Summary
כאן אנו מתארים ומדגימים פרוטוקול לבידוד תאי אנדותל סינוסואידליים ראשוניים בכבד עכבר (LSEC). הפרוטוקול מבוסס על זלוף קולגן בכבד, טיהור תאים לא-פרנצ'ימליים על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה ובחירת חרוזים מגנטיים CD146. אנו גם מנצלים את הפנוטיפ ומאפיינים את ה-LSECs המבודדים הללו באמצעות ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק.
Abstract
תאי אנדותל סינוסואידליים בכבד (LSECs) הם תאי אנדותל מיוחדים הממוקמים בממשק שבין מחזור הדם לבין הפרנכימה של הכבד. ל-LSECs יש מורפולוגיה מובחנת המאופיינת בנוכחות של fenestrae ובהיעדר קרום מרתף. LSECs ממלאים תפקידים חיוניים בהפרעות פתולוגיות רבות בכבד, כולל חוסר ויסות מטבולי, דלקת, פיברוזיס, אנגיוגנזה וקרצינוגנזה. עם זאת, מעט מאוד פורסם על הבידוד והאפיון של LSECs. כאן, פרוטוקול זה דן בבידוד של LSEC מעכברים בריאים ולא אלכוהוליים של מחלת כבד שומני (NAFLD). הפרוטוקול מבוסס על זלוף קולגן של כבד העכבר ועל בחירה חיובית של חרוזים מגנטיים של תאים לא-פרנצ'ימליים לטיהור LSECs. מחקר זה מאפיין LSECs באמצעות סמנים ספציפיים על ידי ציטומטריה של זרימה ומזהה את התכונות הפנוטיפיות האופייניות על ידי סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים. LSECs שבודדו בעקבות פרוטוקול זה יכולים לשמש למחקרים פונקציונליים, כולל מבחני הידבקות וחדירות, כמו גם מחקרים במורד הזרם עבור מסלול עניין מסוים. בנוסף, ניתן לאגד או להשתמש ב-LSECs אלה בנפרד, מה שמאפשר יצירת נתונים מרובי-אומיקות, כולל תפזורת RNA-seq או תא בודד, פרוטאומי או פוספו-פרוטאומיקה, ובדיקה עבור כרומטין נגיש לטרנספוזאז באמצעות ריצוף (ATAC-seq), בין היתר. פרוטוקול זה יהיה שימושי עבור חוקרים החוקרים את התקשורת של LSECs עם תאי כבד אחרים בבריאות ובמחלות ויאפשר הבנה מעמיקה של תפקידם של LSECs במנגנונים הפתוגניים של פגיעה חריפה וכרונית בכבד.
Introduction
תאי אנדותל סינוסואידליים בכבד (LSECs) מרפדים את דפנות הסינוסואידים הכבדים והם התאים הלא-פרנכימליים הנפוצים ביותר בכבד1. LSECs נבדלים מתאי אנדותל נימיים אחרים במקומות אחרים בגוף על ידי נוכחות של fenestrae והיעדר קרום מרתף קלאסי או דיאפרגמה 2,3. לפיכך, LSECs הם בעלי מאפיינים פנוטיפיים ומבניים ייחודיים המשפרים את חדירותם ואת יכולתם האנדוציטית לחסל מגוון של מקרומולקולות במחזור הדם, כולל שומנים וליפופרוטאינים. LSECs ממלאים תפקיד מרכזי בהצלבה בין תאים פרנכימליים ולא-פרנצ'ימליים, כגון תאי סטלה ותאי מערכת החיסון. LSECs הם המפתח לשמירה על הומאוסטזיס בכבד על ידי שמירה על תאי הסטלטים ותאי קופפר במצבשקט 4. LSECs מווסתים את הרכב אוכלוסיות תאי החיסון בכבד על ידי תיווך הידבקות והגירה טרנס-אנדותל של לויקוציטים במחזור 5,6. במהלך פגיעה חריפה וכרונית בכבד7, כולל פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה (IRI)8, סטאטוהפטיטיס לא אלכוהולית (NASH)9, וקרצינומה הפטוצלולרית (HCC), LSECs עוברים שינויים פנוטיפיים הידועים בשם קפילאריזציה המאופיינים בהתגוננות והיווצרות של קרום מרתף10. שינויים פנוטיפיים אלה ב-LSECs קשורים לתפקוד לקוי של LSECs ולרכישת תכונות פרותרומבוטיות, פרו-דלקתיות ופרופילוגניות.
מספר שיטות לבידוד של LSECs מכבד העכבר פותחו11. טכניקות מסוימות תלויות בהפרדת תאים לא-פרנכימליים ופרנכימליים ולאחר מכן צנטריפוגת גרדיאנט צפיפות כדי לטהר את ה-LSECs משברים לא-פרנצ'ימליים. המגבלה של שיטה זו היא נוכחות של מקרופאגים מזהמים בשלבים האחרונים של בידוד LSECs, אשר יכול להשפיע על טוהר של LSECsמבודדים 12. פרוטוקול זה מבוסס על זלוף קולגןאז של כבד העכבר ועל בחירה חיובית של חרוזים מגנטיים CD146+ של תאים לא-פרנצ'ימליים לטיהור LSECs. LSECs שבודדו בשיטה זו מראים טוהר גבוה ומורפולוגיה ומשומרת וכדאיות. LSECs אלה הם אופטימליים למחקרים פונקציונליים, כולל בדיקת חדירות והידבקות, כמו גם מחקרים במורד הזרם עבור מסלולי עניין. יתר על כן, עם העניין הגובר ביצירת מערכי ביג דאטה הן במחקר קליני והן במדע הגילוי, ניתן לאגד או להשתמש בנפרד ב-LSECs באיכות גבוהה אלה המבודדים מכבדים בריאים וחולים עם סטאטוהפטיטיס לא-אלכוהולית (NASH) או מצבים אחרים, מה שמאפשר יצירת נתונים מרובי-אומיקה והשוואה בין בריאות למחלות 13,14 . בנוסף, ניתן להשתמש ב-LSECs המבודדים כדי לפתח מודלים דו-ממדיים כמו גם תלת-ממדיים במבחנה כמו אורגנואידים כדי לפענח את מסלול האיתות המופעל ב-LSECs ואת התקשורת הבין-תאית שלהם עם תאי כבד אחרים תחת גירויים רעילים שונים ובתגובה להתערבויות טיפוליות שונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקולים של בעלי חיים נערכו כפי שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של מאיו קליניק. עכברים זכרים C57BL/6J בני שמונה שבועות נרכשו ממעבדת ג'קסון. העכברים שוכנו במתקן מחזור בהיר-כהה מבוקר טמפרטורה של 12:12 שעות עם גישה חופשית לתזונה.
1. הכנת צלחת או צלחת תרבית מצופה קולגן
- כדי לייצר 50 מ"ל של חומצה אצטית של 0.02 מול/ל', יש להוסיף 0.6 מ"ל של חומצה אצטית קרחונית ל-49.4 מ"ל של H2O.
- הכינו 50 מיקרוגרם/מ"ל קולגן מסוג I בחומצה אצטית 0.02 מול/ל'. הדילול תלוי בריכוז המגרש.
- מצפים מנות תרבית 10 ס"מ עם תמיסת קולגן של 3 מ"ל. דגירה בטמפרטורת החדר (RT) למשך שעה אחת.
הערה: בעת שימוש בצלחת או צלחת אחרת לתרבית, יש להתאים את נפח תמיסת הציפוי בהתאם לאזור התרבית, בדרך כלל להשתמש ב- 6-10 מיקרוגרם / ס"מ2. - יש להסיר את הנוזל העודף מהמשטח המצופה, ולשטוף עם מלח עם גוש פוספט (PBS) 3 פעמים. אפשרו לכלים להתייבש באוויר.
- אם תמיסת הקולגן אינה סטרילית, עיקרו את הכלים המצופה בקולגן על ידי חשיפה לאור אולטרה סגול (UV) למשך 10 דקות במכסה אדים של תרבית רקמה סטרילית.
2. הגדרת ציוד
- הגדירו את מנגנון הזלוף המחומם והלח, כפי שמוצג באיור 1B.
- שטפו את מערכת הזלוף באמצעות 10% אקונומיקה למשך 5 דקות ולאחר מכן מים סטריליים למשך 10 דקות נוספות.
- מסננים את נוזל השטיפה ככל האפשר לפני שאתם מנקבים את תמיסת הקולגנאז.
- החדירו תמיסת קולגןאז דרך מערכת הזלוף (כפי שמוצג באיור 1B) כדי לחמם אותה מראש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הגדר את קצב המשאבה במהירות 1 כפי שמוצג בחוגת בקרת המהירות (שווה ערך ל- 40 מ"ל לדקה).
- שמור על מהירות זו זהה לאורך כל ההליך. יש לעשות שימוש חוזר בתמיסת הקולגאז הפועלת במעגל סגור במהלך יום הבידוד של LSEC.
הערה: מהירות המשאבה קבועה על 1 כדי למנוע לחץ מכני שעלול להפריע למצב הביולוגי של LSECs.
3. הליך כירורגי
- שקלו את העכבר.
- יש להזריק 90 מ"ג/ק"ג משקל גוף של קטמין ומשקל גוף של 10 מ"ג/ק"ג של קסילאזין תוך-צפקי (IP).
- ברגע שהעכבר אינו פעיל לגירויים כואבים, הצמידו את העכבר למשטח הניתוח, כפי שניתן לראות באיור 1B.
- מרססים את בטן העכבר ב-70% אתנול. באמצעות מספריים כירורגיים, לבצע חתך באורך של כ -5 ס"מ החל מהחלק התחתון של הבטן ועד לתהליך xiphoid.
- לאחר מכן, לעשות שני חתכים לרוחב באמצעות מספריים קשתית קטנה בכל צד של הבטן כדי לחשוף באופן מלא את איברי הבטן.
- מניחים את הנדן של הצנתר התוך ורידי (IV) מתחת לגב החיה כדי להרים וליישר את הבטן.
- באמצעות מלקחיים קבועים של חבישה מעוקלת, משכו בעדינות את המעיים ואת הבטן משמאל לבעל החיים.
- מניחים תפר כירורגי 5-0 מתחת לווריד הנבוב התחתון (IVC) ממש מתחת לכליה השמאלית החשופה. קשרו תקלה רופפת בתפר.
- מניחים עוד תפר כירורגי 5-0 סביב וריד פורטל הכבד (PV) ממש מעל נקודת ההסתעפות של וריד הטחול מה-PV הכבדי. קשרו תקלה רופפת בתפר.
- באמצעות תפר PV כמתח, הכנס את קטטר 20 G IV בכבד PV 1 ס"מ מתחת למקום שבו הוא מסתעף ימינה ושמאלה PV כבד.
- החליקו את הצנתר במעלה הווריד אך שמרו אותו מתחת לאזור ההסתעפות. אפשרו לדם לנוע במורד הצנתר עד שהוא מתחיל לטפטף החוצה.
- עם חלק מהמאגר A (טבלה 1) בבקבוק תוך ורידי (IV) הממוקם מעל האזור הניתוחי, השתמש בקו עירוי והצמד אותו לצנתר. יש לשטוף את הכבד בתמיסה זו תוך הימנעות מכניסת אוויר למערכת.
- קשרו את התפר סביב הווריד הנבוב התחתון מתחת לכליה. זה יאפשר לכבד לחדור רטרו.
- חותכים את ה-IVC מתחת לתפר כדי לאפשר לבעל החיים לדמם החוצה.
הערה: שלב זה חייב להתבצע במהירות כדי למנוע גודש של הכבד. - אבטחו את צנתר ה-IV עם תפר ה-PV.
- לאחר ההחדרה, חותכים את הקיבה, המעיים, הטחול ושאר הפתחים המחוברים לכבד.
- חותכים את הסרעפת ואת כלי הדם העיקריים מחלל בית החזה. מוציאים את הכבד מבעל החיים ומניחים אותו על מגש הזלוף.
- יש להסיר בזהירות את קו ה- IV ולחבר את תמיסת הקולגןאז בתא המשחזר.
הערה: שלבים 3.16-3.18 צריכים להיעשות תוך 5 דקות, כך שהכבד לא יוחדר זמן רב מדי עם Buffer A. היזהר מאוד לא לאפשר בועות אוויר לתוך הכבד. - אפשרו לכבד לחלחל עד שהקפסולה הופכת מנומרת ונראית מטושטשת (10-15 דקות או יותר, המחזור משתנה בהתאם למגוון ההמון של הקולגנאז).
- בזמן שהכבד נמצא בזלוף, יש לוודא שבעל החיים מת לפני השלכתו בשקית נמק.
- לאחר העיכול, מוציאים את הכבד מהתא ומניחים אותו בצלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ עם כ-20 מ"ל של מדיום הנשרים המהונדסים (DMEM) של דולבקו ללא סרום.
- לקטוף בעדינות את הכבד עם כמה קצוות פיפטה ולהשליך את עץ המרה.
- מסננים את תרחיף הכבד דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל.
- צנטריפוגה תרחיף התא ב 50 x g במשך 2 דקות ב- RT. לאסוף את supernatant המכיל תאים כבדים שאינם פרנצ'ימליים.
הערה: הפטוציטים מואצים בכדור, אשר ניתן לטהר עוד יותר באמצעות צנטריפוגה גרדיאנט כפי שתואר קודם לכן15.
4. הפרדת תאי כבד לא-פרנצ'ימליים וטיהור LSECs
הערה: טהרו את ה-CD146+ LSECs באמצעות החרוזים האימונומגנטיים, בהתאם להוראות היצרן.
- צנטריפוגה את supernatant ב 300 x g במשך 5 דקות ב 4 ° C.
- אסוף את גלולת התא ובצע החייאה ב- 1 מ"ל של מאגר בידוד (טבלה 1), קבע את מספר התא באמצעות מונה תאים אוטומטי בהתאם להוראות היצרן.
- צנטריפוגה את מתלה התא ב 300 x g במשך 10 דקות ב 4 ° C, לשאוף את supernatant לחלוטין.
- בצעו החייאה של הכדור עם 90 μL של מאגר בידוד לכל 107 תאים בסך הכל.
- הוסף 10 μL של חרוזים מגנטיים CD146 לכל 107 תאים בסך הכל. מערבבים היטב ודגירה במשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
- כדי לשטוף את התאים, להוסיף 1-2 מ"ל של מאגר בידוד לכל 107 תאים, צנטריפוגה ב 300 x g במשך 10 דקות, ולאחר מכן לשאוף את supernatant לחלוטין.
- יש לבצע שימוש חוזר של עד 109 תאים ב-500 μL של מאגר בידוד (טבלה 1).
הערה: עבור מספרי תאים גבוהים יותר, הגדל את נפח המאגר בהתאם. - הכן את עמוד ההפרדה, שטפו אותו עם 3 מ"ל של חיץ בידוד.
- החל את תרחיף התא על העמודה הערומה עם מסנני קדם-הפרדה של 70 מיקרומטר.
- שטפו את העמודה עם 3 מ"ל של מאגר בידוד 3 פעמים.
הערה: בעת שטיפת העמודה, יש להוסיף את מאגר הבידוד ברגע שמאגר העמודות מתרוקן. - הסר את העמודה מהמפריד והנח אותה על צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל. פיפט 5 מ"ל של חיץ בידוד על העמודה.
- כדי לשחזר את החרוזים המגנטיים המסומנים בתאים, דחפו בחוזקה את הבוכנה לתוך העמודה כדי לשטוף את התאים.
- צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות ב 4 ° C. LSECs מוכנים לבדיקה מיקרוסקופית וניתוח במורד הזרם.
5. LSECs אימונופנוטיפ והערכת טוהר על ידי ציטומטריית זרימה
- קבע את מספרי התאים של LSECs מבודדים באמצעות מונה תאים אוטומטי בהתאם להוראות היצרן.
- צנטריפוגה את התאים ב 300 x g במשך 5 דקות, לשאוף את supernatant לחלוטין.
- קח 1 x 106 תאים / צינור ו resuspend עם 90 μL של מאגר צביעה (טבלה 1).
- הוסף 10 μL / שפופרת של בלוק FcR עכבר ו 1 μL של צבע כדאיות, דגירה ב 4 ° C למשך 10 דקות.
- הכתימו את התאים בשילוב של נוגדני CD45, CD146 ו-stabilin-2 המדוללים בשעה 1:50 עם מאגר צביעה. דגירה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
- לשטוף את התאים עם 5 מ"ל של חיץ צביעה וצנטריפוגה ב 300 x g במשך 10 דקות, ולאחר מכן לשאוף את supernatant לחלוטין.
- בצעו החייאה של התאים עם 300 μL של מאגר צביעה והעבירו דרך ציטומטר הזרימה.
6. תרבות ובחינה של LSECs
- זרע 1 x 106 תאים/באר בצלחת של 6 בארות ותרביב אותו עם מדיום גדילה של תאי אנדותל המורכב מ-5% סרום בקר עוברי (FBS), תוסף גדילה של תאי אנדותל 1% ותמיסת פרימוצין של 1%.
- בחנו את ה-LSECs המבודדים על ידי מיקרוסקופיית אור. רכוש תמונות בשדה בהיר עם הגדלה של פי 10.
7. מורפולוגיה של LSECs ובדיקת fenestrae על ידי סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים
- ציפוי מראש של תרבית התאים (גודל נקבובית של 3 מיקרומטר) בתמיסת קולגן.
- LSECs מבודדים בתרבית (120,000 תאים) על התוספת עם מדיום גדילה של תאי אנדותל בצלחת של 24 בארות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס חמה ולחה. אפשרו לתאים להתיישב ולהיצמד למשך שעתיים.
- לקיבוע תאים, הוסיפו נפח שווה ערך של 37 מעלות צלזיוס המקבע של טראמפ לתקשורת תרביות התאים.
- לאחר הדגירה במשך 10 דקות, החליפו 50% מהקיבעון המדולל של טראמפ בקיבעון של טראמפ.
- לתקן את התאים ב-Trump fixative במשך 2 שעות, ואז לדגום במשך שעה אחת ב-1% אוסמיום טטרוקסידים.
- המשך עם התייבשות הדגימות, ייבוש בהתקן ייבוש נקודה קריטית, הרכבה, ציפוי ניתור ובדיקה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שרטוטים ניסיוניים והתקנת ציוד:
בפרוטוקול זה, כבד העכברים עוכל באמצעות מעגל פרפוזיה סגור, ואז תאים לא-פרנצ'ימליים והפטוציטים הופרדו על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה ב-50 x g במשך 2 דקות. LSECs ראשוניים בודדו באמצעות בחירת חרוזים מגנטיים CD146 מהשבר הלא-פרנצ'ימלי. הסכימות הניסיוניות מוצגות באיור 1A. הצינורית הונחה דרך ה-PV בזמן שהווריד הנבוב התחתון נקשר כדי להבטיח זילוף חד-כיווני של קולגן דרך הכבד (איור 1B). תא הזלוף הפנימי מצויד במערכת חימום ולחות כדי להבטיח אוויר מנגנון חם ולח של 37-40 מעלות צלזיוס. הקולגנאז המחורבן מסתובב דרך מערכת סגורה וניתן לעשות בו שימוש חוזר עבור שניים או שלושה עכברים במהלך יום הבידוד כדי להפוך את הבידוד לחסכוני יותר.
הערכה של טוהר LSECs מבודדים וסמני פני שטח על ידי ציטומטריית זרימה:
הטוהר של ה-LSECs המבודדים הוערך על ידי שימוש בסמני פני השטח הספציפיים של LSEC CD146 ו-stabilin-2 16,17,18. תאים מוכתמים נותחו על ציטומטר זרימה; הנתונים נותחו באמצעות תוכנת FlowJo.
אוכלוסיית LSEC הייתה מגודרת (איור 2A) וניתחה סינגלטים עבור אסטרטגיית הגטינג הבאה; תאים בני קיימא הוגדרו באמצעות צביעת כדאיות לפני תיוג תאים בסמנים ספציפיים (איור 2B). לאחר מכן, אוכלוסיית CD45- הייתה מגודרת כך שלא תכלול כל זיהום של תאי מערכת החיסון. ה-LSECs המבודדים הגיעו לכדאיות של 94.8% (איור 2C). אחוז תאי ה-CD45 היה 89.7% (איור 2D), ו-92.3% מהתאים היו תאי CD146 ו-stabilin-2 בעלי חיוביות כפולה (CD45-CD146+stabilin-2+) LSECs (איור 2E).
מורפולוגיה של ה-LSECs המבודדים:
ה-LSECs המבודדים נזרעו בצלחת של 6 בארות ב-1 x 106 תאים/באר, עברו תרבית בתווך גדילה שלם, ונבחנו על ידי מיקרוסקופיית אור לאחר 6 שעות של תרבית (איור 3A). LSECs צופו על תוסף תרבית בגודל 3 מיקרומטרים של נקבוביות כדי להמחיש את ה-LSECs fenestrae על ידי סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM). לאחר הקיבוע והעיבוד, זוהו ה-fenestrae, כפי שמוצג באיור 3B. כפי שדווח בעבר, LSECs מאבדים את הפנסטרה שלהם בתרבות בן לילה19; לפיכך, מומלץ לעבד את התאים בהקדם האפשרי לאחר הבידוד למחקרים במורד הזרם כדי למנוע dedifferentiation במבחנה.
איור 1: שרטוטים ניסיוניים והתקנת ציוד. (A) סכמות ניסיוניות תוכננו באמצעות Bio render. (ב) הגדרת הציוד ותהליךו. הכבד נקטף והוחדר במנגנון זלוף קולגן סגור. לאחר מכן הכבד הועבר לתבשיל ומנותק. מתלי הכבד נאספו. חלק התא הלא-פרנצ'ימלי הופרד על ידי צנטריפוגה ב-50 x g למשך 2 דקות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: הערכה של טוהר LSECs מבודדים וסמני פני שטח על ידי ציטומטריית זרימה. ניתוח נתונים ואסטרטגיית גידור כפי שמוצג, (A) LSECs מגודרים ו-(B) סינגלטים המבוססים על פיזור קדימה (FSC)/פיזור צד (SSC). LSECs מבודדים הוכתמו בצבע כדאיות ובשילוב של נוגדנים CD45, CD146 ו-stabilin-2. סינגלטים היו מגודרים ומנותחים, (C) LSECs בני קיימא היו מגודרים על (D) אוכלוסיית CD45 ונותחו עבור (E) CD146 וביטוי סטבילין-2. כל השערים נקבעו על ידי פלואורסצנציה מינוס אחד (FMO). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: מורפולוגיה של LSECs מבודדים. (A) תמונת שדה בהירה של LSECs מתורבתים. LSECs מבודדים עברו תרבית במדיום הגדילה השלם במשך 6 שעות ונבחנו על ידי מיקרוסקופיית אור (סרגל קנה מידה 100 מיקרומטר). (B) LSEC נבדק על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM). חצים לבנים מציינים LSEC fenestrae (סרגל קנה מידה, לוח שמאלי 5 μm, לוח ימני 1 μm). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| פתרון מלאי KRH (10x) | |
| ריאגנטים | ריכוז |
| NaCl | 1.15 מ' |
| HEPES (חומצה חופשית) | 0.2 מ' |
| KCl | 0.05 מ' |
| KH2PO4 | 0.01 מטר |
| מאגר א' | |
| ריאגנטים | ריכוז |
| תמיסת KRH, PH=7.4 | 1x |
| EGTA | 0.5 מ"מ |
| התאם את PH ל- 7.4, סנן דרך מסנן של 0.2 מיקרומטר לפני השימוש. | |
| מאוחסן בטמפרטורת החדר עד 6 חודשים. | |
| חיץ ב' | |
| תמיסת KRH, PH=7.4 | 1x |
| CaCl2 | 1 מ"מ |
| התאם את PH ל- 7.4, סנן דרך מסנן של 0.2 מיקרומטר לפני השימוש. | |
| מאוחסן בטמפרטורת החדר עד 6 חודשים. | |
| תמיסת קולגן | |
| ריאגנטים | ריכוז |
| מאגר B, PH =7.4 | 125 מ"ל |
| קולגןאז | 35-40 מ"ג, מוסיפים BSA עד 100 מ"ג |
| פתרון פרקול | |
| ריאגנטים | ריכוז |
| פרקול | 22.5 מ"ל |
| PBS (10x), PH = 7.4 | 2.5 מ"ל |
| איזואלציה/חיץ צביעה | |
| ריאגנטים | ריכוז |
| מאגר שטיפת MACS | 1250 מ"ל |
| מניית BSA | 125 מ"ל |
טבלה 1: מתכון למאגרים. הטבלה כוללת את הרכב המאגרים והפתרונות ששימשו במחקר זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בכתב היד הנוכחי אנו מתארים פרוטוקול לבידוד LSEC מכבד עכברים המורכב מפרפוזיית קולגןאז דו-שלבית ומיון תאים המופעלים על ידי מגנטית (MACS) לאחר מכן. פרוטוקול זה מורכב משלושת השלבים הבאים: (1) פרפוזיה דרך ה-PV עם מאגר נטול סידן ואחריו מאגר המכיל קולגן כדי להשיג פיזור תאי כבד; (2) הרחקה של הפטוציטים עם צנטריפוגה במהירות נמוכה; ו-(3) בחירה חיובית מבוססת MACS של LSECs מתאים לא-פרנצ'ימליים (NPCs) באמצעות חרוזים מגנטיים נגד CD146. ניתן היה להשלים את כל ההליך תוך 3 שעות. יתר על כן, העלות עבור הליך זה, כולל כל החומרים המתכלים, היא בסביבות 150 דולר לעכבר, מה שמרמז על כך ששיטה זו של בידוד LSEC היא יעילה וחסכונית באופן כללי. אנו משתמשים גם בשלבים (1) ו-(2) לבידוד של הפטוציטים ראשוניים של עכברים, שהם מעבר להיקף של כתב היד הנוכחי.
ישנם כמה שלבים קריטיים בתותח פורטלי וזלוף כבד: (i) מיקום צנתר: יש למקם את קצה הצנתר לא פחות מ-3 מ"מ דיסטלי לביפורקציה PV של עכבר בוגר, המזוהה בדרך כלל בהילום של הכבד. מיקום עמוק של קצה הצנתר ב- PV יפגע בזלוף של חלק מהאונות של הכבד. זלוף לקוי של האונה מתבטא בהיעדר שינוי צבע של האונה וניתן לתקן אותו אם מבחינים בו מיד על ידי מיקום מחדש קל של הצנתר לתוך ה-PV הדיסטלי. תמרון זה יכול אולי לייעל את זלוף האונה. (ii) בועות אוויר: מסלול העירוי בין המשאבה לבין ה-PV צריך להישמר נקי לחלוטין מבועות אוויר. כניסת אוויר דקה לתוך PV יכולה לגרום לתסחיף אוויר, מה שגורם לזלוף כבד לא שלם. כדי לחסל את האוויר בקטטר לאחר הסרת המחט הפנימית, לחיץ A מוזרק מזרק פרוקסימלי לבועה כדי לגרש כל אוויר לפני חיבור קו העירוי לצנתר. (iii) חוזק הקולגאז: כדי לשמור על פעילות הקולג'אנאז במהלך הזלוף, חיוני להבטיח כי Buffer B המוחדר לתוך PV יש את הריכוז המדויק של קולגןאז ו- pH והוא נשמר על כ 37 מעלות צלזיוס. כפי שניתן לראות באיור 1, תא מותאם אישית משמש כדי לשמור על כל מערכת הזלוף באווירה חמה ולחה של 37 מעלות צלזיוס; בנוסף, אספקת החמצן נשמרת במהלך פיזור קולגן כדי להשיג עיכול מלא. אפשרות חלופית כוללת אמבט מים לחימום מראש של תמיסת הקולגאז20, ומערכת פרפוזיה פתוחה של קולגןאז באתרה שבה תמיסת הקולגנאז מתנקזת מהכבד דרך IVC21 החתוך.
למרות שהפרוטוקול משתמש בצנתרים מודגשים יחסית (20 G) כדי להבטיח זרימת זלוף נאותה, קטטר דק יותר יעבוד היטב גם על סמך דיווחים קודמים 22,23,24. עם זאת, לפעמים קשה להצליח לתמרן את ה- PV במיוחד כאשר עכברים משמשים למודלים ספציפיים של מחלות או אם יש להם אנומליות PV. אם תותח PV נכשל, עיכול כבד מכני ואנזימטי באמצעות ערכת אנזימים ודיסוציאטור רקמות עדין הוא שיטה חלופית לשלבים (1) ו-(2) להשגת תרחיף של תאים לא-פרנצ'ימליים (NPC). אישרנו כי תפוקת התאים והכדאיות בשיטה חלופית זו של דיסוציאציה ללא זלוף בכבד הייתה דומה לשיטה המקורית (הנתונים לא הוצגו). זלוף ורידים פורטלי לעיכול כבד הועסק על ידי אחרים ואנחנו 13,16,20. יתר על כן, שיטה זו מונעת את הסיכון התיאורטי של שינויים פנוטיפיים או תפקודיים של LSECs המושרים על ידי כוח מכני במהלך העיכול בכבד. לכן, השימוש בשיטה מבוססת PV perfusion המתוארת בפרוטוקול זה מומלץ עד כה מאוד.
כאן מוצגים התשואה והטוהר האופטימליים של LSEC בעת שימוש בפרוטוקול הנוכחי. השגנו בערך 2-5 x 106 תאים לכל עכבר הן מעכברים בריאים והן מעכברים עם NASH שנגרם על ידי דיאטה באמצעות הפרוטוקול הנוכחי. באשר לטוהר, החיוביות של אותו סמן פני שטח המשמש להפרדה אימונומגנטית (CD146) תומכת בדיוק של טכניקת הבידוד שלנו. בנוסף, ישנם מספר סמני פני שטח LSEC מוכרים היטב, כגון קולטן חומצה היאלורונית אנדותל כלי הלימפה 1 (LYVE-1), CD32b ו stabilin-2. עדיין קיימות מחלוקות סביב סמנים אלה; לדוגמה, i) LYVE-1 קיים גם בתאי אנדותל לימפתיים, ו- ii) LSECs באזור פריפורטלי חסרים ביטוי CD32b18. לפיכך, כדי לבחון את הטוהר של LSECs מבודדים אלה עם ציטומטריית זרימה, stabilin-2 שימש כסמן LSEC ספציפי מבוסס בנוסף CD146. באמצעות מתודולוגיה זו, אישרנו של-LSECs המבודדים יש >94% כדאיות וטוהר >90% (איור 2). הפנוטיפ הספציפי ל-LSEC של התאים המבודדים אושש עוד יותר באמצעות SEM, שבו לרוב התאים יש fenestrae (איור 3B), התכונה המורפולוגית האופיינית של LSECs.
מבין מתודולוגיות הבידוד של LSECs, בחירת חרוזים אימונומגנטיים היא הטכניקה המשמשת ביותר לבידוד ה-LSECs מהשבר NPC 24,25,26,27. לעומת זאת, שיטות אחרות כוללות אלוטריגציה צנטריפוגלית והפרדה סלקטיבית מבוססת הידבקות 22,28,29. הודגם כי השיטות הלא-אימונומגנטיות מספקות תפוקות גבוהות של LSECs (בערך 9 x 106 תאים לכל עכבר)11. לפיכך, תשואה נמוכה יחסית של LSECs מבודדים יכולה להיות מגבלה של הפרוטוקול הנוכחי. מצד שני, השיטות הלא-אימונומגנטיות המבוססות על ברירה דורשות מומחיות טכנית גבוהה ולעיתים מראות תוצאות לא עקביות על תפוקת התאים ועלהטוהר 11, בעוד שהשיטה מבוססת הברירה האימונומגנטית מחזיקה ביתרון של תפוקה וטוהר עקביים על פני שיטות קיימות אחרות. יתר על כן, עבור בידוד תאים המבוסס על בחירת חרוזים אימונומגנטיים, הספציפיות של סמני פני השטח של התא המשמשים היא תמיד עניין של דאגה. לדוגמה, CD31, אשר שימש בעבר כסמן להפרדת LSEC אימונומגנטית, מתבטא באופן דומיננטי באנדותל PV וב- LSECs3 הקפילריים. למרות שדווח כי CD146 בא לידי ביטוי גם בתאי הרג טבעיים ותאי סטלטה בכבד30,31, הטוהר הגבוה של LSECs שבודדו באמצעות פרוטוקול זה ממתן את החששות לגבי הספציפיות של סמן האנדותל CD146. השוואת היתרונות והחסרונות של מתודולוגיות שונות לבידוד LSEC נדונה במקום אחר 11,18,32. ההשוואה בין תפוקת התאים והטוהרים בין שיטות אחרות לבין שיטה זו חורגת מתחום כתב היד הנוכחי ומצדיקה חקירות עתידיות.
לסיכום, אנו מציגים פרוטוקול בידוד LSEC ראשוני של עכבר המבוסס על אחת הגישות הנפוצות והמקובלות ביותר. LSECs מבודדים מציגים טוהר גבוה ותפקוד שמור. יתר על כן, פרוטוקול זה יעיל וישים לכבד העכבר הבריא כמו גם לכבד מדגמי עכברים שונים של מחלות. ניתן להשתמש ב-LSECs באיכות גבוהה מעכברים אלה עבור יצירת ערכת נתונים רב-תחומית13,14. לפיכך, גישה זו מאפשרת זיהוי של מנגנונים מולקולריים המווסתים את תפקודו של LSEC ומשפרת את הבנתנו את תפקידם בתקשורת הבין-תאית בכבד בבריאות ובמחלות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לכל המחברים אין קונפליקטים לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות של ה- NIH (1RO1DK122948 ל- SHI) ומנגנון המענקים של NIH Silvio O. Conte לחקר מחלות עיכול P30 (DK084567). תמיכה ניתנה גם ל- KF על ידי האגודה היפנית לקידום המדע (JSPS) מלגות מחקר בחו"ל. אנו רוצים גם להודות לד"ר גרגורי ג'יי ג'יי גורס וסטיבן ברונק על התכנון והאופטימיזציה המקוריים שלהם של מנגנון פיזור הקולגנאז.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.0-inch 20 G Intra Venous (IV) catheter | Terumo, SOmerset, NJ, USA | SR-OX2051CA | |
| 2–3-inch perfuion tray with a hole in the center | customized; made in house | ||
| 405/520 viability dye | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-205 | |
| 4-inch regular curved dressing forceps | Fisher Brand | FS16-100-110 | |
| 5-0 Perma-Hand silk suture | Ethicon, Raritan, NJ, USA | A182H | |
| Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluorà 488 | MBL International, Woburn, MA, USA | D317-A48 | |
| BSA stock | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
| Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-118-407 | |
| CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-007 | |
| Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-803 | |
| Collagen type I | Corning, Corning, NY, USA | 354236 | |
| Collagenase II | Gibco, Waltham, MA, USA | 17101-015 | |
| Endothelial cells growth medium | ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA | 211-500 | |
| FcR blocking reagent, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-575 | |
| FlowJo software, version 10.6 | Becton, Dickinson and Company | ||
| Hardened Fine scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14091-11 | |
| Heated (37 °C) and humidified recirculating perfusion apparatus equipped with Oxygen injection at a rate of 10psi. | customized; made in house | ||
| Hitachi S 4700 scanning electron microscope | Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA | SEM096 | |
| LS columns | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-401 | |
| MACS pre-separation filters (70 μm) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-095-823 | |
| MACS rinsing buffer | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
| MACS Smart Strainer (70 μm) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-098-462 | |
| MACSQunt flow cytometer | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | ||
| Millicell Cell Culture Insert | Millipore Sigma, Burlington, MA, USA | PITP01250 | |
| Nexcelom cell counter | Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, USA | Cellometer Auto T4 Plus | |
| Percoll | GE Healthcare, Chicago, IL, USA | 17-0891-01 | |
| Surgical scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14001-12 | |
| Very small curved dressing forceps | F.S.T, Foster city, CA, USA | 11063-07 |
References
- Morin, O., Goulet, F., Normand, C. Liver sinusoidal endothelial cells: isolation, purification, characterization and interaction with hepatocytes. Revisiones Sobre Biologia Celular: RBC. 15, 1-85 (1988).
- Ibrahim, S. H. Sinusoidal endotheliopathy in nonalcoholic steatohepatitis: therapeutic implications. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 321 (1), 67-74 (2021).
- Poisson, J., et al. Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases. Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).
- Marrone, G., Shah, V. H., Gracia-Sancho, J. Sinusoidal communication in liver fibrosis and regeneration. Journal of Hepatology. 65 (3), 608-617 (2016).
- Shetty, S., Lalor, P. F., Adams, D. H. Liver sinusoidal endothelial cells - gatekeepers of hepatic immunity. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 15 (9), 555-567 (2018).
- Smedsrød, B., Pertoft, H., Gustafson, S., Laurent, T. C. Scavenger functions of the liver endothelial cell. Biochemical Journal. 266 (2), 313-327 (1990).
- DeLeve, L. D. Liver sinusoidal endothelial cells in hepatic fibrosis. Hepatology. 61 (5), 1740-1746 (2015).
- Dar, W. A., Sullivan, E., Bynon, J. S., Eltzschig, H., Ju, C. Ischaemia reperfusion injury in liver transplantation: Cellular and molecular mechanisms. Liver International. 39 (5), 788-801 (2019).
- Furuta, K., Guo, Q., Hirsova, P., Ibrahim, S. H. Emerging Roles of Liver Sinusoidal Endothelial Cells in Nonalcoholic Steatohepatitis. Biology. 9 (11), Basel. 395 (2020).
- Wu, L. Q., et al. Phenotypic and functional differences between human liver cancer endothelial cells and liver sinusoidal endothelial cells. Journal of Vascular Research. 45 (1), 78-86 (2008).
- Meyer, J., Gonelle-Gispert, C., Morel, P., Bühler, L. Methods for isolation and purification of murine liver sinusoidal endothelial cells: A systematic review. PLoS One. 11 (3), 0151945 (2016).
- Meyer, J., Lacotte, S., Morel, P., Gonelle-Gispert, C., Buhler, L. An optimized method for mouse liver sinusoidal endothelial cell isolation. Experimental Cell Research. 349 (2), 291-301 (2016).
- Furuta, K., et al. Lipid-induced endothelial vascular cell adhesion molecule 1 promotes nonalcoholic steatohepatitis pathogenesis. Journal of Clinical Investigation. 131 (6), (2021).
- Guo, Q., et al. Integrin β(1)-enriched extracellular vesicles mediate monocyte adhesion and promote liver inflammation in murine NASH. Journal of Hepatology. 71 (1), 1193-1205 (2019).
- Hirsova, P., Ibrahim, S. H., Bronk, S. F., Yagita, H., Gores, G. J. Vismodegib suppresses TRAIL-mediated liver injury in a mouse model of nonalcoholic steatohepatitis. PLoS One. 8 (7), 70599 (2013).
- Schrage, A., et al. Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1. Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).
- Olsavszky, V., et al. Exploring the transcriptomic network of multi-ligand scavenger receptor Stabilin-1- and Stabilin-2-deficient liver sinusoidal endothelial cells. Gene. 768, 145284 (2021).
- DeLeve, L. D., Maretti-Mira, A. C. Liver sinusoidal endothelial cell: An update. Seminars in Liver Disease. 37 (4), 377-387 (2017).
- DeLeve, L. D., Wang, X., Hu, L., McCuskey, M. K., McCuskey, R. S. Rat liver sinusoidal endothelial cell phenotype is maintained by paracrine and autocrine regulation. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 287 (4), 757-763 (2004).
- Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
- Ishiguro, K., Yan, I. K., Patel, T. Isolation of tissue extracellular vesicles from the liver. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e58649 (2019).
- Topp, S. A., Upadhya, G. A., Strasberg, S. M. Cold preservation of isolated sinusoidal endothelial cells in MMP 9 knockout mice: effect on morphology and platelet adhesion. Liver Transplantation. 10 (8), 1041-1048 (2004).
- Katz, S. C., Pillarisetty, V. G., Bleier, J. I., Shah, A. B., DeMatteo, R. P. Liver sinusoidal endothelial cells are insufficient to activate T cells. Journal of Immunology. 173 (1), 230-235 (2004).
- Liu, W., et al. Sample preparation method for isolation of single-cell types from mouse liver for proteomic studies. Proteomics. 11 (17), 3556-3564 (2011).
- Do, H., Healey, J. F., Waller, E. K., Lollar, P. Expression of factor VIII by murine liver sinusoidal endothelial cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (28), 19587-19592 (1999).
- Schrage, A., et al. Enhanced T cell transmigration across the murine liver sinusoidal endothelium is mediated by transcytosis and surface presentation of chemokines. Hepatology. 48 (4), 1262-1272 (2008).
- Chou, C. H., et al. Lysophosphatidic acid alters the expression profiles of angiogenic factors, cytokines, and chemokines in mouse liver sinusoidal endothelial cells. PLoS One. 10 (3), 0122060 (2015).
- Deleve, L. D. Dacarbazine toxicity in murine liver cells: a model of hepatic endothelial injury and glutathione defense. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 268 (3), 1261-1270 (1994).
- Smedsrød, B., Pertoft, H., Eggertsen, G., Sundström, C. Functional and morphological characterization of cultures of Kupffer cells and liver endothelial cells prepared by means of density separation in Percoll, and selective substrate adherence. Cell and Tissue Research. 241 (3), 639-649 (1985).
- Despoix, N., et al. Mouse CD146/MCAM is a marker of natural killer cell maturation. European Journal of Immunology. 38 (10), 2855-2864 (2008).
- Strauss, O., Phillips, A., Ruggiero, K., Bartlett, A., Dunbar, P. R. Immunofluorescence identifies distinct subsets of endothelial cells in the human liver. Scientific Reports. 7, 44356 (2017).
- Halpern, K. B., et al. Paired-cell sequencing enables spatial gene expression mapping of liver endothelial cells. Nature Biotechnology. 36 (10), 962-970 (2018).
