Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Bestemmelse af vaccineimmunogenicitet under anvendelse af bovin monocytafledte dendritiske celler

Published: May 19, 2023 doi: 10.3791/64874
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1, 1, 1
1Animal Production and Health Section, Joint Food and Agriculture Organization (FAO)/International Atomic Energy Agency (IAEA) Centre of Nuclear Techniques in Food and Agriculture, International Atomic Energy Agency, 2Teaching and Research Farm Kremesberg, Clinical Unit for Herd Health Management in Ruminants, Department for Farm Animals and Veterinary Public Health, University of Veterinary Medicine, Vienna

Summary

Metoden beskriver dannelsen af bovin monocytafledte dendritiske celler (MoDC'er) og deres anvendelse til in vitro-evaluering af antigenkandidater under udviklingen af potentielle veterinærvacciner hos kvæg.

Abstract

Dendritiske celler (DC'er) er de mest potente antigenpræsenterende celler (APC'er) i immunsystemet. De patruljerer organismen på udkig efter patogener og spiller en unik rolle i immunsystemet ved at forbinde de medfødte og adaptive immunresponser. Disse celler kan fagocytisere og derefter præsentere fangede antigener til effektorimmunceller, hvilket udløser en bred vifte af immunresponser. Dette papir demonstrerer en standardiseret metode til in vitro-generering af bovin monocytafledte dendritiske celler (MoDC'er) isoleret fra mononukleære celler i kvægperifert blod (PBMC'er) og deres anvendelse til evaluering af vaccineimmunogenicitet.

Magnetisk baseret cellesortering blev brugt til at isolere CD14+ monocytter fra PBMC'er, og tilskud af komplet dyrkningsmedium med interleukin (IL)-4 og granulocyt-makrofagkolonistimulerende faktor (GM-CSF) blev anvendt til at inducere differentieringen af CD14+ monocytter til naive MoDC'er. Genereringen af umodne MoDC'er blev bekræftet ved at detektere ekspressionen af større histokompatibilitetskompleks II (MHC II), CD86 og CD40 celleoverflademarkører. En kommercielt tilgængelig rabiesvaccine blev brugt til at pulsere de umodne MoDC'er, som efterfølgende blev dyrket sammen med naive lymfocytter.

Flowcytometrianalysen af de antigenpulserede MoDC'er og lymfocytcokulturen afslørede stimuleringen af T-lymfocytproliferation gennem ekspression af Ki-67-, CD25-, CD4- og CD8-markører. Analysen af mRNA-ekspressionen af IFN-γ og Ki-67 ved anvendelse af kvantitativ PCR viste, at MoDC'erne kunne inducere antigenspecifik priming af lymfocytter i dette in vitro-cokultursystem . Desuden viste IFN-γ-sekretion vurderet ved hjælp af ELISA en signifikant højere titer (**p < 0,01) i rabiesvaccine-pulseret MoDC-lymfocyt-cokultur end i den ikke-antigenpulserede MoDC-lymfocyt-cokultur. Disse resultater viser validiteten af dette in vitro MoDC-assay til måling af vaccineimmunogenicitet, hvilket betyder, at dette assay kan bruges til at identificere potentielle vaccinekandidater til kvæg, inden der fortsættes med in vivo-forsøg , samt i vaccineimmunogenicitetsvurderinger af kommercielle vacciner.

Introduction

Veterinærvaccination er et afgørende aspekt af husdyrhold og sundhed, da det bidrager til at forbedre fødevaresikkerheden og dyrevelfærden ved at yde beskyttelse mod sygdomme, der påvirker husdyrsektoren globalt1. En effektiv in vitro-metode til vurdering af mulige vaccinekandidaters immunogenicitet ville bidrage til at fremskynde processen med udvikling og produktion af vacciner. Det er derfor nødvendigt at udvide området for immunassays med innovative metoder baseret på in vitro-undersøgelser , da dette vil bidrage til at afsløre kompleksiteten af immunprocesserne i forbindelse med immunisering og patogeninfektion. I øjeblikket anvendes in vivo dyreimmuniserings- og provokationsundersøgelser, som kræver periodisk prøveudtagning (f.eks. blod og milt), til at måle immunogeniciteten af kandidatvacciner og adjuvanser. Disse analyser er dyre, tidskrævende og har etiske konsekvenser, fordi eutanasi af dyr i de fleste tilfælde udføres ved afslutningen af forsøgene.

Som et alternativ til in vivo-assays er mononukleære celler i perifert blod (PBMC'er) blevet anvendt til at evaluere vaccineinducerede immunresponser in vitro2. PBMC'er er en heterogen population af celler sammensat af 70% -90% lymfocytter, 10% -20% monocytter og et begrænset antal dendritiske celler (DC'er, 1% -2%)3. PBMC'er har antigenpræsenterende celler (APC'er) såsom B-celler, monocytter og DC'er, som konstant patruljerer organismen på udkig efter tegn på infektion eller vævsskade. Lokalt udskillede kemokiner letter rekruttering og aktivering af APC'er til disse steder ved at binde til celleoverfladereceptorer. I tilfælde af monocytter styrer kemokiner deres skæbne til enten at differentiere sig til DC'er eller makrofager4. Så snart DC'er støder på og fanger et patogen, migrerer de til sekundære lymfoide organer, hvor de kan præsentere de forarbejdede patogenpeptidantigener ved hjælp af større histokompatibilitetskompleks (MHC) klasse I eller klasse II overfladeproteiner til henholdsvis CD8 + T-celler eller CD4 + T-celler, hvilket udløser et immunrespons 5,6.

DC'ernes nøglerolle i orkestrering af et beskyttende immunrespons mod forskellige patogener gør dem til et interessant forskningsmål for forståelse af intracellulære immunmekanismer, især når man designer vacciner og adjuvanser mod infektiøse agenser7. Da fraktionen af DC'er, der kan opnås fra PBMC'er, er ret lille (1% -2%), er monocytter i stedet blevet brugt til at generere DC'er in vitro8. Disse monocytafledte DC'er (MoDC'er) blev oprindeligt udviklet som en mulig behandlingsstrategi i kræftimmunterapi9. For nylig er MoDC'er blevet brugt til vaccineforskning 10,11,12, og klassiske monocytter er den dominerende undertype (89%) til MoDC-produktion 13. Produktionen af MoDC'er in vitro er tidligere opnået ved tilsætning af granulocyt-makrofagkolonistimulerende faktor (GM-CSF) givet i kombination med andre cytokiner såsom interleukin-4 (IL-4), tumornekrosefaktor α (TNF-α) eller IL-1314,15,16.

Succesen med et in vitro MoDC-assay afhænger af antigenstimulerede modne MoDC'ers evne til at modulere omfanget og typen af immunresponset, der er specifikt for den type antigen, der detekteres17. Den type patogen, der genkendes og præsenteres af MoDC'er, bestemmer differentieringen af CD4 + T-hjælperceller (Th) i enten Th1-, Th2- eller Th17-effektorceller og er kendetegnet ved en patogenspecifik sekretorisk cytokinprofil. Et Th1-respons fremkaldes mod intracellulære patogener og resulterer i udskillelsen af interferon-gamma (IFN-γ) og tumornekrosefaktor beta (TNF-β), som modulerer fagocytisk afhængig beskyttelse. Et Th2-respons udløses mod parasitære organismer og er kendetegnet ved IL-4, IL-5, IL-10 og IL-13-sekretion, som initierer fagocytisk uafhængig humoral beskyttelse. Th17 tilbyder neutrofilafhængig beskyttelse mod ekstracellulære bakterie- og svampeinfektioner medieret af sekretionen af IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 og TNF-α 18,19,20,21. Baseret på tidligere undersøgelser er det blevet bemærket, at ikke alle patogener falder inden for den forventede cytokinprofil. For eksempel stimulerer dermale MoDC'er som reaktion på Leishmania parasitisk infektion IFN-γ sekretion fra CD4 + T-celler og CD8 + T-celler og inducerer således et beskyttende proinflammatorisk Th1-respons22.

Det har også vist sig, at MoDC'er fra kyllinger, der er primet med Salmonella lipopolysaccharid (LPS), kan fremkalde en variabel respons mod Salmonella typhimurium ved at aktivere både Th1- og Th2-responser, mens Salmonella gallinarum inducerer et Th2-respons alene, hvilket kan forklare sidstnævntes højere resistens over for MoDC-clearance23. Aktivering af MoDC'er mod Brucella canis (B. canis) er også blevet rapporteret hos både hunde og humane MoDC'er, hvilket betyder, at dette kan repræsentere en zoonotisk infektionsmekanisme24. Humane MoDC'er, der er primet med B. canis, inducerer et stærkt Th1-respons, der giver resistens over for alvorlig infektion, mens hunde-MoDC'er inducerer et dominerende Th17-respons med et reduceret Th1-respons, hvilket efterfølgende fører til etablering af kronisk infektion25. Bovin MoDC'er viser en øget affinitet for mund- og klovesygevirus (FMDV) konjugeret med immunoglobulin G (IgG) sammenlignet med ikke-konjugeret mund- og klovesyge alene, da MoDC'erne danner et viralt antistofkompleks som reaktion på de tidligere10. Samlet set viser disse undersøgelser, hvordan MoDC'er er blevet brugt til at analysere kompleksiteten af immunresponser under patogeninfektion. De adaptive immunresponser kan evalueres ved kvantificering af specifikke markører forbundet med lymfocytproliferation. Ki-67, et intracellulært protein, der kun påvises i delende celler, betragtes som en pålidelig markør for spredningsundersøgelser26, og tilsvarende svarer CD25 udtrykt på overfladen af T-celler i den sene aktiveringsfase til lymfocytproliferation27,28.

Denne undersøgelse demonstrerer en standardiseret metode til in vitro-generering af kvæg-MoDC'er efterfulgt af deres anvendelse i et in vitro-immunassay, der anvendes til test af vacciners immunogenicitet. En kommercielt tilgængelig rabiesvaccine (RV) blev brugt til at validere effektiviteten af dette assay. T-lymfocytaktivering og proliferation blev målt ved flowcytometri, kvantitativ polymerasekædereaktion i realtid (qPCR) og enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) gennem analyse af veletablerede celleaktiveringsmarkører såsom Ki-67 og CD25 og sekretion af IFN-γ 28,29,30,31. Der udføres ingen eksperimentelle dyre- eller humane forsøg under MoDC-assayet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Blodindsamling udføres af en certificeret dyrlægetjeneste i overensstemmelse med de etiske retningslinjer fra det østrigske agentur for sundhed og fødevaresikkerhed (AGES) og i overensstemmelse med de accepterede dyrevelfærdsstandarder32. Undersøgelsen modtog etisk godkendelse fra det østrigske landbrugsministerium. Det eksperimentelle design for MoDC-generering og dens efterfølgende anvendelse er illustreret i figur 1.

1. Produktion af naive MoDC'er

BEMÆRK: Hele blodprøver blev opnået fra en enkelt patogenfri kalv ved jugular venepunktur med hepariniserede vacutainere (otte 9 ml blodrør blev brugt til denne undersøgelse). Transport blodet i en isboks. Opbevar prøverne ved 2-4 °C til senere brug, eller behandl dem straks. Hold blodet roterende for at undgå blodpropper. Steriliser vacutainerne med 70% ethanol. Alle de følgende eksperimenter blev udført med en biologisk prøve og seks tekniske replikater.

  1. Densitetsgradientcentrifugering for at isolere PBMC'er fra det hepariniserede blod
    1. Bland blodet godt ved at vende det 10x.
    2. Brug en 10 ml pipette til at overføre 20 ml hepariniseret blod til et sterilt 50 ml rør og fortynd det med 10 ml fosfatbufret saltvand (PBS).
    3. Der pipetteres 15 ml lymfocytisolationsmedium til et sterilt 50 ml glas.
      BEMÆRK: Lad det lymfocytisolerende medium opnå stuetemperatur før pipettering.
    4. Vip 50 ml røret med lymfocytisolationsmediet til en position på 45°. Peg spidsen af en 25 ml pipette vinkelret, og læg forsigtigt de 30 ml blod-PBS oven på lymfocytisolationsmediet uden at blande de to. Meget langsomt bringes 50 ml røret tilbage til lodret position.
    5. Der centrifugeres ved 800 × g i 35 minutter ved 20 °C med maksimal acceleration og uden bremsning (retardationsfunktionen slået fra).
    6. Brug en Pasteur-pipette til at opsamle PBMC-laget (det tynde hvide lag lige efter det første lag plasma) og overføre det til et nyt 50 ml rør.
      BEMÆRK: Densitetsgradientcentrifugering adskiller fuldblod i forskellige lag. Som følge heraf sætter erytrocytterne sig i bunden som en pellet, de mononukleære celler (PBMC'er) sætter sig ved grænsefladelaget, og plasmaet danner det øverste lag. Granulocytter findes mellem pellet og PBMC-laget.
    7. De høstede PBMC'er vaskes 2x ved at tilsætte PBS op til et volumen på 40 ml og blandes grundigt ved pipettering op og ned. Derefter centrifugeres ved 500 × g ved 4 °C i 7 minutter med maksimal acceleration og maksimal deceleration.
    8. Supernatanten kasseres ved dekantering, pelletpen resuspenderes i 15 ml 1x ammoniumchlorid-kaliumbuffer (ACK) og inkuberes ved stuetemperatur i 10-15 min.
      BEMÆRK: Må ikke inkuberes i mere end 15 min. Kommercielt tilgængelig ACK-buffer anvendes til at sikre lysering af de resterende røde blodlegemer (RBC'er), der er til stede i PBMC-fraktionen.
    9. PBS tilsættes op til et volumen på 40 ml, og centrifugeres derefter ved 500 × g og 4 °C i 7 minutter med maksimal acceleration og deceleration.
    10. Supernatanten kasseres ved dekantering, og trin 1.1.9 gentages.
    11. Supernatanten kasseres, og pelletpen resuspenderes i 10 ml komplet dyrkningssubstrat (ved stuetemperatur).
      BEMÆRK: Det komplette dyrkningsmedium består af RPMI 1640-cellekulturmedium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin.
  2. Magnetisk adskillelse af CD14+/-cellerne fra PBMC-populationen ved hjælp af CD14-konjugerede magnetiske perler
    1. Tæl cellerne med en ren hæmocytometercelletæller ved hjælp af 10 μL cellesuspension blandet med 10 μL trypanblå (0,4%) opløsning.
      BEMÆRK: Trypanblåt farvestof er et giftigt kemisk og potentielt kræftfremkaldende stof. Det skal håndteres, mens du bærer personlige værnemidler (PPE) for at undgå kontakt, og affald skal kasseres i en lufttæt specialiseret giftig affaldsbeholder. Døde celler vises blå, mens levende celler vises klare under mikroskopet.
    2. Centrifuger i 7 min ved 500 × g.
    3. Supernatanten kasseres med en pipette, og pellet resuspenderes i fluorescensaktiveret cellesorteringsbuffer (FACS) med et volumen på 40 μL for hver 1 × 107 celler. Bland grundigt med en pipette.
      BEMÆRK: FACS-buffer består af 2% FBS og 2 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) opløst i PBS.
    4. Tilsæt 5 μL CD14 mikroperlebuffer pr. 1 × 107 celler, og bland grundigt med en pipette.
    5. Der inkuberes i 30 minutter ved 4-8 °C til positiv selektion af bovin CD14+ monocytter33. Vortex hvert 15. minut i inkubationsperioden.
    6. Valgfrit trin (til flowcytometrianalyse): Tilsæt 10 μL CD14-FITC (fluoresceinisothiocyanat) farvningsantistof med efterfølgende inkubation i 15 minutter ved 4-8 °C. Se flowcytometrianalysen i trin 5 for detaljer.
    7. Tilsæt 1 ml FACS-buffer, og centrifuger i 7 minutter ved 500 × g.
    8. Supernatanten kasseres, og pelletpen resuspenderes i 500 μL FACS-buffer pr. 1 × 108 celler.
    9. Indsæt den immunmagnetiske celleseparationskolonne i separatoren (magnetisk søjleholder), og anbring et 15 ml opsamlingsrør under søjleudløbet til opsamling af gennemstrømningen.
    10. Kolonnen vaskes med 1 ml afgasset FACS-buffer. Efter skylning skal du udskifte det brugte 15 ml rør med et nyt.
    11. Cellesuspensionen (fra trin 1.2.8) tillades at passere gennem kolonnen ved pipettering af 1 × 108 celler i 500 μL buffer ad gangen.
      BEMÆRK: Vær opmærksom på ikke at generere luftbobler, mens du blander cellerne, før du lader dem gennem søjlen.
    12. Skyl kolonnen 3x med 3 ml afgasset FACS-buffer hver gang.
    13. Saml gennemstrømningen, og mærk denne første eluerede fraktion som CD14-cellefraktionen (PBMC'er minus CD14+ monocytter); Dette kaldes også den naive lymfocytfraktion.
      BEMÆRK: CD14-cellerne opretholdes i komplet dyrkningsmedium, indtil antigenpulserede MoDC'er produceres.
    14. Fjern kolonnen fra separatoren.
    15. Anbring et nyt sterilt 15 ml rør under søjlen til opsamling af spildevandet.
    16. Der pipetteres 5 ml FACS-buffer ind i søjlen, og den presses straks igennem med et stempel.
    17. Saml gennemløbet, og mærk denne anden eluerede fraktion som CD14+ cellefraktionen; Dette kaldes også den naive monocytfraktion.
    18. Tilsæt komplet dyrkningsmedium til de høstede CD14+ monocytter for at opnå 1 × 106 celler / ml.
      BEMÆRK: Tæl de levende celler i den eluerede CD14+ cellefraktion for at estimere mængden af komplet dyrkningsmedium, der kræves for at opnå det ønskede celleantal.
    19. Tag en steril plade med 24 brønde, og tilsæt 1 ml af cellesuspensionen (1 × 106 celler/ml) til hvert hul.
  3. Differentiering af CD14+ naive monocytter i naive MoDC'er ved tilsætning af 3% w/v cytokincocktail (GM-CSF + IL-4) med i alt 5 dages inkubation
    1. Suppler hvert hul, der indeholder CD14+ monocytter, med 40 μL (3% w/v) af cytokincocktailen, der leveres i sættet.
    2. Pladen inkuberes i en befugtet inkubator med 5 % CO2 og ved 37 °C i 48 timer.
    3. På dag 2 overføres halvdelen af hvert huls indhold (500 μL) ved hjælp af en pipette til individuelle 1,5 ml rør, og der centrifugeres ved 500 × g ved 4 °C i 7 minutter.
    4. Supernatanten kasseres, og pellets resuspenderes i 500 μl frisk, komplet næringssubstrat.
    5. 500 μL af denne cellesuspension overføres fra trin 1.3.4 tilbage til hvert udpeget hul, således at det endelige volumen er 1 ml.
    6. Berig hver brønd med 20 μL cytokincocktail.
    7. Kulturen inkuberes i 72 timer i en befugtet inkubator med 5% CO2 og ved 37 °C.
    8. Efter inkubationen på dag 5 fjernes pladen fra inkubatoren.
      BEMÆRK: Hver brønd vil indeholde 1 ml af en cellesuspension af naive MoDC'er. Antallet af MoDC'er vil være en procentdel (~ 20%) af de originale monocytter belagt (1 × 106 / ml).

2. MoDC endocytisk aktivitetsanalyse

BEMÆRK: Antigenoptagelsesassay eller endocytisk aktivitetsassay måler naive MoDC'ers evne til at internalisere fremmed materiale. Udfør analysen ved hjælp af naive MoDC'er dyrket med 3% w / v cytokincocktail og med 5 dages inkubation, som tidligere beskrevet34.

  1. Høst den naive MoDC-cellesuspension fra 24-brøndpladen, og overfør den til et 15 ml rør; Opsaml også eventuelle resterende celler ved at skylle brøndene med PBS.
  2. Centrifuger i 500 × g i 7 min. Supernatanten kasseres, og pelletsen resuspenderes i 1 ml dyrkningsmedium suppleret med 1 % FBS.
  3. Tæl de levende MoDC-celler for at estimere det mediumvolumen, der kræves for at opnå det ønskede celleantal (2 × 105 celler / ml).
  4. Kultur de naive MoDC'er i 100 μL komplet dyrkningsmedium i en 24-brøndplade med en slutcellekoncentration på 2 × 105 celler / ml.
  5. Hvert hul suppleres med 1 mg/ml FITC-konjugeret dextran (fluorescerende sonde, der anvendes som endocytosesporstof).
    BEMÆRK: FITC-dextran fungerer som en fluorescerende sonde og bruges som endocytosespor.
  6. Pladen dækkes til, og den inkuberes i mørke ved 5 % CO2 og 37 °C i 60 minutter.
    BEMÆRK: Til baggrundskontrol inkuberes de ekstra MoDC-celler (2 × 105 celler/ml) med 1 mg/ml FITC-dextran på is, da denne type inkubation forhindrer indtrængen af spormolekylet (FITC-dextran) i cellerne.
  7. Efter inkubation overføres straks 24-brøndpladen på is for at stoppe endocytosen af FITC-dextran.
  8. Vask cellerne med iskold FACS-buffer.
  9. Høst, centrifuger og resuspender pellet i 500 μL FACS-buffer.
  10. Analyser fluorescensintensiteten af FITC-dextranet i cellerne ved hjælp af flowcytometri. Se flowcytometrianalysen i trin 5.2 for detaljer.

3. Generering af antigenpulserede MoDC'er

BEMÆRK: En kommercielt tilgængelig og klinisk godkendt vaccine mod rabiesvirus (RV) kan inducere differentieringen af naive MoDC'er i modne antigenpræsenterende MoDC'er. Brug 0.1% (~ 1 μL) af en enkelt RV-vaccinationsdosis til at generere antigenpulserede MoDC'er. Desuden foretrækkes det at producere RV-pulserede MoDC'er i den samme kulturplade, der anvendes (i trin 1.3.8) til at generere naive MoDC'erfordi overførsel af de naive MoDC'er til en ny 24-brøndplade vil påvirke dem negativt.

  1. Fra trin 1.3.8) Der tilsættes 1 μL/ml RV-suspension til 1 ml naiv MoDC-kultur i 24-brøndspladen, og der inkuberes i 48 timer ved 5% CO2 og 37 °C.
    BEMÆRK: Naive MoDC'er dyrket uden RV-stimulering bruges som baggrundskontrol (og som ikke-specifik stimulering til samkultur med lymfocytter i de næste trin).
  2. Efter inkubation, på dag 7, opbevares pladen med 24 brønde indeholdende de antigenpulserede MoDC'er på is i 10 minutter.
  3. Tilsæt 1 ml iskold PBS pr. brønd. Hvert brønd blandes grundigt ved pipettering, og suspensionen overføres til et 15 ml rør.
  4. Brøndene vaskes med 2 ml iskold PBS for at opsamle de resterende celler, der er tilbage i hver brønd.
  5. Indholdet overføres til deres respektive reagensglas, og cellesuspensionen centrifugeres ved 500 × g i 7 minutter.
  6. Supernatanten kasseres, cellepelletten (antigenpulserede MoDC'er) resuspenderes i et komplet dyrkningsmedium, og rumfanget justeres til en endelig cellekoncentration på 1 × 105 celler/ml.
    BEMÆRK: Tæl de levende celler for at estimere den mængde medium, der kræves for at opnå det ønskede celleantal. Brug RV-pulserede MoDC'er fra dag 7 til MoDC-lymfocyt-cokultursystemet.

4. MoDC-lymfocyt co-kultur

BEMÆRK: In vitro MoDC-lymfocyt-cokultursystemet bestemmer MoDC'ernes evne til at prime antigenspecifikke lymfocytter. De forskellige behandlingsgrupper af celler efter 16 dages samkultur inkluderer specifik, ikke-specifik og kontrol. Den specifikke gruppe er defineret som lymfocytter dyrket sammen med RV-pulserede MoDC'er; den ikke-specifikke gruppe defineres som lymfocytter dyrket sammen med ikke-antigenpulserede MoDC'er og kontrolgruppen er defineret som lymfocytter dyrket uden MoDC'er.

  1. Tilsæt komplet dyrkningsmedium til den eluerede naive lymfocytfraktion (CD14-celler) for at opnå en cellekoncentration på 2 × 106 celler / ml.
    BEMÆRK: Tæl de levende celler i CD14-cellekulturen, der er blevet opretholdt i komplet dyrkningsmedium i en 24-brønds plade siden deres indsamling for at estimere det medium, der kræves for at opnå det ønskede celletal.
  2. På dag 7 skal du tage en steril plade med 24 brønde og frø brøndene med 1 ml naiv lymfocytcellesuspension (2 × 106 celle / ml) plus 1 ml antigenpulseret eller ikke-antigenpulseret MoDC-suspension (1 × 105 celle / ml).
    BEMÆRK: Det samlede volumen i hver brønd vil være 2 ml med et forhold på 1:20 MoDC'er til lymfocytter pr. Brønd.
  3. Pladen inkuberes i 48 timer ved 37 °C og 5 % CO2.
  4. Kulturberigelse og restimulering med antigenpulserende MoDC'er
    1. Efter inkubation af den antigenpulserede MoDC-lymfocyt-cokultur, på dag 9, suppleres hver brønd med 20 ng / ml rekombinant IL-2 og fortsætter med at inkubere i yderligere 120 timer (5 dages inkubation).
    2. På dag 14 overføres 1 ml af samkulturen til et sterilt 1,5 ml rør, og centrifugeres ved 500 × g i 7 min.
    3. Supernatanten kasseres, og cellepelletten resuspenderes med 1 ml antigenpulserede eller ikke-pulserende MoDC'er (1 × 105 celle/ml). Bland forsigtigt ved pipettering, og overfør cellesuspensionerne tilbage til deres udpegede huller.
      BEMÆRK: På dette trin er det samlede volumen i hver brønd 2 ml.
    4. Der fortsættes med inkubation ved 5 % CO2 og 37 °C i 48 timer. Efter inkubation på dag 16 er cokulturen klar til analyse ved hjælp af flowcytometri, qPCR og ELISA.
      BEMÆRK: For hver 2 ml i hver brønd i MoDC-lymfocyt-cokulturen farves 1 ml resuspenderede celler til flowcytometri, 1 ml anvendes til RNA-ekstraktion, og supernatanterne fra begge anvendes til ELISA.

5. Flow cytometrisk analyse

BEMÆRK: Plet cellerne med passende markører/mAb, før prøverne køres på et flowcytometer. Se materialetabellen for detaljer om reagenserne (farvning mAb og isotypekontroller), kit, instrument og software, der bruges til flowcytometrianalysen.

  1. Protokol til farvning af flowcytometer
    BEMÆRK: Udfør celleoverfladefarvning for PBMC'erne og naive lymfocytter og monocytter ved hjælp af anti-CD14 mAb (trin 1.2.6). Til farvning af celleoverfladen på naive MoDC'er skal du bruge anti-CD86-specifik, anti-CD40-specifik og anti-MHC II-specifik mAb. Til celleoverfladefarvning af celler fra dag 16 co-kulturer, brug anti-CD4, anti-CD8, anti-CD25 mAbs; til intracellulær farvning skal du bruge anti-Ki-67 mAb. Desuden pletter cellerne enten med negativ isotypekontrol mAb eller uden mAb (FMO: fluorescerende minus en). Hovedforskellen ved farvning til overflade- og intracellulære markører er, at cellerne for celleoverflademarkører skal farves med specifik overflade mAb inden levende / død (L / D) farvning eller andre processer. Imidlertid udføres intracellulær farvning efter L / D-farvning og kræver et fikserings- plus permeabiliseringstrin for at tillade intracellulær penetration.
    1. Der overføres 1 ml cellesuspension til et sterilt 1,5 ml rør ved hjælp af en pipette, og centrifugeres i 10 minutter ved 500 × g.
      BEMÆRK: Efter centrifugering gemmes supernatanten til ELISA-analyse, når cellerne fra MoDC-lymfocyt-cokulturen behandles.
    2. Resuspender pellet i 1 ml PBS, og overfør det til et 15 ml rør. De resterende celler opsamles ved hjælp af 1 ml PBS, og dette kombineres med den resuspenderede pellet.
    3. Der tilsættes 10 ml PBS til det 15 ml glas, der indeholder cellerne, blandes ved pipettering og centrifugeres i 7 minutter ved 850 x g.
    4. Supernatanten kasseres, og trin 5.1.3 gentages.
    5. Supernatanten kasseres, og cellepelletsen resuspenderes forsigtigt med restsuspensionen (ca. 180 μl) tilbage efter dekantering af supernatanten.
    6. Overfør cellesuspensionen til en v-bund 96-brøndplade, og forsegl hullerne for at undgå spild.
    7. Pladen centrifugeres ved 1.400 × g i 5 min. Efter centrifugering svirpes pladen over en affaldsbeholder for at tømme hullerne for væske, og banken pladen på absorberende papir for at sikre, at overskydende væske fjernes.
    8. Der tilsættes 25 μL overfladefarvningsmasterblanding pr. hul, og blandingen forsigtigt med en pipette efterfulgt af inkubation ved 4 °C i 30 minutter.
      BEMÆRK: For at forberede overfladefarvningsmasterblanding til et enkelt hul tilsættes 2,5 μL overflade mAb til 20 μL FACS-buffer.
    9. Der tilsættes 200 μL FACS-buffer pr. hul, og centrifugeres ved 1.400 × g i 5 minutter. Efter centrifugering tømmes hullerne for væske ved dekantering, og pladen bankes på absorberende papir for at fjerne overskydende væske.
    10. Tilsæt 100 μL L/D-farvningsopløsning pr. hul. Bland grundigt med en pipette efterfulgt af inkubation ved 4 °C i 15 minutter i mørke.
      BEMÆRK: For et enkelt hul opløses 0,25 μL L / D-farvestof i 100 μL FACS-buffer. L / D-farvestoffet hjælper med at skelne mellem levende og døde celler.
    11. Tilsæt 100 μL FACS-buffer. Dæk hullerne med låget, og centrifuger pladen i 1.400 × g i 5 min. Supernatanten kasseres ved dekantering, og pladen bankes på absorberende papir.
    12. Gentag trin 5.1.11.
    13. Der tilsættes 50 μL fikseringsopløsning pr. hul (leveres med sættet), og blandes med en pipette, inden pladen inkuberes ved stuetemperatur i mørke i 10 minutter.
    14. Tilsæt 150 μL af den 1x permeabiliseringsvaskebuffer (PW), der følger med sættet, og dæk hullerne med låget.
      BEMÆRK: For at forberede 10 ml 1x PW-buffer fortyndes 1 ml 10x permbuffer i 10 ml dH2O.
    15. Pladen centrifugeres ved 1.400 × g i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten kasseres ved dekantering, og pladen bankes på absorberende papir.
    16. Der tilsættes 200 μL 1x PW efterfulgt af centrifugering ved 1.400 × g i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten kasseres ved dekantering, og pladen bankes på absorberende papir.
    17. Til intracellulær farvning tilsættes 25 μL intracellulær farvningsmasterblanding (anti-human Ki-67 mAb) pr. Hul. Bland godt, og inkuber pladen i 30 minutter ved 4 °C eller på is i mørke.
      BEMÆRK: For at forberede intracellulær farvningsmasterblanding til en enkelt brønd tilsættes 1 μL Ki-67 mAb til 24 μL 1x PW. Den intracellulære farvningsmarkør anvendes kun ved behandling af celler fra dag 16 co-kultur. Intracellulær farvning udføres ikke under behandling af PBMC'er, naive lymfocytter, monocytter og naive MoDC'er.
    18. Efter inkubation tilsættes 200 μL 1x PW til hvert hul. Bland med en pipette, og centrifuger i 1.400 × g i 5 minutter. Supernatanten kasseres ved dekantering, og pladen bankes på absorberende papir.
    19. Der tilsættes 200 μL FACS-buffer efterfulgt af centrifugering ved 1.400 × g i 5 minutter. Supernatanten kasseres ved dekantering, og pladen bankes på absorberende papir.
    20. Cellepellet resuspenderes i 200 μL FACS-buffer, og indholdet af hvert hul overføres til separate sterile flowcytometerrør. Brug 300 μL FACS-buffer pr. brønd til at opsamle restcellerne. Cellerne er nu klar til flowcytometrianalyse.
  2. Kørsel af prøven på et flowcytometer
    BEMÆRK: Prøverne blev kørt på et flowcytometer (ved hjælp af 488 nm, 638 nm og 405 nm lasere) i henhold til producentens manual35. Se vejledningen for detaljer, fejlfinding og tilpasning af protokollen.
    1. Udfør rutinemæssige rengøringsprocedurer før og efter aflæsning af prøverne.
      BEMÆRK: Spring ikke en position over, mens du lægger rørene i instrumentet.
      1. Til rengøringscyklussen anvendes i alt fire reagensglas, hvor det første rør indeholder strømningsrensereagens, og de resterende tre rør indeholderdH2O. hvert rør vil have 3 ml. Under rengøringskørslen skal du hente data med en medium strømningshastighed i ca. 1 min ved at registrere 100.000 hændelser pr. rør under 330 V for fremadrettet spredning (FSC) mod 265 V for sidespredning (SSC).
        BEMÆRK: Der må ikke rapporteres snavs eller cellulære hændelser under rengøringen; Hvis dette sker, skal du udføre rengøringstrinnet igen. For at køre prøverne skal du sørge for, at alle prøverne er i en homogen suspension, inden dataene erhverves, da dette sikrer en nøjagtig aflæsning.
    2. For at tilslutte og tænde cytometeret skal du klikke på applikationsknappen i venstre hjørne af titellinjen. Fra applikationens rullemenu skal du vælge indstillingen Cytometri og klikke på indstillingen Tænd.
      BEMÆRK: Fra applikationens rullemenu giver indstillingen Åbn brugerne mulighed for at gennemse de forprogrammerede assays, mens indstillingen Ny protokol giver brugerne mulighed for at oprette nye protokoller.
    3. Læg først den negative kontrolprøve i multirørholderen. Vælg Ny protokol, og hold øje med arbejdslisten i venstre side af arbejdsområdet /skærmen.
    4. På arbejdslisten skal du definere prøvens placering i multirørsholderen og give et navn til prøven og protokollen til identifikation.
    5. Fra hardwarepanelet i venstre side af arbejdsområdet skal du justere og vælge flere parametre såsom detektorerne (FSC, SSC og 10 fluorescensområder), spændingerne (V) og forstærkningerne for fotomultiplikatorerne og signalets arealhøjde-bredde (AHW).
      BEMÆRK: Følgende indstillinger for detektorerne blev valgt ud fra eksperimentet og det anvendte instrument: FSC-AHW: AHW, V: 270, G: 5; SSC-AHW: A, V: 350, G: 10; FL1 (CD8/FITC Dextran)-AHW: A, V: 400, G: 1; FL2 (CD25/PE)-AHW: A, V: 500, G: 1; FL6 (CD4/Alexa Fluor 647)-AHW: A, V: 700, G: 1; FL7 (Ki-67 / Alexa Fluor 700)-AHW: A, V: 625, G: 1; FL9 (L/D)-AHW: A, V: 425, G: 1.
    6. Fra kontrolpanelet til instrumentanskaffelse under titellinjen skal du justere indstillingerne for flowhastighed (medium), tid (5 min) og hændelser (se trin 5.2.8), der ønskes registreret. Klik på indstillingen Anskaf enkelt for at lade instrumentet tegne/køre prøven og vise forhåndsvisningen i realtid af de registrerede hændelser.
    7. Fra forhåndsvisningen i realtid skal du justere tærsklen for fluorescens (spænding og forstærkning) og cellestørrelse for til sidst at tegne porte omkring den ønskede cellepopulation , mens du udelukker cellulært affald.
      BEMÆRK: FSC hjælper med at skelne celler på grundlag af størrelse, hvilket giver brugerne mulighed for at skelne mellem celler i immunsystemet, såsom monocytter og lymfocytter; monocytter er større og viser en højere FSC-intensitet sammenlignet med lymfocytter.
    8. Få ca. 5.000 levende MoDC, 50.000 levende lymfocytter og 50.000 levende monocythændelser.
    9. Når alle parametre er justeret i forhold til den negative kontrolprøve, skal du klikke på Stop og gemme protokollen.
    10. Læg nu alle prøverne på multirørslæsseren. Definer hver prøve på arbejdslisten, og anvend de parametre, der er justeret i forhold til den negative kontrol, på alle prøverne i eksperimentet. Klik på indstillingen Anskaf for at tillade, at alle prøverne i eksperimentet køres fortløbende.
    11. Når dataene fra alle prøverne er erhvervet, skal du gemme og omdanne til læsbare data ved hjælp af en passende dataanalysesoftware, der tillader generering af sekventielle biparametriske og monoparametriske histogrammer.

6. Messenger RNA (mRNA) ekspression analyse

  1. RNA-ekstraktion
    BEMÆRK: Uddrag total RNA fra den antigenpulserede MoDC-lymfocyt-cokultur (specifik), den ikke-antigenpulserede MoDC-lymfocyt-cokultur (ikke-specifik), lymfocytkulturen uden MoDC'er (kontrol) og fra naive lymfocytter (CD14-celler isoleret før co-dyrkning ). Til RNA-ekstraktionen fremstilles ethanol ved hjælp af RNasefrit vand. Se materialetabellen for detaljer om ekstraktionssættet og reagenserne.
    1. Der overføres 1 ml cellesuspension fra MoDC-lymfocyt-cokulturpladen (~1 × 106 celler/ml) til et sterilt 1,5 ml sterilt rør ved hjælp af en pipette, og centrifugeres i 10 minutter ved 500 × g.
    2. Gem supernatanten til ELISA. Resuspender cellepillen i 1 ml PBS, og overfør den til et 15 ml rør. Eventuelle resterende celler indsamles ved hjælp af 1 ml PBS.
    3. Centrifuger i 10 min ved 500 × g.
      BEMÆRK: Alle prøverne skal håndteres forsigtigt som levende celler, indtil cellelyse udføres ved hjælp af lysisbufferen, der leveres i sættet. Celledød frigiver RNaser, der hurtigt hydrolyserer de RNA-skabeloner, der er nødvendige til kvantificering nedstrøms. RLT-buffer lyserer celler i en opløsning, der hæmmer RNaser.
    4. Tilsæt 350 μL lysisbuffer til hver tom brønd, og inkuber i 2-3 minutter for at lyse de vedhængende celler, der ikke blev høstet i de foregående trin.
    5. Når centrifugeringen i trin 6.1.3 er afsluttet, kasseres supernatanten, og cellepellet kombineres med de 350 μl lysisbuffer, der er tilsat i trin 6.1.4.
      BEMÆRK: På dette tidspunkt er det muligt at opbevare rørene ved -80 °C eller fortsætte med RNA-ekstraktion (følgende trin).
    6. Der pipetteres 350 μL 70 % ethanol til lysatet i trin 6.1.5. Det endelige volumen pr. prøve er 700 μL.
    7. Indsæt ekstraktionskolonnen i et 2 ml opsamlingsrør (følger med sættet).
    8. De 700 μL prøve overføres pr. ekstraktionskolonne, og der centrifugeres ved 10.000 × g i 15 s. Kassér gennemstrømningen i opsamlingsrøret, og placer den tilbage i centrifugeringskolonnen.
    9. I ekstraktionskolonnen tilsættes 350 μL streng vaskebuffer (medfølger i sættet), og centrifugeres ved mere end 10.000 × g i 15 sekunder. Kassér gennemstrømningen.
    10. Der tilsættes 80 μL DNase I-inkubationsblanding pr. prøve på ekstraktionskolonnens membran, og den sættes i 15 minutter ved 20-30 °C.
      BEMÆRK: For at forberede DNase I-inkubationsblanding pr. prøve tilsættes 10 μL DNase I-stamopløsning til 70 μL DNase-buffer for et slutvolumen på 80 μL. Bland grundigt ved at vende glasset flere gange efterfulgt af en kort centrifugering i centrifugen.
    11. Udsugningskolonnen vaskes med 350 μL streng vaskebuffer efterfulgt af centrifugering ved 10.000 × g i 15 minutter. Gennemstrømningen i opsamlingsrøret kasseres efter centrifugering.
    12. Udsugningskolonnen vaskes 2x med 500 μL mild vaskebuffer hver gang og med centrifugering ved 10.000 × g i 15 s og anden gang i 2 min. Gennemstrømningen kasseres efter hver centrifugering.
    13. Centrifuger kolonnen ved maksimal hastighed i 1 min for at tørre membranen, og kassér opsamlingsrøret.
    14. Anbring ekstraktionskolonnen i et nyt 1,5 ml opsamlingsrør.
    15. Der pipetteres 50 μL RNasefrit vand på søjlemembranen, og der inkuberes i 3-5 minutter ved stuetemperatur.
      BEMÆRK: For RNA-koncentrationer under 100 ng reduceres elueringsvolumenet til 30 μL, og ekstraktionssøjlemembranen elueres igen ved hjælp af produktet fra den første eluering for at koncentrere slutproduktet.
    16. Der centrifugeres ved 10.000 × g i 1 min for at eluere RNA'et.
    17. Koncentrationen af RNA måles ved at detektere absorbansen ved 260 nm ved hjælp af 0,5-2 μL prøve. Den endelige RNA-koncentration justeres til 0,1-1 μg/μL ved hjælp af RNasefrit vand.
    18. RNA-delprøverne opbevares ved -80 °C til senere brug.
  2. Syntese af komplementært DNA
    1. Syntetiser komplementært DNA (cDNA) fra ekstraheret skabelon-RNA i henhold til producentens protokol, der følger med sættet (se materialetabellen for detaljer).
      BEMÆRK: En oversigt over reagenserne og de anvendte mængder er vist i tabel 1 og tabel 2. En komplet protokol er beskrevet i supplerende fil 1.
  3. Kvantitativ polymerasekædereaktion i realtid
    1. For qPCR køres cDNA-prøverne i tre eksemplarer. Kvantificer bovin mRNA-transkriptionsniveauerne for Ki-67 og IFN-γ ved hjælp af specifikke primersæt med henvisning til GAPDH-genet , som vist i tabel 3.
      BEMÆRK: En komplet protokol er beskrevet i supplerende fil 1.

7. Enzymbundet immunosorbentassay

  1. De indsamlede kultursupernatanter, der er rige på sekretoriske proteiner, behandles til kvantificering af IFN-γ gennem ELISA.
    BEMÆRK: Se materialefortegnelsen for detaljer om brug af sættet. En komplet protokol er beskrevet i supplerende fil 1.

8. Statistisk analyse

  1. Analyser dataene, og lav grafiske illustrationer af eksperimentelt design ved hjælp af kommerciel software. Brug en uparret ikke-parametrisk test til den sammenlignende analyse. Betragt P-værdier < 0,05 som statistisk signifikante.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne metode beskriver in vitro-generering af MoDC'er fra kvæg til evaluering af kandidatvaccineantigener forud for in vivo-undersøgelser. Figur 1 illustrerer forsøgsplanen for frembringelse af MoDC hos kvæg og anvendelsen af MoDC'erne til in vitro-assayet. Ved hjælp af den magnetisk baserede cellesorteringsteknik var det muligt at indsamle ca. 26 millioner CD14+ myocytter fra de høstede PBMC'er, som tidligere var isoleret fra 50 ml kvægblod. Den eluerede cellefraktion fri for CD14+ monocytter var rig på lymfocytter og blev brugt som kilde til naive CD4+ og CD8+ T-celler (CD14-lymfocytcellefraktion).

Den naive monocytfraktion var sammensat af 98% CD14+ monocytceller, som observeret efter CD14-cellefarvning og flowcytometri (figur 2A,B). De rensede naive monocytceller, når de udsættes for dyrkning i nærvær af 3% cytokincocktail (GM-CSF og IL-4) med en efterfølgende inkubation på 5 dage, differentieret til en DC-lignende fænotype. Fra en startkultur på 26 millioner CD14+ monocytter kunne i alt ca. 12 millioner MoDC'er opnås efter 5 dages inkubation. De naive MoDC'er var funktionelt i stand til antigenoptagelse, som observeret ved hjælp af flowcytometrianalysen af FITC-dextran (figur 3). Desuden var de naive MoDC'er fænotypisk karakteriseret ved at vurdere ekspressionen af MHC klasse II og co-stimulerende CD86 og CD40 celleoverflademarkører, som validerede den DC-lignende fænotype (figur 4).

Den antigenpulserende stimulering af naive MoDC'er blev opnået ved at dyrke dem i nærvær af inaktiveret RV i 2 dage. Aktiveringen af naive lymfocytter (CD14-cellefraktionen) blev opnået ved antigenpulseret MoDC-lymfocyt-co-dyrkning med det efterfølgende tilskud af IL-2 . Under MoDC-lymfocyt-cokulturen på dag 9 blev der observeret en morfologisk ændring i de RV-pulserede MoDC'er, da de viste dendritforlængelse, hvilket er karakteristisk for MoDC-modning (figur 5). På dag 14 blev lymfocytaktivering forbedret ved at restimulere co-kulturen gennem tilsætning af nyproducerede RV-pulserede MoDC'er fra det samme dyr.

Sammenlignet med den ikke-pulserende MoDC-lymfocyt-cokultur blev en signifikant stigning (p < 0,01) i lymfocytproliferation demonstreret ved opregulering af Ki-67- og CD25-aktiveringsmarkørerne på både CD4+ - og CD8+ T-cellerne på dag 16 i den pulserende MoDC-lymfocyt-cokultur (figur 6). CD8 + T-cellerne fra de modne RV-pulserede MoDC-cokulturer udviste en otte gange opregulering (p < 0,01) af Ki-67 sammenlignet med den ikke-specifikke gruppe (figur 7A). CD4 + T-cellerne i samme co-kultur viste en syv gange stigning (p < 0,01) i Ki-67 sammenlignet med kontroller (figur 7B). Dette demonstrerer RV-primede MoDC'ers evne til med succes at præsentere RV-antigenet for naive lymfocytter og derefter aktivere dem i en in vitro-tilstand , svarende til hvad der sker i et levende dyr. Ud over at analysere cellerne ved hjælp af flowcytometri blev cokulturerne også udsat for qPCR og ELISA for at kvantificere den RV-specifikke lymfocytaktivering ved anvendelse af henholdsvis RNA-transkription (Ki-67 og IFN-γ) og ekstracellulær sekretion (IFN-γ) (figur 8). Disse yderligere detektionsmetoder kan også bruges som bekræftende test for yderligere at validere resultaterne af flowcytometri. RNA-ekspressionen for Ki-67 og IFN-γ demonstreret ved qPCR og IFN-γ-niveauerne demonstreret af ELISA viste lignende stigningsmønstre, hvilket indikerer lymfocytproliferation, i den antigenspecifikke co-kultur sammenlignet med den ikke-specifikke behandlingsgruppe. Derfor korrelerede qPCR- og ELISA-resultaterne med flowcytometriresultaterne. qPCR viste en stigning på >30% i IFN-γ ekspression og en stigning på >5% i Ki-67-ekspression i alle co-kulturer , der bruger GAPDH som kalibrator (figur 8A, B). En signifikant højere koncentration af udskilt IFN-γ (**p > 0,01) blev målt med ELISA ved anvendelse af kultursupernatanter fra den RV-pulserede MoDC-lymfocyt-cokultur sammenlignet med den ikke-specifikke behandlingsgruppe (figur 8C).

Figure 1
Figur 1: Eksperimentelt design af det bovin MoDC-baserede in vitro-assay. (A) Høst og cellesortering af CD14+ monocyt- og CD14-lymfocytcellefraktioner fra bovin PBMC'er. Kvægblod behandles ved densitetsgradientcentrifugering for at indsamle PBMC'er efterfulgt af magnetisk baseret cellesortering ved hjælp af immunomagnetiske celleseparationskolonner og den efterfølgende dyrkning af den høstede CD14+ naive monocytcellefraktion i suppleret RPMI 1640-medium. (B) Produktion af MoDC'er ved anvendelse af 3% cytokincocktail (GM-CSF + IL-4) med 5 dages inkubation og MoDC-lymfocyt-cokultur. På dag 0 dyrkes monocytterne i nærvær af cytokincocktailen og inkuberes i 48 timer for at inducere differentiering. På dag 2 restimuleres kulturen med den samme cytokincocktail efterfulgt af inkubation i 72 timer, hvilket fører til produktion af naive MoDC'er. På dag 5 tilsættes vaccineantigenet (rabiesvaccine) til den naive MoDC-cellekultur efterfulgt af 48 timers inkubation. På dag 7 udføres co-dyrkning af antigenpulserede MoDC'er med naive lymfocytter (CD14-cellefraktionen) efterfulgt af inkubation. På dag 9 tilføjes IL-2 til co-kulturen. På dag 14 udføres berigelsen/restimuleringen af de aktiverede/primede lymfocytter ved tilsætning af antigenpulserede MoDC'er efterfulgt af inkubation i 48 timer. Endelig høstes cellerne og kultursupernatanten på dag 16 til lymfocytproliferationsanalysen. Forkortelser: MODC'er = bovin monocytafledte dendritiske celler; PBMC'er = mononukleære celler i perifert blod; GM-CSF = granulocyt-makrofag-kolonistimulerende faktor. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Morfologi og renhed af bovin CD14+ monocytter høstet fra PBMC'er ved hjælp af anti-CD14-konjugerede mikroperler. A) Morfologi af bovin monocytter inkuberet i 4 timer ved 37 °C i fuldt dyrkningsmedium for at fjerne mikroperler, fastgjort på polylysinbelagte dias og farvet med modificeret Giemsa-plet. Skalabjælke = 50 μm. (B) Flowcytometrihistogram, der viser den eluerede CD14+ cellefraktion med et renhedsniveau på 98,6% observeret ved anvendelse af anti-CD14-antistof (rødt) og FITC-konjugeret muse IgG1-isotypekontrolantistof (grønt). Forkortelser: PBMC'er = mononukleære celler i perifert blod; FITC cont = fluorescein isothiocyanat kontrol. Dette tal er ændret fra Kangethe et al., 201811. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Endocytisk aktivitet af bovin MoDC'er genereret in vitro. Flowcytometrihistogram, der viser optagelsen af spormolekylet (FITC-dextran) ved dag 5 naive MoDC'er. MoDC'er inkuberet ved 37 °C i 60 minutter med spormolekylet (blåt) og MoDC'er inkuberet på is med spormolekylet (grå) anvendt som baggrundskontrol. Forkortelser: MODC'er = bovin monocytafledte dendritiske celler; FITC = fluoresceinisothiocyanat. Dette tal er ændret fra Kangethe et al., 201811. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Fænotypning af in vitro-genererede MoDC-specifikke celleoverflademarkører for kvæg. Flowcytometrihistogrammer for (A) gating-strategier for MoDC'er og for (B) dag 5-naive MoDC'er farvet med tre forskellige DC-specifikke mAbs (blå), herunder følgende: anti-får MHC II mAb, anti-bovin CD86 mAb og anti-kvæg CD40 mAb. Alle sammenlignet med deres tilsvarende isotypekontroller (rød). Forkortelser: DC = dendritiske celler; MODC'er = bovin monocytafledte DC'er MHC II = større histokompatibilitetskompleks II. Dette tal er ændret fra Kangethe et al., 201811. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Tegn på modning af in vitro-producerede MoDC'er under MoDC-lymfocyt-co-kultur. Observation af den karakteristiske udvidede dendritiske struktur ved antigenpulserede MoDC'er med inverteret mikroskopi på dag 9 i MoDC-lymfocyt-cokulturen. (A) Modne MoDC'er inden for et stærkt sammenflydende område af co-dyrkede lymfocytter. (B) Modne MoDC'er kan let skelnes i et område med færre lymfocytter i samkultur. Skalastænger = 50 μm. Forkortelse: MODC'er = bovin monocytafledte dendritiske celler. Dette tal er ændret fra Kangethe et al., 201811. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Sekventiel gatingstrategi vedtaget for prikplotter mod Ki-67 og CD25-ekspression af lymfocytter i MoDC-lymfocyt-cokultur. (A) Denfulde gating-strategi for celler høstet fra dag 16 MoDC-lymfocyt-co-kultur. (B) Ki-67-ekspressionen fra CD4+-gated lymfocytter og (C) fra CD8+ lymfocytter sammenlignet med FMO-kontrollen (uden mAb) og mus IgG1-k isotypekontrol mAb. CD25-ekspressionen på gated (D) CD8+ og (E) CD4+ lymfocytter sammenlignet med mus IgG1 isotype kontrol mAb. Behandlingsgruppen repræsenterer specifikt lymfocytter dyrket sammen med RV-pulserede MoDC'er, mens kontrollen repræsenterer lymfocytter dyrket i fravær af MoDC'er. Forkortelser: MODC'er = bovin monocytafledte dendritiske celler; FMO = fluorescerende minus en; RV = rabiesvaccine. Dette tal er ændret fra Kangethe et al., 201811. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Flowcytometridataanalyse af Ki-67 og CD25-ekspression ved CD4+ og CD8+ lymfocytter efter priming med antigenet. Ki-67 og CD25 udtryk fra dag 16 co-kultur. Behandlingsgruppen (specifik) er defineret som lymfocytter dyrket med RV-pulserede MoDC'er; den ikke-specifikke gruppe svarer til lymfocytter dyrket med ikke-antigenpulserede MoDC'er kontrolgruppen svarer til lymfocytter dyrket uden MoDC'er. De vandrette søjler repræsenterer gennemsnittet af seks tekniske replikater. (A) Intracellulær ekspression af Ki-67-markøren ved CD8 T-celler og (B) ved CD4 T-celler. (C) CD25-markørens celleoverfladeekspression med CD8 T-celler og (D) med CD4 T-celler. Forkortelser: MODC'er = bovin monocytafledte dendritiske celler; RV = rabiesvaccine. Dette tal er ændret fra Kangethe et al., 201811. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 8
Figur 8: Th1-markøraktivering (IFN-γ og Ki-67) af MoDC'er primet med rabiesvirusantigenet, som påvist gennem qPCR og ELISA. Data taget fra et dyr med seks tekniske replikater. De vandrette søjler repræsenterer middelværdien. Tre PCR-replikater vist som foldændringer sammenlignet med naive lymfocytter efter normalisering med et GAPDH-referencegen . (A) IFN-γ udtryk, (B) Ki-67 udtryk. C) Sammenligning af IFN-γ-sekretion i kultursupernatanten mellem tre behandlingsgrupper, som påvist ved ELISA. Den specifikke gruppe er defineret som lymfocytter dyrket med RV-pulserede MoDC'er; den ikke-specifikke gruppe svarer til lymfocytter dyrket med ikke-antigenpulserede MoDC'er kontrolgruppen svarer til lymfocytter dyrket uden MoDC'er. Forkortelser: MODC'er = bovin monocytafledte dendritiske celler; RV = rabiesvaccine. Dette tal er ændret fra Kangethe et al., 201811. Klik her for at se en større version af denne figur.

Reagenser Endelig koncentration Volumen pr. reaktion
dNTP'er Mix (10 mM) 1.000 μM 1 μL
Tilfældige Hexamer primere (50 ng / μL) 25 μM 1 μL
RNA skabelon 0,1 – 1 μg/μL χ μL (efter behov)
RNAsefrit vand - χ μL (efter behov)
Endelig reaktionsvolumen - 10 μL

Tabel 1: Master mix sammensætning (RNA primer mix).

Reagenser Endelig koncentration Volumen pr. reaktion
RT-buffer 10x 1x 2 μL
MgCl2 25 mM 5 mM 4 μL
DTT 0,1 m 10 mM 2 μL
RNAse-hæmmer 40 E/μL 2 U 1 μL

Tabel 2: 2x PCR-reaktionsblandingen. Forkortelser: RT = revers transkriptase; DTT = dithiothreitol.

Cytokin Art Tiltrædelse nummer Sekvens Længde Tm
IFN-γ Bos tyren FJ263670 F- GTGGGCCTCTCTTCTCAGAA 234 80.5
R- GATCATCCACCGGAATTTGA
Ki-67 Bos tyren XM_015460791.2 F-AAGATTCCAGCGCCCATTCA 148 86.5
R-TGAGGAACGAACACGACTGG
GAPDH Bos tyren Sassu et al., 2020 F-CCTGGAGAAACCTGCCAAGT 214 85.5
R-GCCAAATTCATTGTCGTACCA

Tabel 3: Primersæt anvendt til forstærkning50.

Reagenser Endelig koncentration Volumen pr. reaktion
Supermix 1x 5 μL
Fremadgående primer (5 μM) 250 / 125 nM 1 μL
Omvendte primere (5 μM) 250 / 125 nM 1 μL
cDNA 1:10 fortyndet 1,25 NG 2 μL
Nukleasefrit vand - 1 μL
Endelig reaktionsvolumen - 10 μL

Tabel 4: qPCR-mastermix

Rør nr. Koncentration af standard Seriel fortynding
1 50 ng/ml 50 μL standard + 350 μL vaskebuffer
2 12,5 ng/ml 150 μL fra rør 1 + 450 μL vaskebuffer
3 6,25 ng/ml 250 μL fra rør 2 + 250 μL vaskebuffer
4 3,13 ng/ml 250 μL fra rør 3 + 250 μL vaskebuffer
5 1,56 ng/ml 250 μL fra rør 4 + 250 μL vaskebuffer
6 0,78 ng/ml 250 μL fra rør 5 + 250 μL vaskebuffer
7 0,2 ng/ml 150 μL fra rør 6 + 450 μL vaskebuffer
8 0,1 ng/ml 250 μL fra rør 7 + 250 μL vaskebuffer
9 0,025 ng/ml 100 μL fra rør 8 + 300 μL vaskebuffer

Tabel 5: IFN-γ standardfortyndingsserie

Supplerende fil 1: Protokoller til syntese af komplementært DNA, kvantitativ polymerasekædereaktion i realtid (qPCR) og enzymbundet immunosorbentassay (ELISA). Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S1: MoDC'er med antigenoptagelsesevne med forskellige koncentrationer af cytokincocktail og med 3 dages eller 5 dages dyrkning. Forskellige koncentrationer (5% w/v og 3% w/v) af cytokincocktailen indeholdende GM-CSF og IL-4 blev testet enten med 3 dages eller 5 dages dyrkning for at vurdere den bedste kombination til at generere højtydende antigenoptagelses-MoDC'er (ved anvendelse af spormolekylet FITC-dextran). Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S2: CD4- og CD8-priming med difteritoksoid (DT) og bluetonguevirus serotype 4 (BTV). Ekspressionen af Ki-67 med CD8-celler efter pulsering med (A) DT og (C) BTV og ekspressionen af Ki-67 med CD4-celler efter pulsering med (B) DT og (D) BVT på dag 16. Der blev foretaget sammenligninger med kulturer pulseret med DT og BVT (specifik), (C,D) med CD40L og med ikke-specifikke priming- og kontrolbehandlinger. De vandrette søjler angiver middelværdien. *p < 0,05, **p < 0,01 ifølge en Mann-Whitney-test. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne undersøgelse demonstrerer en standardiseret in vitro-metode til generering og fænotypebestemmelse af bovin MoDC'er og deres efterfølgende anvendelse til måling af vaccineimmunogeniciteten af en kommerciel vaccine (f.eks. RV). Bovin MoDC'er kan bruges som et værktøj til screening af potentielle vaccineantigener mod kvægsygdomme og forudsigelse af deres potentielle kliniske indvirkning baseret på immunresponser, inden de fortsætter mod in vivo-dyreforsøg . De genererede MoDC'er blev identificeret ud fra deres morfologiske, fænotypiske og funktionelle egenskaber. Vi viste, at MoDC'erne afledt af kvæg CD14+ monocytter udviste træk set i DC'er, såsom udvidede dendritter, ekspressionen af celleoverflademarkører til antigenpræsentation såsom MHC II, ekspressionen af co-stimulerende molekyler på MoDC'er såsom CD40 og CD86, endocytisk aktivitet og evnen til at aktivere naive lymfocytter.

De cellekulturmedier, der anvendes i dette eksperiment (DMEM og RPMI), anvendes i vid udstrækning til celledifferentiering og dyrkning, hvor RPMI hyppigere vedtages til monocytdifferentiering36. RPMI-tilskud med enten FBS eller HS (hesteserum) påvirker ikke monocytdifferentiering37. Rekombinant GM-CSF og IL-4 tilskud giver en inflammatorisk tilstand, der udløser monocytdifferentiering og rutinemæssigt anvendes til produktion af funktionelt levedygtige MoDC'er, der er i stand til antigenoptagelse og præsentation til immunceller38,39. I denne undersøgelse blev RPMI 1640-medium suppleret med 10% FBS (komplet dyrkningsmedium), 1% penicillin-streptomycin og tilsætning af en kommercielt tilgængelig cytokincocktail (GM-CSF plus IL-4) induceret bovin monocytdifferentiering, hvilket resulterede i produktion af levedygtige MoDC'er. Når de genererede MoDC'er blev inkuberet med RV, før de dyrkede sammen med naive lymfocytter, inducerede de et T-celleafhængigt immunrespons, der var specifikt mod RV, hvilket beviser, at modne MoDC'er tilstrækkeligt kan præsentere RV-antigener til lymfocytter, der aldrig er stødt på RV. Dette er et afgørende kendetegn ved adaptiv immunitet, som vi nu kan replikere i laboratoriet.

Vi observerede, at en højere koncentration af cytokincocktail (5%) kombineret med en længere inkubationstid (5 dage) producerede MoDC'er med lavere endocytisk evne til antigenoptagelse end dem, der blev behandlet med en lavere koncentration af cytokincocktail (3%) med samme inkubationstid (5 dage), som vist i supplerende figur S1. Derfor konkluderer vi, at en lavere koncentration af cytokincocktail (f.eks. 3%) med 5 dages inkubation er optimal til at producere funktionelt potente MoDC'er. Celleoverflademarkører såsom MHC II, CD40 og CD86 er til stede på APC'er, og deres opregulering indikerer funktionel celleaktivering40,41,4 2. Vi demonstrerede forbedret ekspression af MHC II, CD40 og CD86 efter monocytdifferentiering til naive MoDC'er ved hjælp af cytokincocktailen (figur 4).

Optimering af forholdet mellem naive lymfocytter og MoDC'er i et dyrkningssystem er en nøglefaktor, der påvirker resultatet af MoDC-assayet, med forskellige MoDC til lymfocytforhold, der inducerer varierede lymfocytresponser43. Efter at have evalueret MoDC til lymfocytforhold på 1: 10-1: 40 observerede vi imidlertid, at forøgelse af koncentrationen af MoDC'er ikke øgede lymfocytaktiveringen, og vi besluttede os til sidst for et optimalt forhold på 1: 20, hvilket svarer til tidligere rapporterede undersøgelser44,45. Det skal bemærkes, at den eluerede naive lymfocytfraktion kan indeholde ikke-specifikt aktiverede T-celler; Derfor er det bydende nødvendigt at have en kontrolgruppe svarende til kun naiv lymfocytkultur.

Aktiverede CD4 + og CD8 + T-celler udtrykker specifikke markører og udskiller en række cytokiner, og deres kvantificering indikerer immunaktivering. Den intracellulære ekspression af Ki-67, en velkarakteriseret immunaktiveringsmarkør, blev opreguleret i denne MoDC-lymfocyt-co-kultur29,46. Tilsvarende i denne undersøgelse indikerede den forbedrede IFN-γ-sekretion af lymfocytter et Th1-respons fremkaldt mod RV-antigenet30,31,47. IL-2-ekspression af CD4 + T-celler er også en god markør til visualisering af T-celleaktivering; dets inkorporering på dag 9 af MoDC-lymfocyt-cokulturen gjorde det imidlertid til et uegnet mål til måling af lymfocytproliferation til denne undersøgelse48. Opreguleringen af CD25 i nærvær af IL-2 har tidligere vist sig at bestemme priming af både CD4 + og CD8 + T-celler og blev brugt i denne undersøgelse til at måle priming af naive lymfocytter af RV-pulserede MoDC'er28.

Cytotoksiske CD8 T-celler er vigtige effektorceller mod intracellulære vaccineantigener eller virale patogener49. Ved at måle lymfocytaktiveringsmarkører (Ki-67 og CD25) og cytokinekspression (IFN-γ) fandt vi, at de antigenbelastede MoDC'er havde signifikant (p < 0,01) aktivering af både CD8- og CD4 T-celleresponser, hvor CD8-responsen og Th1-polariseringen var mere udbredt mod RV-antigenet. En vigtig faktor, der skal overvejes, når man designer et MoDC-assay for adjuvanskonjugerede vacciner, er adjuvansinducerede lymfocytresponser. Vi anbefaler at bruge en kontrolgruppe (adjuverende kontrol), der kun består af adjuvans for at eliminere eventuelle baggrundssignaler. Denne opsætning kan også bruges til at måle effekten af forskellige adjuvanser, der kan forstærke lymfocytresponser mod et lavt immunogent antigen, hvilket er afgørende for beskyttelse under in vivo-undersøgelser .

Der er nogle begrænsninger i denne undersøgelse, som vi vil fremhæve. De eksperimentelle data for hvert assay blev afledt af et enkelt dyr med seks tekniske replikater. At have et større antal biologiske replikater ville være gavnligt for at minimere fejl og give forbedret statistisk pålidelighed og resultater med højere nøjagtighed. Ikke desto mindre blev dette assay i en tidligere publikation11 også testet og valideret ved hjælp af et dipetteritoksoid (supplerende figur S2A,B) og en kommerciel vaccine mod bluetonguevirusserotype 4 (supplerende figur S2C,D) med henholdsvis tre og to biologiske dyr. Desuden ville sammenligning af resultaterne fra denne in vitro-undersøgelse med en in vivo-undersøgelse bidrage til yderligere at validere ægtheden af dette immunassay, hvilket igen ville fremskynde processen med implementering af dette in vitro MoDC-assay som en rutinemæssig test i vaccineproduktion og kvalitetskontrol. Endelig blev udtrykket af CD14 i MoDC'er ikke undersøgt, da litteraturen er inkonsekvent med hensyn til dette aspekt, især når man sammenligner MoDC'er fra forskellige dyrearter.

Afslutningsvis rapporterer vi et in vitro bovin MoDC-assay, der kan bruges til at måle vaccineinduceret immunogenicitet. Dette MoDC-assay kan også evalueres ved hjælp af forskellige metoder, herunder flowcytometri, ELISA og qPCR. At have flere metoder til evaluering af aktiveringsmarkører er afgørende i områder med begrænsede ressourcer, hvor et flowcytometer muligvis ikke er let tilgængeligt. Dette assay kan indgå som et kvalitetskontroltrin af nationale veterinærlaboratorier, der producerer store partier kvægvacciner. Derudover kan det bruges til at identificere potentielle vaccineantigener under udviklingen af nye kvægvacciner og endda til at vælge, hvilken adjuvans der skal bruges før et dyreforsøg. Alle disse faktorer vil bidrage til en mere etisk og økonomisk overkommelig tilgang til udvikling og anvendelse af kvægvacciner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Eveline Wodak og Dr. Angelika Loistch (AGES) for deres støtte til bestemmelse af dyrenes sundhedsstatus og for at levere BTV, Dr. Bernhard Reinelt for at levere kvægblod og Dr. Bharani Settypalli og Dr. William Dundon fra IAEA for nyttige råd om henholdsvis PCR-eksperimenter i realtid og sprogredigering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACK Lysing Buffer Gibco, Thermo Fisher A1049201 Ammonium-Chloride-Potassium buffer for lysis of residual RBCs in harvested PBMC Fraction
BD Vacutainer Heparin Tubes Becton, Dickinson (BD) and Company 366480 10 mL, additive sodium heparin 158 USP units, glass tube, 16 x 100 mm size
Bovine Dendritic Cell Growth Kit Bio-Rad, UK PBP015KZZ Cytokine cocktail composed of recombinant bovine IL-4 and GM-CSF
Bovine IFN-γ ELISA Kit Bio-Rad MCA5638KZZ Kit use for measuring IFN-γ expression in culture supernatant
CD14 Antibody Bio-Rad MCA2678F Mouse anti-bovine CD14 monoclonal antibody, clone CC-G33, isotype IgG1
CD25 Antibody Bio-Rad MCA2430PE Mouse anti bovine CD25 monoclonal antibody, clone IL-A11, isotype IgG1
CD4 Antibody Bio-Rad MCA1653A647 Mouse anti bovine CD4 monoclonal antibody, clone CC8, isotype IgG2a
CD40 Antibody Bio-Rad MCA2431F Mouse anti-bovine CD40 monoclonal antibody, clone IL-A156, isotype IgG1
CD8 Antibody Bio-Rad MCA837F Mouse anti bovine CD8 monoclonal antibody, clone CC63, isotype IgG2a
CD86 Antibody Bio-Rad MCA2437PE Mouse anti-bovine CD86 monoclonal antibody, clone IL-A190, isotype IgG1
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System Bio-Rad - Thermal cycler PCR machine
Corning Centrifuge Tube Falcon Corning  352096 & 352070 15 mL and 50 mL, high-clarity poypropylene conical bottom, graduated, sterial, seal screw cap, falcon tube
Cytofix/Cytoperm Plus BD Bio Sciences 555028 Fixation/permeabilization kit with BD golgiPlug, use for flow cytometer cell staining
Ethanol Sigma Aldrich 1009832500 Absolute for analysis EMSURE ACS,ISO, Reag. Ph Eur
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco, Thermo Fisher 10500064 Qualified, heat inactivated
Ficoll Plaque PLUS GE Health care Life Sciences, USA 341691 Lymphocyte-isolation medium
FlowClean Cleaning Agent Beckman Coulter, Life Sciences A64669 500 mL
FlowJo FlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, USA - Flow cytometer Histogram software
FlowTubes/ FACS  (Fluorescence-activated single-cell sorting) Tube Falcon Corning  352235 5 mL, sterial, round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap, use in flow cytometry analysis
Fluoresceinisothiocynat-Dextran Sigma Aldrich, Germany 60842-46-8 FITC-dextran MW
Gallios Flow Cytometer Beckman Coulter - Flow cytometer machine
Hard-Shell 96-Well PCR Plates Bio-Rad HSP9601 96 well, low profile, thin wall, skirted, white/clear
Human CD14 MicroBeads Miltenyi Bioteck, Germany 130-050-201 2 mL microbeads conjugated to monoclonal anti-human CD14 antibody isotype IgG2a, used for selection of bovine monocytes from PBMCs
Kaluza Beckman Coulter, Germany - Flow cytometer multicolor data analysis software
MACS Column Miltenyi Bioteck, Germany 130-042-401 Magnetic activated cell sorting or immune magentic cell separation colum for separation of various CD14 cell population based on cell surface antigens
MHC Class II DQ DR Polymorphic Antibody Bio-Rad MCA2228F Mouse anti-sheep MHC Class II DQ DR Polymorphic:FITC, clone 49.1, isotype IgG2a, cross reactive with bovine
Microcentrifuge Tube Sigma Aldrich HS4325 1.5 mL, conical bottom, graduated, sterial tube
Microsoft Power Point Microsoft - The graphical illustrations of experimental design
Mouse IgG1 Negative Control:FITC for CD14, CD40 Antibody Bio-Rad MCA928F Isotype control CD14 and CD40 monoclonal antibody 
Mouse IgG1 Negative Control:PE for CD86 Antibody Bio-Rad MCA928PE Isotype control CD86 monoclonal antibody 
Mouse IgG1 Negative Control:RPE for CD25 Antibody Bio-Rad MCA928PE Isotype control CD25 monoclonal antibody 
Mouse IgG2a Negative Control:FITC for MHC Class II Antibody Bio-Rad MCA929F Isotype control for MHC class II monoclonal antibody 
Nobivac Rabies MSD Animal Health, UK - 1 µL/mL of cell cultured inactivated vaccine containing > 2 I.U./mL Rabies virus strain
Optical seals Bi0-Rad TCS0803 0.2 mL flat PCR tube 8-cap strips, optical, ultraclear, compatible for qPCR machine
Penicillin-Streptomycin Gibco, Thermo Fisher 15140122 100 mL
Phosphate Buffer Saline (PBS) Gibco, Thermo Fisher 10010023 pH 7.4, 1x concentration
Prism - GraphPad 5 Software  Dotmatics - Statistical software
Purified Anti-human Ki-67 antibody Biolegend, USA 350501 Monoclonal antibody, cross reactive with cow, clone ki-67
Purified Mouse IgG1 k Isotype Ctrl Antibody Biolegend 400101 Isotype control for Ki-67 monoclonal antibody
READIDROP Propidium Iodide BD Bio Sciences 1351101 Live/dead cell marker used for flow cytometry, amine reactive dye
Recombinant Human IL-2 Protein R&D System, USA 202-IL-010/CF Interleukin-2, 20 ng/ml
RNeasy Mini Kit Qiagen 74106 Kit use for extraction of total RNA; RLT buffer = lysis buffer; RW1 buffer = stringent guanidine-containing washing buffer; RDD buffer = DNase buffer; RPE buffer = mild wash buffer; RNaseOUT = RNase inhibitor.
RPMI 1640 Medium Sigma Aldrich R8758 Cell culture media with L-glutamine and sodium bicarbonate
SMART-servier medical art  Les Laboratories Servier - Licensed under a creative commons attribution 3.0 unported license
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 172-5270 2x qPCR mix conatins dNTPs, Ss07d fusion polymerase, MgCl2, SYBR Green I supermix = supermix, ROX normalization dyes.
SuperScript III First-Strand Synthesis System Invitrogen, Thermo Fisher 18080051 Kit for cDNA synthsis
Tissue Culture Test plate 24 TPP, Switzerland 92024 24 well plate, sterilized by radiation , growth enhanced treated, volume 3.18 mL
Trypan Blue Solution Gibco, Thermo Fisher 15250061 0.4%, 100 mL, dye to assess cell viability
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Invitrogen, Thermo Fisher 10977023 0.1 µm membrane filtered distilled water
VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes Thermo Fisher Scientific 15206067 VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes have a green top and contain spray-dried lithium, sodium or ammonium heparin on the inner walls and are usedin clinical chemistry, immunology and serology. The anticoagulant heparin activates antithrombin, which blocks the clotting cascade and thus produces a whole blood/plasma sample.
Water Sigma Aldrich W3500-1L Sterile-filtered, bioReagent suitable for cell culture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roth, J. A., Sandbulte, M. R. The role of veterinary vaccines in livestock production, animal health, and public health. In Veterinary Vaccines: Principles and Applications. Metwally, S., El Idrissi, A., Viljoen, G. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 1-10 (2021).
  2. Roberts, N. J., Douglas, R. G., Simons, R. M., Diamond, M. E. Virus-induced interferon production by human macrophages. The Journal of Immunology. 123 (1), 365-369 (1979).
  3. Kleiveland, C. R. Peripheral blood mononuclear cells. The Impact of Food Bioactives on Health: In Vitro and Ex Vivo Models. Verhoeckx, K., Cotter, P., López-Expósito, I., Kleiveland, C., Lea, T., Mackie, A., Requena, T., Swiatecka, D., Wichers, H. , Springer. Cham, Switzerland. 161-167 (2015).
  4. Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 762-774 (2011).
  5. Domínguez, P. M., Ardavín, C. Differentiation and function of mouse monocyte-derived dendritic cells in steady state and inflammation. Immunological Reviews. 234 (1), 90-104 (2010).
  6. Steinman, R. M. Linking innate to adaptive immunity through dendritic cells. Novartis Foundation Symposium. 279, 101-109 (2006).
  7. Vandebriel, R. J., Hoefnagel, M. H. N. Dendritic cell-based in vitro assays for vaccine immunogenicity. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 8 (9), 1323-1325 (2012).
  8. Hopewell, E. L., Cox, C. Manufacturing dendritic cells for immunotherapy: Monocyte enrichment. Molecular Therapy. Methods and Clinical Development. 16, 155-160 (2020).
  9. Morse, M. A., Zhou, L. -J., Tedder, T. F., Lyerly, H. K., Smith, C. Generation of dendritic cells in vitro from peripheral blood mononuclear cells with granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor, interleukin-4, and tumor necrosis factor-alpha for use in cancer immunotherapy. Annals of Surgery. 226 (1), 6-16 (1997).
  10. Robinson, L., et al. Foot-and-mouth disease virus exhibits an altered tropism in the presence of specific immunoglobulins, enabling productive infection and killing of dendritic cells. Journal of Virology. 85 (5), 2212-2223 (2011).
  11. Kangethe, R. T., Pichler, R., Chuma, F. N. J., Cattoli, G., Wijewardana, V. Bovine monocyte derived dendritic cell based assay for measuring vaccine immunogenicity in vitro. Veterinary Immunology and Immunopathology. 197, 39-48 (2018).
  12. Harwood, L. J., Gerber, H., Sobrino, F., Summerfield, A., McCullough, K. C. Dendritic cell internalization of foot-and-mouth disease virus: Influence of heparan sulfate binding on virus uptake and induction of the immune response. Journal of Virology. 82 (13), 6379-6394 (2008).
  13. Hussen, J., et al. Phenotypic and functional heterogeneity of bovine blood monocytes. PLoS One. 8 (8), 71502 (2013).
  14. Shi, Y., et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and T-cell responses: What we do and don't know. Cell Research. 16 (2), 126-133 (2006).
  15. Zhou, L. -J., Tedder, T. F. CD14+ blood monocytes can differentiate into functionally mature CD83+ dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (6), 2588-2592 (1996).
  16. Bautista, E. M., Nfon, C., Ferman, G. S., Golde, W. T. IL-13 replaces IL-4 in development of monocyte derived dendritic cells (MoDC) of swine. Veterinary Immunology and Immunopathology. 115 (1-2), 56-67 (2007).
  17. León, B., Ardavín, C. Monocyte-derived dendritic cells in innate and adaptive immunity. Immunology and Cell Biology. 86 (4), 320-324 (2008).
  18. Berger, A. Th1 and Th2 responses: What are they. British Medical Journal. 321 (7258), 424 (2000).
  19. Romagnani, S. Th1/th2 cells. Inflammatory Bowel Diseases. 5 (4), 285-294 (1999).
  20. Kaiko, G. E., Horvat, J. C., Beagley, K. W., Hansbro, P. M. Immunological decision-making: How does the immune system decide to mount a helper T-cell response. Immunology. 123 (3), 326-338 (2008).
  21. Duckworth, B. C., Groom, J. R. Conversations that count: Cellular interactions that drive T cell fate. Immunological Reviews. 300 (1), 203-219 (2021).
  22. León, B., López-Bravo, M., Ardavín, C. Monocyte-derived dendritic cells formed at the infection site control the induction of protective T helper 1 responses against Leishmania. Immunity. 26 (4), 519-531 (2007).
  23. Singh, D., et al. Differential responses of chicken monocyte-derived dendritic cells infected with Salmonella gallinarum and Salmonella typhimurium. Scientific Reports. 11, 17214 (2021).
  24. Pujol, M., et al. Variability in the response of canine and human dendritic cells stimulated with Brucella canis. Veterinary Research. 48, 72 (2017).
  25. Pujol, M., Borie, C., Montoya, M., Ferreira, A., Vernal, R. Brucella canis induces canine CD4+ T cells multi-cytokine Th1/Th17 production via dendritic cell activation. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 62, 68-75 (2019).
  26. Lašťovička, J., Rataj, M., Bartůňková, J. Assessment of lymphocyte proliferation for diagnostic purpose: Comparison of CFSE staining, Ki-67 expression and 3H-thymidine incorporation. Human Immunology. 77 (12), 1215-1222 (2016).
  27. Reddy, M., Eirikis, E., Davis, C., Davis, H. M., Prabhakar, U. Comparative analysis of lymphocyte activation marker expression and cytokine secretion profile in stimulated human peripheral blood mononuclear cell cultures: An in vitro model to monitor cellular immune function. Journal of Immunological Methods. 293 (1-2), 127-142 (2004).
  28. Shatrova, A. N., et al. Time-dependent regulation of IL-2R α-chain (CD25) expression by TCR signal strength and IL-2-induced STAT5 signaling in activated human blood T lymphocytes. PLoS One. 11 (12), 0167215 (2016).
  29. Shedlock, D. J., et al. Ki-67 staining for determination of rhesus macaque T cell proliferative responses ex vivo. Cytometry, Part A. 77 (3), 275-284 (2010).
  30. Yen, H. -R., et al. Tc17 CD8 T cells: Functional plasticity and subset diversity. Journal of Immunology. 183 (11), 7161-7168 (2009).
  31. Kawamura, I., et al. IFN-gamma-producing ability as a possible marker for the protective T cells against Mycobacterium bovis BCG in mice. Journal of Immunology. 148 (9), 2887-2893 (1992).
  32. Federal Ministry Republic of Austria. Agriculture, Forestry, Regions and Water Management. The Federal Act on Animal Welfare (Tierschutzgesetz - TSchG). Federal Law Gazette I 2004/118. , Available from: https://info.bml.gv.at/en/topics/agriculture/agriculture-in-austria/animal-production-in-austria/animal-welfare-act.html (2005).
  33. Corripio-Miyar, Y., et al. Phenotypic and functional analysis of monocyte populations in cattle peripheral blood identifies a subset with high endocytic and allogeneic T-cell stimulatory capacity. Veterinary Research. 46, 112 (2015).
  34. Wijewardana, V., et al. Generation of canine dendritic cells from peripheral blood monocytes without using purified cytokines. Veterinary Immunology and Immunopathology. 114 (1-2), 37-48 (2006).
  35. Gallios Flow Cytometer with Kaluza for Gallios Software. Instructions for Use. Beckman Coulter. , Available from: http://www.cytometrie-imagerie-saint-antoine.org/media/3924/Kaluza.Gallos.pdf (2014).
  36. Švajger, U., Jeras, M. Optimal dendritic cell differentiation in rpmi media requires the absence of HEPES buffer. Immunological Investigations. 40 (4), 413-426 (2011).
  37. Chometon, T. Q., et al. A protocol for rapid monocyte isolation and generation of singular human monocyte-derived dendritic cells. PLoS One. 15 (4), 0231132 (2020).
  38. Blanco, F. C., et al. Semi-stable production of bovine IL-4 and GM-CSF in the mammalian episomal expression system. Journal of Veterinary Research. 65 (3), 315-321 (2021).
  39. Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. Journal of Experimental Medicine. 179 (4), 1109-1118 (1994).
  40. Cho, K. -J., Roche, P. A. Regulation of MHC class II-peptide complex expression by ubiquitination. Frontiers in Immunology. 4, 369 (2013).
  41. Sansom, D. M., Manzotti, C. N., Zheng, Y. What's the difference between CD80 and CD86. Trends in Immunology. 24 (6), 313-318 (2003).
  42. Han Lee, G., et al. The role of CD40 expression in dendritic cells in cancer biology; a systematic review. Current Cancer Drug Targets. 14 (7), 610-620 (2014).
  43. Tanaka, H., Demeure, C. E., Rubio, M., Delespesse, G., Sarfati, M. Human monocyte-derived dendritic cells induce naive T cell differentiation into T helper cell type 2 (Th2) or Th1/Th2 effectors: Role of stimulator/responder ratio. Journal of Experimental Medicine. 192 (3), 405-412 (2000).
  44. Klechevsky, E., et al. Cross-priming CD8+ T cells by targeting antigens to human dendritic cells through DCIR. Blood. 116 (10), 1685-1697 (2010).
  45. Schlienger, K., Craighead, N., Lee, K. P., Levine, B. L., June, C. H. Efficient priming of protein antigen-specific human CD4+ T cells by monocyte-derived dendritic cells. Blood. 96 (10), 3490-3498 (2000).
  46. Soares, A., et al. Novel application of Ki67 to quantify antigen-specific in vitro lymphoproliferation. Journal of Immunological Methods. 362 (1-2), 43-50 (2010).
  47. Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations. Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2009).
  48. Bachmann, M. F., Oxenius, A. Interleukin 2: From immunostimulation to immunoregulation and back again. EMBO Reports. 8 (12), 1142-1148 (2007).
  49. Koup, R. A., Douek, D. C. Vaccine design for CD8 T lymphocyte responses. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 1 (1), 007252 (2011).
  50. Sassu, E. L., et al. Development and evaluation of a real-time PCR panel for the detection of 20 immune markers in cattle and sheep. Veterinary Immunology and Immunopathology. 227, 110092 (2020).

Tags

Tom værdi udgave 195
Bestemmelse af vaccineimmunogenicitet under anvendelse af bovin monocytafledte dendritiske celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liaqat, F., Kangethe, R. T.,… More

Liaqat, F., Kangethe, R. T., Pichler, R., Liu, B., Huber, J., Wijewardana, V., Cattoli, G., Porfiri, L. Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (195), e64874, doi:10.3791/64874 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter