Summary
Här beskriver och demonstrerar vi ett protokoll för primär muslever sinusformad endotelcell (LSEC) isolering. Protokollet är baserat på leverkollagenasperfusion, icke-parerkymal cellrening genom låghastighetscentrifugering och CD146 magnetiskt pärlval. Vi fenotypar och karakteriserar också dessa isolerade LSECs med hjälp av flödescytometri och svepelektronmikroskopi.
Abstract
Lever sinusformade endotelceller (LSECs) är specialiserade endotelceller belägna vid gränssnittet mellan cirkulationen och leverparenkymen. LSC har en distinkt morfologi som kännetecknas av närvaron av fenestrae och frånvaron av basalmembran. LSECs spelar viktiga roller i många patologiska störningar i levern, inklusive metabolisk dysregulering, inflammation, fibros, angiogenes och cancerframkallande. Lite har dock publicerats om isoleringen och karakteriseringen av LSECs. Här diskuterar detta protokoll isoleringen av LSEC från både friska och alkoholfria fettleversjukdomar (NAFLD) möss. Protokollet är baserat på kollagenasperfusion av muslevern och magnetiska pärlor positivt urval av icke-föräldrarkymala celler för att rena LSECC. Denna studie karakteriserar LSECs med hjälp av specifika markörer genom flödescytometri och identifierar de karakteristiska fenotypiska egenskaperna genom att skanna elektronmikroskopi. LSECs isolerade enligt detta protokoll kan användas för funktionella studier, inklusive vidhäftnings- och permeabilitetsanalyser, samt nedströmsstudier för en viss väg av intresse. Dessutom kan dessa LSECs poolas eller användas individuellt, vilket möjliggör multi-omics datagenerering inklusive RNA-seq bulk eller single cell, proteomic eller phospho-proteomics, och Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), bland andra. Detta protokoll kommer att vara användbart för utredare som studerar LSECs kommunikation med andra leverceller i hälsa och sjukdom och möjliggöra en fördjupad förståelse av LSECs roll i de patogena mekanismerna för akut och kronisk leverskada.
Introduction
Lever sinusformade endotelceller (LSECs) kantar leverns sinusoidväggar och är de vanligaste icke-parerenkymala cellerna i levern1. LSECs skiljer sig från andra kapillärendotelceller någon annanstans i kroppen genom närvaron av fenestrae och bristen på ett klassiskt basalmembran eller ett membran 2,3. Därför har LSECs distinkta fenotypiska och strukturella egenskaper som förbättrar deras permeabilitet och endocytiska kapacitet för att eliminera en mängd cirkulerande makromolekyler, inklusive lipider och lipoproteiner. LSECs spelar en central roll i överhörningen mellan parenkymala och icke-föräldrarkymala celler, såsom stellatceller och immunceller. LSECs är nyckeln till att upprätthålla leverhomeostas genom att hålla stellatcellerna och Kupffer-cellerna i vilande status4. LSECs modulerar sammansättningen av populationer av leverimmunceller genom att förmedla vidhäftning och transendotelmigration av cirkulerande leukocyter 5,6. Under akut och kronisk leverskada7, inklusive ischemi-reperfusionsskada (IRI)8, alkoholfri steatohepatit (NASH)9 och hepatocellulärt karcinom (HCC), genomgår LSECs fenotypiska förändringar som kallas kapillarisering kännetecknad av defenestration och bildning av basalmembran10. Dessa fenotypiska förändringar i LSECs är associerade med LSECs dysfunktion och förvärv av protrombotiska, proinflammatoriska och profibrogena egenskaper.
Flera metoder för isolering av LSECs från muslever har utvecklats11. Vissa tekniker är beroende av att separera icke-föräldrarkymala och parenkymala celler följt av densitetsgradientcentrifugering för att rena LSECc från icke-parenkymala fraktioner. Begränsningen av denna metod är förekomsten av förorenande makrofager i de sista stegen av LSECs isolering, vilket kan påverka renheten hos de isolerade LSECs12. Detta protokoll är baserat på kollagenasperfusion av muslevern och CD146+ magnetiska pärlor positivt urval av icke-föräldrarkymala celler för att rena LSECs. LSECs isolerade med denna metod visar hög renhet och bevarad morfologi och livskraft. Dessa LSECs är optimala för funktionella studier, inklusive permeabilitet och vidhäftningsanalys, samt nedströmsstudier för vägar av intresse. Dessutom, med det växande intresset för att generera stora dataset inom både klinisk forskning och upptäcktsvetenskap, kan dessa högkvalitativa LSECs isolerade från både friska och sjuka lever med alkoholfri steatohepatit (NASH) eller andra tillstånd slås samman eller användas individuellt, vilket möjliggör multi-omics datagenerering och jämförelse mellan hälsa och sjukdom13,14 . Dessutom kan de isolerade LSEC: erna användas för att utveckla tvådimensionella såväl som tredimensionella in vitro-modeller som organoider för att dechiffrera den aktiverade signalvägen i LSECs och deras intercellulära kommunikation med andra leverceller under olika skadliga stimuli och som svar på olika terapeutiska ingrepp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurprotokoll genomfördes som godkänt av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) på Mayo Clinic. Åtta veckor gamla C57BL/6J hanmöss köptes från Jackson Laboratory. Möss var inrymda i en temperaturkontrollerad 12:12-h ljus-mörk cykelanläggning med fri tillgång till kost.
1. Beredning av kollagenbelagd odlingsskål eller tallrik
- För att göra 50 ml 0,02 mol / L ättiksyra, tillsätt 0,6 ml isättika till 49,4 mlH2O.
- Gör 50 μg / ml kollagen typ I i 0,02 mol / L ättiksyra. Utspädning beror på partiets koncentration.
- Täck 10 cm odlingsrätter med 3 ml kollagenlösning. Inkubera vid rumstemperatur (RT) i 1 timme.
OBS: När du använder en annan skål eller tallrik för odling måste volymen av beläggningslösningen justeras baserat på odlingsområdet, använd vanligtvis 6-10 μg / cm2. - Ta bort överflödig vätska från den belagda ytan och tvätta med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) 3 gånger. Låt diskarna lufttorka.
- Om kollagenlösningen inte är steril, sterilisera de kollagenbelagda diskarna genom exponering för ultraviolett (UV) ljus i 10 minuter i en steril vävnadsodlingskåpa.
2. Inställning av utrustning
- Ställ in den uppvärmda och fuktade återcirkulerande perfusionsapparaten enligt figur 1B.
- Skölj perfusionssystemet med 10% blekmedel i 5 min följt av sterilt vatten i ytterligare 10 minuter.
- Töm sköljvätskan så mycket som möjligt innan du perfuserar kollagenaslösningen.
- Infusera kollagenaslösning genom perfusionssystemet (som visas i figur 1B) för att förvärma den vid 37 °C. Ställ in pumphastigheten på varvtal 1 som visas på hastighetsreglaget (lika med 40 ml/min).
- Håll denna hastighet densamma under hela proceduren. Återanvänd kollagenaslösningen som körs i en sluten krets under dagen för LSEC-isoleringen.
OBS: Pumphastigheten är fixerad till 1 för att undvika mekaniskt tryck som kan störa LSECs biologiska tillstånd.
3. Kirurgiskt ingrepp
- Väg musen.
- Injicera 90 mg/kg kroppsvikt ketamin och 10 mg/kg kroppsvikt xylazin intraperitonealt (IP).
- När musen är icke-reaktiv mot smärtsamma stimuli, säkra musen till den kirurgiska ytan, som visas i figur 1B.
- Spraya musens buk med 70% etanol. Använd kirurgisk sax, gör ett snitt på ~ 5 cm långt från underdelen av buken upp till xiphoidprocessen.
- Gör sedan två laterala snitt med en liten irissax på varje sida av buken för att helt exponera bukorganen.
- Placera manteln på den intravenösa (IV) katetern under djurets rygg för att lyfta och jämna buken.
- Använd en vanlig krökt dressing pincett, dra försiktigt tarmarna och magen av till vänster om djuret.
- Placera en 5-0 kirurgisk sutur under den underlägsna vena cava (IVC) strax under den exponerade vänstra njuren. Bind en lös hitch i suturen.
- Placera ytterligare 5-0 kirurgisk sutur runt leverportalvenen (PV) strax ovanför mjältvenens förgreningspunkt från lever-PV. Bind en lös hitch i suturen.
- Använd PV-suturen som spänning, sätt in 20 G IV-katetern i lever-PV 1 cm under där den grenar sig till höger och vänster lever-PV.
- Skjut katetern upp i venen men håll den under förgreningsområdet. Låt blodet färdas ner i katetern tills det börjar droppa ut.
- Med en del av buffert A (tabell 1) i en intravenös (IV) flaska placerad ovanför det kirurgiska området, använd en IV-linje och fäst den på katetern. Spola levern med denna lösning samtidigt som du undviker luftinträde i systemet.
- Bind av suturen runt den underlägsna vena cava under njuren. Detta gör det möjligt för levern att retro perfusera.
- Skär IVC under suturen så att djuret kan blöda ut.
OBS: Detta steg måste utföras snabbt för att undvika trängsel i levern. - Fäst IV-katetern med PV-suturen.
- När du har perfuserat, skär bort magen, tarmarna, mjälten och andra inälvor som är fästa vid levern.
- Skär bort membranet och de stora kärlen från brösthålan. Ta bort levern från djuret och placera den på perfusionsbrickan.
- Ta försiktigt bort IV-linjen och anslut kollagenaslösningen i recirkulerande kammare.
OBS: Steg 3.16-3.18 måste göras inom 5 minuter, så levern kommer inte att perfuseras för länge med buffert A. Var mycket försiktig så att du inte tillåter några luftbubblor i levern. - Låt levern perfusera tills kapseln blir fläckig och verkar grumlig (10-15 min eller mer, perioden varierar beroende på de olika partierna av kollagenas).
- Medan levern är i perfusion, se till att djuret är avlidet innan du slänger det i en obduktionspåse.
- När den har smälts, ta bort levern från kammaren och placera den i en 10 cm petriskål med cirka 20 ml serumfri Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM).
- Plocka försiktigt isär levern med ett par pipettspetsar och kasta gallträdet.
- Filtrera leversuspensionen genom en 70 μm cellsil i ett 50 ml koniskt rör.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 50 x g i 2 min vid RT. Samla supernatanten innehållande icke-parerkymala leverceller.
OBS: Hepatocyter fälls ut i pelleten, som kan renas ytterligare med hjälp av gradientcentrifugering enligt tidigare beskrivit15.
4. Separation av icke-föräldrars leverceller och LSECs rening
OBS: Rena CD146+ LSECs med hjälp av de immunomagnetiska pärlorna, enligt tillverkningens instruktioner.
- Centrifugera supernatanten vid 300 x g i 5 min vid 4 °C.
- Samla cellpelleten och återsuspendera i 1 ml isoleringsbuffert (tabell 1), bestäm cellnumret med hjälp av en automatisk cellräknare enligt tillverkarens instruktioner.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 300 x g i 10 min vid 4 °C, aspirera supernatanten helt.
- Resuspend pelletsen med 90 μL isoleringsbuffert per 107 totala celler.
- Tillsätt 10 μL CD146 magnetiska pärlor per 107 totala celler. Blanda väl och inkubera i 15 min vid 4 °C.
- För att tvätta cellerna, tillsätt 1-2 ml isoleringsbuffert per 107 celler, centrifug vid 300 x g i 10 minuter och aspirera sedan supernatanten helt.
- Resuspend upp till 109 celler i 500 μL isoleringsbuffert (tabell 1).
OBS: För högre cellnummer, skala upp buffertvolymen i enlighet där med detta. - Förbered separationskolonnen, skölj den med 3 ml isoleringsbuffert.
- Applicera cellsuspensionen på kolonnen staplad med 70 μm förseparationsfilter.
- Tvätta kolonnen med 3 ml isoleringsbuffert 3 gånger.
OBS: Vid tvättning av kolonnen bör isoleringsbufferten läggas till så snart kolonnbehållaren är tom. - Ta bort kolonnen från separatorn och placera den på ett 15 ml centrifugrör. Pipett 5 ml isoleringsbuffert på kolonnen.
- För att återställa de magnetiska pärlorna märkta celler, tryck kolven ordentligt in i kolonnen för att spola ut cellerna.
- Centrifug vid 300 x g i 5 min vid 4 °C. LSECs är redo för mikroskopisk undersökning och nedströms analys.
5. LSECs immunofenotypning och renhetsbedömning genom flödescytometri
- Bestäm cellnumren för isolerade LSECs med hjälp av en automatisk cellräknare enligt tillverkarens instruktioner.
- Centrifugera cellerna vid 300 x g i 5 min, aspirera supernatanten helt.
- Ta 1 x 106 celler / rör och återsuspendera med 90 μL färgningsbuffert (tabell 1).
- Tillsätt 10 μL/rör mus FcR-block och 1 μL viabilitetsfärgämne, inkubera vid 4 °C i 10 min.
- Fläck cellerna med en kombination av CD45, CD146 och stabilin-2 antikroppar utspädda vid 1:50 med färgningsbuffert. Inkubera vid 4 ° C i 20 min.
- Tvätta cellerna med 5 ml färgningsbuffert och centrifug vid 300 x g i 10 min och aspirera sedan supernatanten helt.
- Resuspendera cellerna med 300 μL färgningsbuffert och kör genom flödescytometern.
6. LSECs kultur och undersökning
- Frö 1 x 106 celler/brunn i en 6-brunnsplatta och odla den med endotelceller tillväxtmedium bestående av 5% fetalt bovint serum (FBS), 1% endotelceller tillväxttillskott och 1% primocinlösning.
- Undersök de isolerade LSEC: erna med ljusmikroskopi. Skaffa ljusfältsbilder med en 10x förstoring.
7. LSECs morfologi och fenestrae undersökning genom svepelektronmikroskopi
- Förbelägga cellodlingsinsatserna (3 μm porstorlek) med kollagenlösning.
- Odlingsisolaterade LSECs (120 000 celler) på insatsen med endotelceller tillväxtmedium i en 24-brunnsplatta vid 37 ° C varm och fuktig atmosfär. Låt cellerna slå sig ner och fästa i 2 timmar.
- För cellfixering, lägg till en motsvarande volym av förvärmd vid 37 ° C Trumps fixeringsmedel till cellodlingsmediet.
- Efter inkubation i 10 minuter, ersätt 50% utspädd Trumps fixativ med outspädd Trumps fixativ.
- Fixa cellerna i Trump fixativ i 2 timmar, inkubera sedan i 1 timme i 1% osmiumtetroxider.
- Fortsätt med prover uttorkning, torkning i en kritisk punkttorkningsanordning, montering, sputterbeläggning och undersökning med hjälp av ett svepelektronmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Experimentella scheman och utrustning som ställs in:
I detta protokoll smältes muslever med hjälp av en sluten perfusionskrets, sedan separerades icke-föräldrarkymala celler och hepatocyter genom centrifugering med låg hastighet vid 50 x g i 2 minuter. Primära LSECs isolerades med användning av CD146 magnetiska pärlor urval från den icke-parerkymala fraktionen. De experimentella scheman visas i figur 1A. Kanylen placerades genom PV medan den underlägsna vena cava var bunden för att säkerställa enkelriktad perfusion av kollagenas genom levern (Figur 1B). Den interna perfusionskammaren är utrustad med ett värme- och befuktningssystem för att säkerställa en 37-40 ° C varm och fuktig apparatluft. Det perfuserade kollagenaset cirkulerar genom ett slutet system och kan återanvändas för två eller tre möss under isoleringsdagen för att göra isoleringen mer kostnadseffektiv.
Bedömning av isolerade LSECs renhet och ytmarkörer med flödescytometri:
Renheten hos de isolerade LSEC bedömdes genom att använda väl karakteriserade specifika LSEC-ytmarkörer CD146 och stabilin-2 16,17,18. Färgade celler analyserades på en flödescytometer; data analyserades med hjälp av FlowJo-programvaran.
LSEC-populationen var gated (figur 2A) och analyserade singlets för följande grindstrategi; viabla celler definierades med hjälp av viabilitet färgämne färgning innan celler märktes med specifika markörer (figur 2B). Då var CD45-populationen gated för att utesluta eventuell kontaminering av immunceller. De isolerade LSEC: erna nådde 94,8% livskraft (figur 2C). Andelen CD45-celler var 89,7% (figur 2D) och 92,3% av cellerna var CD146 och stabilin-2 dubbelpositiva (CD45-CD146 + stabilin-2+) LSECs (figur 2E).
Morfologi hos de isolerade LSEC: erna:
De isolerade LSC:erna såddes i en 6-brunnsplatta vid 1 x 106 celler/brunn, odlades i ett komplett tillväxtmedium och undersöktes med ljusmikroskopi efter 6 timmars odling (figur 3A). LSC pläterades på en 3 μm porstor odlingsinsats för att visualisera LSECs fenestrae genom att skanna elektronmikroskop (SEM). Efter fixering och bearbetning identifierades fenestrae, som visas i figur 3B. Som tidigare rapporterats förlorar LSECC sin fenestrae i kultur över19; Därför rekommenderas att bearbeta cellerna så snart som möjligt efter isoleringen för nedströmsstudier för att undvika dedifferentiering in vitro.
Figur 1: Experimentella scheman och utrustning konfigurerad. (A) Experimentella scheman utformades med hjälp av Bio rendering. (B) Installation och process av utrustning. Levern skördades och perfusionerades i en sluten kollagenasperfusionsapparat. Levern överfördes sedan till en maträtt och dissocierades. Leversuspensionen samlades in. Den icke-föräldrarkymala cellfraktionen separerades genom centrifugering vid 50 x g i 2 min. LSECs renades med hjälp av magnetiska pärlor. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Bedömning av isolerade LSECs renhet och ytmarkörer med flödescytometri. Dataanalys och grindstrategi som visas, (A) gated LSECs och (B) singlets baserat på forward scatter (FSC)/side scatter (SSC). Isolerade LSECs färgades med ett viabilitetsfärgämne och en kombination av CD45, CD146 och stabilin-2-antikroppar. Singlets gated och analyserades, (C) livskraftiga LSECs gated på (D) CD45-population och analyserades för (E) CD146 och stabilin-2-uttryck. Alla grindar bestämdes av fluorescens minus en (FMO). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Morfologi hos isolerade LSECs. (A) Ljus fältbild av odlade LSECs. Isolerade LSECs odlades i hela tillväxtmediet i 6 timmar och undersöktes med ljusmikroskopi (Scale bar 100 μm). (B) LSEC undersöktes med svepelektronmikroskop (SEM). Vita pilar indikerar LSEC fenestrae (Skalstång, vänster panel 5 μm, höger panel 1 μm). Klicka här för att se en större version av denna figur.
| KRH-lagerlösning (10x) | |
| Reagenser | Koncentration |
| NaCl | 1,15 M |
| HEPES (fri syra) | 0,2 M |
| KCl | 0,05 m |
| KH2PO4 | 0,01 m |
| Buffert A | |
| Reagenser | Koncentration |
| KRH-lösning, PH=7,4 | 1x |
| EGTA | 0,5 mM |
| Justera PH till 7,4, filtrera genom ett 0,2 μm filter före användning. | |
| Förvaras vid rumstemperatur i upp till 6 månader. | |
| Buffert B | |
| KRH-lösning, PH=7,4 | 1x |
| CaCl2 | 1 mM |
| Justera PH till 7,4, filtrera genom ett 0,2 μm filter före användning. | |
| Förvaras vid rumstemperatur i upp till 6 månader. | |
| Kollagenaslösning | |
| Reagenser | Koncentration |
| Buffert B, PH=7,4 | 125 ml |
| Kollagenas | 35-40 mg, tillsätt BSA upp till 100 mg |
| Percoll-lösning | |
| Reagenser | Koncentration |
| Percoll | 22,5 ml |
| PBS (10x), PH = 7,4 | 2,5 ml |
| Isoaltion/färgningsbuffert | |
| Reagenser | Koncentration |
| MACS sköljbuffert | 1250 ml |
| BSA-lager | 125 ml |
Tabell 1: Buffertrecept. Tabellen innehåller sammansättningen av de buffertar och lösningar som används i denna studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I det aktuella manuskriptet beskriver vi ett protokoll för LSEC-isolering från muslever bestående av tvåstegs kollagenasperfusion och efterföljande magnetisk aktiverad cellsortering (MACS). Detta protokoll består av följande tre steg: (1) Perfusion genom PV med en kalciumfri buffert följt av en kollagenasinnehållande buffert för att uppnå levercellsdispersion; (2) Uteslutning av hepatocyter med låghastighetscentrifugering. och (3) MACS-baserat positivt urval av LSECs från icke-föräldrarkymala celler (NPC) med användning av magnetiska pärlor mot CD146. Hela proceduren kunde slutföras inom 3 timmar. Dessutom är kostnaden för denna procedur, inklusive alla förbrukningsvaror, cirka 150 USD per mus, vilket tyder på att denna metod för LSEC-isolering är övergripande effektiv och kostnadseffektiv. Vi använder steg (1) och (2) för isolering av primära mushepatocyter också, vilket ligger utanför ramen för det aktuella manuskriptet.
Det finns några kritiska steg i portalburkulering och leverperfusion: (i) Kateterpositionering: kateterspetsen ska placeras inte mindre än 3 mm distal till PV-förgreningen av en vuxen mus, som vanligtvis identifieras i leverns hilum. Djup placering av kateterspetsen i PV kommer att äventyra perfusionen av vissa lober i levern. Dålig perfusion av en lob manifesterar sig som en frånvaro av en färgförändring av loben och kan åtgärdas om den märks omedelbart genom en liten ompositionering av katetern i distal PV. Denna manöver kan möjligen optimera lobperfusion. ii) Luftbubblor: infusionsvägen mellan pumpen och solcellerna ska hållas helt fri från luftbubblor. Minutluftinträde i PV kan orsaka en luftemboli, vilket resulterar i ofullständig leverperfusion. För att eliminera luft i katetern efter avlägsnande av den inre nålen injiceras buffert A med en spruta proximal till bubblan för att utvisa luft innan infusionsledningen ansluts till katetern. iii) Kollagenasstyrka: För att bibehålla kollagenasaktiviteten under perfusionen är det viktigt att säkerställa att buffert B som infunderas i pv har den exakta koncentrationen av kollagenas och pH och hålls vid cirka 37 °C. Som visas i figur 1 används en anpassad kammare för att hålla hela perfusionssystemet i en 37 ° C varm och fuktad atmosfär; Dessutom upprätthålls syretillförseln under kollagenasperfusion för att uppnå fullständig matsmältning. Ett alternativ inkluderar ett vattenbad för att förvärma kollagenaslösningen20 och ett öppet kollagenasperfusionssystem på plats där kollagenaslösningen rinner ut ur levern genom den skurna IVC21.
Även om protokollet använder relativt djärva katetrar (20 G) för att säkerställa ett adekvat perfusionsflöde, kommer en tunnare kateter också att fungera bra baserat på tidigare rapporter 22,23,24. Det är emellertid ibland svårt att framgångsrikt kannulera PV, särskilt när möss används för specifika sjukdomsmodeller eller om de har PV-anomalier. Om PV-kanylering misslyckas är mekanisk och enzymatisk leversmältning med hjälp av ett enzymkit och mild vävnadsdissociator en alternativ metod för steg (1) och (2) för att erhålla icke-parenkymal cell (NPC) suspension. Vi har bekräftat att cellutbytet och livskraften i denna alternativa metod för dissociation utan leverperfusion var jämförbar med den ursprungliga metoden (data visas inte). Portalvenperfusion för leverförtunning har använts av andra och oss 13,16,20. Vidare undviker denna metod den teoretiska risken för LSECs fenotypiska eller funktionella förändringar inducerade av mekanisk kraft under leverns matsmältning. Därför rekommenderas användningen av den PV-perfusionsbaserade metoden som visas i detta protokoll hittills starkt.
Här visas det optimala LSEC-utbytet och renheten vid användning av det aktuella protokollet. Vi fick ungefär 2-5 x 106 celler per mus från både friska möss och möss med dietinducerad NASH med hjälp av det aktuella protokollet. När det gäller renhet stöder positiviteten hos samma ytmarkör som används för immunomagnetisk separation (CD146) noggrannheten i vår isoleringsteknik. Dessutom finns det flera välkända LSEC-ytmarkörer, såsom lymfkärlendotelial hyaluronsyrareceptor 1 (LYVE-1), CD32b och stabilin-2. Kontroverser finns fortfarande kring dessa markörer; till exempel i) LYVE-1 finns också i lymfatiska endotelceller, och ii) LSECs i ett periportalområde saknar CD32b-uttryck18. För att undersöka renheten hos dessa isolerade LSECs med flödescytometri användes stabilin-2 som en etablerad specifik LSEC-markör utöver CD146. Med hjälp av denna metod bekräftade vi att de isolerade LSEC hade >94% livskraft och >90% renhet (figur 2). Den LSEC-specifika fenotypen hos de isolerade cellerna bekräftades ytterligare med hjälp av SEM, där de flesta cellerna har fenestrae (figur 3B), den karakteristiska morfologiska egenskapen hos LSEC.
Bland LSECs isoleringsmetoder är immunomagnetiskt pärlval den teknik som används mest för att isolera LSECs från NPC-fraktionen 24,25,26,27. Däremot innefattar andra metoder centrifugalutriering och selektiv vidhäftningsbaserad separation 22,28,29. De icke-immunomagnetiska metoderna har visat sig ge höga utbyten av LSECs (cirka 9 x 106 celler per mus)11. Därför kan ett relativt lägre utbyte av isolerade LSECs vara en begränsning av det nuvarande protokollet. Å andra sidan kräver de icke-immunomagnetiska urvalsbaserade metoderna hög teknisk expertis och visar ibland inkonsekventa resultat på cellutbyten och renhet11, medan den immunomagnetiska urvalsbaserade metoden har fördelen av konsekvent utbyte och renhet jämfört med andra befintliga metoder. För immunomagnetiska pärlor urvalsbaserad cellisolering är dessutom specificiteten hos de använda cellytmarkörerna alltid en fråga om oro. Till exempel uttrycks CD31, som tidigare har använts som en markör för immunomagnetisk LSEC-separation, dominerande på PV-endotelet och kapilläriserade LSECs3. Även om CD146 har rapporterats uttryckas även på naturliga mördarceller och leverstellatceller 30,31, mildrar den höga renheten hos LSECs isolerade med hjälp av detta protokoll oro över specificiteten hos endotelmarkören CD146. Jämförelse av för- och nackdelar med olika metoder för LSEC-isolering diskuteras någon annanstans 11,18,32. Jämförelse av cellutbyten och renhet mellan andra metoder och denna metod ligger utanför ramen för det aktuella manuskriptet och motiverar framtida undersökningar.
Sammanfattningsvis presenterar vi ett primärt mus LSEC-isoleringsprotokoll baserat på en av de mest använda och accepterade metoderna. Isolerade LSECs uppvisar hög renhet och bevarad funktion. Dessutom är detta protokoll effektivt och tillämpligt på den friska muslevern såväl som levern från olika sjukdomsmusmodeller. Högkvalitativa LSECs från dessa möss kan användas för multiomics dataset generation13,14. Således underlättar detta tillvägagångssätt identifieringen av molekylära mekanismer som reglerar LSEC: s funktion och förbättrar vår förståelse för deras roller i intercellulär kommunikation i levern i hälsa och sjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla författare har inga konflikter att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases of the NIH (1RO1DK122948 to SHI) och NIH Silvio O. Conte Digestive Diseases Research Core Centers P30 bidragsmekanism (DK084567). Stöd gavs också till KF av Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Overseas Research Fellowships. Vi vill också tacka Dr. Gregory J. Gores och Steven Bronk för deras ursprungliga design och optimering av kollagenasperfusionsapparaten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.0-inch 20 G Intra Venous (IV) catheter | Terumo, SOmerset, NJ, USA | SR-OX2051CA | |
| 2–3-inch perfuion tray with a hole in the center | customized; made in house | ||
| 405/520 viability dye | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-205 | |
| 4-inch regular curved dressing forceps | Fisher Brand | FS16-100-110 | |
| 5-0 Perma-Hand silk suture | Ethicon, Raritan, NJ, USA | A182H | |
| Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluorà 488 | MBL International, Woburn, MA, USA | D317-A48 | |
| BSA stock | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
| Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-118-407 | |
| CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-007 | |
| Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-803 | |
| Collagen type I | Corning, Corning, NY, USA | 354236 | |
| Collagenase II | Gibco, Waltham, MA, USA | 17101-015 | |
| Endothelial cells growth medium | ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA | 211-500 | |
| FcR blocking reagent, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-575 | |
| FlowJo software, version 10.6 | Becton, Dickinson and Company | ||
| Hardened Fine scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14091-11 | |
| Heated (37 °C) and humidified recirculating perfusion apparatus equipped with Oxygen injection at a rate of 10psi. | customized; made in house | ||
| Hitachi S 4700 scanning electron microscope | Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA | SEM096 | |
| LS columns | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-401 | |
| MACS pre-separation filters (70 μm) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-095-823 | |
| MACS rinsing buffer | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
| MACS Smart Strainer (70 μm) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-098-462 | |
| MACSQunt flow cytometer | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | ||
| Millicell Cell Culture Insert | Millipore Sigma, Burlington, MA, USA | PITP01250 | |
| Nexcelom cell counter | Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, USA | Cellometer Auto T4 Plus | |
| Percoll | GE Healthcare, Chicago, IL, USA | 17-0891-01 | |
| Surgical scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14001-12 | |
| Very small curved dressing forceps | F.S.T, Foster city, CA, USA | 11063-07 |
References
- Morin, O., Goulet, F., Normand, C. Liver sinusoidal endothelial cells: isolation, purification, characterization and interaction with hepatocytes. Revisiones Sobre Biologia Celular: RBC. 15, 1-85 (1988).
- Ibrahim, S. H. Sinusoidal endotheliopathy in nonalcoholic steatohepatitis: therapeutic implications. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 321 (1), 67-74 (2021).
- Poisson, J., et al. Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases. Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).
- Marrone, G., Shah, V. H., Gracia-Sancho, J. Sinusoidal communication in liver fibrosis and regeneration. Journal of Hepatology. 65 (3), 608-617 (2016).
- Shetty, S., Lalor, P. F., Adams, D. H. Liver sinusoidal endothelial cells - gatekeepers of hepatic immunity. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 15 (9), 555-567 (2018).
- Smedsrød, B., Pertoft, H., Gustafson, S., Laurent, T. C. Scavenger functions of the liver endothelial cell. Biochemical Journal. 266 (2), 313-327 (1990).
- DeLeve, L. D. Liver sinusoidal endothelial cells in hepatic fibrosis. Hepatology. 61 (5), 1740-1746 (2015).
- Dar, W. A., Sullivan, E., Bynon, J. S., Eltzschig, H., Ju, C. Ischaemia reperfusion injury in liver transplantation: Cellular and molecular mechanisms. Liver International. 39 (5), 788-801 (2019).
- Furuta, K., Guo, Q., Hirsova, P., Ibrahim, S. H. Emerging Roles of Liver Sinusoidal Endothelial Cells in Nonalcoholic Steatohepatitis. Biology. 9 (11), Basel. 395 (2020).
- Wu, L. Q., et al. Phenotypic and functional differences between human liver cancer endothelial cells and liver sinusoidal endothelial cells. Journal of Vascular Research. 45 (1), 78-86 (2008).
- Meyer, J., Gonelle-Gispert, C., Morel, P., Bühler, L. Methods for isolation and purification of murine liver sinusoidal endothelial cells: A systematic review. PLoS One. 11 (3), 0151945 (2016).
- Meyer, J., Lacotte, S., Morel, P., Gonelle-Gispert, C., Buhler, L. An optimized method for mouse liver sinusoidal endothelial cell isolation. Experimental Cell Research. 349 (2), 291-301 (2016).
- Furuta, K., et al. Lipid-induced endothelial vascular cell adhesion molecule 1 promotes nonalcoholic steatohepatitis pathogenesis. Journal of Clinical Investigation. 131 (6), (2021).
- Guo, Q., et al. Integrin β(1)-enriched extracellular vesicles mediate monocyte adhesion and promote liver inflammation in murine NASH. Journal of Hepatology. 71 (1), 1193-1205 (2019).
- Hirsova, P., Ibrahim, S. H., Bronk, S. F., Yagita, H., Gores, G. J. Vismodegib suppresses TRAIL-mediated liver injury in a mouse model of nonalcoholic steatohepatitis. PLoS One. 8 (7), 70599 (2013).
- Schrage, A., et al. Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1. Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).
- Olsavszky, V., et al. Exploring the transcriptomic network of multi-ligand scavenger receptor Stabilin-1- and Stabilin-2-deficient liver sinusoidal endothelial cells. Gene. 768, 145284 (2021).
- DeLeve, L. D., Maretti-Mira, A. C. Liver sinusoidal endothelial cell: An update. Seminars in Liver Disease. 37 (4), 377-387 (2017).
- DeLeve, L. D., Wang, X., Hu, L., McCuskey, M. K., McCuskey, R. S. Rat liver sinusoidal endothelial cell phenotype is maintained by paracrine and autocrine regulation. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 287 (4), 757-763 (2004).
- Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
- Ishiguro, K., Yan, I. K., Patel, T. Isolation of tissue extracellular vesicles from the liver. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e58649 (2019).
- Topp, S. A., Upadhya, G. A., Strasberg, S. M. Cold preservation of isolated sinusoidal endothelial cells in MMP 9 knockout mice: effect on morphology and platelet adhesion. Liver Transplantation. 10 (8), 1041-1048 (2004).
- Katz, S. C., Pillarisetty, V. G., Bleier, J. I., Shah, A. B., DeMatteo, R. P. Liver sinusoidal endothelial cells are insufficient to activate T cells. Journal of Immunology. 173 (1), 230-235 (2004).
- Liu, W., et al. Sample preparation method for isolation of single-cell types from mouse liver for proteomic studies. Proteomics. 11 (17), 3556-3564 (2011).
- Do, H., Healey, J. F., Waller, E. K., Lollar, P. Expression of factor VIII by murine liver sinusoidal endothelial cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (28), 19587-19592 (1999).
- Schrage, A., et al. Enhanced T cell transmigration across the murine liver sinusoidal endothelium is mediated by transcytosis and surface presentation of chemokines. Hepatology. 48 (4), 1262-1272 (2008).
- Chou, C. H., et al. Lysophosphatidic acid alters the expression profiles of angiogenic factors, cytokines, and chemokines in mouse liver sinusoidal endothelial cells. PLoS One. 10 (3), 0122060 (2015).
- Deleve, L. D. Dacarbazine toxicity in murine liver cells: a model of hepatic endothelial injury and glutathione defense. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 268 (3), 1261-1270 (1994).
- Smedsrød, B., Pertoft, H., Eggertsen, G., Sundström, C. Functional and morphological characterization of cultures of Kupffer cells and liver endothelial cells prepared by means of density separation in Percoll, and selective substrate adherence. Cell and Tissue Research. 241 (3), 639-649 (1985).
- Despoix, N., et al. Mouse CD146/MCAM is a marker of natural killer cell maturation. European Journal of Immunology. 38 (10), 2855-2864 (2008).
- Strauss, O., Phillips, A., Ruggiero, K., Bartlett, A., Dunbar, P. R. Immunofluorescence identifies distinct subsets of endothelial cells in the human liver. Scientific Reports. 7, 44356 (2017).
- Halpern, K. B., et al. Paired-cell sequencing enables spatial gene expression mapping of liver endothelial cells. Nature Biotechnology. 36 (10), 962-970 (2018).
