Summary
Aquí describimos y demostramos un protocolo para el aislamiento primario de células endoteliales sinusoidales sinusoidales hepáticas (LSEC) del ratón. El protocolo se basa en la perfusión de colagenasa hepática, la purificación de células no parentales por centrifugación de baja velocidad y la selección de perlas magnéticas CD146. También fenotipo y caracterizamos estos LSEC aislados mediante citometría de flujo y microscopía electrónica de barrido.
Abstract
Las células endoteliales sinusoidales hepáticas (LSEC) son células endoteliales especializadas ubicadas en la interfaz entre la circulación y el parénquima hepático. Los LSEC tienen una morfología distinta caracterizada por la presencia de fenestras y la ausencia de membrana basal. Los LSEC desempeñan un papel esencial en muchos trastornos patológicos en el hígado, incluida la desregulación metabólica, la inflamación, la fibrosis, la angiogénesis y la carcinogénesis. Sin embargo, poco se ha publicado sobre el aislamiento y la caracterización de los LSEC. Aquí, este protocolo discute el aislamiento de LSEC de ratones sanos y sin enfermedad del hígado graso (NAFLD). El protocolo se basa en la perfusión de colagenasa del hígado de ratón y perlas magnéticas de selección positiva de células no pares para purificar LSEC. Este estudio caracteriza los LSEC utilizando marcadores específicos por citometría de flujo e identifica las características fenotípicas características mediante microscopía electrónica de barrido. Los LSEC aislados siguiendo este protocolo se pueden utilizar para estudios funcionales, incluidos ensayos de adhesión y permeabilidad, así como estudios posteriores para una vía particular de interés. Además, estos LSEC se pueden agrupar o utilizar individualmente, lo que permite la generación de datos multiómicos, incluida la generación de datos RNA-seq a granel o unicelular, proteómica o fosfoprotómica, y el ensayo de cromatina accesible a la transposasa mediante secuenciación (ATAC-seq), entre otros. Este protocolo será útil para los investigadores que estudian la comunicación de los LSEC con otras células hepáticas en la salud y la enfermedad y permitirá una comprensión profunda del papel de los LSEC en los mecanismos patógenos de la lesión hepática aguda y crónica.
Introduction
Las células endoteliales sinusoidales hepáticas (LSAC) recubren las paredes sinusoides hepáticas y son las células no parenquimatosas más abundantes en el hígado1. Los LSEC se distinguen de otras células endoteliales capilares en otras partes del cuerpo por la presencia de fenestras y la falta de una membrana basal clásica o un diafragma 2,3. Por lo tanto, los LSEC poseen características fenotípicas y estructurales distintivas que mejoran su permeabilidad y capacidad endocítica para eliminar una variedad de macromoléculas circulantes, incluidos los lípidos y las lipoproteínas. Los LSEC desempeñan un papel fundamental en la diafonía entre las células parenquimatosas y no parenquimatosas, como las células estrelladas y las células inmunes. Los LSEC son clave para mantener la homeostasis hepática al mantener las células estrelladas y las células de Kupffer en un estado de reposo4. Los LSEC modulan la composición de las poblaciones de células inmunes hepáticas mediando la adhesión y la migración transendotelial de los leucocitos circulantes 5,6. Durante la lesión hepática aguda y crónica 7, incluidala lesión por isquemia-reperfusión (IRI)8, la esteatohepatitis no alcohólica (EHNA)9 y el carcinoma hepatocelular (CHC), los LSEC experimentan cambios fenotípicos conocidos como capilarización caracterizados por la defenestración y la formación de la membrana basal10. Estos cambios fenotípicos en los LSEC están asociados con la disfunción de los LSEC y la adquisición de propiedades protrombóticas, proinflamatorias y profibrogénicas.
Se han desarrollado varios métodos para el aislamiento de LSECs del hígado de ratón11. Algunas técnicas dependen de la separación de células no parenquimatosas y parenquimatosas seguidas de centrifugación por gradiente de densidad para purificar los LSEC de las fracciones no paresquimatosas. La limitación de este método es la presencia de macrófagos contaminantes en los pasos finales del aislamiento de LSECs, lo que podría afectar la pureza de los LSECs aislados12. Este protocolo se basa en la perfusión de colagenasa del hígado de ratón y en la selección positiva de perlas magnéticas CD146+ de células no paresquimatosas para purificar LSAC. Los LSEC aislados utilizando este método muestran alta pureza y conservan morfología y viabilidad. Estos LSEC son óptimos para estudios funcionales, incluidos los ensayos de permeabilidad y adhesión, así como para estudios posteriores para vías de interés. Además, con el creciente interés en generar grandes conjuntos de datos tanto en la investigación clínica como en la ciencia del descubrimiento, estos LSEC de alta calidad aislados de hígados sanos y enfermos con esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) u otras afecciones se pueden agrupar o utilizar individualmente, lo que permite la generación de datos multiómicos y la comparación entre la salud y la enfermedad13,14 . Además, los LSEC aislados se pueden emplear para desarrollar modelos bidimensionales y tridimensionales in vitro como organoides para descifrar la vía de señalización activada en LSEC y su comunicación intercelular con otras células hepáticas bajo diferentes estímulos nocivos y en respuesta a diversas intervenciones terapéuticas.
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Protocol
Los protocolos con animales se llevaron a cabo según lo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de Mayo Clinic. Los ratones machos C57BL / 6J de ocho semanas de edad fueron comprados en el Laboratorio Jackson. Los ratones fueron alojados en una instalación de ciclo de luz-oscuridad de 12:12 h con temperatura controlada con acceso gratuito a la dieta.
1. Preparación de un plato o plato de cultivo recubierto de colágeno
- Para producir 50 ml de ácido acético de 0,02 mol/L, añadir 0,6 ml de ácido acético glacial a 49,4 ml de H2O.
- Hacer 50 μg/ml de colágeno tipo I en ácido acético 0.02 mol/L. La dilución depende de la concentración del lote.
- Cubra los platos de cultivo de 10 cm con 3 ml de solución de colágeno. Incubar a temperatura ambiente (RT) durante 1 h.
NOTA: Cuando se utiliza un plato o plato diferente para el cultivo, el volumen de la solución de recubrimiento debe ajustarse en función del área de cultivo, generalmente use 6-10 μg / cm2. - Retire el exceso de líquido de la superficie recubierta y lávese con solución salina tamponada con fosfato (PBS) 3 veces. Deje que los platos se sequen al aire.
- Si la solución de colágeno no es estéril, esterilice los platos recubiertos de colágeno mediante la exposición a la luz ultravioleta (UV) durante 10 minutos en una campana de cultivo de tejidos estériles.
2. Configuración del equipo
- Configure el aparato de perfusión de recirculación calentado y humidificado como se muestra en la Figura 1B.
- Enjuague el sistema de perfusión con lejía al 10% durante 5 minutos, seguido de agua estéril durante otros 10 minutos.
- Escurra el líquido de enjuague tanto como sea posible antes de perfundir la solución de colagenasa.
- Infundir solución de colagenasa a través del sistema de perfusión (como se muestra en la Figura 1B) para precalentarla a 37 °C. Ajuste la velocidad de la bomba a la velocidad 1 como se muestra en el dial de control de velocidad (igual a 40 ml/min).
- Mantenga esta velocidad igual durante todo el procedimiento. Reutilizar la solución de colagenasa en circuito cerrado durante el día del aislamiento de LSEC.
NOTA: La velocidad de la bomba se fija en 1 para evitar la presión mecánica que podría perturbar la condición biológica de LSEC.
3. Procedimiento quirúrgico
- Pesa el ratón.
- Inyecte 90 mg/kg de peso corporal de ketamina y 10 mg/kg de peso corporal de xilazina por vía intraperitoneal (IP).
- Una vez que el ratón no sea reactivo a los estímulos dolorosos, asegure el ratón a la superficie quirúrgica, como se muestra en la Figura 1B.
- Rocíe el abdomen del ratón con etanol al 70%. Usando tijeras quirúrgicas, haga una incisión de ~ 5 cm de largo a partir de la parte inferior del abdomen hasta el proceso xifoide.
- A continuación, haga dos cortes laterales con pequeñas tijeras de iris a cada lado del abdomen para exponer completamente los órganos abdominales.
- Coloque la vaina del catéter intravenoso (IV) debajo de la espalda del animal para levantar y nivelar el abdomen.
- Usando un apósito curvo regular, tire suavemente de los intestinos y el estómago hacia la izquierda del animal.
- Coloque una sutura quirúrgica 5-0 debajo de la vena cava inferior (IVC) justo debajo del riñón izquierdo expuesto. Ata un enganche suelto en la sutura.
- Coloque otra sutura quirúrgica 5-0 alrededor de la vena porta hepática (PV) justo encima del punto de ramificación de la vena esplénica fuera de la PV hepática. Ata un enganche suelto en la sutura.
- Usando la sutura PV como tensión, inserte el catéter 20 G IV en el PV hepático 1 cm por debajo de donde se ramifica a la PV hepática derecha e izquierda.
- Deslice el catéter por la vena, pero manténgalo debajo del área de ramificación. Permita que la sangre viaje por el catéter hasta que comience a gotear.
- Con parte del tampón A (Tabla 1) en un frasco intravenoso (IV) colocado sobre el área quirúrgica, use una línea IV y conéctela al catéter. Enjuague el hígado con esta solución mientras evita la entrada de aire en el sistema.
- Ate la sutura alrededor de la vena cava inferior debajo del riñón. Esto permitirá que el hígado retrofunda la perfusión.
- Corte el IVC debajo de la sutura para permitir que el animal se desangre.
NOTA: Este paso debe realizarse rápidamente para evitar la congestión del hígado. - Asegure el catéter intravenoso con la sutura PV.
- Una vez perfundido, corte el estómago, los intestinos, el bazo y otras entrañas adheridas al hígado.
- Corte el diafragma y los vasos principales de la cavidad torácica. Retire el hígado del animal y colóquelo en la bandeja de perfusión.
- Retire con cuidado la línea IV y conecte la solución de colagenasa en la cámara de recirculación.
NOTA: Los pasos 3.16-3.18 deben realizarse dentro de los 5 minutos, para que el hígado no se perfunda demasiado tiempo con Buffer A. Tenga mucho cuidado de no permitir que entren burbujas de aire en el hígado. - Permita que el hígado se perfunda hasta que la cápsula se motee y aparezca blanda (10-15 minutos o más, el período varía según los diferentes lotes de colagenasa).
- Mientras el hígado está en perfusión, asegúrese de que el animal haya fallecido antes de desecharlo en una bolsa de necropsia.
- Una vez digerido, retire el hígado de la cámara y colóquelo en una placa de Petri de 10 cm con aproximadamente 20 ml de Medio Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco sin suero.
- Separe suavemente el hígado con un par de puntas de pipeta y deseche el árbol biliar.
- Filtre la suspensión hepática a través de un colador celular de 70 μm en un tubo cónico de 50 ml.
- Centrifugar la suspensión celular a 50 x g durante 2 min en RT. Recoger el sobrenadante que contiene células hepáticas no parenquimatosas.
NOTA: Los hepatocitos se precipitan en el pellet, que se puede purificar aún más mediante centrifugación por gradiente como se describió anteriormente15.
4. Separación de células hepáticas no paresquimatosas y purificación de LSEC
NOTA: Purifique los LSEC CD146+ utilizando las perlas inmunomagnéticas, siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Centrifugar el sobrenadante a 300 x g durante 5 min a 4 °C.
- Recoja el pellet de celda y vuelva a suspenderlo en 1 ml de tampón de aislamiento (Tabla 1), determine el número de celda utilizando un contador de celda automático siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Centrifugar la suspensión celular a 300 x g durante 10 min a 4 °C, aspirar el sobrenadante por completo.
- Resuspend el pellet con 90 μL de tampón de aislamiento por 107 células totales.
- Añadir 10 μL de perlas magnéticas CD146 por cada 107 células totales. Mezclar bien e incubar durante 15 min a 4 °C.
- Para lavar las células, agregue 1-2 ml de tampón de aislamiento por cada 107 células, centrífuga a 300 x g durante 10 minutos y luego aspire el sobrenadante por completo.
- Resuspendir hasta 109 celdas en 500 μL de tampón de aislamiento (Tabla 1).
NOTA: Para números de celda más altos, escale el volumen del búfer en consecuencia. - Prepare la columna de separación, enjuáguela con 3 ml de tampón de aislamiento.
- Aplique la suspensión de celda sobre la columna apilada con filtros de preseparación de 70 μm.
- Lave la columna con los 3 ml de tampón de aislamiento 3 veces.
NOTA: Al lavar la columna, el búfer de aislamiento debe agregarse tan pronto como el depósito de la columna esté vacío. - Retire la columna del separador y colóquela sobre un tubo centrífugo de 15 ml. Pipeta 5 ml de tampón de aislamiento sobre la columna.
- Para recuperar las células marcadas con cuentas magnéticas, empuje firmemente el émbolo hacia la columna para eliminar las células.
- Centrífuga a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Los LSEC están listos para el examen microscópico y el análisis posterior.
5. Inmunofenotipificación de LSEC y evaluación de la pureza por citometría de flujo
- Determine los números de celda de los LSEC aislados utilizando un contador de celdas automático siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Centrifugar las células a 300 x g durante 5 min, aspirar el sobrenadante por completo.
- Tomar 1 x 106 células/tubo y resuspend con 90 μL de tampón de tinción (Tabla 1).
- Añadir 10 μL/tubo de bloque FcR de ratón y 1 μL de colorante de viabilidad, incubar a 4 °C durante 10 min.
- Mante las células con una combinación de anticuerpos CD45, CD146 y estabilina-2 diluidos a 1:50 con tampón de tinción. Incubar a 4 °C durante 20 min.
- Lave las células con 5 ml de tampón de tinción y centrífuga a 300 x g durante 10 min, luego aspire el sobrenadante por completo.
- Resuspend las células con 300 μL de tampón de tinción y correr a través del citómetro de flujo.
6. Cultura y examen de LSECs
- Sembrar 1 x 106 células/pocillo en una placa de 6 pocillos y cultivarlo con medio de crecimiento de células endoteliales que consiste en 5% de suero fetal bovino (FBS), 1% de suplemento de crecimiento de células endoteliales y solución de primocina al 1%.
- Examinar los LSEC aislados mediante microscopía de luz. Adquiera imágenes de campo brillante con un aumento de 10x.
7. Examen de morfología y fenestra de LSECs mediante microscopía electrónica de barrido
- Cubra previamente los insertos de cultivo celular (tamaño de poro de 3 μm) con solución de colágeno.
- Cultivo aislado de LSEC (120.000 células) en el inserto con medio de crecimiento de células endoteliales en una placa de 24 pocillos a 37 °C atmósfera cálida y humidificada. Deje que las células se asienten y se adhieran durante 2 h.
- Para la fijación celular, agregue un volumen equivalente de fijador de Trump precalentado a 37 ° C a los medios de cultivo celular.
- Después de la incubación durante 10 minutos, reemplace el fijador de Trump diluido al 50% con el fijador de Trump sin diluir.
- Fije las células en el fijador Trump durante 2 h, luego incube durante 1 h en tetróxidos de osmio al 1%.
- Proceda con la deshidratación de las muestras, el secado en un dispositivo de secado de punto crítico, el montaje, el recubrimiento por pulverización y el examen con un microscopio electrónico de barrido.
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Representative Results
Esquemas experimentales y configuración de equipos:
En este protocolo, el hígado de ratón se digirió utilizando un circuito de perfusión cerrado, luego las células no parentales y los hepatocitos se separaron mediante centrifugación de baja velocidad a 50 x g durante 2 min. Los LSEC primarios se aislaron utilizando la selección de perlas magnéticas CD146 de la fracción no parnquimatosa. Los esquemas experimentales se muestran en la Figura 1A. La cánula se colocó a través de la PV mientras que la vena cava inferior se ató para asegurar la perfusión unidireccional de la colagenasa a través del hígado (Figura 1B). La cámara de perfusión interna está equipada con un sistema de calefacción y humidificación para garantizar un aire caliente y humidificado de 37-40 °C. La colagenasa perfundida circula a través de un sistema cerrado y se puede reutilizar para dos o tres ratones durante el día de aislamiento para que el aislamiento sea más rentable.
Evaluación de la pureza de los LSEC aislados y de los marcadores de superficie por citometría de flujo:
La pureza de los LSEC aislados se evaluó mediante el empleo de marcadores de superficie específicos de LSEC bien caracterizados CD146 y estabilina-2 16,17,18. Las células teñidas se analizaron en un citómetro de flujo; los datos se analizaron mediante el software FlowJo.
La población de LSEC fue cerrada (Figura 2A) y analizó singletes para la siguiente estrategia de gating; las células viables se definieron mediante tinción de colorante de viabilidad antes de etiquetar las células con marcadores específicos (Figura 2B). Luego, la población de CD45 fue cerrada para excluir cualquier contaminación de células inmunes. Los LSEC aislados alcanzaron un 94,8% de viabilidad (Figura 2C). El porcentaje de células CD45 fue del 89,7% (Figura 2D), y el 92,3% de las células fueron CD146 y stabilina-2 doblemente positivas (CD45-CD146+estabilina-2+) LSEC (Figura 2E).
Morfología de los LSEC aislados:
Los LSEC aislados se sembraron en una placa de 6 pocillos a 1 x 106 células/pozo, se cultivaron en un medio de crecimiento completo y se examinaron mediante microscopía de luz después de 6 h de cultivo (Figura 3A). Los LSEC se colocaron en un inserto de cultivo de 3 μm del tamaño de un poro para visualizar los fenestras de LSEC mediante microscopio electrónico de barrido (SEM). Después de la fijación y el procesamiento, se identificaron las fenestras, como se muestra en la Figura 3B. Como se informó anteriormente, los LSEC pierden sus fenestras en cultivo durante la noche19; por lo tanto, se recomienda procesar las células lo antes posible después del aislamiento para estudios posteriores para evitar la desdiferenciación in vitro.
Figura 1: Esquemas experimentales y configuración de equipos. (A) Los esquemas experimentales se diseñaron utilizando Bio render. (B) Configuración y proceso del equipo. El hígado fue cosechado y perfundido en un aparato cerrado de perfusión de colagenasa. El hígado se transfirió a un plato y se disoció. Se recogió la suspensión hepática. La fracción celular no parenquimatosa se separó por centrifugación a 50 x g durante 2 min. Los LSEC se purificaron utilizando perlas magnéticas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Evaluación de la pureza de los LSEC aislados y de los marcadores de superficie por citometría de flujo. Análisis de datos y estrategia de cierre como se muestra, (A) LSEC cerradas y (B) singletes basados en dispersión hacia adelante (FSC) / dispersión lateral (SSC). Los LSEC aislados se tiñeron con un colorante de viabilidad y una combinación de anticuerpos CD45, CD146 y estabilina-2. Los singletes fueron cerrados y analizados, (C) los LSEC viables fueron cerrados en la población (D) CD45 y analizados para (E) CD146 y la expresión de estabilina-2. Todas las puertas fueron determinadas por fluorescencia menos una (FMO). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Morfología de los LSEC aislados. (A) Imagen de campo brillante de los LSEC cultivados. Los LSEC aislados se cultivaron en el medio de crecimiento completo durante 6 h y se examinaron mediante microscopía de luz (barra de escala de 100 μm). (B) La LSEC fue examinada por microscopio electrónico de barrido (SEM). Las flechas blancas indican fenestras LSEC (barra de escala, panel izquierdo 5 μm, panel derecho 1 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Solución madre KRH (10x) | |
| Reactivos | Concentración |
| NaCl | 1,15 M |
| HEPES (ácido libre) | 0,2 M |
| Kcl | 0,05 M |
| KH2PO4 | 0,01 M |
| Búfer A | |
| Reactivos | Concentración |
| Solución de KRH, PH=7.4 | 1x |
| EGTA | 0,5 mM |
| Ajuste el pH a 7.4, filtre a través de un filtro de 0.2 μm antes de usarlo. | |
| Almacenado a temperatura ambiente durante un máximo de 6 meses. | |
| Búfer | |
| Solución de KRH, PH=7.4 | 1x |
| CaCl2 | 1 mM |
| Ajuste el pH a 7.4, filtre a través de un filtro de 0.2 μm antes de usarlo. | |
| Almacenado a temperatura ambiente durante un máximo de 6 meses. | |
| Solución de colagenasa | |
| Reactivos | Concentración |
| Búfer B, PH=7.4 | 125 ml |
| Colagenasa | 35–40 mg, agregue BSA hasta 100 mg |
| Solución Percoll | |
| Reactivos | Concentración |
| Percoll | 22,5 ml |
| PBS (10x), PH=7.4 | 2,5 ml |
| Tampón de isoalción/tinción | |
| Reactivos | Concentración |
| Búfer de enjuague MACS | 1250 ml |
| Acciones de BSA | 125 ml |
Tabla 1: Receta de tampones. La tabla comprende la composición de los tampones y soluciones utilizados en este estudio.
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Discussion
En el manuscrito actual, describimos un protocolo para el aislamiento de LSEC del hígado de ratón que consiste en la perfusión de colagenasa de dos pasos y la posterior clasificación celular activada magnéticamente (MACS). Este protocolo consta de los siguientes tres pasos: (1) Perfusión a través del PV con un tampón libre de calcio seguido de un tampón que contiene colagenasa para lograr la dispersión de las células hepáticas; (2) Exclusión de hepatocitos con centrifugación de baja velocidad; y (3) selección positiva basada en MACS de LSEC de células no paresquimatosas (NPC) utilizando perlas magnéticas anti-CD146. Todo el procedimiento podría completarse en 3 h. Además, el costo de este procedimiento, incluidos todos los suministros consumibles, es de alrededor de 150 USD por ratón, lo que sugiere que este método de aislamiento de LSEC es en general eficiente y rentable. También utilizamos los pasos (1) y (2) para el aislamiento de los hepatocitos primarios de ratón, lo que está más allá del alcance del manuscrito actual.
Hay algunos pasos críticos en la canulación portal y la perfusión hepática: (i) Posicionamiento del catéter: la punta del catéter debe colocarse no menos de 3 mm distal a la bifurcación PV de un ratón adulto, que generalmente se identifica en el hilio del hígado. La colocación profunda de la punta del catéter en la PV comprometerá la perfusión de algunos lóbulos del hígado. La mala perfusión de un lóbulo se manifiesta como una ausencia de un cambio de color del lóbulo y puede rectificarse si se nota inmediatamente mediante un ligero reposicionamiento del catéter en la PV distal. Esta maniobra podría posiblemente optimizar la perfusión del lóbulo. ii) Burbujas de aire: la ruta de infusión entre la bomba y la fotovoltaica debe mantenerse completamente libre de burbujas de aire. La entrada diminuta de aire en el PV puede causar una embolia de aire, lo que resulta en una perfusión hepática incompleta. Para eliminar el aire en el catéter después de extraer la aguja interna, se inyecta Buffer A con una jeringa proximal a la burbuja para expulsar el aire antes de conectar la línea de infusión al catéter. (iii) Fuerza de la colagenasa: Para mantener la actividad de la colagenasa durante la perfusión, es esencial asegurar que el tampón B infundido en el PV tenga la concentración precisa de colagenasa y pH y se mantenga a aproximadamente 37 ° C. Como se muestra en la Figura 1, se utiliza una cámara personalizada para mantener todo el sistema de perfusión en una atmósfera cálida y humidificada de 37 °C; además, el suministro de oxígeno se mantiene durante la perfusión de colagenasa para lograr una digestión completa. Una opción alternativa incluye un baño de agua para precalentar la solución de colagenasa20, y un sistema de perfusión de colagenasa abierta in situ donde la solución de colagenasa drena fuera del hígado a través del corte IVC21.
Aunque el protocolo utiliza catéteres relativamente audaces (20 G) para asegurar un flujo de perfusión adecuado, un catéter más delgado también funcionará bien según informes anteriores 22,23,24. Sin embargo, a veces es difícil cannular con éxito el PV, especialmente cuando los ratones se utilizan para modelos de enfermedades específicas o si tienen anomalías PV. Si la canulación PV falla, la digestión hepática mecánica y enzimática utilizando un kit de enzimas y un disociador de tejido suave es un método alternativo para los pasos (1) y (2) para obtener la suspensión de células no pares (NPC). Hemos confirmado que el rendimiento celular y la viabilidad en este método alternativo de disociación sin perfusión hepática fue comparable al método original (datos no mostrados). La perfusión de la vena porta para la digestión hepática ha sido empleada por otros y por nosotros 13,16,20. Además, este método evita el riesgo teórico de alteraciones fenotípicas o funcionales de LSEC inducidas por la fuerza mecánica durante la digestión hepática. Por lo tanto, el uso del método basado en perfusión PV representado en este protocolo es hasta ahora muy recomendable.
Aquí, se muestra el rendimiento óptimo de LSEC y la pureza al emplear el protocolo actual. Obtuvimos aproximadamente 2-5 x 106 células por ratón tanto de ratones sanos como de ratones con NASH inducida por la dieta utilizando el protocolo actual. En cuanto a la pureza, la positividad del mismo marcador de superficie utilizado para la separación inmunomagnética (CD146) apoya la precisión de nuestra técnica de aislamiento. Además, hay varios marcadores de superficie LSEC bien reconocidos, como el receptor 1 de ácido hialurónico endotelial de vasos linfáticos (LYVE-1), CD32b y estabilina-2. Todavía existen controversias en torno a estos marcadores; por ejemplo, i) LYVE-1 está presente también en las células endoteliales linfáticas, y ii) los LSEC en un área periportal carecen de expresión de CD32b18. Por lo tanto, para examinar la pureza de estos LSEC aislados con citometría de flujo, se empleó la estabilina-2 como un marcador LSEC específico establecido además de CD146. Utilizando esta metodología, confirmamos que los LSEC aislados tenían >94% de viabilidad y >90% de pureza (Figura 2). El fenotipo específico de LSEC de las células aisladas se confirmó aún más utilizando SEM, donde la mayoría de las células tienen fenestra (Figura 3B), la característica morfológica característica de los LSEC.
Entre las metodologías de aislamiento de LSEC, la selección de perlas inmunomagnéticas es la técnica más utilizada para aislar a las LSEC de la fracciónNPC 24,25,26,27. Por el contrario, otros métodos incluyen la elutriación centrífuga y la separación basada en la adhesión selectiva 22,28,29. Se ha demostrado que los métodos no inmunomagnéticos ofrecen altos rendimientos de LSEC (aproximadamente 9 x 106 células por ratón)11. Por lo tanto, un rendimiento relativamente menor de LSEC aislados podría ser una limitación del protocolo actual. Por otro lado, los métodos basados en la selección no inmunomagnética requieren una alta experiencia técnica y, a veces, muestran resultados inconsistentes en los rendimientos y purezas celulares11, mientras que el método basado en la selección inmunomagnética tiene la ventaja de un rendimiento y pureza consistentes sobre otros métodos existentes. Además, para el aislamiento celular basado en la selección de perlas inmunomagnéticas, la especificidad de los marcadores de superficie celular utilizados siempre es motivo de preocupación. Por ejemplo, CD31, que se ha utilizado anteriormente como marcador para la separación inmunomagnética de LSEC, se expresa predominantemente en el endotelio PV y LSEC capilarizados3. Aunque se ha informado que CD146 se expresa también en células asesinas naturales y células estrelladas hepáticas 30,31, la alta pureza de los LSEC aislados utilizando este protocolo mitiga las preocupaciones con respecto a la especificidad del marcador endotelial CD146. La comparación de los pros y los contras de diversas metodologías para el aislamiento de la ESEC se discute en otra parte 11,18,32. La comparación de los rendimientos y purezas celulares entre otros métodos y este método está más allá del alcance del manuscrito actual y justifica futuras investigaciones.
En conclusión, presentamos un protocolo de aislamiento LSEC primario de ratón basado en uno de los enfoques más utilizados y aceptados. Los LSEC aislados muestran una alta pureza y una función preservada. Además, este protocolo es eficiente y aplicable al hígado de ratón sano, así como al hígado de diferentes modelos de ratón de enfermedad. Los LSEC de alta calidad de estos ratones se pueden emplear para la generaciónde conjuntos de datos multiómicos 13,14. Por lo tanto, este enfoque facilita la identificación de mecanismos moleculares que regulan la función de LSEC y mejora nuestra comprensión de sus roles en la comunicación intercelular en el hígado en la salud y la enfermedad.
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Disclosures
Todos los autores no tienen conflictos que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales de los NIH (1RO1DK122948 a SHI) y el mecanismo de subvención P30 de los NIH Silvio O. Conte Digestive Diseases Research Core Centers (DK084567). La Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) también prestó apoyo a KF en las becas de investigación en el extranjero. También nos gustaría reconocer al Dr. Gregory J. Gores y Steven Bronk por su diseño original y optimización del aparato de perfusión de colagenasa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.0-inch 20 G Intra Venous (IV) catheter | Terumo, SOmerset, NJ, USA | SR-OX2051CA | |
| 2–3-inch perfuion tray with a hole in the center | customized; made in house | ||
| 405/520 viability dye | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-205 | |
| 4-inch regular curved dressing forceps | Fisher Brand | FS16-100-110 | |
| 5-0 Perma-Hand silk suture | Ethicon, Raritan, NJ, USA | A182H | |
| Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluorà 488 | MBL International, Woburn, MA, USA | D317-A48 | |
| BSA stock | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
| Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-118-407 | |
| CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-007 | |
| Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-803 | |
| Collagen type I | Corning, Corning, NY, USA | 354236 | |
| Collagenase II | Gibco, Waltham, MA, USA | 17101-015 | |
| Endothelial cells growth medium | ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA | 211-500 | |
| FcR blocking reagent, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-575 | |
| FlowJo software, version 10.6 | Becton, Dickinson and Company | ||
| Hardened Fine scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14091-11 | |
| Heated (37 °C) and humidified recirculating perfusion apparatus equipped with Oxygen injection at a rate of 10psi. | customized; made in house | ||
| Hitachi S 4700 scanning electron microscope | Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA | SEM096 | |
| LS columns | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-401 | |
| MACS pre-separation filters (70 μm) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-095-823 | |
| MACS rinsing buffer | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
| MACS Smart Strainer (70 μm) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-098-462 | |
| MACSQunt flow cytometer | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | ||
| Millicell Cell Culture Insert | Millipore Sigma, Burlington, MA, USA | PITP01250 | |
| Nexcelom cell counter | Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, USA | Cellometer Auto T4 Plus | |
| Percoll | GE Healthcare, Chicago, IL, USA | 17-0891-01 | |
| Surgical scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14001-12 | |
| Very small curved dressing forceps | F.S.T, Foster city, CA, USA | 11063-07 |
References
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