Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Bepaling van de immunogeniciteit van het vaccin met behulp van van runderen monocyten afgeleide dendritische cellen

Published: May 19, 2023 doi: 10.3791/64874
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1, 1, 1
1Animal Production and Health Section, Joint Food and Agriculture Organization (FAO)/International Atomic Energy Agency (IAEA) Centre of Nuclear Techniques in Food and Agriculture, International Atomic Energy Agency, 2Teaching and Research Farm Kremesberg, Clinical Unit for Herd Health Management in Ruminants, Department for Farm Animals and Veterinary Public Health, University of Veterinary Medicine, Vienna

Summary

De methodologie beschrijft de generatie van van boviene monocyten afgeleide dendritische cellen (MoDC's) en hun toepassing voor de in vitro evaluatie van antigene kandidaten tijdens de ontwikkeling van potentiële veterinaire vaccins bij runderen.

Abstract

Dendritische cellen (DC's) zijn de krachtigste antigeen-presenterende cellen (APC's) binnen het immuunsysteem. Ze patrouilleren in het organisme op zoek naar ziekteverwekkers en spelen een unieke rol binnen het immuunsysteem door de aangeboren en adaptieve immuunresponsen te koppelen. Deze cellen kunnen fagocytiseren en vervolgens gevangen antigenen presenteren aan effector-immuuncellen, waardoor een breed scala aan immuunresponsen wordt geactiveerd. Dit artikel demonstreert een gestandaardiseerde methode voor de in vitro generatie van van runderen monocyten-afgeleide dendritische cellen (MoDC's) geïsoleerd uit perifere bloedmononucleaire cellen van runderen (PBMC's) en hun toepassing bij het evalueren van vaccinimmunogeniciteit.

Magnetische celsortering werd gebruikt om CD14+ monocyten uit PBMC's te isoleren, en de suppletie van compleet kweekmedium met interleukine (IL)-4 en granulocyt-macrofaag koloniestimulerende factor (GM-CSF) werd gebruikt om de differentiatie van CD14+ monocyten in naïeve MoDC's te induceren. De generatie van onrijpe MoDC's werd bevestigd door het detecteren van de expressie van belangrijke histocompatibiliteitscomplex II (MHC II), CD86 en CD40 celoppervlakmarkers. Een in de handel verkrijgbaar rabiësvaccin werd gebruikt om de onrijpe MoDC's te pulseren, die vervolgens samen met naïeve lymfocyten werden gekweekt.

De flowcytometrie-analyse van de antigeen-gepulseerde MoDC's en lymfocytenco-cultuur onthulde de stimulatie van T-lymfocytenproliferatie door de expressie van Ki-67-, CD25-, CD4- en CD8-markers. De analyse van de mRNA-expressie van IFN-γ en Ki-67, met behulp van kwantitatieve PCR, toonde aan dat de MoDC's de antigeenspecifieke priming van lymfocyten in dit in vitro co-cultuursysteem konden induceren. Bovendien toonde IFN-γ secretie beoordeeld met behulp van ELISA een significant hogere titer (**p < 0,01) in de rabiësvaccin-gepulseerde MoDC-lymfocytencocultuur dan in de niet-antigeen-gepulseerde MoDC-lymfocytencocultuur. Deze resultaten tonen de validiteit van deze in vitro MoDC-test om vaccinimmunogeniciteit te meten, wat betekent dat deze test kan worden gebruikt om potentiële vaccinkandidaten voor runderen te identificeren voordat wordt overgegaan tot in vivo onderzoeken, evenals in vaccinimmunogeniciteitsbeoordelingen van commerciële vaccins.

Introduction

Veterinaire vaccinatie is een cruciaal aspect van de veehouderij en gezondheid, omdat het bijdraagt aan het verbeteren van de voedselzekerheid en het dierenwelzijn door bescherming te bieden tegen ziekten die de veehouderij wereldwijd treffen1. Een effectieve in vitro methode om de immunogeniciteit van mogelijke vaccinkandidaten te beoordelen, zou het proces van vaccinontwikkeling en -productie helpen versnellen. Het is daarom noodzakelijk om het veld van immuuntesten uit te breiden met innovatieve methodologieën op basis van in vitro studies, omdat dit zou helpen om de complexiteit van de immuunprocessen met betrekking tot immunisatie en pathogene infectie te onthullen. Momenteel worden in vivo immunisatie- en challengestudies bij dieren, die periodieke bemonstering vereisen (bijv. Bloed en milt), gebruikt om de immunogeniciteit van kandidaat-vaccins en adjuvantia te meten. Deze testen zijn duur, tijdrovend en hebben ethische implicaties, omdat in de meeste gevallen euthanasie bij dieren wordt uitgevoerd aan het einde van de proeven.

Als alternatief voor in vivo assays zijn perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) gebruikt om vaccin-geïnduceerde immuunresponsen in vitrote evalueren 2. PBMC's zijn een heterogene populatie van cellen die bestaat uit 70% -90% lymfocyten, 10% -20% monocyten en een beperkt aantal dendritische cellen (DC's, 1% -2%)3. PBMC's herbergen antigeen-presenterende cellen (APC's) zoals B-cellen, monocyten en DC's, die voortdurend patrouilleren in het organisme op zoek naar tekenen van infectie of weefselbeschadiging. Lokaal uitgescheiden chemokines vergemakkelijken de rekrutering en activering van APC's naar deze plaatsen door zich te binden aan celoppervlakreceptoren. In het geval van monocyten richten chemokines hun lot om te differentiëren in DC's of macrofagen4. Zodra DC's een pathogeen tegenkomen en vangen, migreren ze naar secundaire lymfoïde organen, waar ze de verwerkte pathogene peptide-antigenen kunnen presenteren met behulp van major histocompatibility complex (MHC) klasse I of klasse II oppervlakte-eiwitten aan respectievelijk CD8 + T-cellen of CD4 + T-cellen, waardoor een immuunrespons 5,6 wordt geactiveerd.

De sleutelrol die DC's spelen bij het orkestreren van een beschermende immuunrespons tegen verschillende pathogenen maakt ze een interessant onderzoeksdoel voor het begrijpen van intracellulaire immuunmechanismen, vooral bij het ontwerpen van vaccins en adjuvantia tegen infectieuze agentia7. Aangezien de fractie van DC's die kan worden verkregen uit PBMC's vrij klein is (1%-2%), zijn monocyten in plaats daarvan gebruikt om DC's in vitro8 te genereren. Deze van monocyten afgeleide DC's (MoDC's) werden aanvankelijk ontwikkeld als een mogelijke behandelingsstrategie in kankerimmunotherapie9. Meer recent zijn MoDC's gebruikt voor vaccinonderzoek 10,11,12, en klassieke monocyten zijn het overheersende subtype (89%) voor MoDC-productie 13. De productie van MoDC's in vitro is eerder bereikt door de toevoeging van granulocyt-macrofaag koloniestimulerende factor (GM-CSF) gegeven in combinatie met andere cytokines zoals interleukine-4 (IL-4), tumornecrosefactor α (TNF-α) of IL-1314,15,16.

Het succes van een in vitro MoDC-test is afhankelijk van het vermogen van antigeen-gestimuleerde volwassen MoDC's om de omvang en het type van de immuunrespons te moduleren die specifiek zijn voor het type antigeen dat is gedetecteerd17. Het type pathogeen dat door MoDC's wordt herkend en gepresenteerd, bepaalt de differentiatie van CD4 + T-helper (Th) -cellen in Th1-, Th2- of Th17-effectorcellen en wordt gekenmerkt door een pathogeenspecifiek secretoir cytokineprofiel. Een Th1-respons wordt opgewekt tegen intracellulaire pathogenen en resulteert in de secretie van interferon-gamma (IFN-γ) en tumornecrosefactor bèta (TNF-β), die fagocytisch-afhankelijke bescherming moduleert. Een Th2-respons wordt geactiveerd tegen parasitaire organismen en wordt gekenmerkt door IL-4, IL-5, IL-10 en IL-13-secretie, die fagocytisch-onafhankelijke humorale bescherming initieert. Th17 biedt neutrofielafhankelijke bescherming tegen extracellulaire bacteriële en schimmelinfecties gemedieerd door de secretie van IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 en TNF-α 18,19,20,21. Op basis van eerdere studies is opgemerkt dat niet alle pathogenen binnen het verwachte cytokineprofiel vallen. Dermale MoDC's stimuleren bijvoorbeeld, als reactie op leishmania parasitaire infectie, IFN-γ secretie van CD4 + T-cellen en CD8 + T-cellen, waardoor een beschermende pro-inflammatoire Th1-respons wordt geïnduceerd22.

Het is ook aangetoond dat MoDC's bij kippen die zijn geprimed met Salmonella lipopolysaccharide (LPS), een variabele respons tegen Salmonella typhimurium kunnen induceren door zowel Th1- als Th2-responsen te activeren, terwijl Salmonella gallinarum alleen een Th2-respons induceert, wat de hogere weerstand van de laatste tegen MoDC-klaring23 zou kunnen verklaren. De activering van MoDC's tegen Brucella canis (B. canis) is ook gemeld in zowel honden- als menselijke MoDC's, wat betekent dat dit een zoönotisch infectiemechanisme kan vertegenwoordigen24. Menselijke MoDC's geprimed met B. canis induceren een sterke Th1-respons die weerstand biedt tegen ernstige infectie, terwijl Canine MoDC's een dominante Th17-respons induceren met een verminderde Th1-respons, wat vervolgens leidt tot de oprichting van chronische infectie25. Runder-MoDC's vertonen een verhoogde affiniteit voor mond- en klauwzeervirus (FMDV) geconjugeerd met immunoglobuline G (IgG) in vergelijking met niet-geconjugeerde FMDV alleen, aangezien de MoDC's een viraal antilichaamcomplex vormen als reactie op de eerste10. Samen laten deze studies zien hoe MoDC's zijn gebruikt om de complexiteit van immuunresponsen tijdens pathogene infectie te analyseren. De adaptieve immuunresponsen kunnen worden geëvalueerd door de kwantificering van specifieke markers geassocieerd met lymfocytenproliferatie. Ki-67, een intracellulair eiwit dat alleen in delende cellen wordt gedetecteerd, wordt beschouwd als een betrouwbare marker voor proliferatiestudies26, en evenzo komt CD25 uitgedrukt op het oppervlak van T-cellen tijdens de late fase van activering overeen met lymfocytenproliferatie27,28.

Deze studie toont een gestandaardiseerde methode voor de in vitro generatie van runder-MoDC's, gevolgd door hun toepassing in een in vitro immuuntest die wordt gebruikt voor het testen van de immunogeniciteit van vaccins. Een in de handel verkrijgbaar rabiësvaccin (RV) werd gebruikt om de werkzaamheid van deze test te valideren. T-lymfocytenactivatie en -proliferatie werden gemeten door flowcytometrie, real-time kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) en enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) door de analyse van gevestigde celactivatiemarkers zoals Ki-67 en CD25 en de secretie van IFN-γ 28,29,30,31. Er worden geen dier- of menselijke experimentele proeven uitgevoerd tijdens de MoDC-test.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bloedafname wordt uitgevoerd door een gecertificeerde dierenarts in overeenstemming met de ethische richtlijnen van het Oostenrijkse Agentschap voor Gezondheid en Voedselveiligheid (AGES) en in overeenstemming met de geaccepteerde dierenwelzijnsnormen32. De studie kreeg ethische goedkeuring van het Oostenrijkse ministerie van Landbouw. Het experimentele ontwerp voor het genereren van MoDC's en de daaropvolgende toepassing ervan wordt geïllustreerd in figuur 1.

1. Productie van naïeve MoDC's

OPMERKING: Volbloedmonsters werden verkregen van een enkel pathogeenvrij kalf door jugulaire aderpunctie met gehepariniseerde vacutainers (acht bloedbuizen van 9 ml werden gebruikt voor deze studie). Transporteer het bloed in een ijskist. Bewaar de monsters bij 2-4 °C voor later gebruik of verwerk ze onmiddellijk. Houd het bloed draaiende om bloedstolling te voorkomen. Steriliseer de vacutainers met 70% ethanol. Alle volgende experimenten werden uitgevoerd met één biologisch monster en zes technische replicaties.

  1. Dichtheidsgradiëntcentrifugatie om PBMC's te isoleren uit het gehepariniseerde bloed
    1. Meng het bloed goed door het 10x om te keren.
    2. Breng met behulp van een pipet van 10 ml 20 ml gehepariniseerd bloed over naar een steriele buis van 50 ml en verdun deze met 10 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
    3. Pipetteer 15 ml lymfocytenisolatiemedium tot een steriele buis van 50 ml.
      OPMERKING: Laat het lymfocytenisolerende medium op kamertemperatuur komen voordat u gaat pipetteren.
    4. Kantel de buis van 50 ml met het lymfocytenisolatiemedium in een positie van 45°. Richt de punt van een pipet van 25 ml loodrecht en leg de 30 ml bloed-PBS voorzichtig op het lymfocytenisolatiemedium, zonder de twee te mengen. Breng heel langzaam de buis van 50 ml terug naar een verticale positie.
    5. Centrifugeer bij 800 × g gedurende 35 minuten bij 20 °C bij maximale acceleratie en zonder remmen (vertragingsfunctie uitgeschakeld).
    6. Gebruik een Pasteur-pipet om de PBMC-laag (de dunne witte laag direct na de eerste laag plasma) te verzamelen en over te brengen in een nieuwe buis van 50 ml.
      OPMERKING: Dichtheidsgradiëntcentrifugatie scheidt volbloed in verschillende lagen. Als gevolg hiervan bezinken de erytrocyten aan de onderkant als een pellet, de mononucleaire cellen (PBMC's) bezinken op de interfacelaag en vormt het plasma de bovenste laag. Granulocyten worden gevonden tussen de pellet en de PBMC-laag.
    7. Was de geoogste PBMC's 2x door PBS toe te voegen tot een volume van 40 ml en meng grondig door op en neer te pipetteren. Centrifugeer vervolgens gedurende 7 minuten bij 500 × g bij 4 °C met maximale versnelling en maximale vertraging.
    8. Gooi het supernatant weg door decantatie, resuspensie van de pellet in 15 ml 1x ammoniumchloride-kalium (ACK) buffer en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10-15 minuten.
      OPMERKING: Incubeer niet langer dan 15 minuten. In de handel verkrijgbare ACK-buffer wordt gebruikt om de lysis van de resterende rode bloedcellen (RBC's) in de PBMC-fractie te waarborgen.
    9. Voeg PBS toe tot een volume van 40 ml en centrifugeer vervolgens gedurende 7 minuten bij 500 × g en 4 °C met maximale versnelling en vertraging.
    10. Gooi het supernatant weg door te decanteren en herhaal stap 1.1.9.
    11. Gooi het supernatant weg en resuspensie de pellet in 10 ml volledig kweekmedium (bij kamertemperatuur).
      OPMERKING: Het volledige kweekmedium bestaat uit RPMI 1640 celkweekmedium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine.
  2. Magnetische scheiding van de CD14+/− cellen van de PBMC-populatie met behulp van CD14-geconjugeerde magnetische kralen
    1. Tel de cellen met een schone hemocytometer celteller met behulp van 10 μL celsuspensie gemengd met 10 μL trypan blauwe (0,4%) oplossing.
      OPMERKING: Trypan blauwe kleurstof is een giftige chemische stof en potentieel carcinogeen. Het moet worden gehanteerd terwijl u persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM' s) draagt om contact te voorkomen, en afval moet worden weggegooid in een luchtdichte gespecialiseerde container voor giftig afval. Dode cellen zullen blauw lijken, terwijl levende cellen helder onder de microscoop zullen verschijnen.
    2. Centrifugeer gedurende 7 minuten bij 500 × g.
    3. Gooi het supernatant weg met behulp van een pipet en resuspensie van de pellet in fluorescentie-geactiveerde celsorteerbuffer (FACS) met een volume van 40 μL voor elke 1 × 107 cellen. Meng grondig met behulp van een pipet.
      OPMERKING: FACS-buffer bestaat uit 2% FBS en 2 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) opgelost in PBS.
    4. Voeg 5 μL CD14 microbeadbuffer per 1 × 107 cellen toe en meng grondig met een pipet.
    5. Incubeer gedurende 30 minuten bij 4-8 °C voor de positieve selectie van runder-CD14+ monocyten33. Vortex elke 15 minuten tijdens de incubatietijd.
    6. Optionele stap (voor flowcytometrie-analyse): Voeg 10 μL CD14-FITC (fluoresceïne-isothiocyanaat) kleuringsantilichaam toe met daaropvolgende incubatie gedurende 15 minuten bij 4-8 °C. Raadpleeg de flowcytometrie-analyse in stap 5 voor meer informatie.
    7. Voeg 1 ml FACS-buffer toe en centrifugeer gedurende 7 minuten bij 500 × g.
    8. Gooi het supernatant weg en resuspensie van de pellet in 500 μL FACS-buffer per 1 ×10 8 cellen.
    9. Plaats de immunomagnetische celscheidingskolom in de separator (magnetische kolomhouder) en plaats een opvangbuis van 15 ml onder de kolomuitlaat voor het opvangen van de doorstroming.
    10. Was de kolom met 1 ml ontgaste FACS-buffer. Vervang na het spoelen de gebruikte buis van 15 ml door een nieuwe.
    11. Laat de celsuspensie (vanaf stap 1.2.8) door de kolom gaan door 1 × 108 cellen in 500 μL buffer per keer te pipetteren.
      OPMERKING: Let op dat u geen luchtbellen genereert tijdens het mengen van de cellen voordat u ze door de kolom laat.
    12. Spoel de kolom 3x af met telkens 3 ml ontgaste FACS-buffer.
    13. Verzamel de doorstroming en label deze eerste geëlueerde fractie als de CD14− -celfractie (PBMC's minus CD14+ monocyten); Dit wordt ook wel de naïeve lymfocytenfractie genoemd.
      OPMERKING: De CD14− -cellen worden in volledig kweekmedium bewaard totdat antigeengepulseerde MoDC's worden geproduceerd.
    14. Verwijder de kolom uit het scheidingsteken.
    15. Plaats een nieuwe steriele buis van 15 ml onder de kolom voor het opvangen van het effluent.
    16. Pipetteer 5 ml FACS-buffer in de kolom en duw deze er onmiddellijk doorheen met een zuiger.
    17. Verzamel de doorstroming en label deze tweede geëlueerde fractie als de CD14+ celfractie; Dit wordt ook wel de naïeve monocytenfractie genoemd.
    18. Voeg een compleet kweekmedium toe aan de geoogste CD14+ monocyten om 1 × 106 cellen/ml te verkrijgen.
      OPMERKING: Tel de levende cellen in de geëlueerde CD14+ celfractie om het volume van het volledige kweekmedium te schatten dat nodig is om het gewenste celgetal te bereiken.
    19. Neem een steriele plaat met 24 putten en voeg 1 ml van de celsuspensie (1 × 106 cellen / ml) toe aan elke put.
  3. Differentiatie van de CD14+ naïeve monocyten in naïeve MoDC's door toevoeging van 3% w/v cytokinecocktail (GM-CSF + IL-4) met in totaal 5 dagen incubatie
    1. Vul elke put met CD14+ monocyten aan met 40 μL (3% m/v) van de cytokinecocktail in de kit.
    2. Incubeer de plaat in een bevochtigde incubator met 5% CO2 en bij 37 °C gedurende 48 uur.
    3. Breng op dag 2 de helft van de inhoud van elke put (500 μL) met behulp van een pipet over in afzonderlijke buizen van 1,5 ml en centrifugeer gedurende 7 minuten bij 500 × g bij 4 °C.
    4. Gooi het supernatant weg en resuspensie van de pellet in 500 μL vers volledig kweekmedium.
    5. Breng 500 μL van deze celsuspensie van stap 1.3.4 terug naar elke aangewezen put, zodat het uiteindelijke volume 1 ml is.
    6. Verrijk elk putje met 20 μL cytokinecocktail.
    7. Incubeer de kweek gedurende 72 uur in een bevochtigde incubator met 5% CO2 en bij 37 °C.
    8. Verwijder na de incubatie op dag 5 de plaat uit de couveuse.
      OPMERKING: Elke put bevat 1 ml van een celsuspensie van naïeve MoDC's. Het aantal MoDC's is een percentage (~20%) van de oorspronkelijke monocyten (1 × 106/ml).

2. MoDC endocytische activiteit assay

OPMERKING: De antigeenopnametest of endocytische activiteitstest meet het vermogen van naïeve MoDC's om vreemd materiaal te internaliseren. Voer de test uit met naïeve MoDC's gekweekt met 3% w / v cytokinecocktail en met 5 dagen incubatie, zoals eerder beschreven34.

  1. Oogst de naïeve MoDC-celsuspensie van de 24-putplaat en breng deze over naar een buis van 15 ml; verzamel ook eventuele resterende cellen door de putten te spoelen met PBS.
  2. Centrifugeer gedurende 500 × g gedurende 7 min. Gooi het supernatant weg en resuspensie de pellet in 1 ml kweekmedium aangevuld met 1% FBS.
  3. Tel de levende MoDC-cellen om het volume medium te schatten dat nodig is om het gewenste celgetal te bereiken (2 × 105 cellen/ml).
  4. Kweek de naïeve MoDC's in 100 μL volledig kweekmedium in een 24-well plaat met een uiteindelijke celconcentratie van 2 × 105 cellen/ml.
  5. Vul elke put aan met 1 mg / ml FITC-geconjugeerd dextran (fluorescerende sonde gebruikt als de endocytose tracer).
    OPMERKING: De FITC-dextran werkt als een fluorescerende sonde en wordt gebruikt als een endocytose tracer.
  6. Dek de plaat af en incubeer in het donker bij 5% CO2 en 37 °C gedurende 60 min.
    OPMERKING: Incubeer voor de achtergrondcontrole de extra MoDC-cellen (2 × 105 cellen / ml) met 1 mg / ml FITC-dextran op ijs, omdat dit type incubatie voorkomt dat het tracermolecuul (FITC-dextran) in de cellen binnendringt.
  7. Breng na incubatie onmiddellijk de 24-putplaat op ijs over om de endocytose van FITC-dextran te stoppen.
  8. Was de cellen met ijskoude FACS-buffer.
  9. Oogst, centrifugeer en resuspensie van de pellet in 500 μL FACS-buffer.
  10. Analyseer de fluorescentie-intensiteit van het FITC-dextran in de cellen met behulp van flowcytometrie. Raadpleeg de flowcytometrie-analyse in stap 5.2 voor meer informatie.

3. Generatie van antigeen-gepulseerde MoDC's

OPMERKING: Een commercieel verkrijgbaar en klinisch goedgekeurd vaccin tegen rabiësvirus (RV) kan de differentiatie van naïeve MoDC's in volwassen antigeen-presenterende MoDC's induceren. Gebruik 0,1% (~ 1 μL) van een enkele RV-vaccinatiedosis om antigeen-gepulseerde MoDC's te genereren. Bovendien verdient het de voorkeur om RV-gepulste MoDC's te produceren in dezelfde kweekplaat die wordt gebruikt (in stap 1.3.8) om naïeve MoDC's te genereren, omdat het overbrengen van de naïeve MoDC's naar een nieuwe 24-putplaat een negatief effect op hen zal hebben.

  1. Vanaf stap 1.3.8) Voeg 1 μL/ml RV-suspensie toe aan 1 ml naïeve MoDC-cultuur in de 24-putplaat en incubeer gedurende 48 uur bij 5% CO2 en 37 °C.
    OPMERKING: Naïeve MoDC's gekweekt zonder RV-stimulatie worden gebruikt als achtergrondcontrole (en als niet-specifieke stimulatie voor co-cultuur met lymfocyten in de volgende stappen).
  2. Houd na incubatie, op dag 7, de 24-putplaat met de antigeen-gepulseerde MoDC's gedurende 10 minuten op ijs.
  3. Voeg 1 ml ijskoude PBS per put toe. Meng elk goed grondig door pipetteren en breng de suspensie over in een buis van 15 ml.
  4. Was de putjes met 2 ml ijskoude PBS om de resterende cellen in elke put te verzamelen.
  5. Breng de inhoud over in hun respectievelijke buizen en centrifugeer de celsuspensie gedurende 7 minuten op 500 × g .
  6. Gooi het supernatant weg, resuspendien de celkorrel (antigeengepulseerde MoDC's) in volledig kweekmedium en pas het volume aan tot een uiteindelijke celconcentratie van 1 × 105 cellen/ml.
    OPMERKING: Tel de levende cellen om het volume van het medium te schatten dat nodig is om het gewenste celgetal te bereiken. Gebruik RV-gepulseerde MoDC's vanaf dag 7 voor het MoDC-lymfocyt co-cultuur systeem.

4. MoDC-lymfocyten co-cultuur

OPMERKING: Het in vitro MoDC-lymfocytencocultuursysteem bepaalt het vermogen van MoDC's om antigeenspecifieke lymfocyten te primen. De verschillende behandelingsgroepen van cellen na 16 dagen co-cultuur omvatten specifieke, niet-specifieke en controle. De specifieke groep wordt gedefinieerd als lymfocyten die samen met RV-gepulseerde MoDC's zijn gekweekt; de niet-specifieke groep wordt gedefinieerd als lymfocyten die samen met niet-antigeengepulseerde MoDC's worden gekweekt; en de controlegroep wordt gedefinieerd als lymfocyten gekweekt zonder MoDC's.

  1. Voeg een volledig kweekmedium toe aan de geëlueerde naïeve lymfocytenfractie (CD14− cellen) om een celconcentratie van 2 × 106 cellen/ml te bereiken.
    OPMERKING: Tel de levende cellen in de CD14− -celcultuur die sinds hun verzameling in een volledig kweekmedium in een 24-well-plaat zijn bewaard om het volume medium te schatten dat nodig is om het gewenste celgetal te bereiken.
  2. Neem op dag 7 een steriele plaat met 24 putten en zaai de putjes in met 1 ml naïeve lymfocytencelsuspensie (2 × 106 cel / ml) plus 1 ml antigeen-gepulseerde of niet-antigeen-gepulste MoDC-suspensie (1 × 105 cel / ml).
    OPMERKING: Het totale volume in elke put is 2 ml met een verhouding van 1:20 MoDC's tot lymfocyten per put.
  3. Incubeer de plaat gedurende 48 uur bij 37 °C en 5% CO2.
  4. Kweekverrijking en -restimulatie met antigeen-gepulseerde MoDC's
    1. Na de incubatie van de antigeen-gepulseerde MoDC-lymfocytencocultuur, op dag 9, vul elke put aan met 20 ng / ml recombinant IL-2 en blijf nog eens 120 uur incuberen (5 dagen incubatie).
    2. Breng op dag 14 1 ml van de co-cultuur over in een steriele buis van 1,5 ml en centrifugeer gedurende 7 minuten op 500 × g .
    3. Gooi het supernatant weg en resuspensie van de celpellet met 1 ml antigeen-gepulseerde of niet-gepulseerde MoDC's (1 × 105 cel / ml). Meng voorzichtig door pipetteren en breng de celsuspensies terug naar hun aangewezen putjes.
      OPMERKING: Bij deze stap is het totale volume in elke put 2 ml.
    4. Ga door met incubatie bij 5% CO2 en 37 °C gedurende 48 uur. Na incubatie op dag 16 is de co-cultuur klaar voor analyse met behulp van flowcytometrie, qPCR en ELISA.
      OPMERKING: Voor elke 2 ml in elke put van de MoDC-lymfocytencocultuur wordt 1 ml geresuspendeerde cellen gekleurd voor flowcytometrie, 1 ml wordt gebruikt voor RNA-extractie en de supernatanten van beide worden gebruikt voor ELISA.

5. Flowcytometrische analyse

OPMERKING: Kleur de cellen met de juiste markers/mAb voordat u de monsters op een flowcytometer uitvoert. Raadpleeg de materiaaltabel voor meer informatie over de reagentia (kleuring mAb- en isotypecontroles), de kit, het instrument en de software die worden gebruikt voor de analyse van de flowcytometrie.

  1. Flow cytometer kleuringsprotocol
    OPMERKING: Voer celoppervlakkleuring uit voor de PBMC's en naïeve lymfocyten en monocyten met behulp van anti-CD14 mAb (stap 1.2.6). Gebruik voor de celoppervlakkleuring van naïeve MoDC's anti-CD86-specifieke, anti-CD40-specifieke en anti-MHC II-specifieke mAb. Gebruik voor de celoppervlakkleuring van cellen vanaf dag 16 co-culturen anti-CD4, anti-CD8, anti-CD25 mAbs; gebruik voor intracellulaire kleuring anti-Ki-67 mAb. Bovendien kleurt u de cellen met negatieve isotypecontrole mAb of zonder mAb (FMO: fluorescerend min één). Het belangrijkste verschil bij het kleuren voor oppervlakte- en intracellulaire markers is dat voor celoppervlakmarkers de cellen moeten worden gekleurd met specifieke oppervlakte-mAb voorafgaand aan levend / dood (L / D) kleuring of andere processen. Intracellulaire kleuring wordt echter uitgevoerd na L / D-kleuring en vereist een fixatie plus permeabilisatiestap om intracellulaire penetratie mogelijk te maken.
    1. Breng 1 ml celsuspensie over in een steriele buis van 1,5 ml met behulp van een pipet en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 500 × g.
      OPMERKING: Bewaar na centrifugatie bij het verwerken van de cellen uit de MoDC-lymfocytencocultuur het supernatant voor ELISA-analyse.
    2. Resuspensie van de pellet in 1 ml PBS en breng deze over in een buis van 15 ml. Verzamel de resterende cellen met behulp van 1 ml PBS en combineer dit met de geresuspendeerde pellet.
    3. Voeg 10 ml PBS toe aan de buis van 15 ml met de cellen, meng door pipetteren en centrifugeer gedurende 7 minuten bij 850 x g.
    4. Gooi het supernatant weg en herhaal stap 5.1.3.
    5. Gooi het supernatant weg en resuspensie de celkorrel voorzichtig met de resterende suspensie (ongeveer 180 μL) die overblijft na het decanteren van het supernatant.
    6. Breng de celophanging over op een V-bodem 96-putplaat en sluit de putten af om morsen te voorkomen.
    7. Centrifugeer de plaat gedurende 5 minuten op 1.400 × g . Veeg na het centrifugeren de plaat over een afvalcontainer om de putten van vloeistof te legen en tik de plaat op absorberend papier om ervoor te zorgen dat overtollige vloeistof wordt verwijderd.
    8. Voeg 25 μL oppervlaktekleuringshoofdmengsel per put toe en meng voorzichtig met een pipet, gevolgd door incubatie bij 4 °C gedurende 30 minuten.
      OPMERKING: Om oppervlaktekleuringsmastermix voor een enkele put te bereiden, voegt u 2,5 μL oppervlakte-mAb toe aan 20 μL FACS-buffer.
    9. Voeg 200 μL FACS-buffer per put toe en centrifugeer gedurende 5 minuten op 1.400 × g . Na het centrifugeren leegt u de putten van vloeistof door te decanteren en tikt u de plaat op absorberend papier om overtollige vloeistof te verwijderen.
    10. Voeg 100 μL L/D-kleuringsoplossing per put toe. Meng grondig met een pipet, gevolgd door incubatie bij 4 °C gedurende 15 minuten in het donker.
      OPMERKING: Los voor een enkele put 0,25 μL L/D-kleurstof op in 100 μL FACS-buffer. De L/D-kleurstof helpt onderscheid te maken tussen levende en dode cellen.
    11. Voeg 100 μL FACS-buffer toe. Bedek de putjes met het deksel en centrifugeer de plaat gedurende 1.400 × g gedurende 5 minuten. Gooi het supernatant weg door te decanteren en tik op de plaat op absorberend papier.
    12. Herhaal stap 5.1.11.
    13. Voeg 50 μL fixatieoplossing per put toe (meegeleverd met de kit) en meng met een pipet voordat u de plaat gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker incubeert.
    14. Voeg 150 μL van de 1x permeabilisatie-wasbuffer (PW) toe die bij de kit is geleverd en bedek de putjes met het deksel.
      OPMERKING: Om 10 ml 1x PW-buffer te bereiden, verdunt u 1 ml 10x permanentbuffer in 10 ml dH2O.
    15. Centrifugeer de plaat gedurende 5 minuten bij 1.400 × g bij 4 °C. Gooi het supernatant weg door te decanteren en tik op de plaat op absorberend papier.
    16. Voeg 200 μL 1x PW toe, gevolgd door centrifugeren bij 1.400 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg door te decanteren en tik op de plaat op absorberend papier.
    17. Voeg voor intracellulaire kleuring 25 μL intracellulaire kleuringsmastermix (anti-humane Ki-67 mAb) per put toe. Meng goed en incubeer de plaat gedurende 30 minuten bij 4 °C of op ijs in het donker.
      OPMERKING: Om intracellulaire kleuringsmastermix voor een enkele put te bereiden, voegt u 1 μL Ki-67 mAb toe aan 24 μL 1x PW. De intracellulaire kleuringsmarker wordt alleen gebruikt bij het verwerken van cellen vanaf dag 16 co-cultuur. Intracellulaire kleuring wordt niet gedaan tijdens het verwerken van PBMC's, naïeve lymfocyten, monocyten en naïeve MoDC's.
    18. Voeg na incubatie 200 μL 1x PW toe aan elke put. Meng met een pipet en centrifugeer gedurende 1.400 × g gedurende 5 minuten. Gooi het supernatant weg door te decanteren en tik op de plaat op absorberend papier.
    19. Voeg 200 μL FACS-buffer toe, gevolgd door centrifugeren bij 1.400 × g gedurende 5 minuten. Gooi het supernatant weg door te decanteren en tik op de plaat op absorberend papier.
    20. Resuspendie van de celpellet in 200 μL FACS-buffer en breng de inhoud van elke put over naar afzonderlijke steriele flowcytometerbuizen. Gebruik 300 μL FACS-buffer per put om de resterende cellen te verzamelen. De cellen zijn nu klaar voor flowcytometrie-analyse.
  2. Het monster uitvoeren op een flowcytometer
    OPMERKING: De monsters werden uitgevoerd op een flowcytometer (met behulp van 488 nm, 638 nm en 405 nm lasers) volgens de handleiding van de fabrikant35. Raadpleeg de handleiding voor meer informatie, probleemoplossing en aanpassing van het protocol.
    1. Voer routinematige reinigingsprocedures uit voor en na het lezen van de monsters.
      OPMERKING: Sla geen positie over tijdens het laden van de buizen in het instrument.
      1. Gebruik voor de reinigingscyclus in totaal vier buizen, waarbij de eerste buis een stroomreinigingsreagens bevat en de overige drie buizen dH2O bevatten; elke buis heeft 3 ml. Verkrijg tijdens de reinigingsrun gegevens met een gemiddeld debiet gedurende ongeveer 1 minuut door 100.000 gebeurtenissen per buis onder 330 V vast te leggen voor voorwaartse verstrooiing (FSC) tegen 265 V voor zijverstrooiing (SSC).
        OPMERKING: Er mogen geen vuil of cellulaire gebeurtenissen worden gemeld tijdens de reiniging; Als dit gebeurt, voert u de reinigingsstap opnieuw uit. Voor het uitvoeren van de monsters, moet u ervoor zorgen dat alle monsters zich in een homogene suspensie bevinden voordat u de gegevens ophaalt, omdat dit een nauwkeurige meting garandeert.
    2. Om de cytometer aan te sluiten en in te schakelen, klikt u op de toepassingsknop in de linkerhoek van de titelbalk. Selecteer in het vervolgkeuzemenu van de toepassing de optie Cytometrie en klik op de optie Inschakelen.
      OPMERKING: Vanuit het vervolgkeuzemenu van de toepassing kunnen gebruikers met de optie Openen door de voorgeprogrammeerde assays bladeren, terwijl gebruikers met de optie Nieuw protocol nieuwe protocollen kunnen maken.
    3. Laad in eerste instantie het negatieve controlemonster in de houder met meerdere buizen. Selecteer Nieuw protocol en bekijk de werklijst aan de linkerkant van de werkruimte/het scherm.
    4. Definieer op de werklijst de positie van het monster in de houder met meerdere buizen en geef een naam aan het monster en het protocol voor identificatie.
    5. Pas in het hardwarepaneel aan de linkerkant van de werkruimte meerdere parameters aan en selecteer deze, zoals de detectoren (FSC, SSC en 10 fluorescentiebereiken), de spanningen (V ) en winsten van de fotomultipliers en de gebiedshoogte-breedte (AHW) van het signaal.
      OPMERKING: De volgende instellingen voor de detectoren zijn geselecteerd op basis van het experiment en het gebruikte instrument: FSC-AHW: AHW, V: 270, G: 5; SSC-AHW: A, V: 350, G: 10; FL1 (CD8/FITC Dextran)-AHW: A, V: 400, G: 1; FL2 (CD25/PE)-AHW: A, V: 500, G: 1; FL6 (CD4/Alexa Fluor 647)-AHW: A, V: 700, G: 1; FL7 (Ki-67/Alexa Fluor 700)-AHW: A, V: 625, G: 1; FL9 (L/D)-AHW: A, V: 425, G: 1.
    6. Pas in het configuratiescherm voor instrumentacquisitie onder de titelbalk de gewenste opties aan voor debiet (gemiddeld), tijd (5 min) en gebeurtenissen (zie stap 5.2.8). Klik op de optie Single verwerven om het instrument in staat te stellen het monster te tekenen / uit te voeren en de real-time preview van de gedetecteerde gebeurtenissen weer te geven.
    7. Pas vanuit de real-time preview de drempel van fluorescentie (spanning en versterking) en celgrootte aan om uiteindelijk poorten rond de gewenste celpopulatie te tekenen terwijl cellulair puin wordt uitgesloten.
      OPMERKING: FSC helpt om cellen te onderscheiden op basis van grootte, waardoor gebruikers onderscheid kunnen maken tussen cellen van het immuunsysteem, zoals monocyten en lymfocyten; monocyten zijn groter en vertonen een hogere FSC-intensiteit in vergelijking met lymfocyten.
    8. Verkrijg in totaal ongeveer 5.000 live MoDC, 50.000 live lymfocyten en 50.000 live monocytengebeurtenissen.
    9. Zodra alle parameters zijn aangepast met betrekking tot het negatieve controlemonster, klikt u op Stoppen en slaat u het protocol op.
    10. Laad nu alle monsters op de multi-tube lader. Definieer elk voorbeeld in de werklijst en pas de parameters die zijn aangepast met betrekking tot het negatieve besturingselement toe op alle monsters in het experiment. Klik op de optie Verkrijgen om alle voorbeelden in het experiment achtereenvolgens uit te voeren.
    11. Zodra de gegevens van alle monsters zijn verkregen, slaat u deze op en transformeert u deze in leesbare gegevens met behulp van een geschikte gegevensanalysesoftware waarmee sequentiële biparametrische en monoparametrische histogrammen kunnen worden gegenereerd.

6. Messenger RNA (mRNA) expressie analyse

  1. RNA-extractie
    OPMERKING: Extraheer totaal RNA uit de antigeen-gepulseerde MoDC-lymfocyt co-cultuur (specifiek), de niet-antigeen-gepulseerde MoDC-lymfocyt co-cultuur (niet-specifiek), de lymfocytencultuur zonder MoDC's (controle) en uit naïeve lymfocyten (CD14− cellen geïsoleerd voorafgaand aan co-kweek). Bereid voor de RNA-extractie ethanol met RNase-vrij water. Raadpleeg de materiaaltabel voor meer informatie over de extractiekit en reagentia.
    1. Breng 1 ml celsuspensie over van de MoDC-lymfocytencocultuurplaat (~ 1 × 106 cellen / ml) naar een steriele 1,5 ml steriele buis met behulp van een pipet en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 500 × g.
    2. Bewaar het supernatant voor ELISA. Resuspendeer de celpellet in 1 ml PBS en breng deze over in een buis van 15 ml. Verzamel eventuele resterende cellen met behulp van 1 ml PBS.
    3. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 500 × g.
      OPMERKING: Alle monsters moeten voorzichtig worden behandeld als levende cellen totdat cellysis wordt uitgevoerd met behulp van de lysisbuffer die in de kit wordt geleverd. Celdood geeft RNases vrij die snel de RNA-sjablonen hydrolyseren die nodig zijn voor kwantificering stroomafwaarts. RLT-buffer lyseert cellen in een oplossing die RNases remt.
    4. Voeg 350 μL lysisbuffer toe aan elke lege put en incuber gedurende 2-3 minuten om de aanhangende cellen te lyseren die niet in de vorige stappen zijn geoogst.
    5. Zodra de centrifugatie in stap 6.1.3 is voltooid, gooit u het supernatant weg en combineert u de celpellet met de 350 μL lysisbuffer die in stap 6.1.4 is toegevoegd.
      OPMERKING: Op dit punt is het mogelijk om de buizen op te slaan bij −80 °C of door te gaan met RNA-extractie (volgende stappen).
    6. Pipetteer 350 μL van 70% ethanol naar het lysaat in stap 6.1.5. Het uiteindelijke volume per monster is 700 μL.
    7. Plaats de extractiekolom in een opvangbuis van 2 ml (meegeleverd met de kit).
    8. Breng het monster van 700 μL per extractiekolom over en centrifugeer gedurende 15 s met 10.000 × g . Gooi de doorstroming in de opvangbuis weg en plaats deze terug in de draaikolom.
    9. Voeg in de extractiekolom 350 μL strenge wasbuffer toe (meegeleverd in de kit) en centrifugeer gedurende 15 s met meer dan 10.000 × g . Gooi de doorstroming weg.
    10. Voeg 80 μL DNase I-incubatiemix per monster toe aan het membraan van de extractiekolom en laat het gedurende 15 minuten op 20-30 °C inwerken.
      OPMERKING: Om DNase I-incubatiemix per monster te bereiden, voegt u 10 μL DNase I-stamoplossing toe aan 70 μL DNase-buffer voor een eindvolume van 80 μL. Meng grondig door de buis meerdere keren om te keren, gevolgd door een korte spin in de centrifuge.
    11. Was de extractiekolom met 350 μL strenge wasbuffer, gevolgd door centrifugeren op 10.000 × g gedurende 15 minuten. Gooi de doorstroming in de opvangbuis na centrifugeren weg.
    12. Was de extractiekolom 2x met 500 μL milde wasbuffer telkens en met centrifugeren op 10.000 × g gedurende 15 s en een tweede keer gedurende 2 min. Gooi de doorstroming na elke centrifugatie weg.
    13. Centrifugeer de kolom op maximale snelheid gedurende 1 minuut om het membraan te drogen en gooi de opvangbuis weg.
    14. Plaats de afzuigkolom in een nieuwe opvangbuis van 1,5 ml.
    15. Pipetteer 50 μL RNase-vrij water op het kolommembraan en incubeer gedurende 3-5 minuten bij kamertemperatuur.
      OPMERKING: Voor RNA-concentraties lager dan 100 ng, verlaag het elutievolume tot 30 μl en elueer het membraan van de extractiekolom opnieuw met behulp van het product van de eerste elutie om het eindproduct te concentreren.
    16. Centrifugeer bij 10.000 × g gedurende 1 minuut om het RNA te elueren.
    17. Meet de concentratie van RNA door de absorptie bij 260 nm te detecteren met behulp van 0,5-2 μL monster. Pas de uiteindelijke RNA-concentratie aan op 0,1-1 μg/μl met behulp van RNase-vrij water.
    18. Bewaar de RNA-aliquots bij −80 °C voor later gebruik.
  2. Synthese van complementair DNA
    1. Synthetiseer complementair DNA (cDNA) uit geëxtraheerd sjabloon-RNA volgens het protocol van de fabrikant dat bij de kit is geleverd (raadpleeg de materiaaltabel voor meer informatie).
      OPMERKING: Een samenvatting van de gebruikte reagentia en de gebruikte volumes is weergegeven in tabel 1 en tabel 2. Een volledig protocol is gedetailleerd in Aanvullend Dossier 1.
  3. Real-time kwantitatieve polymerase kettingreactie
    1. Voor qPCR voert u de cDNA-monsters in drievoud uit. Kwantificeer de runder-mRNA-transcriptniveaus voor Ki-67 en IFN-γ met behulp van specifieke primersets met betrekking tot het GAPDH-gen , zoals weergegeven in tabel 3.
      OPMERKING: Een volledig protocol wordt gedetailleerd beschreven in Aanvullend Dossier 1.

7. Enzymgebonden immunosorbenttest

  1. Verwerk de verzamelde kweeksupernatanten die rijk zijn aan secretoire eiwitten voor de kwantificering van IFN-γ via ELISA.
    OPMERKING: Raadpleeg de materiaaltabel voor meer informatie over het gebruik van de kit. Een volledig protocol is gedetailleerd in Aanvullend Dossier 1.

8. Statistische analyse

  1. Analyseer de gegevens en maak grafische illustraties van experimenteel ontwerp met behulp van commerciële software. Gebruik een ongepaarde niet-parametrische test voor de vergelijkende analyse. Beschouw P-waarden < 0,05 als statistisch significant.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Deze methodologie beschrijft de in vitro generatie van runder-MoDC's voor de evaluatie van kandidaat-vaccinantigenen voorafgaand aan het uitvoeren van in vivo studies. Figuur 1 illustreert het experimentele schema van de productie van MoDC's bij runderen en de toepassing van de MoDC's voor de in vitro test. Met behulp van de magnetische celsorteertechniek was het mogelijk om ongeveer 26 miljoen CD14+ myocyten te verzamelen uit de geoogste PBMC's, die eerder werden geïsoleerd uit 50 ml runderbloed. De geëlueerde celfractie vrij van CD14+ monocyten was rijk aan lymfocyten en werd gebruikt als bron van naïeve CD4+ en CD8+ T-cellen (CD14− lymfocytencelfractie).

De naïeve monocytenfractie bestond voor 98% uit CD14+ monocytencellen, zoals waargenomen na CD14-celkleuring en flowcytometrie (figuur 2A,B). De gezuiverde naïeve monocytencellen, wanneer ze werden gekweekt in aanwezigheid van de 3% cytokinecocktail (GM-CSF en IL-4) met een daaropvolgende incubatie van 5 dagen, gedifferentieerd tot een DC-achtig fenotype. Uit een startkweek van 26 miljoen CD14+ monocyten konden na 5 dagen incubatie in totaal ongeveer 12 miljoen MoDC's worden verkregen. De naïeve MoDC's waren functioneel in staat tot antigeenopname, zoals waargenomen met behulp van de flowcytometrie-analyse van FITC-dextran (figuur 3). Bovendien werden de naïeve MoDC's fenotypisch gekenmerkt door het beoordelen van de expressie van MHC klasse II en co-stimulerende CD86 en CD40 celoppervlakmarkers, die het DC-achtige fenotype valideerden (figuur 4).

De antigeen-gepulseerde stimulatie van naïeve MoDC's werd bereikt door ze gedurende 2 dagen te kweken in de aanwezigheid van geïnactiveerde RV. De activering van naïeve lymfocyten (de CD14− celfractie) werd bereikt door antigeen-gepulseerde MoDC-lymfocyten co-kweek met de daaropvolgende suppletie van IL-2. Tijdens de MoDC-lymfocytencocultuur op dag 9 werd een morfologische verandering waargenomen in de RV-gepulseerde MoDC's, omdat ze dendrietextensie vertoonden, wat een kenmerk is van MoDC-rijping (figuur 5). Op dag 14 werd de activering van lymfocyten versterkt door de co-cultuur te restimuleren door de toevoeging van nieuw geproduceerde RV-gepulseerde MoDC's van hetzelfde dier.

Vergeleken met de niet-gepulseerde MoDC-lymfocytencocultuur werd een significante toename (p < 0,01) in lymfocytenproliferatie aangetoond door de upregulatie van de Ki-67- en CD25-activeringsmarkers op zowel de CD4+ als de CD8+ T-cellen op dag 16 in de gepulseerde MoDC-lymfocytencocultuur (figuur 6). De CD8+ T-cellen uit de volwassen RV-gepulseerde MoDC-coculturen vertoonden een achtvoudige upregulatie (p < 0,01) van Ki-67 in vergelijking met de niet-specifieke groep (figuur 7A). De CD4+ T-cellen in dezelfde co-cultuur vertoonden een zevenvoudige toename (p < 0,01) in Ki-67 in vergelijking met controles (figuur 7B). Dit toont het vermogen van RV-geprimeerde MoDC's om het RV-antigeen met succes te presenteren aan naïeve lymfocyten en ze vervolgens te activeren in een in vitro toestand, vergelijkbaar met wat er gebeurt in een levend dier. Naast het analyseren van de cellen met behulp van flowcytometrie, werden de coculturen ook onderworpen aan qPCR en ELISA om de RV-specifieke lymfocytenactivatie te kwantificeren met behulp van respectievelijk RNA-transcriptie (Ki-67 en IFN-γ) en extracellulaire secretie (IFN-γ) (figuur 8). Deze aanvullende detectiemethoden kunnen ook worden gebruikt als bevestigingstests om de resultaten van flowcytometrie verder te valideren. De RNA-expressie voor Ki-67 en IFN-γ aangetoond door qPCR en de IFN-γ niveaus aangetoond door ELISA vertoonden vergelijkbare patronen van toename, wat wijst op lymfocytenproliferatie, in de antigeenspecifieke co-cultuur in vergelijking met de niet-specifieke behandelingsgroep. Daarom correleerden de qPCR- en ELISA-resultaten met de flowcytometrieresultaten. De qPCR toonde een toename van >30% in IFN-γ expressie en een toename van >5% in Ki-67-expressie in alle coculturen die GAPDH als kalibrator gebruikten (figuur 8A,B). Een significant hogere concentratie uitgescheiden IFN-γ (**p > 0,01) werd gemeten met ELISA met behulp van kweeksupernatanten uit de RV-gepulseerde MoDC-lymfocytencocultuur in vergelijking met de niet-specifieke behandelingsgroep (figuur 8C).

Figure 1
Figuur 1: Experimenteel ontwerp van de in vitro test op basis van het MoDC bij runderen. (A) Oogsten en sorteren van cellen van de CD14+ monocyten en CD14− lymfocytencelfracties uit runder-PBMC's. Runderbloed wordt verwerkt door dichtheidsgradiëntcentrifugatie om PBMC's te verzamelen, gevolgd door magnetische celsortering met behulp van immunomagnetische celscheidingskolommen en de daaropvolgende kweek van de geoogste CD14+ naïeve monocytencelfractie in aangevuld RPMI 1640-medium. (B) De productie van MoDC's met behulp van 3% cytokinecocktail (GM-CSF + IL-4) met 5 dagen incubatie en MoDC-lymfocytencocultuur. Op dag 0 worden de monocyten gekweekt in aanwezigheid van de cytokinecocktail en gedurende 48 uur geïncubeerd om differentiatie te induceren. Op dag 2 wordt de cultuur opnieuw geïmuleerd met dezelfde cytokinecocktail, gevolgd door incubatie gedurende 72 uur, wat leidt tot de productie van naïeve MoDC's. Op dag 5 wordt het vaccinantigeen (rabiësvaccin) toegevoegd aan de naïeve MoDC-celcultuur, gevolgd door 48 uur incubatie. Op dag 7 wordt de co-kweek van antigeen-gepulseerde MoDC's met naïeve lymfocyten (de CD14− celfractie) uitgevoerd, gevolgd door incubatie. Op dag 9 wordt IL-2 toegevoegd aan de co-cultuur. Op dag 14 wordt de verrijking/restimulatie van de geactiveerde/geprimeerde lymfocyten uitgevoerd door toevoeging van antigeen-gepulseerde MoDC's, gevolgd door incubatie gedurende 48 uur. Ten slotte worden op dag 16 de cellen en het kweeksupernatant geoogst voor de lymfocytenproliferatietest. Afkortingen: MODC's = van boviene monocyten afgeleide dendritische cellen; PBMC's = perifere mononucleaire bloedcellen; GM-CSF = granulocyt-macrofaag-kolonie-stimulerende factor. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Morfologie en zuiverheid van boviene CD14+ monocyten geoogst uit PBMC's met behulp van anti-CD14-geconjugeerde microbeads. (A) Morfologie van rundermonocyten die gedurende 4 uur bij 37 °C in volledig kweekmedium zijn geïncubeerd om microbeads te verwijderen, gefixeerd op met polylysine bedekte glaasjes en gekleurd met gemodificeerde Giemsa-kleuring. Schaalbalk = 50 μm. (B) Flowcytometrie histogram met de geëlueerde CD14+ celfractie met een zuiverheidsniveau van 98,6% waargenomen met behulp van anti-CD14 antilichaam (rood) en FITC-geconjugeerd muis IgG1 isotype controle antilichaam (groen). Afkortingen: PBMC's = perifere mononucleaire bloedcellen; FITC cont = fluoresceïne-isothiocyanaatcontrole. Dit cijfer is aangepast van Kangethe et al., 201811. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: In vitro gegenereerde endocytische activiteit van MoDC's van runderen. Flowcytometrie histogram toont de opname van het tracermolecuul (FITC-dextran) op dag 5 naïeve MoDC's. MoDC's geïncubeerd bij 37 °C gedurende 60 minuten met het tracermolecuul (blauw) en MoDC's geïncubeerd op ijs met het tracermolecuul (grijs) gebruikt als achtergrondcontrole. Afkortingen: MODC's = van boviene monocyten afgeleide dendritische cellen; FITC = fluoresceïne-isothiocyanaat. Dit cijfer is aangepast van Kangethe et al., 201811. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Fenotypering van in vitro gegenereerde boviene MoDC-specifieke celoppervlakmarkers. Flowcytometrie histogrammen voor (A) gating strategieën van MoDC's en voor (B) dag 5 naïeve MoDC's gekleurd met drie verschillende DC-specificmAbs (blauw), waaronder de volgende: anti-schapen MHC II mAb, anti-bovine CD86 mAb, en anti-bovine CD40 mAb. Allemaal vergeleken met hun overeenkomstige isotypecontroles (rood). Afkortingen: DC = dendritische cellen; MODC's = van rundermonocyten afgeleide DC's; MHC II = major histocompatibiliteit complex II. Dit cijfer is aangepast van Kangethe et al., 201811. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Tekenen van rijping van in vitro geproduceerde MoDC's tijdens MoDC-lymfocytencocultuur. Observatie van de karakteristieke uitgebreide dendritische structuur door antigeen-gepulseerde MoDC's met omgekeerde microscopie op dag 9 van de MoDC-lymfocytencocultuur. (A) Volwassen MoDC's binnen een sterk confluent gebied van co-gekweekte lymfocyten. (B) Volwassen MoDC's zijn gemakkelijk te onderscheiden in een gebied met minder lymfocyten in co-cultuur. Schaalstaven = 50 μm. Afkorting: MODC's = van boviene monocyten afgeleide dendritische cellen. Dit cijfer is aangepast van Kangethe et al., 201811. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Sequentiële gatingstrategie aangenomen voor dotplots tegen Ki-67 en CD25-expressie door lymfocyten in MoDC-lymfocytencocultuur. (A) Devolledige gatingstrategie voor cellen geoogst vanaf dag 16 MoDC-lymfocytencocultuur. (B) De Ki-67-expressie van CD4+-gated lymfocyten en (C) van CD8+ lymfocyten vergeleken met de FMO-controle (zonder mAb) en muis IgG1-k isotypecontrole mAb. De CD25-expressie op gated (D) CD8+ en (E) CD4+ lymfocyten vergeleken met muis IgG1 isotype controle mAb. De behandelingsgroep vertegenwoordigt specifiek lymfocyten die samen met RV-gepulseerde MoDC's zijn gekweekt, terwijl de controle lymfocyten vertegenwoordigt die zijn gekweekt in afwezigheid van MoDC's. Afkortingen: MODC's = van boviene monocyten afgeleide dendritische cellen; FMO = fluorescerend min één; RV = rabiës vaccin. Dit cijfer is aangepast van Kangethe et al., 201811. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: Flowcytometrie data-analyse van Ki-67 en CD25 expressie door CD4+ en CD8+ lymfocyten na priming met het antigeen. Ki-67 en CD25 expressie vanaf dag 16 co-cultuur. De behandelingsgroep (specifiek) wordt gedefinieerd als lymfocyten gekweekt met RV-gepulseerde MoDC's; de niet-specifieke groep komt overeen met lymfocyten gekweekt met niet-antigeen-gepulseerde MoDC's; de controlegroep komt overeen met lymfocyten gekweekt zonder MoDC's. De horizontale balken vertegenwoordigen het gemiddelde van zes technische replicaties. (A) Intracellulaire expressie van de Ki-67 marker door CD8 T-cellen en (B) door CD4 T-cellen. (C) Celoppervlakexpressie van de CD25-marker door CD8 T-cellen en (D) door CD4 T-cellen. Afkortingen: MODC's = van boviene monocyten afgeleide dendritische cellen; RV = rabiës vaccin. Dit cijfer is aangepast van Kangethe et al., 201811. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 8
Figuur 8: Th1-marker (IFN-γ en Ki-67) activering door MoDC's geprimed met het rabiësvirusantigeen, zoals gedetecteerd via qPCR en ELISA. Gegevens van één dier met zes technische replica's. De horizontale balken geven het gemiddelde weer. Drie PCR-replicaties getoond als vouwveranderingen in vergelijking met naïeve lymfocyten na normalisatie met een GAPDH-referentiegen . (A) IFN-γ uitdrukking, (B) Ki-67 uitdrukking. (C) Vergelijking van IFN-γ secretie in het kweeksupernatant tussen drie behandelingsgroepen, zoals gedetecteerd door ELISA. De specifieke groep wordt gedefinieerd als lymfocyten gekweekt met RV-gepulseerde MoDC's; de niet-specifieke groep komt overeen met lymfocyten gekweekt met niet-antigeen-gepulseerde MoDC's; de controlegroep komt overeen met lymfocyten gekweekt zonder MoDC's. Afkortingen: MODC's = van boviene monocyten afgeleide dendritische cellen; RV = rabiës vaccin. Dit cijfer is aangepast van Kangethe et al., 201811. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Reagentia Eindconcentratie Volume per reactie
dNTPs Mix (10 mM) 1.000 μM 1 μL
Willekeurige Hexamer Primers (50 ng/μL) 25 μM 1 μL
RNA-sjabloon 0,1 – 1 μg/μL χ μL (indien vereist)
RNAse Vrij water - χ μL (indien vereist)
Uiteindelijke reactievolume - 10 μL

Tabel 1: Master mix samenstelling (RNA primer mix).

Reagentia Eindconcentratie Volume per reactie
RT buffer 10x 1x 2 μL
MgCl2 25 mM 5 mM 4 μL
DTT 0,1 m 10 mM 2 μL
RNAse-remmer 40 U/μL 2 U 1 μL

Tabel 2: De 2x PCR reactiemix. Afkortingen: RT = reverse transcriptase; DTT = dithiothreitol.

Cytokine Soort Toetredingsnummer Volgorde Lengte Tm
IFN-γ Bos tier FJ263670 F- GTGGGCCTCTCTTCTCAGAA 234 80.5
R- GATCATCCACCGGAATTTGA
Ki-67 Bos tier XM_015460791,2 F-AAGATTCCAGCGCCCATTCA 148 86.5
R-TGAGGAACGAACACGACTGG
GAPDH Bos tier Sassu et al., 2020 F-CCTGGAGAAACCTGCCAAGT 214 85.5
R-GCCAAATTCATTGTCGTACCA

Tabel 3: Primersets gebruikt voor versterking50.

Reagentia Eindconcentratie Volume per reactie
Supermix 1x 5 μL
Voorwaartse primer (5 μM) 250/ 125 nM 1 μL
Omgekeerde primers (5 μM) 250/ 125 nM 1 μL
cDNA 1:10 verdund 1,25 ng 2 μL
Nuclease-vrij water - 1 μL
Uiteindelijke reactievolume - 10 μL

Tabel 4: qPCR master mix

Buisnr. Concentratie van standaard Seriële verdunning
1 50 ng/ml 50 μL standaard + 350 μL wasbuffer
2 12,5 ng/ml 150 μL uit tube 1 + 450 μL wasbuffer
3 6,25 ng/ml 250 μL uit buis 2 + 250 μL wasbuffer
4 3,13 ng/ml 250 μL uit buis 3 + 250 μL wasbuffer
5 1,56 ng/ml 250 μL uit buis 4 + 250 μL wasbuffer
6 0,78 ng/ml 250 μL uit buis 5 + 250 μL wasbuffer
7 0,2 ng/ml 150 μL uit buis 6 + 450 μL wasbuffer
8 0,1 ng/ml 250 μL uit buis 7 + 250 μL wasbuffer
9 0,025 ng/ml 100 μL uit buis 8 + 300 μL wasbuffer

Tabel 5: IFN-γ standaardverdunningsreeks

Aanvullend dossier 1: Protocollen voor de synthese van complementair DNA, real-time kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) en enzymgebonden immunosorbenttest (ELISA). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S1: Het antigeenopnamevermogen MoDC's met verschillende concentraties van de cytokinecocktail en met 3 dagen of 5 dagen kweek. Verschillende concentraties (5% w/v en 3% m/v) van de cytokinecocktail die GM-CSF en IL-4 bevat, werden getest met 3 dagen of 5 dagen kweek om de beste combinatie te beoordelen om hoogwaardige antigeenopname MoDC's te genereren (met behulp van het tracermolecuul FITC-dextran). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S2: CD4- en CD8-priming met diptheria-toxoïde (DT) en Bluetongue-virus serotype 4 (BTV). De expressie van Ki-67 door CD8-cellen na pulseren met (A) DT en (C) BTV en de expressie van Ki-67 door CD4-cellen na pulseren met (B) DT en (D) BVT op dag 16. Vergelijkingen werden gemaakt met culturen gepulseerd met DT en BVT (specifiek), (C,D) met CD40L, en met niet-specifieke priming- en controlebehandelingen. De horizontale balken geven het gemiddelde aan. *p < 0,05, **p < 0,01 volgens een Mann-Whitney-test. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Deze studie toont een gestandaardiseerde in vitro methode voor het genereren en fenotyperen van boviene MoDC's en hun daaropvolgende gebruik bij het meten van de vaccinimmunogeniciteit van een commercieel vaccin (bijv. RV). Runder-MoDC's kunnen worden gebruikt als een hulpmiddel voor het screenen van potentiële vaccinantigenen tegen veeziekten en het voorspellen van hun potentiële klinische impact op basis van immuunresponsen voordat wordt overgegaan tot in vivo dierproeven. De gegenereerde MoDC's werden geïdentificeerd op basis van hun morfologische, fenotypische en functionele kenmerken. We toonden aan dat de MoDC's afgeleid van rundvee CD14 + monocyten kenmerken vertoonden die werden gezien in DC's, zoals verlengde dendrieten, de expressie van celoppervlakmarkers voor antigeenpresentatie zoals MHC II, de expressie van co-stimulerende moleculen op MoDC's zoals CD40 en CD86, endocytische activiteit en het vermogen om naïeve lymfocyten te activeren.

De celkweekmedia die in dit experiment worden gebruikt (DMEM en RPMI) worden veel gebruikt voor celdifferentiatie en -kweek, waarbij RPMI vaker wordt gebruikt voor monocytendifferentiatie36. RPMI-suppletie met FBS of HS (paardenserum) heeft geen invloed op monocytendifferentiatie37. Recombinante GM-CSF en IL-4 suppletie biedt een inflammatoire aandoening die monocytendifferentiatie veroorzaakt en wordt routinematig gebruikt voor de productie van functioneel levensvatbare MoDC's die in staat zijn tot antigeenopname en presentatie aan immuuncellen38,39. In deze studie werd RPMI 1640-medium aangevuld met 10% FBS (compleet kweekmedium), 1% penicilline-streptomycine en de toevoeging van een commercieel beschikbare cytokinecocktail (GM-CSF plus IL-4) geïnduceerde rundermonocytendifferentiatie, resulterend in de productie van levensvatbare MoDC's. Toen de gegenereerde MoDC's werden geïncubeerd met RV voordat ze co-kweekten met naïeve lymfocyten, induceerden ze een T-celafhankelijke immuunrespons specifiek tegen RV, wat bewijst dat volwassen MoDC's RV-antigenen adequaat kunnen presenteren aan lymfocyten die nog nooit RV zijn tegengekomen. Dit is een cruciaal kenmerk van adaptieve immuniteit dat we nu in het lab kunnen repliceren.

We zagen dat een hogere concentratie cytokinecocktail (5%) in combinatie met een langere incubatietijd (5 dagen) MoDC's produceerde met een lager endocytisch vermogen voor antigeenopname dan degenen die werden behandeld met een lagere concentratie cytokinecocktail (3%) met dezelfde incubatietijd (5 dagen), zoals weergegeven in aanvullende figuur S1. Daarom concluderen we dat een lagere concentratie cytokinecocktail (bijv. 3%) met 5 dagen incubatie optimaal is om functioneel krachtige MoDC's te produceren. Celoppervlakmarkers zoals MHC II, CD40 en CD86 zijn aanwezig op APC's en hun upregulatie duidt op functionele celactivering40,41,4 2. We toonden verbeterde expressie van MHC II, CD40 en CD86 na monocytendifferentiatie in naïeve MoDC's met behulp van de cytokinecocktail (figuur 4).

Het optimaliseren van de verhouding tussen naïeve lymfocyten en MoDC's in een kweeksysteem is een belangrijke factor die de uitkomst van de MoDC-test beïnvloedt, met verschillende MoDC-lymfocytenverhoudingen die gevarieerde lymfocytenresponsen induceren43. Na evaluatie van MoDC-lymfocytenverhoudingen van 1:10-1:40 zagen we echter dat het verhogen van de concentratie van MoDC's de lymfocytenactivatie niet verhoogde, en uiteindelijk kwamen we uit op een optimale verhouding van 1:20, wat vergelijkbaar is met eerder gerapporteerde studies44,45. Opgemerkt moet worden dat de geëlueerde naïeve lymfocytenfractie niet-specifiek geactiveerde T-cellen kan bevatten; Daarom is het noodzakelijk om een controlegroep te hebben die overeenkomt met alleen naïeve lymfocytencultuur.

Geactiveerde CD4+ en CD8+ T-cellen drukken specifieke markers uit en scheiden een verscheidenheid aan cytokines af, en hun kwantificering duidt op immuunactivatie. De intracellulaire expressie van Ki-67, een goed gekarakteriseerde immuunactivatiemarker, werd in deze MoDC-lymfocytencocultuur geupreguleerd29,46. Evenzo in deze studie duidde de verbeterde IFN-γ-secretie door lymfocyten op een Th1-respons die werd opgewekt tegen het RV-antigeen30,31,47. IL-2-expressie door CD4 + T-cellen is ook een goede marker voor het visualiseren van T-celactivering; de opname ervan op dag 9 van de MoDC-lymfocytencocultuur maakte het echter een ongeschikt doelwit voor het meten van lymfocytenproliferatie voor deze studie48. De upregulatie van CD25 in aanwezigheid van IL-2 is eerder aangetoond dat het de priming van zowel CD4 + als CD8 + T-cellen bepaalt en werd in deze studie gebruikt om de priming van naïeve lymfocyten door RV-gepulseerde MoDC's28 te meten.

Cytotoxische CD8 T-cellen zijn belangrijke effectorcellen tegen intracellulaire vaccinantigenen of virale pathogenen49. Door lymfocytenactiveringsmarkers (Ki-67 en CD25) en cytokine-expressie (IFN-γ) te meten, ontdekten we dat de antigeen-geladen MoDC's significante (p < 0,01) activering van zowel CD8- als CD4 T-celresponsen hadden, waarbij de CD8-respons en Th1-polarisatie vaker voorkwamen tegen het RV-antigeen. Een belangrijke factor waarmee rekening moet worden gehouden bij het ontwerpen van een MoDC-test voor adjuvans-geconjugeerde vaccins is adjuvans-geïnduceerde lymfocytresponsen. We raden aan om een controlegroep (adjuvante controle) te gebruiken die alleen uit adjuvans bestaat om achtergrondsignalen te elimineren. Deze opstelling kan ook worden gebruikt om het effect te meten van verschillende adjuvantia die lymfocytenresponsen kunnen versterken op een laag-immunogeen antigeen, wat cruciaal is voor bescherming tijdens in vivo studies.

Er zijn enkele beperkingen in deze studie die we willen benadrukken. De experimentele gegevens voor elke test waren afgeleid van een enkel dier met zes technische replicaties. Het hebben van een groter aantal biologische replicaties zou gunstig zijn om fouten te minimaliseren en verbeterde statistische betrouwbaarheid en resultaten met een hogere nauwkeurigheid te bieden. Niettemin werd deze test in een eerdere publicatie11 ook getest en gevalideerd met behulp van een diptheria-toxoïde (aanvullende figuur S2A,B) en een commercieel vaccin tegen blauwtongvirus serotype 4 (aanvullende figuur S2C,D) met respectievelijk drie en twee biologische dieren. Bovendien zou het vergelijken van de resultaten van deze in vitro studie met een in vivo studie helpen om de authenticiteit van deze immuuntest extra te valideren, wat op zijn beurt het proces van implementatie van deze in vitro MoDC-test als een routinetest in vaccinproductie en kwaliteitscontrole zou versnellen. Ten slotte werd de expressie van CD14 in MoDC's niet onderzocht, omdat de literatuur inconsistent is met betrekking tot dit aspect, vooral bij het vergelijken van MoDC's van verschillende diersoorten.

Concluderend rapporteren we een in vitro boviene MoDC-test die kan worden gebruikt om vaccingeïnduceerde immunogeniciteit te meten. Deze MoDC-test kan ook worden geëvalueerd met behulp van verschillende methoden, waaronder flowcytometrie, ELISA en qPCR. Het hebben van meerdere methoden voor het evalueren van activeringsmarkers is cruciaal in gebieden met beperkte middelen waar een flowcytometer mogelijk niet direct beschikbaar is. Deze test kan worden opgenomen als een kwaliteitscontrolestap door nationale veterinaire laboratoria die grote partijen rundervaccins produceren. Bovendien kan het worden gebruikt om potentiële vaccinantigenen te identificeren tijdens de ontwikkeling van nieuwe rundervaccins en zelfs om te selecteren welk adjuvans moet worden gebruikt vóór een dierproef. Al deze factoren zullen bijdragen aan een meer ethische en betaalbare benadering van de ontwikkeling en het gebruik van rundervaccins.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Acknowledgments

We danken Dr. Eveline Wodak en Dr. Angelika Loistch (AGES) voor hun steun bij het bepalen van de gezondheidsstatus van de dieren en voor het verstrekken van BTV, Dr. Bernhard Reinelt voor het verstrekken van runderbloed en Dr. Bharani Settypalli en Dr. William Dundon van de IAEA voor nuttig advies over respectievelijk de real-time PCR-experimenten en taalbewerking.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACK Lysing Buffer Gibco, Thermo Fisher A1049201 Ammonium-Chloride-Potassium buffer for lysis of residual RBCs in harvested PBMC Fraction
BD Vacutainer Heparin Tubes Becton, Dickinson (BD) and Company 366480 10 mL, additive sodium heparin 158 USP units, glass tube, 16 x 100 mm size
Bovine Dendritic Cell Growth Kit Bio-Rad, UK PBP015KZZ Cytokine cocktail composed of recombinant bovine IL-4 and GM-CSF
Bovine IFN-γ ELISA Kit Bio-Rad MCA5638KZZ Kit use for measuring IFN-γ expression in culture supernatant
CD14 Antibody Bio-Rad MCA2678F Mouse anti-bovine CD14 monoclonal antibody, clone CC-G33, isotype IgG1
CD25 Antibody Bio-Rad MCA2430PE Mouse anti bovine CD25 monoclonal antibody, clone IL-A11, isotype IgG1
CD4 Antibody Bio-Rad MCA1653A647 Mouse anti bovine CD4 monoclonal antibody, clone CC8, isotype IgG2a
CD40 Antibody Bio-Rad MCA2431F Mouse anti-bovine CD40 monoclonal antibody, clone IL-A156, isotype IgG1
CD8 Antibody Bio-Rad MCA837F Mouse anti bovine CD8 monoclonal antibody, clone CC63, isotype IgG2a
CD86 Antibody Bio-Rad MCA2437PE Mouse anti-bovine CD86 monoclonal antibody, clone IL-A190, isotype IgG1
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System Bio-Rad - Thermal cycler PCR machine
Corning Centrifuge Tube Falcon Corning  352096 & 352070 15 mL and 50 mL, high-clarity poypropylene conical bottom, graduated, sterial, seal screw cap, falcon tube
Cytofix/Cytoperm Plus BD Bio Sciences 555028 Fixation/permeabilization kit with BD golgiPlug, use for flow cytometer cell staining
Ethanol Sigma Aldrich 1009832500 Absolute for analysis EMSURE ACS,ISO, Reag. Ph Eur
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco, Thermo Fisher 10500064 Qualified, heat inactivated
Ficoll Plaque PLUS GE Health care Life Sciences, USA 341691 Lymphocyte-isolation medium
FlowClean Cleaning Agent Beckman Coulter, Life Sciences A64669 500 mL
FlowJo FlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, USA - Flow cytometer Histogram software
FlowTubes/ FACS  (Fluorescence-activated single-cell sorting) Tube Falcon Corning  352235 5 mL, sterial, round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap, use in flow cytometry analysis
Fluoresceinisothiocynat-Dextran Sigma Aldrich, Germany 60842-46-8 FITC-dextran MW
Gallios Flow Cytometer Beckman Coulter - Flow cytometer machine
Hard-Shell 96-Well PCR Plates Bio-Rad HSP9601 96 well, low profile, thin wall, skirted, white/clear
Human CD14 MicroBeads Miltenyi Bioteck, Germany 130-050-201 2 mL microbeads conjugated to monoclonal anti-human CD14 antibody isotype IgG2a, used for selection of bovine monocytes from PBMCs
Kaluza Beckman Coulter, Germany - Flow cytometer multicolor data analysis software
MACS Column Miltenyi Bioteck, Germany 130-042-401 Magnetic activated cell sorting or immune magentic cell separation colum for separation of various CD14 cell population based on cell surface antigens
MHC Class II DQ DR Polymorphic Antibody Bio-Rad MCA2228F Mouse anti-sheep MHC Class II DQ DR Polymorphic:FITC, clone 49.1, isotype IgG2a, cross reactive with bovine
Microcentrifuge Tube Sigma Aldrich HS4325 1.5 mL, conical bottom, graduated, sterial tube
Microsoft Power Point Microsoft - The graphical illustrations of experimental design
Mouse IgG1 Negative Control:FITC for CD14, CD40 Antibody Bio-Rad MCA928F Isotype control CD14 and CD40 monoclonal antibody 
Mouse IgG1 Negative Control:PE for CD86 Antibody Bio-Rad MCA928PE Isotype control CD86 monoclonal antibody 
Mouse IgG1 Negative Control:RPE for CD25 Antibody Bio-Rad MCA928PE Isotype control CD25 monoclonal antibody 
Mouse IgG2a Negative Control:FITC for MHC Class II Antibody Bio-Rad MCA929F Isotype control for MHC class II monoclonal antibody 
Nobivac Rabies MSD Animal Health, UK - 1 µL/mL of cell cultured inactivated vaccine containing > 2 I.U./mL Rabies virus strain
Optical seals Bi0-Rad TCS0803 0.2 mL flat PCR tube 8-cap strips, optical, ultraclear, compatible for qPCR machine
Penicillin-Streptomycin Gibco, Thermo Fisher 15140122 100 mL
Phosphate Buffer Saline (PBS) Gibco, Thermo Fisher 10010023 pH 7.4, 1x concentration
Prism - GraphPad 5 Software  Dotmatics - Statistical software
Purified Anti-human Ki-67 antibody Biolegend, USA 350501 Monoclonal antibody, cross reactive with cow, clone ki-67
Purified Mouse IgG1 k Isotype Ctrl Antibody Biolegend 400101 Isotype control for Ki-67 monoclonal antibody
READIDROP Propidium Iodide BD Bio Sciences 1351101 Live/dead cell marker used for flow cytometry, amine reactive dye
Recombinant Human IL-2 Protein R&D System, USA 202-IL-010/CF Interleukin-2, 20 ng/ml
RNeasy Mini Kit Qiagen 74106 Kit use for extraction of total RNA; RLT buffer = lysis buffer; RW1 buffer = stringent guanidine-containing washing buffer; RDD buffer = DNase buffer; RPE buffer = mild wash buffer; RNaseOUT = RNase inhibitor.
RPMI 1640 Medium Sigma Aldrich R8758 Cell culture media with L-glutamine and sodium bicarbonate
SMART-servier medical art  Les Laboratories Servier - Licensed under a creative commons attribution 3.0 unported license
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 172-5270 2x qPCR mix conatins dNTPs, Ss07d fusion polymerase, MgCl2, SYBR Green I supermix = supermix, ROX normalization dyes.
SuperScript III First-Strand Synthesis System Invitrogen, Thermo Fisher 18080051 Kit for cDNA synthsis
Tissue Culture Test plate 24 TPP, Switzerland 92024 24 well plate, sterilized by radiation , growth enhanced treated, volume 3.18 mL
Trypan Blue Solution Gibco, Thermo Fisher 15250061 0.4%, 100 mL, dye to assess cell viability
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Invitrogen, Thermo Fisher 10977023 0.1 µm membrane filtered distilled water
VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes Thermo Fisher Scientific 15206067 VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes have a green top and contain spray-dried lithium, sodium or ammonium heparin on the inner walls and are usedin clinical chemistry, immunology and serology. The anticoagulant heparin activates antithrombin, which blocks the clotting cascade and thus produces a whole blood/plasma sample.
Water Sigma Aldrich W3500-1L Sterile-filtered, bioReagent suitable for cell culture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roth, J. A., Sandbulte, M. R. The role of veterinary vaccines in livestock production, animal health, and public health. In Veterinary Vaccines: Principles and Applications. Metwally, S., El Idrissi, A., Viljoen, G. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 1-10 (2021).
  2. Roberts, N. J., Douglas, R. G., Simons, R. M., Diamond, M. E. Virus-induced interferon production by human macrophages. The Journal of Immunology. 123 (1), 365-369 (1979).
  3. Kleiveland, C. R. Peripheral blood mononuclear cells. The Impact of Food Bioactives on Health: In Vitro and Ex Vivo Models. Verhoeckx, K., Cotter, P., López-Expósito, I., Kleiveland, C., Lea, T., Mackie, A., Requena, T., Swiatecka, D., Wichers, H. , Springer. Cham, Switzerland. 161-167 (2015).
  4. Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 762-774 (2011).
  5. Domínguez, P. M., Ardavín, C. Differentiation and function of mouse monocyte-derived dendritic cells in steady state and inflammation. Immunological Reviews. 234 (1), 90-104 (2010).
  6. Steinman, R. M. Linking innate to adaptive immunity through dendritic cells. Novartis Foundation Symposium. 279, 101-109 (2006).
  7. Vandebriel, R. J., Hoefnagel, M. H. N. Dendritic cell-based in vitro assays for vaccine immunogenicity. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 8 (9), 1323-1325 (2012).
  8. Hopewell, E. L., Cox, C. Manufacturing dendritic cells for immunotherapy: Monocyte enrichment. Molecular Therapy. Methods and Clinical Development. 16, 155-160 (2020).
  9. Morse, M. A., Zhou, L. -J., Tedder, T. F., Lyerly, H. K., Smith, C. Generation of dendritic cells in vitro from peripheral blood mononuclear cells with granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor, interleukin-4, and tumor necrosis factor-alpha for use in cancer immunotherapy. Annals of Surgery. 226 (1), 6-16 (1997).
  10. Robinson, L., et al. Foot-and-mouth disease virus exhibits an altered tropism in the presence of specific immunoglobulins, enabling productive infection and killing of dendritic cells. Journal of Virology. 85 (5), 2212-2223 (2011).
  11. Kangethe, R. T., Pichler, R., Chuma, F. N. J., Cattoli, G., Wijewardana, V. Bovine monocyte derived dendritic cell based assay for measuring vaccine immunogenicity in vitro. Veterinary Immunology and Immunopathology. 197, 39-48 (2018).
  12. Harwood, L. J., Gerber, H., Sobrino, F., Summerfield, A., McCullough, K. C. Dendritic cell internalization of foot-and-mouth disease virus: Influence of heparan sulfate binding on virus uptake and induction of the immune response. Journal of Virology. 82 (13), 6379-6394 (2008).
  13. Hussen, J., et al. Phenotypic and functional heterogeneity of bovine blood monocytes. PLoS One. 8 (8), 71502 (2013).
  14. Shi, Y., et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and T-cell responses: What we do and don't know. Cell Research. 16 (2), 126-133 (2006).
  15. Zhou, L. -J., Tedder, T. F. CD14+ blood monocytes can differentiate into functionally mature CD83+ dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (6), 2588-2592 (1996).
  16. Bautista, E. M., Nfon, C., Ferman, G. S., Golde, W. T. IL-13 replaces IL-4 in development of monocyte derived dendritic cells (MoDC) of swine. Veterinary Immunology and Immunopathology. 115 (1-2), 56-67 (2007).
  17. León, B., Ardavín, C. Monocyte-derived dendritic cells in innate and adaptive immunity. Immunology and Cell Biology. 86 (4), 320-324 (2008).
  18. Berger, A. Th1 and Th2 responses: What are they. British Medical Journal. 321 (7258), 424 (2000).
  19. Romagnani, S. Th1/th2 cells. Inflammatory Bowel Diseases. 5 (4), 285-294 (1999).
  20. Kaiko, G. E., Horvat, J. C., Beagley, K. W., Hansbro, P. M. Immunological decision-making: How does the immune system decide to mount a helper T-cell response. Immunology. 123 (3), 326-338 (2008).
  21. Duckworth, B. C., Groom, J. R. Conversations that count: Cellular interactions that drive T cell fate. Immunological Reviews. 300 (1), 203-219 (2021).
  22. León, B., López-Bravo, M., Ardavín, C. Monocyte-derived dendritic cells formed at the infection site control the induction of protective T helper 1 responses against Leishmania. Immunity. 26 (4), 519-531 (2007).
  23. Singh, D., et al. Differential responses of chicken monocyte-derived dendritic cells infected with Salmonella gallinarum and Salmonella typhimurium. Scientific Reports. 11, 17214 (2021).
  24. Pujol, M., et al. Variability in the response of canine and human dendritic cells stimulated with Brucella canis. Veterinary Research. 48, 72 (2017).
  25. Pujol, M., Borie, C., Montoya, M., Ferreira, A., Vernal, R. Brucella canis induces canine CD4+ T cells multi-cytokine Th1/Th17 production via dendritic cell activation. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 62, 68-75 (2019).
  26. Lašťovička, J., Rataj, M., Bartůňková, J. Assessment of lymphocyte proliferation for diagnostic purpose: Comparison of CFSE staining, Ki-67 expression and 3H-thymidine incorporation. Human Immunology. 77 (12), 1215-1222 (2016).
  27. Reddy, M., Eirikis, E., Davis, C., Davis, H. M., Prabhakar, U. Comparative analysis of lymphocyte activation marker expression and cytokine secretion profile in stimulated human peripheral blood mononuclear cell cultures: An in vitro model to monitor cellular immune function. Journal of Immunological Methods. 293 (1-2), 127-142 (2004).
  28. Shatrova, A. N., et al. Time-dependent regulation of IL-2R α-chain (CD25) expression by TCR signal strength and IL-2-induced STAT5 signaling in activated human blood T lymphocytes. PLoS One. 11 (12), 0167215 (2016).
  29. Shedlock, D. J., et al. Ki-67 staining for determination of rhesus macaque T cell proliferative responses ex vivo. Cytometry, Part A. 77 (3), 275-284 (2010).
  30. Yen, H. -R., et al. Tc17 CD8 T cells: Functional plasticity and subset diversity. Journal of Immunology. 183 (11), 7161-7168 (2009).
  31. Kawamura, I., et al. IFN-gamma-producing ability as a possible marker for the protective T cells against Mycobacterium bovis BCG in mice. Journal of Immunology. 148 (9), 2887-2893 (1992).
  32. Federal Ministry Republic of Austria. Agriculture, Forestry, Regions and Water Management. The Federal Act on Animal Welfare (Tierschutzgesetz - TSchG). Federal Law Gazette I 2004/118. , Available from: https://info.bml.gv.at/en/topics/agriculture/agriculture-in-austria/animal-production-in-austria/animal-welfare-act.html (2005).
  33. Corripio-Miyar, Y., et al. Phenotypic and functional analysis of monocyte populations in cattle peripheral blood identifies a subset with high endocytic and allogeneic T-cell stimulatory capacity. Veterinary Research. 46, 112 (2015).
  34. Wijewardana, V., et al. Generation of canine dendritic cells from peripheral blood monocytes without using purified cytokines. Veterinary Immunology and Immunopathology. 114 (1-2), 37-48 (2006).
  35. Gallios Flow Cytometer with Kaluza for Gallios Software. Instructions for Use. Beckman Coulter. , Available from: http://www.cytometrie-imagerie-saint-antoine.org/media/3924/Kaluza.Gallos.pdf (2014).
  36. Švajger, U., Jeras, M. Optimal dendritic cell differentiation in rpmi media requires the absence of HEPES buffer. Immunological Investigations. 40 (4), 413-426 (2011).
  37. Chometon, T. Q., et al. A protocol for rapid monocyte isolation and generation of singular human monocyte-derived dendritic cells. PLoS One. 15 (4), 0231132 (2020).
  38. Blanco, F. C., et al. Semi-stable production of bovine IL-4 and GM-CSF in the mammalian episomal expression system. Journal of Veterinary Research. 65 (3), 315-321 (2021).
  39. Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. Journal of Experimental Medicine. 179 (4), 1109-1118 (1994).
  40. Cho, K. -J., Roche, P. A. Regulation of MHC class II-peptide complex expression by ubiquitination. Frontiers in Immunology. 4, 369 (2013).
  41. Sansom, D. M., Manzotti, C. N., Zheng, Y. What's the difference between CD80 and CD86. Trends in Immunology. 24 (6), 313-318 (2003).
  42. Han Lee, G., et al. The role of CD40 expression in dendritic cells in cancer biology; a systematic review. Current Cancer Drug Targets. 14 (7), 610-620 (2014).
  43. Tanaka, H., Demeure, C. E., Rubio, M., Delespesse, G., Sarfati, M. Human monocyte-derived dendritic cells induce naive T cell differentiation into T helper cell type 2 (Th2) or Th1/Th2 effectors: Role of stimulator/responder ratio. Journal of Experimental Medicine. 192 (3), 405-412 (2000).
  44. Klechevsky, E., et al. Cross-priming CD8+ T cells by targeting antigens to human dendritic cells through DCIR. Blood. 116 (10), 1685-1697 (2010).
  45. Schlienger, K., Craighead, N., Lee, K. P., Levine, B. L., June, C. H. Efficient priming of protein antigen-specific human CD4+ T cells by monocyte-derived dendritic cells. Blood. 96 (10), 3490-3498 (2000).
  46. Soares, A., et al. Novel application of Ki67 to quantify antigen-specific in vitro lymphoproliferation. Journal of Immunological Methods. 362 (1-2), 43-50 (2010).
  47. Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations. Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2009).
  48. Bachmann, M. F., Oxenius, A. Interleukin 2: From immunostimulation to immunoregulation and back again. EMBO Reports. 8 (12), 1142-1148 (2007).
  49. Koup, R. A., Douek, D. C. Vaccine design for CD8 T lymphocyte responses. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 1 (1), 007252 (2011).
  50. Sassu, E. L., et al. Development and evaluation of a real-time PCR panel for the detection of 20 immune markers in cattle and sheep. Veterinary Immunology and Immunopathology. 227, 110092 (2020).

Tags

Lege waarde nummer 195
Bepaling van de immunogeniciteit van het vaccin met behulp van van runderen monocyten afgeleide dendritische cellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liaqat, F., Kangethe, R. T.,… More

Liaqat, F., Kangethe, R. T., Pichler, R., Liu, B., Huber, J., Wijewardana, V., Cattoli, G., Porfiri, L. Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (195), e64874, doi:10.3791/64874 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter