Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Sığır Monosit Kaynaklı Dendritik Hücreler Kullanılarak Aşı İmmünojenitesinin Belirlenmesi

Published: May 19, 2023 doi: 10.3791/64874
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1, 1, 1
1Animal Production and Health Section, Joint Food and Agriculture Organization (FAO)/International Atomic Energy Agency (IAEA) Centre of Nuclear Techniques in Food and Agriculture, International Atomic Energy Agency, 2Teaching and Research Farm Kremesberg, Clinical Unit for Herd Health Management in Ruminants, Department for Farm Animals and Veterinary Public Health, University of Veterinary Medicine, Vienna

Summary

Metodoloji, sığır monosit kaynaklı dendritik hücrelerin (MoDC'ler) oluşumunu ve sığırlarda potansiyel veteriner aşılarının geliştirilmesi sırasında antijenik adayların in vitro değerlendirilmesi için uygulamalarını açıklamaktadır.

Abstract

Dendritik hücreler (DC'ler), bağışıklık sistemi içindeki en güçlü antijen sunan hücrelerdir (APC'ler). Patojen arayan organizmayı devriye gezerler ve doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık tepkilerini birbirine bağlayarak bağışıklık sistemi içinde benzersiz bir rol oynarlar. Bu hücreler fagositleşebilir ve daha sonra yakalanan antijenleri efektör bağışıklık hücrelerine sunarak çeşitli immün yanıtları tetikleyebilir. Bu yazıda, sığır periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) izole edilen sığır monosit türevi dendritik hücrelerin (MoDC'ler) in vitro jenerasyonu ve aşı immünojenitesinin değerlendirilmesinde uygulanması için standartlaştırılmış bir yöntem gösterilmektedir.

CD14 + monositlerini PBMC'lerden izole etmek için manyetik bazlı hücre sıralama kullanıldı ve CD14 + monositlerin naif MoDC'lere farklılaşmasını indüklemek için interlökin (IL)-4 ve granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) ile tam kültür ortamının takviyesi kullanıldı. Olgunlaşmamış MoDC'lerin oluşumu, majör histokompatibilite kompleksi II (MHC II), CD86 ve CD40 hücre yüzey belirteçlerinin ekspresyonu tespit edilerek doğrulandı. Ticari olarak temin edilebilen bir kuduz aşısı, daha sonra naif lenfositlerle birlikte kültürlenen olgunlaşmamış MoDC'lerin nabzını tutmak için kullanıldı.

Antijen atımlı MoDC'lerin ve lenfosit ko-kültürünün akım sitometri analizi, Ki-67, CD25, CD4 ve CD8 belirteçlerinin ekspresyonu yoluyla T lenfosit proliferasyonunun uyarıldığını ortaya koydu. IFN-γ ve Ki-67'nin mRNA ekspresyonunun kantitatif PCR kullanılarak analizi, MoDC'lerin bu in vitro ko-kültür sisteminde lenfositlerin antijene özgü astarlanmasını indükleyebileceğini göstermiştir. Ayrıca, ELISA kullanılarak değerlendirilen IFN-γ sekresyonu, kuduz aşısı darbeli MoDC-lenfosit ko-kültüründe, antijen darbeli olmayan MoDC-lenfosit ko-kültürüne göre anlamlı derecede daha yüksek bir titre (**p < 0.01) göstermiştir. Bu sonuçlar, aşı immünojenitesini ölçmek için bu in vitro MoDC testinin geçerliliğini göstermektedir, yani bu tahlil, in vivo denemelere devam etmeden önce sığırlar için potansiyel aşı adaylarını tanımlamak ve ticari aşıların aşı immünojenisite değerlendirmelerinde kullanılabilir.

Introduction

Veteriner aşılaması, hayvancılık sektörünü küresel olarak etkileyen hastalıklara karşı koruma sağlayarak gıda güvenliğinin ve hayvan refahının iyileştirilmesine katkıda bulunduğundan, hayvancılık ve sağlığın çok önemli bir yönünü temsil etmektedir1. Olası aşı adaylarının immünojenisitesini değerlendirmek için etkili bir in vitro yöntem, aşı geliştirme ve üretim sürecini hızlandırmaya yardımcı olacaktır. Bu nedenle, immün tahliller alanını in vitro çalışmalara dayanan yenilikçi metodolojilerle genişletmek gereklidir, çünkü bu, bağışıklama ve patojen enfeksiyonu ile ilgili bağışıklık süreçlerinin karmaşıklığını ortaya çıkarmaya yardımcı olacaktır. Şu anda, periyodik örnekleme gerektiren in vivo hayvan bağışıklaması ve meydan okuma çalışmaları (örneğin, kan ve dalak), aday aşıların ve adjuvanların immünojenisitesini ölçmek için kullanılmaktadır. Bu tahliller pahalı, zaman alıcı ve etik etkileri vardır, çünkü çoğu durumda hayvan ötenazisi denemelerin sonunda gerçekleştirilir.

İn vivo testlere alternatif olarak, in vitro2'de aşı kaynaklı immün yanıtları değerlendirmek için periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler) kullanılmıştır. PBMC'ler %70-90 lenfositler, %10-20 monositler ve sınırlı sayıda dendritik hücreden (DC'ler, %1-%2)3 oluşan heterojen bir hücre popülasyonudur. PBMC'ler, B hücreleri, monositler ve DC'ler gibi antijen sunan hücreleri (APC'ler) barındırır ve bunlar enfeksiyon veya doku hasarı belirtileri arayan organizmada sürekli devriye gezer. Lokal olarak salgılanan kemokinler, hücre yüzey reseptörlerine bağlanarak APC'lerin bu bölgelere alınmasını ve aktivasyonunu kolaylaştırır. Monositler söz konusu olduğunda, kemokinler kaderlerini DC'lere veya makrofajlara farklılaşmayayönlendirir 4. DC'ler bir patojenle karşılaşıp yakaladıkları anda, sekonder lenfoid organlara göç ederler, burada işlenmiş patojen peptid antijenlerini majör histokompatibilite kompleksi (MHC) sınıf I veya sınıf II yüzey proteinlerini kullanarak sırasıyla CD8 + T hücrelerine veya CD4 + T hücrelerine sunabilirler, böylece bir bağışıklık tepkisini tetiklerler 5,6.

DC'lerin çeşitli patojenlere karşı koruyucu bir bağışıklık tepkisi düzenlemede oynadığı kilit rol, özellikle enfeksiyöz ajanlara karşı aşılar ve adjuvanlar tasarlarken, onları hücre içi bağışıklık mekanizmalarını anlamak için ilginç bir araştırma hedefi haline getirmektedir7. PBMC'lerden elde edilebilecek DC'lerin fraksiyonu oldukça küçük olduğundan (% 1 -% 2), bunun yerine in vitro8'de DC'ler üretmek için monositler kullanılmıştır. Bu monosit türevi DC'ler (MoDC'ler) başlangıçta kanser immünoterapisinde olası bir tedavi stratejisi olarak geliştirilmiştir9. Daha yakın zamanlarda, MoDC'ler aşı araştırmaları için kullanılmıştır10,11,12 ve klasik monositler MoDC üretimi için baskın alt tiptir (% 89) 13. MoDC'lerin in vitro üretimi daha önce interlökin-4 (IL-4), tümör nekroz faktörü α (TNF-α) veya IL-1314,15,16 gibi diğer sitokinlerle kombinasyon halinde verilen granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktörün (GM-CSF) eklenmesiyle sağlanmıştır.

Bir in vitro MoDC testinin başarısı, antijenle uyarılmış olgun MoDC'lerin, tespit edilen antijen tipine özgü immün yanıtın kapsamını ve tipini modüle etme kapasitesine dayanır17. MoDC'ler tarafından tanınan ve sunulan patojen tipi, CD4 + T yardımcı (Th) hücrelerinin Th1, Th2 veya Th17 efektör hücrelerine farklılaşmasını belirler ve patojene özgü bir sekretuar sitokin profili ile karakterize edilir. Hücre içi patojenlere karşı bir Th1 yanıtı ortaya çıkar ve fagositik bağımlı korumayı modüle eden interferon-gama (IFN-γ) ve tümör nekroz faktörü beta'nın (TNF-β) salgılanmasıyla sonuçlanır. Paraziter organizmalara karşı bir Th2 yanıtı tetiklenir ve fagositik bağımsız humoral korumayı başlatan IL-4, IL-5, IL-10 ve IL-13 sekresyonu ile karakterizedir. Th17, IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 ve TNF-18,19,20,21 salgılanmasının aracılık ettiği hücre dışı bakteriyel ve fungal enfeksiyonlara karşı nötrofil bağımlı koruma sağlar α. Önceki çalışmalara dayanarak, tüm patojenlerin beklenen sitokin profiline girmediği belirtilmiştir. Örneğin, dermal MoDC'ler, Leishmania paraziter enfeksiyonuna yanıt olarak, CD4 + T hücrelerinden ve CD8 + T hücrelerinden IFN-γ sekresyonunu uyarır, böylece koruyucu bir proinflamatuar Th1 yanıtını indükler22.

Ayrıca, Salmonella lipopolisakkarit (LPS) ile astarlanmış tavuk MoDC'lerinde, hem Th1 hem de Th2 yanıtlarını aktive ederek Salmonella typhimurium'a karşı değişken bir yanıt indükleyebileceği, oysa Salmonella gallinarum'un tek başına bir Th2 yanıtını indüklediği gösterilmiştir, bu da ikincisinin MoDC klirensi23'e karşı daha yüksek direncini açıklayabilir. MoDC'lerin Brucella canis'e (B. canis) karşı aktivasyonu hem köpek hem de insan MoDC'lerinde de bildirilmiştir, yani bu zoonotik bir enfeksiyon mekanizmasını temsil edebilir24. B. canis ile astarlanan insan MoDC'leri, şiddetli enfeksiyona direnç kazandıran güçlü bir Th1 yanıtını indüklerken, köpek MoDC'leri, azaltılmış bir Th1 yanıtı ile baskın bir Th17 yanıtını indükler ve daha sonra kronik enfeksiyonun kurulmasına yol açar25. Sığır MoDC'leri, immünoglobulin G (IgG) ile konjuge edilmiş ayak ve ağız hastalığı virüsü (FMDV) için, tek başına konjuge olmayan FMDV'ye kıyasla gelişmiş bir afinite gösterir, çünkü MoDC'ler önceki10'a yanıt olarak bir viral-antikor kompleksi oluşturur. Birlikte ele alındığında, bu çalışmalar MoDC'lerin patojen enfeksiyonu sırasında bağışıklık tepkilerinin karmaşıklığını analiz etmek için nasıl kullanıldığını göstermektedir. Adaptif immün yanıtlar, lenfosit proliferasyonu ile ilişkili spesifik belirteçlerin nicelleştirilmesi ile değerlendirilebilir. Sadece bölünen hücrelerde tespit edilen hücre içi bir protein olan Ki-67, proliferasyon çalışmaları için güvenilir bir belirteç olarak kabul edilir 26 ve benzer şekilde, aktivasyonun geç fazı sırasında T hücrelerinin yüzeyinde eksprese edilen CD25, lenfosit proliferasyonunakarşılık gelir 27,28.

Bu çalışma, sığır MoDC'lerinin in vitro jenerasyonu için standartlaştırılmış bir yöntem ve ardından aşıların immünojenisitesini test etmek için kullanılan in vitro immün tahlilde uygulanmasını göstermektedir. Bu tahlilin etkinliğini doğrulamak için ticari olarak temin edilebilen bir kuduz aşısı (RV) kullanılmıştır. T lenfosit aktivasyonu ve proliferasyonu, Ki-67 ve CD25 gibi iyi bilinen hücre aktivasyon belirteçlerinin analizi ve IFN-γ28,29,30,31 sekresyonu yoluyla akım sitometrisi, gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) ve enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) ile ölçüldü. MoDC testi sırasında hiçbir hayvan veya insan deney denemesi yapılmaz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Kan alımı, Avusturya Sağlık ve Gıda Güvenliği Ajansı'nın (AGES) etik kurallarına ve kabul edilen hayvan refahı standartlarına uygun olarak sertifikalı bir veteriner servisi tarafından gerçekleştirilir32. Çalışma Avusturya Tarım Bakanlığı'ndan etik onay aldı. MoDC'lerin üretimi için deneysel tasarım ve sonraki uygulamaları Şekil 1'de gösterilmiştir.

1. Naif MoDC'lerin üretimi

NOT: Heparinize vakuminerlerle juguler ven ponksiyonu ile patojensiz tek bir buzağıdan tam kan örnekleri alındı (bu çalışma için sekiz adet 9 mL kan tüpü kullanıldı). Kanı bir buz kutusunda taşıyın. Numuneleri daha sonra kullanmak üzere 2-4 ° C'de saklayın veya hemen işleyin. Kanın pıhtılaşmasını önlemek için kanın dönmesini sağlayın. Vakumerleri% 70 etanol ile sterilize edin. Aşağıdaki deneylerin tümü bir biyolojik örnek ve altı teknik kopya ile gerçekleştirilmiştir.

  1. PBMC'leri heparinize kandan izole etmek için yoğunluk gradyanı santrifüjleme
    1. Kanı 10x ters çevirerek iyice karıştırın.
    2. 10 mL'lik bir pipet kullanarak, 20 mL heparinize kanı steril 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile seyreltin.
    3. Steril 50 mL'lik bir tüpe 15 mL lenfosit izolasyon ortamı pipet.
      NOT: Pipetlemeden önce lenfosit izole edici ortamın oda sıcaklığına ulaşmasına izin verin.
    4. Lenfosit izolasyon ortamını içeren 50 mL'lik tüpü 45° konuma kadar eğin. 25 mL'lik bir pipetin ucunu dik olarak doğrultun ve 30 mL'lik kan-PBS'yi lenfosit izolasyon ortamının üzerine, ikisini karıştırmadan dikkatlice katmanlayın. Çok yavaşça, 50 mL'lik tüpü dikey konuma geri getirin.
    5. 20 °C'de 35 dakika boyunca 800 × g'da santrifüj, maksimum hızlanma ile ve frenleme olmadan (yavaşlama fonksiyonu kapalı).
    6. PBMC katmanını (ilk plazma katmanından hemen sonraki ince beyaz tabaka) toplamak ve yeni bir 50 mL tüpe aktarmak için bir Pasteur pipeti kullanın.
      NOT: Yoğunluk gradyanı santrifüjleme, tam kanı farklı katmanlara ayırır. Sonuç olarak, eritrositler bir pelet olarak tabana yerleşir, mononükleer hücreler (PBMC'ler) arayüz tabakasına yerleşir ve plazma üst tabakayı oluşturur. Granülositler pelet ve PBMC tabakası arasında bulunur.
    7. Hasat edilen PBMC'leri 40 mL'lik bir hacme kadar PBS ekleyerek ve yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırarak 2 kat yıkayın. Daha sonra, maksimum hızlanma ve maksimum yavaşlama ile 7 dakika boyunca 4 ° C'de 500 × g'da santrifüj.
    8. Süpernatantı dekantasyonla atın, peleti 15 mL 1x amonyum-klorür-potasyum (ACK) tamponunda tekrar askıya alın ve oda sıcaklığında 10-15 dakika inkübe edin.
      NOT: 15 dakikadan fazla inkübe etmeyin. Ticari olarak temin edilebilen ACK tamponu, PBMC fraksiyonunda bulunan artık kırmızı kan hücrelerinin (RBC'ler) parçalanmasını sağlamak için kullanılır.
    9. 40 mL'lik bir hacme kadar PBS ekleyin ve ardından maksimum hızlanma ve yavaşlama ile 7 dakika boyunca 500 × g ve 4 ° C'de santrifüj yapın.
    10. Süpernatantı boşaltarak atın ve adım 1.1.9'u tekrarlayın.
    11. Süpernatanı atın ve peleti 10 mL tam kültür ortamında (oda sıcaklığında) tekrar askıya alın.
      NOT: Tüm kültür ortamı,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş RPMI 1640 hücre kültürü ortamından oluşur.
  2. CD14+/− hücrelerinin PBMC popülasyonundan CD14-konjuge manyetik boncuklar kullanılarak manyetik olarak ayrılması
    1. 10 μL tripan mavisi (% 0.4) çözeltisi ile karıştırılmış 10 μL hücre süspansiyonu kullanarak temiz bir hemositometre hücre sayacı ile hücreleri sayın.
      NOT: Tripan mavisi boya toksik bir kimyasal ve potansiyel kanserojendir. Temastan kaçınmak için kişisel koruyucu ekipman (KKD) giyilirken kullanılmalı ve atıklar hava geçirmez özel bir toksik atık kabına atılmalıdır. Ölü hücreler mavi görünürken, canlı hücreler mikroskop altında net görünecektir.
    2. 500 × g'da 7 dakika boyunca santrifüj.
    3. Bir pipet kullanarak süpernatantı atın ve her 1 × 107 hücre için 40 μL'lik bir hacim kullanarak peleti floresanla aktive edilmiş hücre sıralama tamponunda (FACS) yeniden askıya alın. Bir pipet kullanarak iyice karıştırın.
      NOT: FACS tamponu, PBS'de çözünmüş %2 FBS ve 2 mM etilendiamintetraasetik asitten (EDTA) oluşur.
    4. 1 ×10 7 hücre başına 5 μL CD14 mikroboncuk tamponu ekleyin ve bir pipet kullanarak iyice karıştırın.
    5. Sığır CD14 + monositlerinin pozitif seçimi için 4-8 ° C'de 30 dakika inkübe edin33. Kuluçka döneminde her 15 dakikada bir vorteks.
    6. İsteğe bağlı adım (akış sitometri analizi için): 10 μL CD14-FITC (floresein izotiyosiyanat) boyama antikoru ekleyin ve ardından 4-8 ° C'de 15 dakika boyunca inkübasyon yapın. Ayrıntılar için adım 5'teki akış sitometrisi analizine bakın.
    7. 1 mL FACS tamponu ekleyin ve 500 × g'da 7 dakika boyunca santrifüj yapın.
    8. Süpernatanı atın ve peleti 1 × 108 hücre başına 500 μL FACS tamponunda yeniden askıya alın.
    9. İmmünomanyetik hücre ayırma kolonunu separatöre (manyetik kolon tutucu) yerleştirin ve akışı toplamak için kolon çıkışının altına 15 mL'lik bir toplama tüpü yerleştirin.
    10. Kolonu 1 mL gazdan arındırılmış FACS tamponu ile yıkayın. Durulamadan sonra, kullanılmış 15 mL tüpü yenisiyle değiştirin.
    11. Bir seferde 500 μL tamponda 1 × 10 8 hücreye pipetleme yaparak hücre süspansiyonunun (adım 1.2.8'den itibaren) kolondan geçmesine izin verin.
      NOT: Kolondan geçmesine izin vermeden önce hücreleri karıştırırken hava kabarcıkları oluşturmamaya dikkat edin.
    12. Kolonu her seferinde 3 mL gazdan arındırılmış FACS tamponu ile 3 kat durulayın.
    13. Akışı toplayın ve bu ilk salınımlı fraksiyonu CD14− hücre fraksiyonu olarak etiketleyin (PBMC'ler eksi CD14+ monositler); Bu aynı zamanda naif lenfosit fraksiyonu olarak da adlandırılır.
      NOT: CD14 hücreleri , antijen darbeli MoDC'ler üretilene kadar tam kültür ortamında tutulur.
    14. Sütunu ayırıcıdan çıkarın.
    15. Atık suyun toplanması için kolonun altına yeni bir steril 15 mL tüp yerleştirin.
    16. Pipet, 5 mL FACS tamponunu kolona yerleştirin ve bir piston kullanarak hemen itin.
    17. Akışı toplayın ve bu ikinci salınımlı fraksiyonu CD14+ hücre fraksiyonu olarak etiketleyin; Buna naif monosit fraksiyonu da denir.
    18. 1 × 106 hücre / mL'ye ulaşmak için toplanan CD14 + monositlere tam kültür ortamı ekleyin.
      NOT: İstenilen hücre sayısına ulaşmak için gereken tam kültür ortamının hacmini tahmin etmek için elütlü CD14+ hücre fraksiyonundaki canlı hücreleri sayın.
    19. Steril bir 24 delikli plaka alın ve her bir kuyucuğa 1 mL hücre süspansiyonu (1 × 106 hücre / mL) ekleyin.
  3. CD14+ naif monositlerin %3 w/v sitokin kokteyli (GM-CSF + IL-4) ilavesi ile naif MoDC'lere farklılaştırılması ve toplam 5 günlük inkübasyon
    1. CD14+ monosit içeren her bir kuyucuğu, kit içinde verilen 40 μL (%3 w/v) sitokin kokteyli ile takviye edin.
    2. Plakayı% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir inkübatörde ve 48 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    3. 2. günde, pipet kullanarak her bir kuyucuğun içeriğinin yarısını (500 μL) ayrı ayrı 1,5 mL tüplere aktarın ve 7 dakika boyunca 4 ° C'de 500 × g'da santrifüj yapın.
    4. Süpernatanı atın ve peleti 500 μL taze tam kültür ortamında yeniden askıya alın.
    5. Bu hücre süspansiyonunun 500 μL'sini adım 1.3.4'ten belirlenen her bir kuyucuğa geri aktarın, böylece son hacim 1 mL olur.
    6. Her bir kuyucuğu 20 μL sitokin kokteyli ile zenginleştirin.
    7. Kültürü% 5 CO2 ile ve 37 ° C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde 72 saat boyunca inkübe edin.
    8. 5. günde inkübasyondan sonra, plakayı inkübatörden çıkarın.
      NOT: Her kuyucuk, naif MoDC'lerin hücre süspansiyonunun 1 mL'sini içerecektir. MoDC'lerin sayısı, kaplanan orijinal monositlerin bir yüzdesi (~% 20) olacaktır (1 × 106 / mL).

2. MoDC endositik aktivite testi

NOT: Antijen alım testi veya endositik aktivite testi, naif MoDC'lerin yabancı maddeleri içselleştirme yeteneğini ölçer. Tahlil, daha önce tarif edildiği gibi,% 3 w / v sitokin kokteyli ve 5 günlük inkübasyon ile kültürlenmiş naif MoDC'leri kullanarak test yapın34.

  1. Naif MoDC hücre süspansiyonunu 24 delikli plakadan toplayın ve 15 mL'lik bir tüpe aktarın; ayrıca kuyucukları PBS ile durulayarak artık hücreleri de toplayın.
  2. 7 dakika boyunca 500 × g santrifüj. Süpernatanı atın ve peleti% 1 FBS ile desteklenmiş 1 mL kültür ortamında yeniden askıya alın.
  3. İstenilen hücre sayısına ulaşmak için gereken ortamın hacmini tahmin etmek için canlı MoDC hücrelerini sayın (2 × 105 hücre / mL).
  4. Kültür, 2 × 105 hücre/mL nihai hücre konsantrasyonuna sahip 24 delikli bir plakada 100 μL tam kültür ortamındaki naif MoDC'ler.
  5. Her bir kuyucuğu 1 mg / mL FITC-konjuge dekstran (endositoz izleyici olarak kullanılan floresan prob) ile destekleyin.
    NOT: FITC-dekstran bir floresan probu gibi davranır ve endositoz izleyici olarak kullanılır.
  6. Plakayı örtün ve karanlıkta 60 dakika boyunca% 5 CO2 ve 37 ° C'de inkübe edin.
    NOT: Arka plan kontrolü için, ilave MoDC hücrelerini (2 × 105 hücre / mL) buz üzerinde 1 mg / mL FITC-dekstran ile inkübe edin, çünkü bu tür bir inkübasyon, izleyici molekülün (FITC-dekstran) hücrelere girmesini önler.
  7. Kuluçkadan sonra, FITC-dekstranın endositozunu durdurmak için 24 kuyucuklu plakayı hemen buz üzerine aktarın.
  8. Hücreleri buz gibi soğuk FACS tamponu ile yıkayın.
  9. Peletleri toplayın, santrifüj edin ve 500 μL FACS tamponunda yeniden askıya alın.
  10. Akış sitometrisini kullanarak hücreler içindeki FITC-dekstranın floresan yoğunluğunu analiz edin. Ayrıntılar için adım 5.2'deki akış sitometrisi analizine bakın.

3. Antijen darbeli MoDC'lerin üretimi

NOT: Kuduz virüsüne (RV) karşı ticari olarak temin edilebilen ve klinik olarak onaylanmış bir aşı, naif MoDC'lerin olgun antijen sunan MoDC'lere farklılaşmasını indükleyebilir. Antijen darbeli MoDC'ler üretmek için tek bir RV aşılama dozunun% 0.1'ini (~ 1 μL) kullanın. Ayrıca, naif MoDC'ler üretmek için kullanılan aynı kültür plakasında (adım 1.3.8'de) RV darbeli MoDC'lerin üretilmesi tercih edilir, çünkü naif MoDC'lerin yeni bir 24 delikli plakaya aktarılması onları olumsuz yönde etkileyecektir.

  1. Adım 1.3.8'den itibaren) 24 delikli plakada 1 mL naif MoDC kültürüne 1 μL/mL RV süspansiyonu ekleyin ve %5 CO2 ve 37 °C'de 48 saat inkübe edin.
    NOT: RV stimülasyonu olmadan kültürlenen Naif MoDC'ler arka plan kontrolü olarak kullanılır (ve sonraki adımlarda lenfositlerle ko-kültür için spesifik olmayan stimülasyon olarak).
  2. İnkübasyondan sonra, 7. günde, antijen darbeli MoDC'leri içeren 24 delikli plakayı 10 dakika boyunca buz üzerinde tutun.
  3. Kuyu başına 1 mL buz gibi soğuk PBS ekleyin. Pipetleme ile her bir kuyucuğu iyice karıştırın ve süspansiyonu 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
  4. Her bir kuyucukta kalan artık hücreleri toplamak için kuyucukları 2 mL buz gibi soğuk PBS ile yıkayın.
  5. İçeriği ilgili tüplerine aktarın ve hücre süspansiyonunu 7 dakika boyunca 500 × g'da santrifüj edin.
  6. Süpernatanı atın, hücre peletini (antijen darbeli MoDC'ler) tam kültür ortamında yeniden askıya alın ve hacmi 1 × 105 hücre / mL'lik bir nihai hücre konsantrasyonuna ayarlayın.
    NOT: İstenen hücre sayısına ulaşmak için gereken ortam hacmini tahmin etmek için canlı hücreleri sayın. MoDC-lenfosit ko-kültür sistemi için 7. günden itibaren RV darbeli MoDC'leri kullanın.

4. MoDC-lenfosit ko-kültürü

NOT: İn vitro MoDC-lenfosit ko-kültür sistemi, MoDC'lerin asal antijene özgü lenfositlere yeteneğini belirler. 16 günlük ko-kültürden sonra hücrelerin farklı tedavi grupları spesifik, spesifik olmayan ve kontrolü içerir. Spesifik grup, RV darbeli MoDC'lerle birlikte kültürlenmiş lenfositler olarak tanımlanır; spesifik olmayan grup, antijen darbeli olmayan MoDC'lerle birlikte kültürlenmiş lenfositler olarak tanımlanır; kontrol grubu ise MoDC'ler olmadan kültüre alınan lenfositler olarak tanımlanmaktadır.

  1. 2 × 106 hücre / mL'lik bir hücre konsantrasyonuna ulaşmak için salınımlı naif lenfosit fraksiyonuna (CD14-hücreler) tam kültür ortamı ekleyin.
    NOT: İstenilen hücre sayısına ulaşmak için gereken ortamın hacmini tahmin etmek için toplandıklarından beri 24 delikli bir plakada tam kültür ortamında tutulan CD14 hücre kültüründeki canlı hücreleri sayın.
  2. 7. günde, steril bir 24 delikli plaka alın ve kuyucukları 1 mL naif lenfosit hücre süspansiyonu (2 × 106 hücre / mL) artı 1 mL antijen darbeli veya antijen darbeli olmayan MoDC süspansiyonu (1 × 105 hücre / mL) ile tohumlayın.
    NOT: Her kuyucuktaki toplam hacim, kuyu başına lenfositlere 1:20 MoDC oranı ile 2 mL olacaktır.
  3. Plakayı 37 ° C'de 48 saat ve% 5 CO2'de inkübe edin.
  4. Antijen darbeli MoDC'lerle kültür zenginleştirme ve yeniden uyarılma
    1. Antijen darbeli MoDC-lenfosit ko-kültürünün inkübasyonundan sonra, 9. günde, her bir kuyucuğu 20 ng / mL rekombinant IL-2 ile destekleyin ve 120 saat daha (5 günlük inkübasyon) inkübe etmeye devam edin.
    2. 14. günde, 1 mL ko-kültürü steril bir 1.5 mL tüpe aktarın ve 7 dakika boyunca 500 × g'da santrifüj.
    3. Süpernatanı atın ve hücre peletini 1 mL antijen darbeli veya darbesiz MoDC'lerle (1 × 105 hücre / mL) yeniden askıya alın. Pipetleme ile nazikçe karıştırın ve hücre süspansiyonlarını belirlenen kuyucuklarına geri aktarın.
      NOT: Bu adımda, her bir kuyucuktaki toplam hacim 2 mL'dir.
    4. 48 saat boyunca% 5 CO2 ve 37 ° C'de inkübasyona devam edin. 16. günde inkübasyondan sonra, ko-kültür akış sitometrisi, qPCR ve ELISA kullanılarak analiz için hazırdır.
      NOT: MoDC-lenfosit ko-kültürünün her bir kuyucuğundaki her 2 mL için, akış sitometrisi için 1 mL yeniden askıya alınmış hücre, RNA ekstraksiyonu için 1 mL kullanılır ve her ikisinden de süpernatantlar ELISA için kullanılır.

5. Akış sitometrik analizi

NOT: Numuneleri bir akış sitometresinde çalıştırmadan önce hücreleri uygun belirteçler/mAb ile lekeleyin. Akış sitometrisi analizi için kullanılan reaktifler (boyama mAb ve izotip kontrolleri), kit, cihaz ve yazılım hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.

  1. Akış sitometresi boyama protokolü
    NOT: Anti-CD14 mAb kullanarak PBMC'ler ve naif lenfositler ve monositler için hücre yüzeyi boyama işlemi gerçekleştirin (adım 1.2.6). Naif MoDC'lerin hücre yüzeyi boyaması için, anti-CD86'ya özgü, anti-CD40'a özgü ve anti-MHC II'ye özgü mAb kullanın. 16. gün ko-kültürlerinden hücrelerin hücre yüzeyi boyaması için, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD25 mAbs kullanın; hücre içi boyama için anti-Ki-67 mAb kullanın. Ayrıca, hücreleri negatif izotip kontrolü mAb ile veya mAb olmadan (FMO: floresan eksi bir) boyayın. Yüzey ve hücre içi belirteçler için boyama yaparken temel fark, hücre yüzey belirteçleri için, hücrelerin canlı / ölü (L / D) boyama veya diğer işlemlerden önce spesifik yüzey mAb ile boyanması gerektiğidir. Bununla birlikte, hücre içi boyama, L / D boyamadan sonra gerçekleştirilir ve hücre içi penetrasyona izin vermek için bir fiksasyon artı geçirgenlik adımı gerektirir.
    1. Bir pipet kullanarak 1 mL hücre süspansiyonunu steril 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın ve 500 × g'da 10 dakika boyunca santrifüjleyin.
      NOT: Santrifüjlemeden sonra, MoDC-lenfosit ko-kültüründen hücreleri işlerken, süpernatantı ELISA analizi için saklayın.
    2. Peletleri 1 mL PBS'de tekrar askıya alın ve 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Artık hücreleri 1 mL PBS kullanarak toplayın ve bunu yeniden askıya alınmış pelet ile birleştirin.
    3. Hücreleri içeren 15 mL'lik tüpe 10 mL PBS ekleyin, pipetleme ile karıştırın ve 850 x g'de 7 dakika boyunca santrifüj yapın.
    4. Supernatan'ı atın ve adım 5.1.3'ü tekrarlayın.
    5. Süpernatanı atın ve hücre peletini, süpernatanı boşalttıktan sonra kalan artık süspansiyonla (yaklaşık 180 μL) dikkatlice askıya alın.
    6. Hücre süspansiyonunu v tabanlı 96 delikli bir plakaya aktarın ve dökülmeyi önlemek için kuyucukları kapatın.
    7. Plakayı 5 dakika boyunca 1.400 × g'da santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, sıvı kuyularını boşaltmak için plakayı bir atık kabının üzerine kaydırın ve fazla sıvının uzaklaştırılmasını sağlamak için plakayı emici kağıda dokunun.
    8. Kuyucuk başına 25 μL yüzey boyama ana karışımı ekleyin ve bir pipet kullanarak yavaşça karıştırın, ardından 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübasyona tabi tutun.
      NOT: Tek bir kuyucuk için yüzey boyama ana karışımını hazırlamak için, 20 μL FACS tamponuna 2,5 μL yüzey mAb ekleyin.
    9. Kuyucuk başına 200 μL FACS tamponu ekleyin ve 5 dakika boyunca 1.400 × g'da santrifüj yapın. Santrifüjlemeden sonra, sıvı kuyucuklarını boşaltarak boşaltın ve fazla sıvıyı çıkarmak için plakayı emici kağıda dokunun.
    10. Kuyucuk başına 100 μL L/D boyama çözeltisi ekleyin. Bir pipet kullanarak iyice karıştırın, ardından karanlıkta 15 dakika boyunca 4 ° C'de inkübasyona tabi tutun.
      NOT: Tek bir kuyucuk için, 0,25 μL L/D boyayı 100 μL FACS tamponunda çözün. L / D boyası, canlı ve ölü hücreler arasında ayrım yapmaya yardımcı olur.
    11. 100 μL FACS tamponu ekleyin. Kuyucukları kapakla örtün ve plakayı 5 dakika boyunca 1.400 × g santrifüj edin. Süpernatantı boşaltarak atın ve plakayı emici kağıda dokunun.
    12. 5.1.11 adımını yineleyin.
    13. Kuyucuk başına 50 μL sabitleme çözeltisi ekleyin (kit ile birlikte verilir) ve plakayı karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe etmeden önce bir pipetle karıştırın.
    14. Kitle birlikte verilen 1x geçirgenleştirme-yıkama tamponundan (PW) 150 μL ekleyin ve kuyucukları kapakla örtün.
      NOT: 10 mL 1x PW tamponu hazırlamak için, 1 mL 10x perm tamponunu 10 mLdH2O içinde seyreltin.
    15. Plakayı 1.400 × g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatantı boşaltarak atın ve plakayı emici kağıda dokunun.
    16. 200 μL 1x PW ekleyin, ardından 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.400 × g'da santrifüjleme yapın. Süpernatantı boşaltarak atın ve plakayı emici kağıda dokunun.
    17. Hücre içi boyama için, kuyucuk başına 25 μL hücre içi boyama ana karışımı (anti-insan Ki-67 mAb) ekleyin. İyice karıştırın ve plakayı 4 ° C'de 30 dakika boyunca veya karanlıkta buz üzerinde inkübe edin.
      NOT: Tek bir kuyucuk için hücre içi boyama ana karışımını hazırlamak için, 24 μL 1x PW'ye 1 μL Ki-67 mAb ekleyin. Hücre içi boyama belirteci sadece 16. gün ko-kültürden hücreleri işlerken kullanılır. PBMC'ler, naif lenfositler, monositler ve naif MoDC'ler işlenirken hücre içi boyama yapılmaz.
    18. Kuluçkadan sonra, her bir kuyucuğa 200 μL 1x PW ekleyin. Bir pipetle karıştırın ve 5 dakika boyunca 1.400 × g santrifüj yapın. Süpernatantı boşaltarak atın ve plakayı emici kağıda dokunun.
    19. 200 μL FACS tamponu ekleyin, ardından 5 dakika boyunca 1.400 × g'da santrifüjleme yapın. Süpernatantı boşaltarak atın ve plakayı emici kağıda dokunun.
    20. Hücre peletini 200 μL FACS tamponunda yeniden askıya alın ve her bir kuyucuğun içeriğini steril akış sitometre tüplerini ayırmak için aktarın. Artık hücreleri toplamak için kuyucuk başına 300 μL FACS tamponu kullanın. Hücreler artık akış sitometrisi analizi için hazırdır.
  2. Numuneyi bir akış sitometresinde çalıştırma
    NOT: Numuneler, üreticinin el kitabına göre bir akış sitometresinde (488 nm, 638 nm ve 405 nm lazerler kullanılarak) çalıştırılmıştır35. Protokolün ayrıntıları, sorun giderme ve özelleştirme için kılavuza bakın.
    1. Numuneleri okumadan önce ve okuduktan sonra rutin temizleme prosedürlerini uygulayın.
      NOT: Tüpleri cihaza yüklerken hiçbir pozisyonu atlamayın.
      1. Temizleme döngüsü için, akış temizleme reaktifi içeren ilk tüp ve dH2O içeren kalan üç tüp ile toplam dört tüp kullanın; her tüp 3 mL'ye sahip olacaktır. Temizleme çalışması sırasında, ileri saçılma (FSC) için 330 V'un altında tüp başına 100.000 olayı, yan saçılma (SSC) için 265 V'un altında yakalayarak yaklaşık 1 dakika boyunca orta akış hızına sahip veriler elde edin.
        NOT: Temizlik sırasında hiçbir döküntü veya hücresel olay bildirilmemelidir; Bu durumda, temizleme adımını yeniden gerçekleştirin. Numuneleri çalıştırmak için, verileri almadan önce tüm numunelerin homojen bir süspansiyonda olduğundan emin olun, çünkü bu doğru bir okuma sağlar.
    2. Sitometreyi bağlamak ve açmak için, başlık çubuğunun sol köşesinde bulunan Uygulama Düğmesine tıklayın. Uygulama açılır menüsünden, Sitometri seçeneğini seçin ve Aç seçeneğine tıklayın.
      NOT: Uygulama açılır menüsünden, Aç seçeneği kullanıcıların önceden programlanmış tahlillere göz atmasına izin verirken, Yeni Protokol seçeneği kullanıcıların yeni protokoller oluşturmasına izin verir.
    3. Başlangıçta negatif kontrol numunesini çok borulu tutucuya yükleyin. Yeni Protokol'ü seçin ve çalışma alanının/ekranın sol tarafındaki iş listesine bakın.
    4. İş listesinde, numunenin çok tüplü tutucudaki konumunu tanımlayın ve tanımlama için numuneye ve protokole bir ad verin.
    5. Çalışma alanının sol tarafında bulunan Donanım Panelinden dedektörler (FSC, SSC ve 10 floresan aralığı), fotoçarpanların voltajları (V) ve kazançları ve sinyalin alan-yükseklik-genişliği (AHW) gibi birden çok parametreyi ayarlayın ve seçin.
      NOT: Dedektörler için aşağıdaki ayarlar deney ve kullanılan cihaza göre seçilmiştir: FSC-AHW: AHW, V: 270, G: 5; SSC-AHW: A, V: 350, G: 10; FL1 (CD8/FITC Dekstran)-AHW: A, V: 400, G: 1; FL2 (CD25/PE)-AHW: A, V: 500, G: 1; FL6 (CD4/Alexa Fluor 647)-AHW: A, V: 700, G: 1; FL7 (Ki-67/Alexa Flor 700)-AHW: A, V: 625, G: 1; FL9 (L/D)-AHW: A, V: 425, G: 1.
    6. Başlık çubuğunun altında bulunan Enstrüman Edinme Kontrol Panelinden algılanmak istenen akış hızı (orta), Zaman (5 dakika) ve Olaylar (bkz. adım 5.2.8) seçeneklerini ayarlayın. Cihazın numuneyi çizmesine/çalıştırmasına izin vermek ve algılanan olayların gerçek zamanlı önizlemesini göstermek için Tekli Al seçeneğine tıklayın.
    7. Gerçek zamanlı önizlemeden, floresan eşiğini (voltaj ve kazanç) ve hücre boyutunu ayarlayarak sonunda herhangi bir hücresel enkazı hariç tutarken istenen hücre popülasyonunun etrafına kapılar çizin.
      NOT: FSC, hücreleri boyut bazında ayırt etmeye yardımcı olur, böylece kullanıcıların monositler ve lenfositler gibi bağışıklık sisteminin hücreleri arasında ayrım yapmalarını sağlar; monositler daha büyüktür ve lenfositlere kıyasla daha yüksek FSC yoğunluğu gösterir.
    8. Yaklaşık toplam 5.000 canlı MoDC, 50.000 canlı lenfosit ve 50.000 canlı monosit etkinliği elde edin.
    9. Tüm parametreler negatif kontrol örneğine göre ayarlandıktan sonra, Durdur'a tıklayın ve protokolü kaydedin.
    10. Şimdi tüm numuneleri çok borulu yükleyiciye yükleyin. İş listesindeki her bir örneği tanımlayın ve negatif kontrole göre ayarlanan parametreleri deneydeki tüm örneklere uygulayın. Denemedeki tüm örneklerin art arda çalıştırılmasına izin vermek için Al seçeneğine tıklayın.
    11. Tüm örneklerden elde edilen veriler alındıktan sonra, sıralı bi-parametrik ve mono-parametrik histogramların oluşturulmasına izin veren uygun bir veri analiz yazılımı kullanarak kaydedin ve okunabilir verilere dönüştürün.

6. Mesajcı RNA (mRNA) ekspresyon analizi

  1. RNA ekstraksiyonu
    NOT: Toplam RNA'yı antijen darbeli MoDC-lenfosit ko-kültüründen (spesifik), antijen darbeli olmayan MoDC-lenfosit ko-kültüründen (spesifik olmayan), MoDC'siz lenfosit kültüründen (kontrol) ve naif lenfositlerden (CD14-birlikte kültürlemeden önce izole edilen hücreler) ekstrakte edin. RNA ekstraksiyonu için, RNaz içermeyen su kullanarak etanol hazırlayın. Ekstraksiyon kiti ve reaktifleri hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.
    1. MoDC-lenfosit ko-kültür plakasından (~1 × 106 hücre/mL) 1 mL hücre süspansiyonunu pipet kullanarak steril 1,5 mL steril bir tüpe aktarın ve 500 × g'da 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
    2. Süpernatantı ELISA için saklayın. Hücre peletini 1 mL PBS'de yeniden askıya alın ve 15 mL'lik bir tüpe aktarın. 1 mL PBS kullanarak kalan hücreleri toplayın.
    3. 500 × g'da 10 dakika boyunca santrifüj.
      NOT: Tüm numuneler, kit içinde sağlanan lizis tamponu kullanılarak hücre lizisi yapılana kadar canlı hücreler olarak hassas bir şekilde ele alınmalıdır. Hücre ölümü, aşağı akış ölçümü için gerekli RNA şablonlarını hızlı bir şekilde hidrolize eden RNazları serbest bırakır. RLT tamponu, RNazları inhibe eden bir çözelti içindeki hücreleri lize eder.
    4. Her boş kuyucuğa 350 μL lizis tamponu ekleyin ve önceki adımlarda hasat edilmeyen yapışkan hücreleri lize etmek için 2-3 dakika inkübe edin.
    5. Adım 6.1.3'teki santrifüjleme tamamlandıktan sonra, süpernatanı atın ve hücre peletini adım 6.1.4'te eklenen 350 μL lizis tamponu ile birleştirin.
      NOT: Bu noktada, tüpleri -80 ° C'de saklamak veya RNA ekstraksiyonuna devam etmek mümkündür (aşağıdaki adımlar).
    6. Adım 6.1.5'te lizata 350 μL% 70 etanol pipet. Numune başına son hacim 700 μL'dir.
    7. Ekstraksiyon sütununu 2 mL'lik bir toplama tüpüne yerleştirin (kit ile birlikte verilir).
    8. Ekstraksiyon kolonu başına 700 μL numuneyi aktarın ve 15 s boyunca 10.000 × g'da santrifüj. Akış akışını toplama tüpüne atın ve tekrar döndürme sütununa yerleştirin.
    9. Ekstraksiyon sütununa 350 μL sıkı yıkama tamponu (kit içinde verilir) ekleyin ve 15 s boyunca 10.000 × g'dan fazla santrifüj yapın. Akışı atın.
    10. Ekstraksiyon kolonunun membranına numune başına 80 μL DNaz I inkübasyon karışımı ekleyin ve 20-30 ° C'de 15 dakika bekletin.
      NOT: Numune başına DNaz I inkübasyon karışımı hazırlamak için, 80 μL'lik son hacim için 70 μL DNaz tamponuna 10 μL DNaz I stok çözeltisi ekleyin. tüpü birkaç kez ters çevirerek iyice karıştırın, ardından santrifüjde kısa bir dönüş yapın.
    11. Ekstraksiyon kolonunu 350 μL sıkı yıkama tamponu ile yıkayın, ardından 15 dakika boyunca 10.000 × g'da santrifüjleme yapın. Santrifüjlemeden sonra toplama borusundaki akışı atın.
    12. Ekstraksiyon kolonunu her seferinde 500 μL hafif yıkama tamponu ile 2 kez ve santrifüjleme ile 10.000 × g'da 15 s ve ikinci kez 2 dakika boyunca yıkayın. Her santrifüjlemeden sonra akışı atın.
    13. Membranı kurutmak için kolonu 1 dakika boyunca maksimum hızda santrifüj edin ve toplama tüpünü atın.
    14. Ekstraksiyon sütununu yeni bir 1,5 mL toplama tüpüne yerleştirin.
    15. 50 μL RNaz içermeyen suyu kolon zarına pipet edin ve oda sıcaklığında 3-5 dakika inkübe edin.
      NOT: 100 ng'nin altındaki RNA konsantrasyonları için, elüsyon hacmini 30 μL'ye düşürün ve nihai ürünü konsantre etmek için ürünü ilk elüsyondan itibaren kullanarak ekstraksiyon kolonu membranını yeniden boşaltın.
    16. RNA'yı açığa çıkarmak için 1 dakika boyunca 10.000 × g'da santrifüj.
    17. 0.5-2 μL numune kullanarak 260 nm'de absorbansı tespit ederek RNA konsantrasyonunu ölçün. RNaz içermeyen su kullanarak nihai RNA konsantrasyonunu 0.1-1 μg / μL'ye ayarlayın.
    18. RNA alikotlarını daha sonra kullanmak üzere -80 ° C'de saklayın.
  2. Tamamlayıcı DNA sentezi
    1. Ekstrakte edilen şablon RNA'dan tamamlayıcı DNA'yı (cDNA), üreticinin kit ile birlikte verilen protokolüne göre sentezleyin (ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın).
      NOT: Reaktiflerin ve kullanılan hacimlerin bir özeti Tablo 1 ve Tablo 2'de gösterilmiştir. Tam bir protokol Ek Dosya 1'de ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
  3. Gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu
    1. qPCR için, cDNA örneklerini üçlü olarak çalıştırın. Ki-67 ve IFN-γ için sığır mRNA transkript seviyelerini, Tablo 3'te gösterildiği gibi, GAPDH genine referans olarak spesifik primer setleri kullanarak sayısallaştırın.
      NOT: Tam bir protokol Ek Dosya 1'de ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

7. Enzime bağlı immünosorbent testi

  1. IFN-γ'nin ELISA aracılığıyla nicelleştirilmesi için salgı proteinleri bakımından zengin toplanan kültür süpernatantlarını işleyin.
    NOT: Kit kullanımıyla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın. Tam bir protokol Ek Dosya 1'de ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

8. İstatistiksel analiz

  1. Verileri analiz edin ve ticari yazılım kullanarak deneysel tasarımın grafiksel illüstrasyonlarını yapın. Karşılaştırmalı analiz için eşlenmemiş parametrik olmayan bir test kullanın. 0,05 < P değerlerinin istatistiksel olarak anlamlı olduğunu düşünün.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu metodoloji, in vivo çalışmalar yapılmadan önce aday aşı antijenlerinin değerlendirilmesi için sığır MoDC'lerinin in vitro jenerasyonunu açıklamaktadır. Şekil 1, sığır MoDC üretiminin deneysel şemasını ve MoDC'lerin in vitro tahlil için uygulanmasını göstermektedir. Manyetik bazlı hücre sıralama tekniğini kullanarak, daha önce 50 mL sığır kanından izole edilen hasat edilen PBMC'lerden yaklaşık 26 milyon CD14 + miyosit toplamak mümkündü. CD14+ monosit içermeyen elüe hücre fraksiyonu lenfositler açısından zengindi ve naif CD4+ ve CD8+ T hücrelerinin (CD14-lenfosit hücre fraksiyonu) kaynağı olarak kullanıldı.

Naif monosit fraksiyonu, CD14 hücre boyama ve akım sitometrisinden sonra gözlendiği gibi, %98 CD14+ monosit hücrelerden oluşuyordu (Şekil 2A, B). Saflaştırılmış naif monosit hücreleri,% 3 sitokin kokteyli (GM-CSF ve IL-4) varlığında kültürlemeye tabi tutulduğunda, 5 günlük bir inkübasyon ile DC benzeri bir fenotipe farklılaşmıştır. 26 milyon CD14+ monositten oluşan bir başlangıç kültüründen, 5 günlük inkübasyondan sonra toplam yaklaşık 12 milyon MoDC elde edilebilir. Naif MoDC'ler, FITC-dekstranın akış sitometri analizi kullanılarak gözlemlendiği gibi, fonksiyonel olarak antijen alımı yeteneğine sahipti (Şekil 3). Ayrıca, naif MoDC'ler, DC benzeri fenotipi doğrulayan MHC sınıf II ve yardımcı uyarıcı CD86 ve CD40 hücre yüzey belirteçlerinin ekspresyonunu değerlendirerek fenotipik olarak karakterize edildi (Şekil 4).

Naif MoDC'lerin antijen darbeli stimülasyonu, 2 gün boyunca inaktive RV varlığında kültürlenerek sağlandı. Naif lenfositlerin (CD14-hücre fraksiyonu) aktivasyonu, daha sonra IL-2'nin takviyesi ile birlikte antijen darbeli MoDC-lenfosit ile birlikte kültürlenerek sağlandı. 9. günde MoDC-lenfosit ko-kültürü sırasında, RV darbeli MoDC'lerde, MoDC olgunlaşmasının bir özelliği olan dendrit uzantısını gösterdikleri için morfolojik bir değişiklik gözlendi (Şekil 5). 14. günde, lenfosit aktivasyonu, aynı hayvandan yeni üretilen RV darbeli MoDC'lerin eklenmesiyle ko-kültürü yeniden simüle ederek arttırıldı.

Pulse olmayan MoDC-lenfosit ko-kültürü ile karşılaştırıldığında, pulse MoDC-lenfosit ko-kültüründe 16. günde hem CD4 + hem de CD8 + T hücrelerinde Ki-67 ve CD25 aktivasyon belirteçlerinin upregülasyonu ile lenfosit proliferasyonunda anlamlı bir artış (p < 0.01) gösterilmiştir (Şekil 6). Olgun RV darbeli MoDC ko-kültürlerinden CD8 + T hücreleri, spesifik olmayan gruba kıyasla Ki-67'nin sekiz kat yukarı regülasyonu (p < 0.01) sergiledi (Şekil 7A). Aynı kokültürdeki CD4 + T hücreleri, Ki-67'de kontrollere kıyasla yedi kat artış (p < 0.01) göstermiştir (Şekil 7B). Bu, RV astarlı MoDC'lerin RV antijenini naif lenfositlere başarılı bir şekilde sunma ve daha sonra bunları canlı bir hayvanda olanlara benzer şekilde in vitro bir durumda aktive etme yeteneğini göstermektedir. Akış sitometrisi kullanarak hücreleri analiz etmenin yanı sıra, ko-kültürler ayrıca sırasıyla RNA transkripsiyonu (Ki-67 ve IFN-γ) ve hücre dışı sekresyon (IFN-γ) kullanılarak RV'ye özgü lenfosit aktivasyonunu ölçmek için qPCR ve ELISA'ya tabi tutuldu (Şekil 8). Bu ek tespit yöntemleri, akış sitometrisinin sonuçlarını daha da doğrulamak için doğrulayıcı testler olarak da kullanılabilir. qPCR ile gösterilen Ki-67 ve IFN-γ için RNA ekspresyonu ve ELISA tarafından gösterilen IFN-γ seviyeleri, spesifik olmayan tedavi grubuna kıyasla antijene özgü ko-kültürde lenfosit proliferasyonunu gösteren benzer artış paternleri göstermiştir. Bu nedenle, qPCR ve ELISA sonuçları akım sitometrisi sonuçları ile korelasyon göstermiştir. qPCR, GAPDH'yi kalibratör olarak kullanan tüm ortak kültürlerde IFN-γ ekspresyonunda %>30 artış ve Ki-67 ekspresyonunda %>5 artış göstermiştir (Şekil 8A, B). Salgılanan IFN-γ'nin anlamlı derecede yüksek konsantrasyonu (**p > 0.01), spesifik olmayan tedavi grubuna kıyasla RV-darbeli MoDC-lenfosit ko-kültüründen kültür süpernatantları kullanılarak ELISA ile ölçüldü (Şekil 8C).

Figure 1
Şekil 1: Sığır MoDC tabanlı in vitro tahlilin deneysel tasarımı. (A) Sığır PBMC'lerinden CD14+ monosit ve CD14− lenfosit hücre fraksiyonlarının toplanması ve hücre ayrıştırılması. Sığır kanı, PBMC'leri toplamak için yoğunluk gradyanı santrifüjleme ile işlenir, ardından immünomanyetik hücre ayırma sütunları kullanılarak manyetik bazlı hücre sıralama ve ardından takviyeli RPMI 1640 ortamında hasat edilen CD14+ naif monosit hücre fraksiyonunun kültürlenmesi yapılır. (B) 5 günlük inkübasyon ve MoDC-lenfosit ko-kültürü ile% 3 sitokin kokteyli (GM-CSF + IL-4) kullanılarak MoDC'lerin üretimi. 0. günde, monositler sitokin kokteyli varlığında kültürlenir ve farklılaşmayı indüklemek için 48 saat boyunca inkübe edilir. 2. günde, kültür aynı sitokin kokteyli ile yeniden uyarılır, ardından 72 saat boyunca inkübasyon yapılır ve bu da naif MoDC'lerin üretimine yol açar. 5. günde, aşı antijeni (kuduz aşısı) naif MoDC hücre kültürüne eklenir ve ardından 48 saatlik inkübasyon yapılır. 7. günde, antijen darbeli MoDC'lerin naif lenfositlerle (CD14-hücre fraksiyonu) birlikte kültürlenmesi gerçekleştirilir ve ardından inkübasyon yapılır. 9. günde, IL-2 ortak kültüre eklenir. 14. günde, aktive edilmiş / astarlanmış lenfositlerin zenginleştirilmesi / yeniden uyarılması, antijen darbeli MoDC'lerin eklenmesiyle gerçekleştirilir ve ardından 48 saat boyunca inkübasyon yapılır. Son olarak, 16. günde, lenfosit proliferasyon testi için hücreler ve kültür süpernatantı toplanır. Kısaltmalar: MODC'ler = sığır monosit türevi dendritik hücreler; PBMC'ler = periferik kan mononükleer hücreleri; GM-CSF = granülosit-makrofaj-koloni-uyarıcı faktör. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Anti-CD14-konjuge mikroboncuklar kullanılarak PBMC'lerden toplanan sığır CD14+ monositlerinin morfolojisi ve saflığı. (A) Mikroboncukları çıkarmak için tam kültür ortamında 37 °C'de 4 saat boyunca inkübe edilen, polilizin kaplı slaytlara sabitlenen ve modifiye Giemsa boyası ile boyanan sığır monositlerinin morfolojisi. Ölçek çubuğu = 50 μm. (B) Anti-CD14 antikoru (kırmızı) ve FITC-konjuge fare IgG1 izotip kontrol antikoru (yeşil) kullanılarak gözlenen% 98.6 saflık seviyesine sahip salınımlı CD14+ hücre fraksiyonunu gösteren akış sitometrisi histogramı. Kısaltmalar: PBMC'ler = periferik kan mononükleer hücreleri; FITC cont = floresein izotiyosiyanat kontrolü. Bu rakam Kangethe ve ark., 201811'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: İn vitro olarak üretilen sığır MoDC'lerinin endositik aktivitesi. İzleyici molekülün (FITC-dekstran) 5. gün naif MoDC'lere kadar alımını gösteren akış sitometri histogramı. MoDC'ler, izleyici molekülü (mavi) ile 60 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edilir ve arka plan kontrolü olarak kullanılan izleyici molekülü (gri) ile buz üzerinde inkübe edilen MoDC'ler. Kısaltmalar: MODC'ler = sığır monosit türevi dendritik hücreler; FITC = floresein izotiyosiyanat. Bu rakam Kangethe ve ark., 201811'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: İn vitro üretilen sığır MoDC'ye özgü hücre yüzey belirteçlerinin fenotiplemesi. MoDC'lerin (A) geçit stratejileri ve (B) gün 5 naif MoDC'ler için akış sitometri histogramları, aşağıdakiler de dahil olmak üzere üç farklı DC'ye özgü mAbs (mavi) ile boyanmıştır: koyun karşıtı MHC II mAb, sığır karşıtı CD86 mAb ve sığır karşıtı CD40 mAb. Hepsi karşılık gelen izotip kontrolleri (kırmızı) ile karşılaştırılmıştır. Kısaltmalar: DC = dendritik hücreler; MODC'ler = sığır monosit türevi DC'ler; MHC II = majör histokompatibilite kompleksi II. Bu rakam Kangethe ve ark., 201811'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: MoDC-lenfosit ko-kültürü sırasında in vitro üretilen MoDC'lerin olgunlaşma belirtileri. MoDC-lenfosit ko-kültürünün 9. gününde ters mikroskopi ile antijen darbeli MoDC'ler tarafından karakteristik genişletilmiş dendritik yapının gözlemlenmesi. (A) Birlikte kültürlenmiş lenfositlerin oldukça akıcı bir alanı içindeki olgun MoDC'ler. (B) Olgun MoDC'ler, ko-kültürde daha az lenfosit bulunan bir alanda kolayca ayırt edilebilir. Ölçek çubukları = 50 μm. Kısaltma: MODC'ler = sığır monosit türevi dendritik hücreler. Bu rakam Kangethe ve ark., 201811'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: MoDC-lenfosit ko-kültüründe lenfositler tarafından Ki-67 ve CD25 ekspresyonuna karşı nokta grafikleri için benimsenen sıralı geçit stratejisi. (A) 16. günden itibaren toplanan hücreler için tam geçit stratejisi MoDC-lenfosit ko-kültürü. (B) CD4 + kapılı lenfositlerden ve (C) CD8 + lenfositlerden Ki-67 ekspresyonu, FMO kontrolü (mAb olmadan) ve fare IgG1-k izotip kontrolü mAb ile karşılaştırıldığında. Kapılı (D) CD8+ ve (E) CD4+ lenfositler üzerindeki CD25 ekspresyonu, fare IgG1 izotipi kontrol mAb ile karşılaştırılmıştır. Tedavi grubu spesifik olarak RV darbeli MoDC'lerle birlikte kültürlenmiş lenfositleri temsil ederken, kontrol MoDC'lerin yokluğunda kültürlenen lenfositleri temsil eder. Kısaltmalar: MODC'ler = sığır monosit türevi dendritik hücreler; FMO = floresan eksi bir; RV = kuduz aşısı. Bu rakam Kangethe ve ark., 201811'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: Ki-67 ve CD25 ekspresyonunun CD4+ ve CD8+ lenfositleri ile antijen ile astarlandıktan sonra akım sitometri veri analizi. 16. günden itibaren Ki-67 ve CD25 ekspresyonu eş-kültür. Tedavi grubu (spesifik), RV darbeli MoDC'ler ile kültürlenen lenfositler olarak tanımlanır; spesifik olmayan grup, antijen darbeli olmayan MoDC'lerle kültürlenen lenfositlere karşılık gelir; kontrol grubu MoDC'ler olmadan kültürlenen lenfositlere karşılık gelir. Yatay çubuklar altı teknik kopyanın ortalamasını temsil eder. (A) Ki-67 belirtecinin CD8 T hücreleri ve (B) CD4 T hücreleri tarafından hücre içi ekspresyonu. (C) CD25 işaretleyicisinin CD8 T hücreleri ve (D) CD4 T hücreleri tarafından hücre yüzeyi ekspresyonu. Kısaltmalar: MODC'ler = sığır monosit türevi dendritik hücreler; RV = kuduz aşısı. Bu rakam Kangethe ve ark., 201811'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 8
Şekil 8: qPCR ve ELISA ile tespit edildiği gibi, kuduz virüsü antijeni ile astarlanmış MoDC'ler tarafından Th1 belirteci (IFN-γ ve Ki-67) aktivasyonu. Altı teknik kopya ile bir hayvandan alınan veriler. Yatay çubuklar ortalamayı temsil eder. Bir GAPDH referans geni ile normalleştirildikten sonra naif lenfositlere kıyasla kıvrım değişiklikleri olarak gösterilen üç PCR replikası. (A) IFN-γ ifadesi, (B) Ki-67 ifadesi. (C) ELISA tarafından tespit edildiği gibi, üç tedavi grubu arasında kültür süpernatantındaki IFN-γ sekresyonunun karşılaştırılması. Spesifik grup, RV darbeli MoDC'lerle kültürlenen lenfositler olarak tanımlanır; spesifik olmayan grup, antijen darbeli olmayan MoDC'lerle kültürlenen lenfositlere karşılık gelir; kontrol grubu MoDC'ler olmadan kültürlenen lenfositlere karşılık gelir. Kısaltmalar: MODC'ler = sığır monosit türevi dendritik hücreler; RV = kuduz aşısı. Bu rakam Kangethe ve ark., 201811'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Reaktif Son Konsantrasyon Reaksiyon başına hacim
dNTP Karışımı (10 mM) 1.000 μM 1 μL
Rastgele Hexamer Astarları (50 ng/μL) 25 μM 1 μL
RNA şablonu 0,1 – 1 μg/μL χ μL (gerektiği gibi)
RNAse Içermeyen su - χ μL (gerektiği gibi)
Son Reaksiyon Hacmi - 10 μL

Tablo 1: Ana karışım bileşimi (RNA primer karışımı).

Reaktif Son Konsantrasyon Reaksiyon başına hacim
RT arabelleği 10x 1 adet 2 μL
MgCl2 25 mM 5 mM 4 μL
DTT 0,1 M 10 mM 2 μL
RNAse inhibitörü 40 U/μL 2 U 1 μL

Tablo 2: 2x PCR reaksiyon karışımı. Kısaltmalar: RT = ters transkriptaz; DTT = ditiyotreitol.

Sitokin Tür Katılım Numarası Sıra Uzunluk Tm
IFN-γ Bos boğa burcu FJ263670 F- GTGGGCCTCTCTTCTCAGAA 234 80.5
R- GATCATCCACCGGAATTTGA
Ki-67 Bos boğa burcu XM_015460791.2 F-AAGATTCCAGCGCCCATTCA 148 86.5
R-TGAGGAACGAACACGACTGG
GAPDH Bos boğa burcu Sassu ve ark., 2020 F-CCTGGAGAAACCTGCCAAGT 214 85.5
R-GCCAAATTCATTGTCGTACCA

Tablo 3: Amplifikasyon için kullanılan astar setleri50.

Reaktif Son Konsantrasyon Reaksiyon başına hacim
Süper Karışım 1 adet 5 μL
İleri Astar (5 μM) 250/ 125 mil 1 μL
Ters Astarlar (5 μM) 250/ 125 mil 1 μL
cDNA 1:10 seyreltilmiş 1,25 inç 2 μL
Nükleaz İçermeyen Su - 1 μL
Son Reaksiyon Hacmi - 10 μL

Tablo 4: qPCR ana karışımı

Tüp No. Standart Konsantrasyonu Seri Seyreltme
1 50 ng/mL 50 μL standart + 350 μL yıkama tamponu
2 12,5 ng/mL Tüp 1 + 450 μL yıkama tamponundan 150 μL
3 6,25 ng/mL Tüp 2'den 250 μL + 250 μL yıkama tamponu
4 3,13 ng/mL Tüp 3'ten 250 μL + 250 μL yıkama tamponu
5 1,56 ng/mL Tüp 4 + 250 μL yıkama tamponundan 250 μL
6 0,78 ng/mL Tüp 5 + 250 μL yıkama tamponundan 250 μL
7 0,2 ng/mL Tüp 6 + 450 μL yıkama tamponundan 150 μL
8 0,1 ng/mL Tüpten 250 μL 7 + 250 μL yıkama tamponu
9 0,025 ng/mL Tüp 8 + 300 μL yıkama tamponundan 100 μL

Tablo 5: IFN-γ standart seyreltme serisi

Ek Dosya 1: Tamamlayıcı DNA, gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) ve enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) sentezi için protokoller. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S1: Antijen alım yeteneği, sitokin kokteylinin farklı konsantrasyonlarında ve 3 gün veya 5 günlük kültürle MoDC'ler. GM-CSF ve IL-4 içeren sitokin kokteylinin farklı konsantrasyonları (% 5 w / v ve% 3 w / v), yüksek performanslı antijen alımı MoDC'leri (izleyici molekül FITC-dekstran kullanılarak) üretmek için en iyi kombinasyonu değerlendirmek üzere 3 gün veya 5 günlük kültürle test edildi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S2: CD4 ve CD8, dipteri toksoid (DT) ve Bluetongue virüsü serotip 4 (BTV) ile astarlanır. Ki-67'nin (A) DT ve (C) BTV ile atımlandıktan sonra CD8 hücreleri tarafından ekspresyonu ve 16. günde (B) DT ve (D) BVT ile atımlandıktan sonra Ki-67'nin CD4 hücreleri tarafından ekspresyonu. DT ve BVT (spesifik), (C,D) CD40L ile atımlı kültürler ve spesifik olmayan astarlama ve kontrol tedavileri ile karşılaştırmalar yapıldı. Yatay çubuklar ortalamayı gösterir. *p < 0.05, **p < Mann-Whitney testine göre 0.01. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu çalışma, sığır MoDC'lerinin üretilmesi ve fenotiplenmesi için standartlaştırılmış bir in vitro yöntemi ve bunların ticari bir aşının (örneğin, RV) aşı immünojenitesini ölçmede daha sonraki kullanımlarını göstermektedir. Sığır MoDC'leri, sığır hastalıklarına karşı potansiyel aşı antijenlerini taramak ve in vivo hayvan deneylerine geçmeden önce bağışıklık tepkilerine dayanarak potansiyel klinik etkilerini tahmin etmek için bir araç olarak kullanılabilir. Üretilen MoDC'ler morfolojik, fenotipik ve fonksiyonel özelliklerine göre tanımlandı. Sığır CD14+ monositlerinden türetilen MoDC'lerin, genişletilmiş dendritler, MHC II gibi antijen sunumu için hücre yüzey belirteçlerinin ekspresyonu, CD40 ve CD86 gibi MoDC'lerde ko-stimülatör moleküllerin ekspresyonu, endositik aktivite ve naif lenfositleri aktive etme yeteneği gibi DC'lerde görülen özellikleri sergilediğini gösterdik.

Bu deneyde kullanılan hücre kültürü ortamı (DMEM ve RPMI), hücre farklılaşması ve ekimi için yaygın olarak kullanılmaktadır, RPMI monosit farklılaşması için daha sık benimsenmektedir36. FBS veya HS (at serumu) ile RPMI takviyesi, monosit farklılaşmasını etkilemez37. Rekombinant GM-CSF ve IL-4 takviyesi, monosit farklılaşmasını tetikleyen enflamatuar bir durum sağlar ve rutin olarak antijen alımı ve immün hücrelere sunum yapabilen fonksiyonel olarak uygulanabilir MoDC'lerin üretimi için kullanılır38,39. Bu çalışmada, RPMI 1640 besiyeri% 10 FBS (tam kültür ortamı),% 1 penisilin-streptomisin ve ticari olarak temin edilebilen bir sitokin kokteylinin (GM-CSF artı IL-4) eklenmesi, sığır monosit farklılaşmasına neden olmuş ve uygulanabilir MoDC'lerin üretilmesine neden olmuştur. Üretilen MoDC'ler naif lenfositlerle birlikte kültürlenmeden önce RV ile inkübe edildiğinde, RV'ye karşı spesifik bir T hücresine bağımlı immün yanıtı indüklediler ve olgun MoDC'lerin RV antijenlerini RV ile hiç karşılaşmamış lenfositlere yeterince sunabildiğini kanıtladılar. Bu, artık laboratuvarda çoğaltabileceğimiz adaptif bağışıklığın çok önemli bir özelliğidir.

Daha yüksek bir sitokin kokteyli konsantrasyonunun (% 5), daha uzun bir inkübasyon süresi (5 gün) ile birleştiğinde, Ek Şekil S1'de gösterildiği gibi, aynı inkübasyon süresine (5 gün) sahip daha düşük bir sitokin kokteyli konsantrasyonu (% 3) ile tedavi edilenlere göre antijen alımı için daha düşük endositik kabiliyete sahip MoDC'ler ürettiğini gözlemledik. Bu nedenle, 5 günlük inkübasyonla daha düşük bir sitokin kokteyli konsantrasyonunun (örneğin,% 3) fonksiyonel olarak güçlü MoDC'ler üretmek için en uygun olduğu sonucuna vardık. MHC II, CD40 ve CD86 gibi hücre yüzey belirteçleri APC'lerde bulunur ve bunların yukarı regülasyonu fonksiyonel hücre aktivasyonunu gösterir40,41,4 2. Sitokin kokteyli kullanılarak monosit farklılaşmasından sonra MHC II, CD40 ve CD86'nın naif MoDC'lere gelişmiş ekspresyonunu gösterdik (Şekil 4).

Bir kültür sistemindeki naif lenfositlerin ve MoDC'lerin oranının optimize edilmesi, MoDC testinin sonucunu etkileyen önemli bir faktördür ve farklı MoDC'den lenfosit oranlarına göre çeşitli lenfosit yanıtlarını indüklemektedir43. Bununla birlikte, MoDC'nin 1: 10-1: 40 lenfosit oranlarını değerlendirdikten sonra, MoDC'lerin konsantrasyonunun arttırılmasının lenfosit aktivasyonunu arttırmadığını gözlemledik ve sonunda daha önce bildirilen çalışmalara benzer şekilde 1: 20'lik optimal bir orana karar verdik44,45. Elüte edilen naif lenfosit fraksiyonunun spesifik olarak aktive edilmemiş T hücreleri içerebileceğine dikkat edilmelidir; Bu nedenle, sadece naif lenfosit kültürüne karşılık gelen bir kontrol grubuna sahip olmak zorunludur.

Aktive edilmiş CD4 + ve CD8 + T hücreleri spesifik belirteçleri eksprese eder ve çeşitli sitokinler salgılar ve bunların nicelleştirilmesi immün aktivasyonu gösterir. İyi karakterize edilmiş bir immün aktivasyon belirteci olan Ki-67'nin hücre içi ekspresyonu, bu MoDC-lenfosit ko-kültürü 29,46'da yukarı regüle edildi. Benzer şekilde, bu çalışmada, lenfositler tarafından IFN-γ sekresyonunun artması, RV antijeni30,31,47'ye karşı ortaya çıkan bir Th1 yanıtını göstermiştir. CD4 + T hücreleri tarafından IL-2 ekspresyonu da T hücresi aktivasyonunu görselleştirmek için iyi bir belirteçtir; Bununla birlikte, MoDC-lenfosit ko-kültürünün 9. gününde dahil edilmesi, bu çalışma için lenfosit proliferasyonunu ölçmek için uygun olmayan bir hedef haline getirmiştir48. IL-2 varlığında CD25'in upregülasyonunun daha önce hem CD4 + hem de CD8 + T hücrelerinin astarlanmasını belirlediği gösterilmiştir ve bu çalışmada naif lenfositlerin RV darbeli MoDC'ler28 tarafından astarlanmasını ölçmek için kullanılmıştır.

Sitotoksik CD8 T hücreleri, hücre içi aşı antijenlerine veya viral patojenlere karşı majör efektör hücrelerdir49. Lenfosit aktivasyon belirteçlerini (Ki-67 ve CD25) ve sitokin ekspresyonunu (IFN-γ) ölçerek, antijen yüklü MoDC'lerin hem CD8 hem de CD4 T hücre yanıtlarının anlamlı (p < 0.01) aktivasyonuna sahip olduğunu, CD8 yanıtının ve Th1 polarizasyonunun RV antijenine karşı daha yaygın olduğunu bulduk. Adjuvan konjuge aşılar için bir MoDC testi tasarlarken göz önünde bulundurulması gereken önemli bir faktör, adjuvan kaynaklı lenfosit yanıtlarıdır. Herhangi bir arka plan sinyalini ortadan kaldırmak için yalnızca adjuvandan oluşan bir kontrol grubu (adjuvan kontrolü) kullanmanızı öneririz. Bu kurulum, lenfosit yanıtlarını in vivo çalışmalar sırasında koruma için çok önemli olan düşük immünojenik bir antijene karşı artırabilen farklı adjuvanların etkisini ölçmek için de kullanılabilir.

Bu çalışmada vurgulamak istediğimiz bazı sınırlamalar vardır. Her bir tahlil için deneysel veriler, altı teknik kopyaya sahip tek bir hayvandan elde edildi. Daha fazla sayıda biyolojik kopyaya sahip olmak, hataları en aza indirmek ve gelişmiş istatistiksel güvenilirlik ve sonuçları daha yüksek doğrulukla sağlamak için faydalı olacaktır. Bununla birlikte, önceki bir yayın11'de, bu tahlil aynı zamanda bir dipteri toksoidi (Ek Şekil S2A, B) ve Bluetongue virüsü serotip 4'e (Ek Şekil S2C, D) karşı ticari bir aşı kullanılarak sırasıyla üç ve iki biyolojik hayvanla test edilmiş ve doğrulanmıştır. Ayrıca, bu in vitro çalışmadan elde edilen sonuçların in vivo bir çalışma ile karşılaştırılması, bu bağışıklık testinin orijinalliğinin ek olarak doğrulanmasına yardımcı olacak ve bu da bu in vitro MoDC testinin aşı üretiminde ve kalite kontrolünde rutin bir test olarak uygulanma sürecini hızlandıracaktır. Son olarak, CD14'ün MoDC'lerdeki ekspresyonu araştırılmamıştır, çünkü literatür bu yönden, özellikle de farklı hayvan türlerinden MoDC'leri karşılaştırırken tutarsızdır.

Sonuç olarak, aşı kaynaklı immünojeniteyi ölçmek için kullanılabilecek bir in vitro sığır MoDC testi sunuyoruz. Bu MoDC testi, akış sitometrisi, ELISA ve qPCR dahil olmak üzere çeşitli yöntemler kullanılarak da değerlendirilebilir. Aktivasyon belirteçlerini değerlendirmek için birden fazla yönteme sahip olmak, bir akış sitometresinin kolayca bulunamayabileceği sınırlı kaynaklara sahip alanlarda çok önemlidir. Bu tahlil, büyük miktarlarda sığır aşısı üreten ulusal veteriner laboratuvarları tarafından bir kalite kontrol adımı olarak dahil edilebilir. Ek olarak, yeni sığır aşılarının geliştirilmesi sırasında potansiyel aşı antijenlerini tanımlamak ve hatta bir hayvan denemesinden önce hangi adjuvanın kullanılacağını seçmek için kullanılabilir. Tüm bu faktörler, sığır aşılarının geliştirilmesi ve kullanılması için daha etik ve uygun fiyatlı bir yaklaşıma katkıda bulunacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.

Acknowledgments

Hayvanların sağlık durumlarını belirleme ve BTV'yi sağlama konusundaki destekleri için Dr. Eveline Wodak ve Dr. Angelika Loistch (AGES), sığır kanı sağladığı için Dr. Bernhard Reinelt'e ve IAEA'dan Dr. Bharani Settypalli ve Dr. William Dundon'a gerçek zamanlı PCR deneyleri ve dil düzenleme konusunda yararlı tavsiyeler için teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACK Lysing Buffer Gibco, Thermo Fisher A1049201 Ammonium-Chloride-Potassium buffer for lysis of residual RBCs in harvested PBMC Fraction
BD Vacutainer Heparin Tubes Becton, Dickinson (BD) and Company 366480 10 mL, additive sodium heparin 158 USP units, glass tube, 16 x 100 mm size
Bovine Dendritic Cell Growth Kit Bio-Rad, UK PBP015KZZ Cytokine cocktail composed of recombinant bovine IL-4 and GM-CSF
Bovine IFN-γ ELISA Kit Bio-Rad MCA5638KZZ Kit use for measuring IFN-γ expression in culture supernatant
CD14 Antibody Bio-Rad MCA2678F Mouse anti-bovine CD14 monoclonal antibody, clone CC-G33, isotype IgG1
CD25 Antibody Bio-Rad MCA2430PE Mouse anti bovine CD25 monoclonal antibody, clone IL-A11, isotype IgG1
CD4 Antibody Bio-Rad MCA1653A647 Mouse anti bovine CD4 monoclonal antibody, clone CC8, isotype IgG2a
CD40 Antibody Bio-Rad MCA2431F Mouse anti-bovine CD40 monoclonal antibody, clone IL-A156, isotype IgG1
CD8 Antibody Bio-Rad MCA837F Mouse anti bovine CD8 monoclonal antibody, clone CC63, isotype IgG2a
CD86 Antibody Bio-Rad MCA2437PE Mouse anti-bovine CD86 monoclonal antibody, clone IL-A190, isotype IgG1
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System Bio-Rad - Thermal cycler PCR machine
Corning Centrifuge Tube Falcon Corning  352096 & 352070 15 mL and 50 mL, high-clarity poypropylene conical bottom, graduated, sterial, seal screw cap, falcon tube
Cytofix/Cytoperm Plus BD Bio Sciences 555028 Fixation/permeabilization kit with BD golgiPlug, use for flow cytometer cell staining
Ethanol Sigma Aldrich 1009832500 Absolute for analysis EMSURE ACS,ISO, Reag. Ph Eur
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco, Thermo Fisher 10500064 Qualified, heat inactivated
Ficoll Plaque PLUS GE Health care Life Sciences, USA 341691 Lymphocyte-isolation medium
FlowClean Cleaning Agent Beckman Coulter, Life Sciences A64669 500 mL
FlowJo FlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, USA - Flow cytometer Histogram software
FlowTubes/ FACS  (Fluorescence-activated single-cell sorting) Tube Falcon Corning  352235 5 mL, sterial, round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap, use in flow cytometry analysis
Fluoresceinisothiocynat-Dextran Sigma Aldrich, Germany 60842-46-8 FITC-dextran MW
Gallios Flow Cytometer Beckman Coulter - Flow cytometer machine
Hard-Shell 96-Well PCR Plates Bio-Rad HSP9601 96 well, low profile, thin wall, skirted, white/clear
Human CD14 MicroBeads Miltenyi Bioteck, Germany 130-050-201 2 mL microbeads conjugated to monoclonal anti-human CD14 antibody isotype IgG2a, used for selection of bovine monocytes from PBMCs
Kaluza Beckman Coulter, Germany - Flow cytometer multicolor data analysis software
MACS Column Miltenyi Bioteck, Germany 130-042-401 Magnetic activated cell sorting or immune magentic cell separation colum for separation of various CD14 cell population based on cell surface antigens
MHC Class II DQ DR Polymorphic Antibody Bio-Rad MCA2228F Mouse anti-sheep MHC Class II DQ DR Polymorphic:FITC, clone 49.1, isotype IgG2a, cross reactive with bovine
Microcentrifuge Tube Sigma Aldrich HS4325 1.5 mL, conical bottom, graduated, sterial tube
Microsoft Power Point Microsoft - The graphical illustrations of experimental design
Mouse IgG1 Negative Control:FITC for CD14, CD40 Antibody Bio-Rad MCA928F Isotype control CD14 and CD40 monoclonal antibody 
Mouse IgG1 Negative Control:PE for CD86 Antibody Bio-Rad MCA928PE Isotype control CD86 monoclonal antibody 
Mouse IgG1 Negative Control:RPE for CD25 Antibody Bio-Rad MCA928PE Isotype control CD25 monoclonal antibody 
Mouse IgG2a Negative Control:FITC for MHC Class II Antibody Bio-Rad MCA929F Isotype control for MHC class II monoclonal antibody 
Nobivac Rabies MSD Animal Health, UK - 1 µL/mL of cell cultured inactivated vaccine containing > 2 I.U./mL Rabies virus strain
Optical seals Bi0-Rad TCS0803 0.2 mL flat PCR tube 8-cap strips, optical, ultraclear, compatible for qPCR machine
Penicillin-Streptomycin Gibco, Thermo Fisher 15140122 100 mL
Phosphate Buffer Saline (PBS) Gibco, Thermo Fisher 10010023 pH 7.4, 1x concentration
Prism - GraphPad 5 Software  Dotmatics - Statistical software
Purified Anti-human Ki-67 antibody Biolegend, USA 350501 Monoclonal antibody, cross reactive with cow, clone ki-67
Purified Mouse IgG1 k Isotype Ctrl Antibody Biolegend 400101 Isotype control for Ki-67 monoclonal antibody
READIDROP Propidium Iodide BD Bio Sciences 1351101 Live/dead cell marker used for flow cytometry, amine reactive dye
Recombinant Human IL-2 Protein R&D System, USA 202-IL-010/CF Interleukin-2, 20 ng/ml
RNeasy Mini Kit Qiagen 74106 Kit use for extraction of total RNA; RLT buffer = lysis buffer; RW1 buffer = stringent guanidine-containing washing buffer; RDD buffer = DNase buffer; RPE buffer = mild wash buffer; RNaseOUT = RNase inhibitor.
RPMI 1640 Medium Sigma Aldrich R8758 Cell culture media with L-glutamine and sodium bicarbonate
SMART-servier medical art  Les Laboratories Servier - Licensed under a creative commons attribution 3.0 unported license
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 172-5270 2x qPCR mix conatins dNTPs, Ss07d fusion polymerase, MgCl2, SYBR Green I supermix = supermix, ROX normalization dyes.
SuperScript III First-Strand Synthesis System Invitrogen, Thermo Fisher 18080051 Kit for cDNA synthsis
Tissue Culture Test plate 24 TPP, Switzerland 92024 24 well plate, sterilized by radiation , growth enhanced treated, volume 3.18 mL
Trypan Blue Solution Gibco, Thermo Fisher 15250061 0.4%, 100 mL, dye to assess cell viability
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Invitrogen, Thermo Fisher 10977023 0.1 µm membrane filtered distilled water
VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes Thermo Fisher Scientific 15206067 VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes have a green top and contain spray-dried lithium, sodium or ammonium heparin on the inner walls and are usedin clinical chemistry, immunology and serology. The anticoagulant heparin activates antithrombin, which blocks the clotting cascade and thus produces a whole blood/plasma sample.
Water Sigma Aldrich W3500-1L Sterile-filtered, bioReagent suitable for cell culture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roth, J. A., Sandbulte, M. R. The role of veterinary vaccines in livestock production, animal health, and public health. In Veterinary Vaccines: Principles and Applications. Metwally, S., El Idrissi, A., Viljoen, G. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 1-10 (2021).
  2. Roberts, N. J., Douglas, R. G., Simons, R. M., Diamond, M. E. Virus-induced interferon production by human macrophages. The Journal of Immunology. 123 (1), 365-369 (1979).
  3. Kleiveland, C. R. Peripheral blood mononuclear cells. The Impact of Food Bioactives on Health: In Vitro and Ex Vivo Models. Verhoeckx, K., Cotter, P., López-Expósito, I., Kleiveland, C., Lea, T., Mackie, A., Requena, T., Swiatecka, D., Wichers, H. , Springer. Cham, Switzerland. 161-167 (2015).
  4. Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 762-774 (2011).
  5. Domínguez, P. M., Ardavín, C. Differentiation and function of mouse monocyte-derived dendritic cells in steady state and inflammation. Immunological Reviews. 234 (1), 90-104 (2010).
  6. Steinman, R. M. Linking innate to adaptive immunity through dendritic cells. Novartis Foundation Symposium. 279, 101-109 (2006).
  7. Vandebriel, R. J., Hoefnagel, M. H. N. Dendritic cell-based in vitro assays for vaccine immunogenicity. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 8 (9), 1323-1325 (2012).
  8. Hopewell, E. L., Cox, C. Manufacturing dendritic cells for immunotherapy: Monocyte enrichment. Molecular Therapy. Methods and Clinical Development. 16, 155-160 (2020).
  9. Morse, M. A., Zhou, L. -J., Tedder, T. F., Lyerly, H. K., Smith, C. Generation of dendritic cells in vitro from peripheral blood mononuclear cells with granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor, interleukin-4, and tumor necrosis factor-alpha for use in cancer immunotherapy. Annals of Surgery. 226 (1), 6-16 (1997).
  10. Robinson, L., et al. Foot-and-mouth disease virus exhibits an altered tropism in the presence of specific immunoglobulins, enabling productive infection and killing of dendritic cells. Journal of Virology. 85 (5), 2212-2223 (2011).
  11. Kangethe, R. T., Pichler, R., Chuma, F. N. J., Cattoli, G., Wijewardana, V. Bovine monocyte derived dendritic cell based assay for measuring vaccine immunogenicity in vitro. Veterinary Immunology and Immunopathology. 197, 39-48 (2018).
  12. Harwood, L. J., Gerber, H., Sobrino, F., Summerfield, A., McCullough, K. C. Dendritic cell internalization of foot-and-mouth disease virus: Influence of heparan sulfate binding on virus uptake and induction of the immune response. Journal of Virology. 82 (13), 6379-6394 (2008).
  13. Hussen, J., et al. Phenotypic and functional heterogeneity of bovine blood monocytes. PLoS One. 8 (8), 71502 (2013).
  14. Shi, Y., et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and T-cell responses: What we do and don't know. Cell Research. 16 (2), 126-133 (2006).
  15. Zhou, L. -J., Tedder, T. F. CD14+ blood monocytes can differentiate into functionally mature CD83+ dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (6), 2588-2592 (1996).
  16. Bautista, E. M., Nfon, C., Ferman, G. S., Golde, W. T. IL-13 replaces IL-4 in development of monocyte derived dendritic cells (MoDC) of swine. Veterinary Immunology and Immunopathology. 115 (1-2), 56-67 (2007).
  17. León, B., Ardavín, C. Monocyte-derived dendritic cells in innate and adaptive immunity. Immunology and Cell Biology. 86 (4), 320-324 (2008).
  18. Berger, A. Th1 and Th2 responses: What are they. British Medical Journal. 321 (7258), 424 (2000).
  19. Romagnani, S. Th1/th2 cells. Inflammatory Bowel Diseases. 5 (4), 285-294 (1999).
  20. Kaiko, G. E., Horvat, J. C., Beagley, K. W., Hansbro, P. M. Immunological decision-making: How does the immune system decide to mount a helper T-cell response. Immunology. 123 (3), 326-338 (2008).
  21. Duckworth, B. C., Groom, J. R. Conversations that count: Cellular interactions that drive T cell fate. Immunological Reviews. 300 (1), 203-219 (2021).
  22. León, B., López-Bravo, M., Ardavín, C. Monocyte-derived dendritic cells formed at the infection site control the induction of protective T helper 1 responses against Leishmania. Immunity. 26 (4), 519-531 (2007).
  23. Singh, D., et al. Differential responses of chicken monocyte-derived dendritic cells infected with Salmonella gallinarum and Salmonella typhimurium. Scientific Reports. 11, 17214 (2021).
  24. Pujol, M., et al. Variability in the response of canine and human dendritic cells stimulated with Brucella canis. Veterinary Research. 48, 72 (2017).
  25. Pujol, M., Borie, C., Montoya, M., Ferreira, A., Vernal, R. Brucella canis induces canine CD4+ T cells multi-cytokine Th1/Th17 production via dendritic cell activation. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 62, 68-75 (2019).
  26. Lašťovička, J., Rataj, M., Bartůňková, J. Assessment of lymphocyte proliferation for diagnostic purpose: Comparison of CFSE staining, Ki-67 expression and 3H-thymidine incorporation. Human Immunology. 77 (12), 1215-1222 (2016).
  27. Reddy, M., Eirikis, E., Davis, C., Davis, H. M., Prabhakar, U. Comparative analysis of lymphocyte activation marker expression and cytokine secretion profile in stimulated human peripheral blood mononuclear cell cultures: An in vitro model to monitor cellular immune function. Journal of Immunological Methods. 293 (1-2), 127-142 (2004).
  28. Shatrova, A. N., et al. Time-dependent regulation of IL-2R α-chain (CD25) expression by TCR signal strength and IL-2-induced STAT5 signaling in activated human blood T lymphocytes. PLoS One. 11 (12), 0167215 (2016).
  29. Shedlock, D. J., et al. Ki-67 staining for determination of rhesus macaque T cell proliferative responses ex vivo. Cytometry, Part A. 77 (3), 275-284 (2010).
  30. Yen, H. -R., et al. Tc17 CD8 T cells: Functional plasticity and subset diversity. Journal of Immunology. 183 (11), 7161-7168 (2009).
  31. Kawamura, I., et al. IFN-gamma-producing ability as a possible marker for the protective T cells against Mycobacterium bovis BCG in mice. Journal of Immunology. 148 (9), 2887-2893 (1992).
  32. Federal Ministry Republic of Austria. Agriculture, Forestry, Regions and Water Management. The Federal Act on Animal Welfare (Tierschutzgesetz - TSchG). Federal Law Gazette I 2004/118. , Available from: https://info.bml.gv.at/en/topics/agriculture/agriculture-in-austria/animal-production-in-austria/animal-welfare-act.html (2005).
  33. Corripio-Miyar, Y., et al. Phenotypic and functional analysis of monocyte populations in cattle peripheral blood identifies a subset with high endocytic and allogeneic T-cell stimulatory capacity. Veterinary Research. 46, 112 (2015).
  34. Wijewardana, V., et al. Generation of canine dendritic cells from peripheral blood monocytes without using purified cytokines. Veterinary Immunology and Immunopathology. 114 (1-2), 37-48 (2006).
  35. Gallios Flow Cytometer with Kaluza for Gallios Software. Instructions for Use. Beckman Coulter. , Available from: http://www.cytometrie-imagerie-saint-antoine.org/media/3924/Kaluza.Gallos.pdf (2014).
  36. Švajger, U., Jeras, M. Optimal dendritic cell differentiation in rpmi media requires the absence of HEPES buffer. Immunological Investigations. 40 (4), 413-426 (2011).
  37. Chometon, T. Q., et al. A protocol for rapid monocyte isolation and generation of singular human monocyte-derived dendritic cells. PLoS One. 15 (4), 0231132 (2020).
  38. Blanco, F. C., et al. Semi-stable production of bovine IL-4 and GM-CSF in the mammalian episomal expression system. Journal of Veterinary Research. 65 (3), 315-321 (2021).
  39. Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. Journal of Experimental Medicine. 179 (4), 1109-1118 (1994).
  40. Cho, K. -J., Roche, P. A. Regulation of MHC class II-peptide complex expression by ubiquitination. Frontiers in Immunology. 4, 369 (2013).
  41. Sansom, D. M., Manzotti, C. N., Zheng, Y. What's the difference between CD80 and CD86. Trends in Immunology. 24 (6), 313-318 (2003).
  42. Han Lee, G., et al. The role of CD40 expression in dendritic cells in cancer biology; a systematic review. Current Cancer Drug Targets. 14 (7), 610-620 (2014).
  43. Tanaka, H., Demeure, C. E., Rubio, M., Delespesse, G., Sarfati, M. Human monocyte-derived dendritic cells induce naive T cell differentiation into T helper cell type 2 (Th2) or Th1/Th2 effectors: Role of stimulator/responder ratio. Journal of Experimental Medicine. 192 (3), 405-412 (2000).
  44. Klechevsky, E., et al. Cross-priming CD8+ T cells by targeting antigens to human dendritic cells through DCIR. Blood. 116 (10), 1685-1697 (2010).
  45. Schlienger, K., Craighead, N., Lee, K. P., Levine, B. L., June, C. H. Efficient priming of protein antigen-specific human CD4+ T cells by monocyte-derived dendritic cells. Blood. 96 (10), 3490-3498 (2000).
  46. Soares, A., et al. Novel application of Ki67 to quantify antigen-specific in vitro lymphoproliferation. Journal of Immunological Methods. 362 (1-2), 43-50 (2010).
  47. Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations. Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2009).
  48. Bachmann, M. F., Oxenius, A. Interleukin 2: From immunostimulation to immunoregulation and back again. EMBO Reports. 8 (12), 1142-1148 (2007).
  49. Koup, R. A., Douek, D. C. Vaccine design for CD8 T lymphocyte responses. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 1 (1), 007252 (2011).
  50. Sassu, E. L., et al. Development and evaluation of a real-time PCR panel for the detection of 20 immune markers in cattle and sheep. Veterinary Immunology and Immunopathology. 227, 110092 (2020).

Tags

Boş Değer Sayı 195
Sığır Monosit Kaynaklı Dendritik Hücreler Kullanılarak Aşı İmmünojenitesinin Belirlenmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liaqat, F., Kangethe, R. T.,… More

Liaqat, F., Kangethe, R. T., Pichler, R., Liu, B., Huber, J., Wijewardana, V., Cattoli, G., Porfiri, L. Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (195), e64874, doi:10.3791/64874 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter