
7. Morfologia LSECs ed esame delle fenestrae mediante microscopia elettronica a scansione
- Pre-rivestire gli inserti di coltura cellulare (dimensione dei pori di 3 μm) con soluzione di collagene.
- LSECs isolate in coltura (120.000 cellule) sull'inserto con mezzo di crescita delle cellule endoteliali in una piastra a 24 pozzetti a 37 °C in atmosfera calda e umidificata. Lasciare che le cellule si stabilizzino e aderiscano per 2 ore.
- Per la fissazione cellulare, aggiungere un volume equivalente di fissativo di Trump preriscaldato a 37 ° C ai terreni di coltura cellulare.
- Dopo l'incubazione per 10 minuti, sostituisci il fissativo di Trump diluito al 50% con il fissativo di Trump non diluito.
- Fissare le cellule in fissativo di Trump per 2 ore, quindi incubare per 1 ora in tetrossidi di osmio all'1%.
- Procedere con la disidratazione dei campioni, l'essiccazione in un dispositivo di essiccazione del punto critico, il montaggio, il rivestimento sputter e l'esame utilizzando un microscopio elettronico a scansione.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Schemi sperimentali e messa a punto delle apparecchiature:
In questo protocollo, il fegato di topo è stato digerito utilizzando un circuito di perfusione chiuso, quindi le cellule non parenchimali e gli epatociti sono stati separati mediante centrifugazione a bassa velocità a 50 x g per 2 minuti. Le LSEC primarie sono state isolate utilizzando la selezione di perline magnetiche CD146 dalla frazione non parenchimale. Gli schemi sperimentali sono mostrati nella Figura 1A. La cannula è stata posizionata attraverso il PV mentre la vena cava inferiore è stata legata per garantire la perfusione unidirezionale della collagenasi attraverso il fegato (Figura 1B). La camera di perfusione interna è dotata di un sistema di riscaldamento e umidificazione per garantire un'aria di apparato calda e umidificata a 37-40 °C. La collagenasi perfusa circola attraverso un sistema chiuso e può essere riutilizzata per due o tre topi durante il giorno di isolamento per rendere l'isolamento più conveniente.
Valutazione della purezza e dei marcatori superficiali isolati di LSECs mediante citometria a flusso:
La purezza delle LSEC isolate è stata valutata utilizzando marcatori di superficie LSEC specifici ben caratterizzati CD146 e stabiln-2 16,17,18. Le cellule colorate sono state analizzate su un citometro a flusso; i dati sono stati analizzati utilizzando il software FlowJo.
La popolazione LSEC è stata gated (Figura 2A) e analizzata singolotti per la seguente strategia di gating; le cellule vitali sono state definite utilizzando la colorazione del colorante di vitalità prima di etichettare le cellule con marcatori specifici (Figura 2B). Quindi la popolazione CD45- è stata chiusa per escludere qualsiasi contaminazione delle cellule immunitarie. Le LSEC isolate hanno raggiunto il 94,8% di vitalità (Figura 2C). La percentuale di cellule CD45- era dell'89,7% (Figura 2D) e il 92,3% delle cellule erano CD146 e stabilin-2 double-positive (CD45-CD146+stabilin-2+) LSECs (Figura 2E).
Morfologia delle LSEC isolate:
Le LSEC isolate sono state seminate in una piastra a 6 pozzetti a 1 x 106 cellule/pozzetto, coltivate in un terreno di crescita completo ed esaminate al microscopio ottico dopo 6 ore di coltura (Figura 3A). Gli LSEC sono stati placcati su un inserto di coltura delle dimensioni di un poro di 3 μm per visualizzare le LSECs fenestrae al microscopio elettronico a scansione (SEM). Dopo la fissazione e l'elaborazione, le fenestrae sono state identificate, come mostrato nella Figura 3B. Come riportato in precedenza, gli LSEC perdono le loro fenestrae in coltura durante la notte19; pertanto, si raccomanda di elaborare le cellule il più presto possibile dopo l'isolamento per studi a valle per evitare la dedifferenziazione in vitro.
Figura 1: Schemi sperimentali e configurazione delle apparecchiature. (A) Gli schemi sperimentali sono stati progettati utilizzando Bio render. (B) Configurazione e processo dell'apparecchiatura. Il fegato è stato raccolto e perfuso in un apparato di perfusione chiuso di collagenasi. Il fegato è stato quindi trasferito in un piatto e dissociato. La sospensione epatica è stata raccolta. La frazione cellulare non parenchimale è stata separata mediante centrifugazione a 50 x g per 2 minuti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Valutazione della purezza delle LSEC isolate e dei marcatori di superficie mediante citometria a flusso. Analisi dei dati e strategia di gating come mostrato, (A) LSEC gated e (B) singoletti basati su forward scatter (FSC)/side scatter (SSC). Le LSECs isolate sono state colorate con un colorante di vitalità e una combinazione di anticorpi CD45, CD146 e stabilin-2. I singlet sono stati gated e analizzati, (C) gli LSEC vitali sono stati gated sulla popolazione (D) CD45 e analizzati per (E) CD146 e l'espressione di stabilin-2. Tutte le porte sono state determinate dalla fluorescenza meno uno (FMO). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Morfologia delle LSEC isolate. (A) Immagine in campo luminoso delle LSEC coltivate. Le LSEC isolate sono state coltivate nel terreno di crescita completo per 6 ore ed esaminate al microscopio ottico (barra di scala 100 μm). (B) LSEC è stato esaminato al microscopio elettronico a scansione (SEM). Le frecce bianche indicano LSEC fenestrae (barra della scala, pannello sinistro 5 μm, pannello destro 1 μm). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Soluzione madre KRH (10x) | |
| Reagenti | Concentrazione |
| NaCl | 1,15 m |
| HEPES (acido libero) | 0,2 M |
| Kcl | 0,05 M |
| KH2PO4 | 0,01 M |
| Buffer A | |
| Reagenti | Concentrazione |
| Soluzione krH, PH=7.4 | 1x |
| EGTA | 0,5 mM |
| Regolare ph a 7,4, filtrare attraverso un filtro da 0,2 μm prima dell'uso. | |
| Conservato a temperatura ambiente per un massimo di 6 mesi. | |
| Buffer B | |
| Soluzione krH, PH=7.4 | 1x |
| CaCl2 · | 1 mM |
| Regolare ph a 7,4, filtrare attraverso un filtro da 0,2 μm prima dell'uso. | |
| Conservato a temperatura ambiente per un massimo di 6 mesi. | |
| Soluzione di collagenasi | |
| Reagenti | Concentrazione |
| Tampone B, PH=7.4 | 125 ml |
| Collagenasi | 35-40 mg, aggiungere BSA fino a 100 mg |
| Soluzione Percoll | |
| Reagenti | Concentrazione |
| Percoll · | 22,5 ml |
| PBS (10x), PH=7,4 | 2,5 ml |
| Tampone di isoalzione/colorazione | |
| Reagenti | Concentrazione |
| Buffer di risciacquo MACS | 1250 ml |
| Stock BSA | 125 ml |
Tabella 1: Ricetta dei buffer. La tabella comprende la composizione dei tamponi e delle soluzioni utilizzate in questo studio.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nel manoscritto attuale, descriviamo un protocollo per l'isolamento LSEC dal fegato di topo costituito dalla perfusione di collagenasi in due fasi e dalla successiva selezione cellulare attivata magneticamente (MACS). Questo protocollo consiste nei seguenti tre passaggi: (1) Perfusione attraverso il PV con un tampone privo di calcio seguito da un tampone contenente collagenasi per ottenere la dispersione delle cellule epatiche; (2) Esclusione degli epatociti con centrifugazione a bassa velocità; e (3) selezione positiva basata su MACS di LSEC da cellule non parenchimali (NPC) utilizzando perline magnetiche anti-CD146. L'intera procedura potrebbe essere completata entro 3 ore. Inoltre, il costo per questa procedura, compresi tutti i materiali di consumo, è di circa 150 USD per mouse, suggerendo che questo metodo di isolamento LSEC è complessivamente efficiente ed economico. Usiamo anche i passaggi (1) e (2) per l'isolamento degli epatociti primari del topo, che esula dallo scopo del manoscritto corrente.
Ci sono alcuni passaggi critici nella cannulazione portale e nella perfusione epatica: (i) Posizionamento del catetere: la punta del catetere deve essere posizionata non meno di 3 mm distale alla biforcazione PV di un topo adulto, che di solito è identificata nell'allume del fegato. Il posizionamento profondo della punta del catetere nel PV comprometterà la perfusione di alcuni lobi del fegato. La scarsa perfusione di un lobo si manifesta come assenza di un cambiamento di colore del lobo e può essere rettificata se notata immediatamente da un leggero riposizionamento del catetere nel PV distale. Questa manovra potrebbe eventualmente ottimizzare la perfusione del lobo. (ii) Bolle d'aria: la via di infusione tra la pompa e il fotovoltaico deve essere mantenuta completamente libera da bolle d'aria. L'ingresso di aria minuto nel PV può causare un'embolia d'aria, che si traduce in una perfusione epatica incompleta. Per eliminare l'aria nel catetere dopo aver rimosso l'ago interno, il tampone A viene iniettato con una siringa prossimale alla bolla per espellere l'aria prima di collegare la linea di infusione al catetere. (iii) Forza della collagenasi: per mantenere l'attività della collagenasi durante la perfusione, è essenziale assicurarsi che il tampone B infuso nel PV abbia la concentrazione precisa di collagenasi e pH e sia mantenuto a circa 37 °C. Come mostrato in Figura 1, una camera personalizzata viene utilizzata per mantenere l'intero sistema di perfusione in un'atmosfera calda e umidificata a 37 °C; inoltre, l'apporto di ossigeno viene mantenuto durante la perfusione di collagenasi per ottenere una digestione completa. Un'opzione alternativa include un bagno d'acqua per preriscaldare la soluzione di collagenasi20 e un sistema di perfusione di collagenasi aperta in situ in cui la soluzione di collagenasi drena dal fegato attraverso il taglio IVC21.
Sebbene il protocollo utilizzi cateteri relativamente audaci (20 G) per garantire un flusso di perfusione adeguato, anche un catetere più sottile funzionerà bene in base ai precedenti rapporti 22,23,24. Tuttavia, a volte è difficile riuscire a cannulare con successo il PV, specialmente quando i topi vengono utilizzati per specifici modelli di malattia o se hanno anomalie PV. Se la cannulazione PV fallisce, la digestione epatica meccanica ed enzimatica utilizzando un kit enzimatico e un dissociatore tissutale delicato è un metodo alternativo per i passaggi (1) e (2) per ottenere la sospensione di cellule non parenchimali (NPC). Abbiamo confermato che la resa cellulare e la vitalità in questo metodo alternativo di dissociazione senza perfusione epatica erano paragonabili al metodo originale (dati non mostrati). La perfusione della vena porta per la digestione del fegato è stata impiegata da altri e da noi 13,16,20. Inoltre, questo metodo evita il rischio teorico di alterazioni fenotipiche o funzionali delle LSECs indotte dalla forza meccanica durante la digestione epatica. Pertanto, l'uso del metodo basato sulla perfusione fotovoltaica descritto in questo protocollo è finora altamente raccomandato.
Qui vengono mostrate la resa e la purezza LSEC ottimali quando si utilizza il protocollo corrente. Abbiamo ottenuto circa 2-5 x 106 cellule per topo sia da topi sani che da topi con NASH indotta dalla dieta utilizzando il protocollo corrente. Per quanto riguarda la purezza, la positività dello stesso marcatore di superficie utilizzato per la separazione immunomagnetica (CD146) supporta l'accuratezza della nostra tecnica di isolamento. Inoltre, ci sono diversi marcatori di superficie LSEC ben riconosciuti, come il recettore dell'acido ialuronico endoteliale dei vasi linfatici 1 (LYVE-1), CD32b e stabilin-2. Esistono ancora controversie intorno a questi marcatori; ad esempio, i) LYVE-1 è presente anche nelle cellule endoteliali linfatiche e ii) le LSEC in un'area periportale mancano di espressione CD32b18. Pertanto, per esaminare la purezza di queste LSEC isolate con citometria a flusso, la stabilina-2 è stata impiegata come marcatore LSEC specifico stabilito in aggiunta a CD146. Utilizzando questa metodologia, la Corte ha confermato che le LSEC isolate avevano una vitalità >94% e una purezza >90% (Figura 2). Il fenotipo LSEC-specifico delle cellule isolate è stato ulteriormente confermato utilizzando SEM, dove la maggior parte delle cellule ha fenestrae (Figura 3B), la caratteristica morfologica caratteristica delle LSEC.
Tra le metodologie di isolamento delle LSEC, la selezione delle perle immunomagnetiche è la tecnica più utilizzata per isolare le LSEC dalla frazione NPC 24,25,26,27. Al contrario, altri metodi includono l'elutriazione centrifuga e la separazione selettiva basata sull'adesione 22,28,29. I metodi non immunomagnetici hanno dimostrato di fornire alte rese di LSECs (circa 9 x 106 cellule per topo)11. Quindi, una resa relativamente inferiore di LSEC isolati potrebbe essere una limitazione del protocollo attuale. D'altra parte, i metodi basati sulla selezione non immunomagnetica richiedono un'elevata competenza tecnica e talvolta mostrano risultati incoerenti sulle rese cellulari e sulle purezze11, mentre il metodo basato sulla selezione immunomagnetica ha il vantaggio di una resa e di una purezza coerenti rispetto ad altri metodi esistenti. Inoltre, per l'isolamento cellulare basato sulla selezione delle perline immunomagnetiche, la specificità dei marcatori di superficie cellulare utilizzati è sempre motivo di preoccupazione. Ad esempio, CD31, che è stato utilizzato in precedenza come marcatore per la separazione LSEC immunomagnetica, è espresso in modo dominante sull'endotelio PV e sulle LSEC capillarizzate3. Sebbene CD146 sia stato segnalato per essere espresso anche su cellule natural killer e cellule stellate epatiche 30,31, l'elevata purezza delle LSECs isolate utilizzando questo protocollo mitiga le preoccupazioni riguardanti la specificità del marcatore endoteliale CD146. Il confronto dei pro e dei contro delle varie metodologie per l'isolamento LSEC è discusso altrove 11,18,32. Il confronto delle rese cellulari e delle purezze tra altri metodi e questo metodo esula dallo scopo del manoscritto attuale e giustifica indagini future.
In conclusione, presentiamo un protocollo di isolamento LSEC primario del mouse basato su uno degli approcci più utilizzati e accettati. Gli LSEC isolati mostrano un'elevata purezza e una funzione preservata. Inoltre, questo protocollo è efficiente e applicabile al fegato di topo sano e al fegato di diversi modelli murini di malattia. Gli LSEC di alta qualità di questi topi possono essere impiegati per la generazione di set di dati multiomici13,14. Pertanto, questo approccio facilita l'identificazione dei meccanismi molecolari che regolano la funzione di LSEC e migliora la nostra comprensione dei loro ruoli nella comunicazione intercellulare nel fegato in salute e malattia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Tutti gli autori non hanno conflitti da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases del NIH (1RO1DK122948 to SHI) e dal NIH Silvio O. Conte Digestive Diseases Research Core Centers P30 grant mechanism (DK084567). Il supporto è stato fornito a KF anche dalla Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Overseas Research Fellowships. Vorremmo anche ringraziare il Dr. Gregory J. Gores e Steven Bronk per il loro design originale e l'ottimizzazione dell'apparato di perfusione della collagenasi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.0-inch 20 G Intra Venous (IV) catheter | Terumo, SOmerset, NJ, USA | SR-OX2051CA | |
| 2–3-inch perfuion tray with a hole in the center | customized; made in house | ||
| 405/520 viability dye | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-205 | |
| 4-inch regular curved dressing forceps | Fisher Brand | FS16-100-110 | |
| 5-0 Perma-Hand silk suture | Ethicon, Raritan, NJ, USA | A182H | |
| Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluorà 488 | MBL International, Woburn, MA, USA | D317-A48 | |
| BSA stock | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
| Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-118-407 | |
| CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-007 | |
| Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-803 | |
| Collagen type I | Corning, Corning, NY, USA | 354236 | |
| Collagenase II | Gibco, Waltham, MA, USA | 17101-015 | |
| Endothelial cells growth medium | ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA | 211-500 | |
| FcR blocking reagent, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-575 | |
| FlowJo software, version 10.6 | Becton, Dickinson and Company | ||
| Hardened Fine scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14091-11 | |
| Heated (37 °C) and humidified recirculating perfusion apparatus equipped with Oxygen injection at a rate of 10psi. | customized; made in house | ||
| Hitachi S 4700 scanning electron microscope | Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA | SEM096 | |
| LS columns | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-401 | |
| MACS pre-separation filters (70 μm) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-095-823 | |
| MACS rinsing buffer | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
| MACS Smart Strainer (70 μm) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-098-462 | |
| MACSQunt flow cytometer | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | ||
| Millicell Cell Culture Insert | Millipore Sigma, Burlington, MA, USA | PITP01250 | |
| Nexcelom cell counter | Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, USA | Cellometer Auto T4 Plus | |
| Percoll | GE Healthcare, Chicago, IL, USA | 17-0891-01 | |
| Surgical scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14001-12 | |
| Very small curved dressing forceps | F.S.T, Foster city, CA, USA | 11063-07 |
References
- Morin, O., Goulet, F., Normand, C. Liver sinusoidal endothelial cells: isolation, purification, characterization and interaction with hepatocytes. Revisiones Sobre Biologia Celular: RBC. 15, 1-85 (1988).
- Ibrahim, S. H. Sinusoidal endotheliopathy in nonalcoholic steatohepatitis: therapeutic implications. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 321 (1), 67-74 (2021).
- Poisson, J., et al. Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases. Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).
- Marrone, G., Shah, V. H., Gracia-Sancho, J. Sinusoidal communication in liver fibrosis and regeneration. Journal of Hepatology. 65 (3), 608-617 (2016).
- Shetty, S., Lalor, P. F., Adams, D. H. Liver sinusoidal endothelial cells - gatekeepers of hepatic immunity. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 15 (9), 555-567 (2018).
- Smedsrød, B., Pertoft, H., Gustafson, S., Laurent, T. C. Scavenger functions of the liver endothelial cell. Biochemical Journal. 266 (2), 313-327 (1990).
- DeLeve, L. D. Liver sinusoidal endothelial cells in hepatic fibrosis. Hepatology. 61 (5), 1740-1746 (2015).
- Dar, W. A., Sullivan, E., Bynon, J. S., Eltzschig, H., Ju, C. Ischaemia reperfusion injury in liver transplantation: Cellular and molecular mechanisms. Liver International. 39 (5), 788-801 (2019).
- Furuta, K., Guo, Q., Hirsova, P., Ibrahim, S. H. Emerging Roles of Liver Sinusoidal Endothelial Cells in Nonalcoholic Steatohepatitis. Biology. 9 (11), Basel. 395 (2020).
- Wu, L. Q., et al. Phenotypic and functional differences between human liver cancer endothelial cells and liver sinusoidal endothelial cells. Journal of Vascular Research. 45 (1), 78-86 (2008).
- Meyer, J., Gonelle-Gispert, C., Morel, P., Bühler, L. Methods for isolation and purification of murine liver sinusoidal endothelial cells: A systematic review. PLoS One. 11 (3), 0151945 (2016).
- Meyer, J., Lacotte, S., Morel, P., Gonelle-Gispert, C., Buhler, L. An optimized method for mouse liver sinusoidal endothelial cell isolation. Experimental Cell Research. 349 (2), 291-301 (2016).
- Furuta, K., et al. Lipid-induced endothelial vascular cell adhesion molecule 1 promotes nonalcoholic steatohepatitis pathogenesis. Journal of Clinical Investigation. 131 (6), (2021).
- Guo, Q., et al. Integrin β(1)-enriched extracellular vesicles mediate monocyte adhesion and promote liver inflammation in murine NASH. Journal of Hepatology. 71 (1), 1193-1205 (2019).
- Hirsova, P., Ibrahim, S. H., Bronk, S. F., Yagita, H., Gores, G. J. Vismodegib suppresses TRAIL-mediated liver injury in a mouse model of nonalcoholic steatohepatitis. PLoS One. 8 (7), 70599 (2013).
- Schrage, A., et al. Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1. Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).
- Olsavszky, V., et al. Exploring the transcriptomic network of multi-ligand scavenger receptor Stabilin-1- and Stabilin-2-deficient liver sinusoidal endothelial cells. Gene. 768, 145284 (2021).
- DeLeve, L. D., Maretti-Mira, A. C. Liver sinusoidal endothelial cell: An update. Seminars in Liver Disease. 37 (4), 377-387 (2017).
- DeLeve, L. D., Wang, X., Hu, L., McCuskey, M. K., McCuskey, R. S. Rat liver sinusoidal endothelial cell phenotype is maintained by paracrine and autocrine regulation. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 287 (4), 757-763 (2004).
- Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
- Ishiguro, K., Yan, I. K., Patel, T. Isolation of tissue extracellular vesicles from the liver. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e58649 (2019).
- Topp, S. A., Upadhya, G. A., Strasberg, S. M. Cold preservation of isolated sinusoidal endothelial cells in MMP 9 knockout mice: effect on morphology and platelet adhesion. Liver Transplantation. 10 (8), 1041-1048 (2004).
- Katz, S. C., Pillarisetty, V. G., Bleier, J. I., Shah, A. B., DeMatteo, R. P. Liver sinusoidal endothelial cells are insufficient to activate T cells. Journal of Immunology. 173 (1), 230-235 (2004).
- Liu, W., et al. Sample preparation method for isolation of single-cell types from mouse liver for proteomic studies. Proteomics. 11 (17), 3556-3564 (2011).
- Do, H., Healey, J. F., Waller, E. K., Lollar, P. Expression of factor VIII by murine liver sinusoidal endothelial cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (28), 19587-19592 (1999).
- Schrage, A., et al. Enhanced T cell transmigration across the murine liver sinusoidal endothelium is mediated by transcytosis and surface presentation of chemokines. Hepatology. 48 (4), 1262-1272 (2008).
- Chou, C. H., et al. Lysophosphatidic acid alters the expression profiles of angiogenic factors, cytokines, and chemokines in mouse liver sinusoidal endothelial cells. PLoS One. 10 (3), 0122060 (2015).
- Deleve, L. D. Dacarbazine toxicity in murine liver cells: a model of hepatic endothelial injury and glutathione defense. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 268 (3), 1261-1270 (1994).
- Smedsrød, B., Pertoft, H., Eggertsen, G., Sundström, C. Functional and morphological characterization of cultures of Kupffer cells and liver endothelial cells prepared by means of density separation in Percoll, and selective substrate adherence. Cell and Tissue Research. 241 (3), 639-649 (1985).
- Despoix, N., et al. Mouse CD146/MCAM is a marker of natural killer cell maturation. European Journal of Immunology. 38 (10), 2855-2864 (2008).
- Strauss, O., Phillips, A., Ruggiero, K., Bartlett, A., Dunbar, P. R. Immunofluorescence identifies distinct subsets of endothelial cells in the human liver. Scientific Reports. 7, 44356 (2017).
- Halpern, K. B., et al. Paired-cell sequencing enables spatial gene expression mapping of liver endothelial cells. Nature Biotechnology. 36 (10), 962-970 (2018).
