Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Определение иммуногенности вакцины с использованием дендритных клеток, полученных из моноцитов крупного рогатого скота

Published: May 19, 2023 doi: 10.3791/64874
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1, 1, 1
1Animal Production and Health Section, Joint Food and Agriculture Organization (FAO)/International Atomic Energy Agency (IAEA) Centre of Nuclear Techniques in Food and Agriculture, International Atomic Energy Agency, 2Teaching and Research Farm Kremesberg, Clinical Unit for Herd Health Management in Ruminants, Department for Farm Animals and Veterinary Public Health, University of Veterinary Medicine, Vienna

Summary

Методология описывает генерацию дендритных клеток, полученных из моноцитов крупного рогатого скота (MoDC), и их применение для оценки in vitro антигенных кандидатов при разработке потенциальных ветеринарных вакцин для крупного рогатого скота.

Abstract

Дендритные клетки (ДК) являются наиболее мощными антигенпрезентирующими клетками (АПК) в иммунной системе. Они патрулируют организм в поисках патогенов и играют уникальную роль в иммунной системе, связывая врожденные и адаптивные иммунные реакции. Эти клетки могут фагоцитировать, а затем представлять захваченные антигены эффекторным иммунным клеткам, вызывая широкий спектр иммунных реакций. В этой статье демонстрируется стандартизированный метод получения in vitro дендритных клеток (MoDC) из моноцитов крупного рогатого скота, выделенных из мононуклеарных клеток периферической крови крупного рогатого скота (PBMC), и их применение для оценки иммуногенности вакцины.

Магнитная сортировка клеток использовалась для выделения моноцитов CD14+ из PBMC, а добавление полной питательной среды интерлейкином (IL)-4 и гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором (GM-CSF) использовалось для индукции дифференцировки моноцитов CD14+ в наивные MoDC. Генерация незрелых MoDC была подтверждена детекцией экспрессии основных маркеров клеточной поверхности комплекса гистосовместимости II (MHC II), CD86 и CD40. Коммерчески доступная вакцина против бешенства использовалась для импульсирования незрелых MoDC, которые впоследствии культивировались совместно с наивными лимфоцитами.

Анализ проточной цитометрии антиген-импульсных MoDC и кокультуры лимфоцитов выявил стимуляцию пролиферации Т-лимфоцитов за счет экспрессии маркеров Ki-67, CD25, CD4 и CD8. Анализ экспрессии мРНК ИФН-γ и Ki-67 с помощью количественной ПЦР показал, что MoDC могут индуцировать антиген-специфический прайминг лимфоцитов в этой системе кокультурирования in vitro . Кроме того, секреция ИФН-γ, оцененная с помощью ИФА, показала значительно более высокий титр (**p < 0,01) в кокультуре MoDC-лимфоцитов с импульсной вакциной против бешенства, чем в кокультуре неантиген-импульсных MoDC-лимфоцитов. Эти результаты показывают достоверность этого анализа in vitro MoDC для измерения иммуногенности вакцины, что означает, что этот анализ может быть использован для выявления потенциальных кандидатов на вакцину для крупного рогатого скота, прежде чем приступить к испытаниям in vivo , а также при оценке иммуногенности вакцин коммерческих вакцин.

Introduction

Ветеринарная вакцинация представляет собой важнейший аспект животноводства и здравоохранения, поскольку она способствует повышению продовольственной безопасности и благополучия животных, обеспечивая защиту от болезней, поражающих животноводческий сектор во всем мире1. Эффективный метод in vitro для оценки иммуногенности возможных вакцин-кандидатов поможет ускорить процесс разработки и производства вакцины. Поэтому необходимо расширить область иммунных анализов инновационными методологиями, основанными на исследованиях in vitro , поскольку это поможет раскрыть сложность иммунных процессов, связанных с иммунизацией и патогенной инфекцией. В настоящее время для измерения иммуногенности вакцин-кандидатов и адъювантов используются иммунизация животных in vivo , которые требуют периодического отбора проб (например, крови и селезенки). Эти анализы являются дорогостоящими, трудоемкими и имеют этические последствия, потому что в большинстве случаев эвтаназия животных проводится к концу испытаний.

В качестве альтернативы анализам in vivo мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) использовались для оценки иммунных реакций, индуцированных вакциной, in vitro2. PBMC представляют собой гетерогенную популяцию клеток, состоящую из 70-90% лимфоцитов, 10-20% моноцитов и ограниченного числа дендритных клеток (DC, 1-2%)3. PBMC содержат антигенпрезентирующие клетки (APC), такие как В-клетки, моноциты и ДК, которые постоянно патрулируют организм в поисках признаков инфекции или повреждения тканей. Локально секретируемые хемокины облегчают рекрутирование и активацию APC в этих участках путем связывания с рецепторами клеточной поверхности. В случае моноцитов хемокины направляют свою судьбу либо на дифференцировку в ДК, либо на макрофаги4. Как только ДК сталкиваются с патогеном и захватывают его, они мигрируют во вторичные лимфоидные органы, где они могут представить обработанные пептидные антигены патогена с использованием поверхностных белков основного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I или класса II CD8+ Т-клеткам CD8+ или CD4+ Т-клеткам, соответственно, вызывая иммунный ответ 5,6.

Ключевая роль, которую играют ДК в организации защитного иммунного ответа против различных патогенов, делает их интересной исследовательской мишенью для понимания внутриклеточных иммунных механизмов, особенно при разработке вакцин и адъювантов против инфекционных агентов7. Поскольку доля ДК, которые могут быть получены из PBMC, довольно мала (1% -2%), моноциты вместо этого использовались для генерации ДК in vitro8. Эти моноцитарные ДК (MoDC) были первоначально разработаны в качестве возможной стратегии лечения в иммунотерапии рака9. Совсем недавно MoDC использовались для исследований вакцин 10,11,12, а классические моноциты являются преобладающим подтипом (89%) для производства MoDC 13. Продуцирование MoDC in vitro ранее достигалось путем добавления гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF), вводимого в сочетании с другими цитокинами, такими как интерлейкин-4 (IL-4), фактор некроза опухоли α (TNF-α) или IL-1314,15,16.

Успех анализа MoDC in vitro зависит от способности стимулированных антигеном зрелых MoDC модулировать степень и тип иммунного ответа, специфичного для типа обнаруженного антигена17. Тип патогена, распознаваемый и представленный MoDC, определяет дифференцировку CD4+ Т-хелперных (Th) клеток в эффекторные клетки Th1, Th2 или Th17 и характеризуется патоген-специфическим секреторным цитокиновым профилем. Ответ Th1 вызывается против внутриклеточных патогенов и приводит к секреции интерферона-гамма (ИФН-γ) и фактора некроза опухоли бета (ФНО-β), который модулирует фагоцитарно-зависимую защиту. Ответ Th2 запускается против паразитических организмов и характеризуется секрецией IL-4, IL-5, IL-10 и IL-13, которая инициирует фагоцитарно-независимую гуморальную защиту. Th17 обеспечивает нейтрофил-зависимую защиту от внеклеточных бактериальных и грибковых инфекций, опосредованных секрецией IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 и TNF-α 18,19,20,21. Основываясь на предыдущих исследованиях, было отмечено, что не все патогены попадают в ожидаемый цитокиновый профиль. Например, кожные МДК в ответ на паразитарную инфекцию лейшмании стимулируют секрецию ИФН-γ из CD4+ Т-клеток и CD8+ Т-клеток, тем самым индуцируя защитный провоспалительный ответ Th122.

Также было показано, что у куриных МДК, заправленных липополисахаридом сальмонеллы (ЛПС), может индуцировать переменный ответ против Salmonella typhimurium, активируя как Th1, так и Th2 ответы, тогда как Salmonella gallinarum индуцирует только ответ Th2, что может объяснить более высокую резистентность последних к клиренсуMoDC 23. Активация MoDC против Brucella canis (B. canis) также была зарегистрирована как у собак, так и у человека, что означает, что это может представлять собой механизм зоонозной инфекции24. MoDC человека, примированные B. canis, индуцируют сильный ответ Th1, который придает устойчивость к тяжелой инфекции, тогда как MoDC собак индуцируют доминирующий ответ Th17 со сниженным ответом Th1, что впоследствии приводит к установлению хронической инфекции25. MoDC крупного рогатого скота демонстрируют повышенное сродство к вирусу ящура (FMDV), конъюгированному с иммуноглобулином G (IgG), по сравнению с одним неконъюгированным ящуром, поскольку MoDC образуют комплекс вирус-антитело в ответ на первые10. Взятые вместе, эти исследования показывают, как MoDC использовались для анализа сложности иммунных реакций во время патогенной инфекции. Адаптивные иммунные реакции могут быть оценены путем количественного определения специфических маркеров, связанных с пролиферацией лимфоцитов. Ki-67, внутриклеточный белок, обнаруживаемый только в делящихся клетках, рассматривается как надежный маркер для исследований пролиферации26, и аналогичным образом CD25, экспрессируемый на поверхности Т-клеток во время поздней фазы активации, соответствует пролиферации лимфоцитов27,28.

В этом исследовании демонстрируется стандартизированный метод получения МДК крупного рогатого скота in vitro с последующим их применением в иммуноанализе in vitro, используемом для тестирования иммуногенности вакцин. Коммерчески доступная вакцина против бешенства (RV) использовалась для подтверждения эффективности этого анализа. Активацию и пролиферацию Т-лимфоцитов измеряли с помощью проточной цитометрии, количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (кПЦР) и иммуноферментного анализа (ИФА) путем анализа хорошо известных маркеров активации клеток, таких как Ki-67 и CD25, и секреции ИФН-γ 28,29,30,31. Во время анализа MoDC экспериментальные испытания на животных или людях не проводятся.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Забор крови осуществляется сертифицированной ветеринарной службой в соответствии с этическими принципами Австрийского агентства по здравоохранению и безопасности пищевых продуктов (AGES) и в соответствии с принятыми стандартами благополучия животных32. Исследование получило этическое одобрение Министерства сельского хозяйства Австрии. Экспериментальный план генерации МРЦ и его последующее применение проиллюстрированы на рисунке 1.

1. Производство наивных МДК

ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы цельной крови были получены от одного теленка, не содержащего патогенов, путем пункции яремной вены гепаринизированными вакутейнерами (для этого исследования использовались восемь пробирок с кровью по 9 мл). Транспортируйте кровь в ящике со льдом. Храните образцы при температуре 2-4 °C для последующего использования или немедленно обрабатывайте их. Следите за тем, чтобы кровь вращалась, чтобы избежать свертывания крови. Стерилизуйте вакуумеры 70% этанолом. Все последующие эксперименты проводились с одним биологическим образцом и шестью техническими репликами.

  1. Центрифугирование в градиенте плотности для выделения PBMC из гепаринизированной крови
    1. Хорошо перемешайте кровь, перевернув ее в 10 раз.
    2. С помощью пипетки объемом 10 мл переведите 20 мл гепаринизированной крови в стерильную пробирку объемом 50 мл и разбавьте ее 10 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS).
    3. Пипеткой 15 мл выделительной среды лимфоцитов в стерильную пробирку объемом 50 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дайте среде, изолирующей лимфоциты, достичь комнатной температуры перед пипеткой.
    4. Наклоните пробирку объемом 50 мл, содержащую среду для выделения лимфоцитов, в положение 45°. Направьте кончик пипетки объемом 25 мл перпендикулярно и аккуратно наложите 30 мл PBS крови поверх среды для выделения лимфоцитов, не смешивая их. Очень медленно верните пробирку объемом 50 мл в вертикальное положение.
    5. Центрифуга при 800 × g в течение 35 мин при 20 °C с максимальным ускорением и без торможения (функция замедления отключена).
    6. Используйте пипетку Пастера, чтобы собрать слой PBMC (тонкий белый слой сразу после первого слоя плазмы) и перенести его в новую пробирку объемом 50 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Центрифугирование с градиентом плотности разделяет цельную кровь на разные слои. В результате эритроциты оседают на дне в виде гранулы, мононуклеарные клетки (PBMC) оседают на границе раздела слоев, а плазма образует верхний слой. Гранулоциты находятся между гранулой и слоем PBMC.
    7. Вымойте собранные PBMC 2 раза, добавив PBS до объема 40 мл и тщательно перемешав, пипеткой вверх и вниз. Затем центрифугу при 500 × g при 4 °C в течение 7 мин с максимальным ускорением и максимальным замедлением.
    8. Выбросьте надосадочную жидкость путем декантации, ресуспендируйте гранулу в 15 мл 1x буфера из хлорида аммония и калия (ACK) и инкубируйте при комнатной температуре в течение 10-15 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не инкубируйте более 15 минут. Коммерчески доступный буфер ACK используется для обеспечения лизиса остаточных эритроцитов (эритроцитов), присутствующих во фракции PBMC.
    9. Добавьте PBS до объема 40 мл, а затем центрифугу при 500 × g и 4 °C в течение 7 мин с максимальным ускорением и замедлением.
    10. Удалите надосадочную жидкость путем декантации и повторите шаг 1.1.9.
    11. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 10 мл полной питательной среды (при комнатной температуре).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полная питательная среда состоит из среды для культивирования клеток RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина-стрептомицина.
  2. Магнитная сепарация клеток CD14+/- из популяции PBMC с использованием CD14-сопряженных магнитных шариков
    1. Подсчитайте клетки с помощью чистого счетчика клеток гемоцитометра, используя 10 мкл клеточной суспензии, смешанной с 10 мкл раствора трипанового синего (0,4%).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Краситель трипановый синий является токсичным химическим веществом и потенциальным канцерогеном. С ним следует обращаться в средствах индивидуальной защиты (СИЗ), чтобы избежать контакта, а отходы следует выбрасывать в герметичный специализированный контейнер для токсичных отходов. Мертвые клетки будут казаться синими, тогда как живые клетки будут казаться прозрачными под микроскопом.
    2. Центрифуга в течение 7 мин по 500 × г.
    3. Откажитесь от надосадочной жидкости с помощью пипетки и ресуспендируйте гранулу в буфере для сортировки клеток, активированном флуоресценцией (FACS), используя объем 40 мкл на каждые 1 × 107 клеток. Тщательно перемешайте с помощью пипетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер FACS состоит из 2% FBS и 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), растворенных в PBS.
    4. Добавьте 5 мкл буфера для микрогранул CD14 на 1 ×10-7 клеток и тщательно перемешайте с помощью пипетки.
    5. Инкубировать в течение 30 мин при 4-8 °C для положительного отбора CD14+ моноцитов крупного рогатого скота33. Вихрь каждые 15 мин в течение инкубационного периода.
    6. Необязательный этап (для проточного цитометрического анализа): Добавьте 10 мкл антитела для окрашивания CD14-FITC (флуоресцеинизотиоцианат) с последующей инкубацией в течение 15 мин при 4-8 °C. Подробности см. в анализе проточной цитометрии на шаге 5.
    7. Добавьте 1 мл буфера FACS и центрифугу в течение 7 мин при 500 × г.
    8. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 500 мкл буфера FACS на 1 × 108 клеток.
    9. Вставьте колонку для разделения иммуномагнитных клеток в сепаратор (держатель магнитной колонки) и поместите пробирку для сбора объемом 15 мл под выходное отверстие колонки для сбора проточного потока.
    10. Промойте колонку 1 мл дегазированного буфера FACS. После полоскания замените использованную пробирку объемом 15 мл на новую.
    11. Дайте суспензии клеток (из шага 1.2.8) пройти через колонку, пипетируя 1 × 108 клеток в 500 мкл буфера за раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите внимание на то, чтобы не образовывались пузырьки воздуха при смешивании ячеек, прежде чем пропускать их через колонку.
    12. Каждый раз промывайте колонку 3 раза 3 мл дегазированного буфера FACS.
    13. Соберите проточный слой и пометьте эту первую элюированную фракцию как фракцию клеток CD14- (PBMC минус моноциты CD14+ ); Это также называется наивной фракцией лимфоцитов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки CD14- выдерживают в полной питательной среде до тех пор, пока не будут получены импульсные антигенные MoDC.
    14. Снимите колонну с разделителя.
    15. Поместите новую стерильную пробирку объемом 15 мл под колонку для сбора сточных вод.
    16. Пипеткой 5 мл буфера FACS введите в колонку и сразу же протолкните ее с помощью поршня.
    17. Соберите проточную часть и пометьте эту вторую элюированную фракцию как клеточную фракцию CD14+ ; Это также называется наивной фракцией моноцитов.
    18. Добавьте полную питательную среду к собранным моноцитам CD14+ , чтобы получить 1 × 106 клеток/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подсчитайте живые клетки в элюированной клеточной фракции CD14+ , чтобы оценить объем полной питательной среды, необходимый для достижения желаемого количества клеток.
    19. Возьмите стерильную 24-луночную пластину и добавьте 1 мл клеточной суспензии (1 × 106 клеток/мл) в каждую лунку.
  3. Дифференцировка CD14+ наивных моноцитов в наивные MoDC путем добавления 3% мас./в. цитокинового коктейля (GM-CSF + IL-4) в общей сложности 5 дней инкубации
    1. Дополните каждую лунку, содержащую моноциты CD14+ , 40 мкл (3% мас./об.) цитокинового коктейля, входящего в комплект.
    2. Инкубируйте планшет в увлажненном инкубаторе с 5% CO2 и при 37 ° C в течение 48 часов.
    3. На 2-й день перенесите половину содержимого каждой лунки (500 мкл) с помощью пипетки в отдельные пробирки объемом 1,5 мл и центрифугу при 500 × г при 4 ° C в течение 7 мин.
    4. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 500 мкл свежей полной питательной среды.
    5. Перенесите 500 мкл этой клеточной суспензии с этапа 1.3.4 обратно в каждую назначенную лунку так, чтобы конечный объем составил 1 мл.
    6. Обогатите каждую лунку 20 мкл цитокинового коктейля.
    7. Инкубируют культуру в течение 72 ч в увлажненном инкубаторе с 5%СО2 и при 37 °C.
    8. После инкубации на 5 день достаньте тарелку из инкубатора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая лунка будет содержать 1 мл клеточной суспензии наивных MoDC. Количество MoDC будет составлять процент (~ 20%) от исходных моноцитов (1 × 106 / мл).

2. Анализ эндоцитарной активности MoDC

ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ поглощения антигена или анализ эндоцитарной активности измеряет способность наивных MoDC усваивать чужеродный материал. Проводят анализ с использованием наивных MoDC, культивируемых с 3% коктейлем цитокинов по массе и с 5-дневной инкубацией, как описаноранее 34.

  1. Соберите наивную клеточную суспензию MoDC с 24-луночной пластины и перенесите ее в пробирку объемом 15 мл; также соберите остатки ячеек, промыв лунки PBS.
  2. Центрифуга по 500 × г в течение 7 мин. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 1 мл питательной среды с добавлением 1% FBS.
  3. Подсчитайте живые клетки MoDC, чтобы оценить объем среды, необходимый для достижения желаемого количества клеток (2 × 10,5 клеток/мл).
  4. Культивируйте наивные МОДы в 100 мкл полной питательной среды в 24-луночном планшете с конечной концентрацией клеток 2 × 10,5 клеток/мл.
  5. Дополните каждую лунку 1 мг / мл FITC-конъюгированного декстрана (флуоресцентный зонд, используемый в качестве индикатора эндоцитоза).
    ПРИМЕЧАНИЕ: FITC-декстран действует как флуоресцентный зонд и используется в качестве индикатора эндоцитоза.
  6. Накройте тарелку крышкой и выдерживайте в темноте при 5%CO2 и 37 °C в течение 60 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для фонового контроля инкубируйте дополнительные клетки MoDC (2 × 105 клеток / мл) с 1 мг / мл FITC-декстрана на льду, так как этот тип инкубации предотвращает проникновение молекулы-индикатора (FITC-декстран) в клетки.
  7. После инкубации немедленно перенесите 24-луночную пластину на лед, чтобы остановить эндоцитоз FITC-декстрана.
  8. Промойте ячейки ледяным буфером FACS.
  9. Соберите, центрифугу и ресуспендируйте гранулу в 500 мкл буфера FACS.
  10. Проанализируйте интенсивность флуоресценции FITC-декстрана в клетках с помощью проточной цитометрии. Подробности см. в анализе проточной цитометрии на шаге 5.2.

3. Генерация антиген-импульсных МОД

ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерчески доступная и клинически одобренная вакцина против вируса бешенства (RV) может индуцировать дифференцировку наивных MoDC в зрелые антигенпрезентирующие MoDC. Используйте 0,1% (~ 1 мкл) одной дозы вакцины против автофургона для получения импульсных антигенных МОДК. Кроме того, предпочтительно производить RV-импульсные MoDC на той же культуральной пластине, которая использовалась (на этапе 1.3.8) для генерации наивных MoDC, поскольку перенос наивных MoDC на новую 24-луночную пластину отрицательно повлияет на них.

  1. Начиная с шага 1.3.8) Добавьте 1 мкл/мл суспензии RV к 1 мл наивной культуры MoDC в 24-луночном планшете и инкубируйте в течение 48 ч при 5%CO2 и 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наивные MoDC, культивируемые без стимуляции RV, используются в качестве фонового контроля (и в качестве неспецифической стимуляции для совместного культивирования с лимфоцитами на следующих этапах).
  2. После инкубации, на 7-й день, держите 24-луночную пластину, содержащую антиген-импульсные MoDC, на льду в течение 10 минут.
  3. Добавьте 1 мл ледяного PBS на лунку. Тщательно перемешайте каждый из них с помощью пипетки и перелейте суспензию в пробирку объемом 15 мл.
  4. Промойте лунки 2 мл ледяного PBS, чтобы собрать остаточные клетки, оставшиеся в каждой лунке.
  5. Переложите содержимое в соответствующие пробирки и центрифугируйте клеточную суспензию при 500 × г в течение 7 мин.
  6. Выбросьте надосадочную жидкость, ресуспендируйте клеточную гранулу (антиген-импульсные MoDC) в полной питательной среде и отрегулируйте объем до конечной клеточной концентрации 1 × 10-5 клеток / мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подсчитайте живые клетки, чтобы оценить объем среды, необходимый для достижения желаемого количества клеток. Используйте RV-импульсные MoDC с 7-го дня для системы совместного культивирования MoDC-лимфоцитов.

4. Кокультура MoDC-лимфоцитов

ПРИМЕЧАНИЕ: Система совместного культивирования MoDC-лимфоцитов in vitro определяет способность MoDC праймировать антиген-специфические лимфоциты. Различные группы лечения клеток после 16 дней совместного культивирования включают специфические, неспецифические и контрольные. Специфическая группа определяется как лимфоциты, культивируемые совместно с RV-импульсными MoDC; неспецифическая группа определяется как лимфоциты, культивируемые совместно с неантиген-импульсными MoDC; а контрольная группа определяется как лимфоциты, культивируемые без MoDC.

  1. Добавьте полную питательную среду к элюированной фракции наивных лимфоцитов (CD14-клетки) для достижения клеточной концентрации 2 × 106 клеток / мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подсчитайте живые клетки в культуре клеток CD14-, которые поддерживались в полной питательной среде в 24-луночном планшете с момента их сбора, чтобы оценить объем среды, необходимый для достижения желаемого количества клеток.
  2. На 7-й день возьмите стерильную 24-луночную пластину и засейте лунки 1 мл наивной клеточной суспензии лимфоцитов (2 × 106 клеток / мл) плюс 1 мл антиген-импульсной или неантиген-импульсной суспензии MoDC (1 × 105 клеток / мл).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем в каждой лунке составит 2 мл с соотношением MoDCs 1:20 к лимфоцитам на лунку.
  3. Инкубировать пластину в течение 48 ч при 37 °C и 5%CO2.
  4. Обогащение культуры и рестимуляция антиген-импульсными МОДК
    1. После инкубации кокультуры антиген-импульсных MoDC-лимфоцитов на 9-й день дополните каждую лунку 20 нг/мл рекомбинантного IL-2 и продолжайте инкубацию еще 120 ч (5-дневная инкубация).
    2. На 14-й день переносят 1 мл сокультуры в стерильную пробирку объемом 1,5 мл и центрифугу при дозе 500 × г в течение 7 мин.
    3. Откажитесь от надосадочной жидкости и ресуспендируйте клеточную гранулу 1 мл антиген-импульсных или неимпульсных MoDC (1 ×10,5 клеток/мл). Аккуратно перемешайте пипеткой и перенесите клеточные суспензии обратно в назначенные лунки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе общий объем в каждой лунке составляет 2 мл.
    4. Продолжайте инкубацию при 5% CO2 и 37 ° C в течение 48 часов. После инкубации на 16-й день совместная культура готова к анализу с помощью проточной цитометрии, кПЦР и ИФА.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На каждые 2 мл в каждой лунке кокультуры MoDC-лимфоцитов 1 мл ресуспендированных клеток окрашивают для проточной цитометрии, 1 мл используют для экстракции РНК, а надосадочные жидкости из обоих используют для ИФА.

5. Проточный цитометрический анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивайте клетки соответствующими маркерами / mAb перед запуском образцов на проточном цитометре. Обратитесь к Таблице материалов для получения подробной информации о реагентах (окрашивание mAb и контроль изотипа), наборе, инструменте и программном обеспечении, используемых для анализа проточной цитометрии.

  1. Протокол окрашивания проточного цитометра
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните окрашивание клеточной поверхности для PBMC и наивных лимфоцитов и моноцитов с использованием анти-CD14 mAb (этап 1.2.6). Для окрашивания клеточной поверхности наивных MoDC используйте анти-CD86-специфический, анти-CD40-специфический и анти-MHC II-специфический mAb. Для окрашивания клеточной поверхности клеток с 16-го дня кокультур используют анти-CD4, анти-CD8, анти-CD25 mAbs; для внутриклеточного окрашивания используют анти-Ki-67 mAb. Кроме того, окрашивайте клетки либо с отрицательным контролем изотипа mAb, либо без mAb (FMO: флуоресцентный минус один). Основное различие при окрашивании на поверхностные и внутриклеточные маркеры заключается в том, что для маркеров клеточной поверхности клетки должны быть окрашены специфическим поверхностным mAb перед окрашиванием живых/мертвых (L/D) или любыми другими процессами. Однако внутриклеточное окрашивание выполняется после окрашивания L/D и требует фиксации плюс этап пермеабилизации, чтобы обеспечить внутриклеточное проникновение.
    1. 1 мл клеточной суспензии переносят в стерильную пробирку объемом 1,5 мл с помощью пипетки и центрифугу в течение 10 мин при дозе 500 × г.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После центрифугирования при обработке клеток из кокультуры MoDC-лимфоцитов сохраняют надосадочную жидкость для ИФА-анализа.
    2. Ресуспендируют гранулу в 1 мл PBS и переносят ее в пробирку объемом 15 мл. Соберите остаточные клетки, используя 1 мл PBS, и объедините его с ресуспендированными гранулами.
    3. Добавьте 10 мл PBS в пробирку объемом 15 мл, содержащую клетки, перемешайте пипеткой и центрифугу в течение 7 мин при 850 x g.
    4. Выбросьте надосадочную жидкость и повторите шаг 5.1.3.
    5. Выбросьте надосадочную жидкость и осторожно ресуспендируйте клеточную гранулу с остаточной суспензией (примерно 180 мкл), оставшейся после декантации надосадочной жидкости.
    6. Перенесите суспензию ячейки на пластину с V-образным дном на 96 лунок и загерметизируйте лунки, чтобы избежать просыпания.
    7. Центрифугируйте пластину при дозе 1 400 × г в течение 5 мин. После центрифугирования проведите тарелкой по контейнеру для отходов, чтобы опорожнить лунки с жидкостью, и постучите пластиной по впитывающей бумаге, чтобы обеспечить удаление лишней жидкости.
    8. Добавьте 25 мкл мастер-смеси для окрашивания поверхности на лунку и аккуратно перемешайте с помощью пипетки с последующей инкубацией при 4 ° C в течение 30 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы приготовить мастер-смесь для окрашивания поверхности для одной лунки, добавьте 2,5 мкл поверхностного mAb к 20 мкл буфера FACS.
    9. Добавьте 200 мкл буфера FACS на лунку и центрифугу при 1,400 × г в течение 5 мин. После центрифугирования опорожните лунки от жидкости путем декантации и постучите пластиной по впитывающей бумаге, чтобы удалить лишнюю жидкость.
    10. Добавьте 100 мкл раствора для окрашивания L/D на лунку. Тщательно перемешать с помощью пипетки с последующей инкубацией при 4 °C в течение 15 мин в темноте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для одной лунки растворите 0,25 мкл красителя L/D в 100 мкл буфера FACS. Краситель L/D помогает различать живые и мертвые клетки.
    11. Добавьте 100 мкл буфера FACS. Накройте лунки крышкой и центрифугируйте тарелку на 1 400 × г в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость путем декантации и постучите тарелкой по впитывающей бумаге.
    12. Повторите шаг 5.1.11.
    13. Добавьте 50 мкл фиксирующего раствора на лунку (входит в комплект) и перемешайте пипеткой перед инкубацией пластины при комнатной температуре в темноте в течение 10 мин.
    14. Добавьте 150 мкл 1x буфера для пермеабилизации-промывки (PW), входящего в комплект, и накройте лунки крышкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы приготовить 10 мл буфера 1x PW, разбавьте 1 мл 10x буфера для химической завивки в 10 мл dH2O.
    15. Центрифугируют планшет при концентрации 1 400 × г в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость путем декантации и постучите тарелкой по впитывающей бумаге.
    16. Добавьте 200 мкл 1x PW с последующим центрифугированием при 1,400 × г в течение 5 мин при 4 ° C. Выбросьте надосадочную жидкость путем декантации и постучите тарелкой по впитывающей бумаге.
    17. Для внутриклеточного окрашивания добавьте 25 мкл мастер-смеси для внутриклеточного окрашивания (античеловеческий Ki-67 mAb) на лунку. Хорошо перемешайте и выдержите тарелку в течение 30 минут при температуре 4 °C или на льду в темноте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы приготовить мастер-смесь для внутриклеточного окрашивания для одной лунки, добавьте 1 мкл Ki-67 mAb к 24 мкл 1x PW. Маркер внутриклеточного окрашивания используется только при обработке клеток с 16-го дня совместной культуры. Внутриклеточное окрашивание не проводится при обработке PBMC, наивных лимфоцитов, моноцитов и наивных MoDC.
    18. После инкубации добавьте 200 мкл 1x PW в каждую лунку. Смешайте пипеткой и центрифугой по 1 400 × г в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость путем декантации и постучите тарелкой по впитывающей бумаге.
    19. Добавляют 200 мкл буфера FACS с последующим центрифугированием при 1 400 × г в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость, сцедив ее, и постучите тарелкой по впитывающей бумаге.
    20. Ресуспендируют клеточную гранулу в 200 мкл буфера FACS и переносят содержимое каждой лунки в отдельные стерильные проточные проточные пробирки. Используйте 300 мкл буфера FACS на лунку для сбора остаточных ячеек. Теперь клетки готовы к анализу проточной цитометрии.
  2. Прогон образца на проточный цитометр
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы были обработаны на проточном цитометре (с использованием лазеров 488 нм, 638 нм и 405 нм) в соответствии с руководством производителя35. Обратитесь к руководству для получения подробной информации, устранения неполадок и настройки протокола.
    1. Выполняйте обычные процедуры очистки до и после считывания образцов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не пропускайте позицию при загрузке трубок в прибор.
      1. Для цикла очистки используйте в общей сложности четыре трубки, первая из которых содержит реагент для очистки потока, а остальные три трубки содержат dH2O; каждая пробирка будет иметь 3 мл. Во время очистки собирайте данные со средним расходом в течение примерно 1 минуты , фиксируя 100 000 событий на трубку при напряжении до 330 В для прямого рассеяния (FSC) против 265 В для бокового рассеяния (SSC).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Во время очистки не следует сообщать о мусоре или клеточных событиях; В этом случае повторите этап очистки. Перед получением данных убедитесь, что все образцы находятся в однородной суспензии, поскольку это обеспечивает точное считывание.
    2. Чтобы подключить цитометр и включить его, нажмите кнопку «Приложение», расположенную в левом углу строки заголовка. В раскрывающемся меню приложения выберите параметр « Цитометрия» и нажмите на параметр «Включить».
      ПРИМЕЧАНИЕ: В раскрывающемся меню приложения опция « Открыть » позволяет пользователям просматривать предварительно запрограммированные анализы, а опция «Новый протокол » позволяет пользователям создавать новые протоколы.
    3. Первоначально загрузите отрицательный контрольный образец в многотрубный держатель. Выберите «Новый протокол» и просмотрите рабочий список в левой части рабочей области/экрана.
    4. В рабочем списке определите положение образца в многопробирочном держателе и дайте имя образцу и протокол идентификации.
    5. На панели оборудования , расположенной в левой части рабочего пространства, отрегулируйте и выберите несколько параметров, таких как детекторы (FSC, SSC и 10 диапазонов флуоресценции), напряжения (V ) и коэффициенты усиления фотоумножителей, а также высота-ширина области (AHW) сигнала.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие настройки детекторов были выбраны на основе эксперимента и используемого прибора: FSC-AHW: AHW, V: 270, G: 5; SSC-AHW: A, V: 350, G: 10; FL1 (CD8/FITC Dextran)-AHW: A, V: 400, G: 1; FL2 (CD25/PE)-AHW: A, V: 500, G: 1; FL6 (CD4/Alexa Fluor 647)-AHW: A, V: 700, G: 1; FL7 (Ki-67/Alexa Fluor 700)-AHW: A, V: 625, G: 1; FL9 (L/D)-AHW: A, V: 425, G: 1.
    6. На панели управления приборами, расположенной под строкой заголовка, отрегулируйте параметры расхода (средний), времени (5 мин) и событий (см. этап 5.2.8), которые необходимо обнаружить. Нажмите на опцию «Получить одиночный», чтобы позволить инструменту нарисовать/запустить сэмпл и показать предварительный просмотр обнаруженных событий в реальном времени.
    7. В режиме предварительного просмотра в реальном времени отрегулируйте порог флуоресценции (напряжение и усиление) и размер ячейки , чтобы в конечном итоге нарисовать ворота вокруг желаемой популяции клеток, исключив при этом любой клеточный мусор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: FSC помогает различать клетки по размеру, тем самым позволяя пользователям различать клетки иммунной системы, такие как моноциты и лимфоциты; моноциты крупнее и показывают более высокую интенсивность FSC по сравнению с лимфоцитами.
    8. Получите в общей сложности 5 000 живых MoDC, 50 000 живых лимфоцитов и 50 000 живых моноцитов.
    9. После того, как все параметры настроены в соответствии с отрицательным контрольным образцом, нажмите « Стоп» и сохраните протокол.
    10. Теперь загрузите все образцы на многотрубный погрузчик. Определите каждый образец в рабочем списке и примените параметры, скорректированные по отношению к отрицательному контролю, ко всем образцам в эксперименте. Нажмите на опцию Получить , чтобы разрешить последовательный запуск всех образцов в эксперименте.
    11. После того, как данные из всех образцов получены, сохраните и преобразуйте их в читаемые данные с помощью соответствующего программного обеспечения для анализа данных, которое позволяет создавать последовательные бипараметрические и монопараметрические гистограммы.

6. Анализ экспрессии матричной РНК (мРНК)

  1. Выделение РНК
    ПРИМЕЧАНИЕ: Извлеките общую РНК из антиген-импульсной кокультуры MoDC-лимфоцитов (специфической), неантиген-импульсной кокультуры MoDC-лимфоцитов (неспецифической), культуры лимфоцитов без MoDC (контроль) и из наивных лимфоцитов (CD14-клетки, выделенные до совместного культивирования). Для экстракции РНК приготовьте этанол с использованием воды, не содержащей РНКазы. Обратитесь к Таблице материалов для получения подробной информации о наборе для экстракции и реагентах.
    1. Перенесите 1 мл клеточной суспензии из пластины для совместной культуры MoDC-лимфоцитов (~1 × 106 клеток/мл) в стерильную стерильную пробирку объемом 1,5 мл с помощью пипетки и центрифугу в течение 10 мин при 500 × г.
    2. Сохраните надосадочную жидкость для ИФА. Ресуспендируют клеточную гранулу в 1 мл PBS и переносят ее в пробирку объемом 15 мл. Соберите все остаточные клетки, используя 1 мл PBS.
    3. Центрифугу в течение 10 мин по 500 × г.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Со всеми образцами следует обращаться деликатно как с живыми клетками до тех пор, пока лизис клеток не будет проведен с использованием буфера лизиса, входящего в комплект. Гибель клеток высвобождает РНКазы, которые быстро гидролизуют матрицы РНК, необходимые для количественного определения ниже по течению. Буфер RLT лизирует клетки в растворе, который ингибирует РНКазы.
    4. Добавьте 350 мкл лизисного буфера в каждую пустую лунку и инкубируйте в течение 2-3 минут, чтобы лизировать адгезивные клетки, которые не были собраны на предыдущих этапах.
    5. После завершения центрифугирования на этапе 6.1.3 откажитесь от надосадочной жидкости и объедините гранулу ячейки с 350 мкл лизисного буфера, добавленного на этапе 6.1.4.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе можно хранить пробирки при температуре -80 ° C или приступить к экстракции РНК (следующие этапы).
    6. Пипетка 350 мкл 70% этанола до лизата на этапе 6.1.5. Конечный объем образца составляет 700 мкл.
    7. Вставьте экстракционную колонку в пробирку объемом 2 мл (входит в комплект).
    8. Перенесите 700 мкл образца на экстракционную колонну и центрифугу при 10 000 × г в течение 15 с. Откажитесь от проточной трубки в сборной трубе и поместите ее обратно в спиновую колонну.
    9. В экстракционную колонну добавьте 350 мкл строгого буфера для промывки (входит в комплект) и центрифугу при концентрации более 10 000 × г в течение 15 с. Откажитесь от проточной части.
    10. Добавьте 80 мкл инкубационной смеси ДНКазы I на образец на мембрану экстракционной колонны и дайте ей застыть в течение 15 мин при 20-30 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы приготовить инкубационную смесь ДНКазы I на образец, добавьте 10 мкл исходного раствора ДНКазы I к 70 мкл буфера ДНКазы для конечного объема 80 мкл. Тщательно перемешайте, несколько раз перевернув пробирку, после чего выполните короткое вращение в центрифуге.
    11. Промывайте экстракционную колонну 350 мкл строгого буфера для промывки с последующим центрифугированием при 10 000 × г в течение 15 мин. Откажитесь от проточного потока в сборной трубке после центрифугирования.
    12. Промывают экстракционную колонну 2 раза 500 мкл мягкого промывочного буфера каждый раз и центрифугированием при 10 000 × г в течение 15 с и второй раз в течение 2 мин. Отбрасывайте проточный канал после каждого центрифугирования.
    13. Центрифугируйте колонну на максимальной скорости в течение 1 мин, чтобы высушить мембрану, и выбросьте сборную пробирку.
    14. Поместите экстракционную колонку в новую пробирку для сбора объемом 1,5 мл.
    15. Пипеткой нанесите 50 мкл воды, не содержащей РНКазы, на мембрану колонки и инкубируйте в течение 3-5 минут при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При концентрациях РНК ниже 100 нг уменьшите объем элюирования до 30 мкл и повторно элюируйте мембрану экстракционной колонки, используя продукт из первого элюирования для концентрирования конечного продукта.
    16. Центрифугу при 10 000 × г в течение 1 мин для элюции РНК.
    17. Измерьте концентрацию РНК, обнаружив поглощение на длине волны 260 нм, используя 0,5-2 мкл образца. Отрегулируйте конечную концентрацию РНК до 0,1-1 мкг/мкл с использованием воды, не содержащей РНКазы.
    18. Храните аликвоты РНК при температуре -80 ° C для последующего использования.
  2. Синтез комплементарной ДНК
    1. Синтезировать комплементарную ДНК (кДНК) из выделенной матричной РНК в соответствии с протоколом производителя, поставляемым с набором (подробности см. в Таблице материалов ).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сводная информация об используемых реагентах и объемах приведена в Таблице 1 и Таблице 2. Полный протокол подробно описан в дополнительном файле 1.
  3. Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени
    1. Для кПЦР запустите образцы кДНК в трех экземплярах. Количественно определите уровни транскрипта мРНК крупного рогатого скота для Ki-67 и ИФН-γ с использованием специфических наборов праймеров по отношению к гену GAPDH , как показано в таблице 3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полный протокол подробно описан в дополнительном файле 1.

7. Иммуноферментный анализ

  1. Обработайте собранную культуру надосадочной жидкостью, богатой секреторными белками, для количественного определения ИФН-γ с помощью ИФА.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к Таблице материалов для получения подробной информации об использовании комплекта. Полный протокол подробно описан в дополнительном файле 1.

8. Статистический анализ

  1. Проанализируйте данные и сделайте графические иллюстрации экспериментального дизайна с использованием коммерческого программного обеспечения. Для сравнительного анализа используйте непарный непараметрический тест. Считайте, что значения P < 0,05 являются статистически значимыми.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Эта методология описывает генерацию in vitro MoDC крупного рогатого скота для оценки антигенов-кандидатов вакцины перед проведением исследований in vivo. На рисунке 1 показана экспериментальная схема генерации MoDC крупного рогатого скота и применение MoDC для анализа in vitro. Используя метод магнитной сортировки клеток, удалось собрать около 26 миллионов CD14+ миоцитов из собранных PBMC, которые ранее были выделены из 50 мл крови крупного рогатого скота. Элюированная клеточная фракция, свободная от моноцитов CD14+, была богата лимфоцитами и использовалась в качестве источника наивных CD4+ и CD8+ Т-клеток (фракция клеток CD14− лимфоцитов).

Наивная фракция моноцитов состояла из 98% клеток моноцитов CD14+ , что наблюдалось после окрашивания клеток CD14 и проточной цитометрии (рис. 2A, B). Очищенные наивные клетки моноцитов при культивировании в присутствии 3% цитокинового коктейля (GM-CSF и IL-4) с последующей инкубацией 5 дней дифференцировались в DC-подобный фенотип. Из исходной культуры из 26 миллионов моноцитов CD14+ после 5 дней инкубации можно было получить в общей сложности около 12 миллионов MoDC. Наивные MoDC были функционально способны к поглощению антигена, что наблюдалось с помощью проточного цитометрического анализа FITC-декстрана (рис. 3). Кроме того, наивные MoDC были фенотипически охарактеризованы оценкой экспрессии MHC класса II и костимулирующих маркеров клеточной поверхности CD86 и CD40, что подтвердило DC-подобный фенотип (рис. 4).

Антиген-импульсная стимуляция наивных МОД достигалась путем их культивирования в присутствии инактивированного ПЖ в течение 2 дней. Активация наивных лимфоцитов (фракция CD14− клеток) достигалась путем антиген-импульсного кокультивирования MoDC-лимфоцитов с последующим добавлением IL-2. Во время совместного культивирования MoDC-лимфоцитов на 9-е сутки в RV-импульсных MoDC наблюдалось морфологическое изменение, поскольку они показали расширение дендритов, что является характеристикой созревания MoDC (рис. 5). На 14-й день активация лимфоцитов усиливалась за счет рестимуляции кокультуры путем добавления вновь продуцируемых RV-импульсных MoDC от того же животного.

По сравнению с неимпульсной кокультурой MoDC-лимфоцитов достоверное увеличение (p < 0,01) пролиферации лимфоцитов было продемонстрировано за счет повышения регуляции маркеров активации Ki-67 и CD25 как на CD4+, так и на CD8+ Т-клетках на 16-е сутки в импульсной кокультуре MoDC-лимфоцитов (рис. 6). CD8+ Т-клетки из зрелых кокультур MoDC с импульсом RV демонстрировали восьмикратную апрегуляцию (p < 0,01) Ki-67 по сравнению с неспецифической группой (рис. 7A). CD4+ Т-клетки в одной и той же кокультуре показали семикратное увеличение (p < 0,01) в Ki-67 по сравнению с контрольной группой (рис. 7B). Это демонстрирует способность МДК, праймированных ПЖ, успешно представлять антиген ПЖ наивным лимфоцитам и впоследствии активировать их в условиях in vitro, подобно тому, как это происходит у живого животного. В дополнение к анализу клеток с помощью проточной цитометрии, совместные культуры также подвергали кПЦР и ИФА для количественной оценки RV-специфической активации лимфоцитов с использованием транскрипции РНК (Ki-67 и ИФН-γ) и внеклеточной секреции (ИФН-γ) соответственно (рис. 8). Эти дополнительные методы обнаружения также могут быть использованы в качестве подтверждающих тестов для дальнейшей проверки результатов проточной цитометрии. Экспрессия РНК для Ki-67 и ИФН-γ, продемонстрированная с помощью кПЦР, и уровни ИФН-γ, продемонстрированные ИФА, показали сходные закономерности увеличения, указывающие на пролиферацию лимфоцитов, в антиген-специфической кокультуре по сравнению с группой неспецифического лечения. Таким образом, результаты кПЦР и ИФА коррелировали с результатами проточной цитометрии. КПЦР показала увеличение экспрессии ИФН-γ на >30% и увеличение экспрессии Ki-67 на >5% во всех кокультурах, использующих GAPDH в качестве калибратора (рис. 8A, B). Достоверно более высокая концентрация секретируемого ИФН-γ (**p > 0,01) была измерена с помощью ИФА с использованием культуральных супернатантов из RV-импульсной кокультуры MoDC-лимфоцитов по сравнению с группой неспецифического лечения (рис. 8C).

Figure 1
Рисунок 1: Экспериментальный дизайн анализа in vitro на основе MoDC крупного рогатого скота. (A) Сбор и клеточная сортировка фракций CD14+ моноцитов и CD14-лимфоцитов из ПБМК крупного рогатого скота. Кровь крупного рогатого скота обрабатывается центрифугированием с градиентом плотности для сбора PBMC с последующей сортировкой клеток на основе магнита с использованием колонок для разделения иммуномагнитных клеток и последующим культивированием собранной фракции моноцитарных клеток CD14+ в дополненной среде RPMI 1640. (B) Производство MoDC с использованием 3% коктейля цитокинов (GM-CSF + IL-4) с 5-дневной инкубацией и кокультурой MoDC-лимфоцитов. На 0-й день моноциты культивируют в присутствии коктейля цитокинов и инкубируют в течение 48 ч, чтобы вызвать дифференцировку. На 2-е сутки культуру рестимулируют тем же цитокиновым коктейлем с последующей инкубацией в течение 72 ч, что приводит к выработке наивных МДК. На 5-й день вакцинный антиген (вакцина против бешенства) добавляют к наивной культуре клеток MoDC с последующей инкубацией в течение 48 часов. На 7-е сутки проводят совместное культивирование антиген-импульсных MoDC с наивными лимфоцитами (фракция CD14-клеток) с последующей инкубацией. На 9-й день IL-2 добавляется в кокультуру. На 14-е сутки проводят обогащение/рестимуляцию активированных/праймированных лимфоцитов путем добавления антиген-импульсных МОДК с последующей инкубацией в течение 48 ч. Наконец, на 16-й день клетки и культуральная надосадочная жидкость собирают для анализа пролиферации лимфоцитов. Сокращения: MODC = дендритные клетки, полученные из моноцитов крупного рогатого скота; PBMC = мононуклеарные клетки периферической крови; GM-CSF = гранулоцитарно-макрофагально-колониестимулирующий фактор. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Морфология и чистота моноцитов CD14+ крупного рогатого скота, собранных из PBMC с использованием анти-CD14-конъюгированных микрогранул. (A) Морфология моноцитов крупного рогатого скота, инкубированных в течение 4 ч при 37 ° C в полной питательной среде для удаления микрогранул, закрепленных на предметных стеклах с полилизиновым покрытием и окрашенных модифицированным окрашиванием Гимзы. Масштабная линейка = 50 мкм. (B) Гистограмма проточной цитометрии, показывающая элюированную фракцию клеток CD14+ с уровнем чистоты 98,6%, наблюдаемую с использованием антитела против CD14 (красный) и FITC-конъюгированного контрольного антитела IgG1 мыши изотипа (зеленый). Сокращения: PBMCs = мононуклеарные клетки периферической крови; FITC cont = контроль изотиоцианата флуоресцеина. Эта цифра была изменена из Kangethe et al., 201811. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Эндоцитарная активность MoDC крупного рогатого скота, генерируемых in vitro. Гистограмма проточной цитометрии, показывающая поглощение молекулы-индикатора (FITC-декстран) на 5-й день наивных MoDC. MoDC инкубировали при 37 ° C в течение 60 мин с молекулой-индикатором (синий), а MoDC инкубировали на льду с молекулой-индикатором (серый), используемой в качестве фонового контроля. Сокращения: MODC = дендритные клетки, полученные из моноцитов крупного рогатого скота; FITC = изотиоцианат флуоресцеина. Эта цифра была изменена из Kangethe et al., 201811. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Фенотипирование маркеров клеточной поверхности крупного рогатого скота, специфичных для MoDC, генерируемых in vitro. Гистограммы проточной цитометрии для (А) стробирующих стратегий MoDC и для (B) наивных MoDC на 5-й день, окрашенных тремя различными DC-специфическими mAb (синие), включая следующие: против овец MHC II mAb, против крупного рогатого скота CD86 mAb и против крупного рогатого скота CD40 mAb. Все они сравниваются с соответствующими элементами изотипа (красный). Сокращения: DC = дендритные клетки; MODC = ДК, полученные из моноцитов крупного рогатого скота; MHC II = главный комплекс гистосовместимости II. Эта цифра была изменена из Kangethe et al., 201811. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Признаки созревания продуцируемых in vitro MoDC во время кокультуры MoDC-лимфоцитов. Наблюдение характерной расширенной дендритной структуры с помощью антиген-импульсных МОДК с инвертированной микроскопией на 9-е сутки кокультуры MoDC-лимфоцитов. (A) Зрелые MoDC в сильно сливающейся области совместно культивируемых лимфоцитов. (B) Зрелые MoDC легко различимы в области с меньшим количеством лимфоцитов в совместной культуре. Масштабные линейки = 50 мкм. Аббревиатура: MODC = дендритные клетки, полученные из моноцитов крупного рогатого скота. Эта цифра была изменена из Kangethe et al., 201811. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Стратегия последовательного стробирования, принятая для точечных графиков против экспрессии Ki-67 и CD25 лимфоцитами в кокультуре MoDC-лимфоцитов. (A) Стратегияполного стробирования для клеток, собранных с 16-го дня совместной культуры MoDC-лимфоцитов. (B) Экспрессия Ki-67 из CD4+-управляемых лимфоцитов и (C) из CD8+ лимфоцитов по сравнению с контролем FMO (без mAb) и контролем изотипа IgG1-k мыши mAb. Экспрессия CD25 на закрытых (D) CD8+ и (E) CD4+ лимфоцитах по сравнению с мышиным изотипом IgG1 контролирует mAb. Группа лечения представляет лимфоциты, культивируемые совместно с RV-импульсными MoDC, тогда как контрольная представляет лимфоциты, культивируемые в отсутствие MoDC. Сокращения: MODC = дендритные клетки, полученные из моноцитов крупного рогатого скота; FMO = флуоресцентный минус один; RV = вакцина против бешенства. Эта цифра была изменена из Kangethe et al., 201811. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7: Анализ данных проточной цитометрии экспрессии Ki-67 и CD25 лимфоцитами CD4+ и CD8+ после прайминга антигеном. Экспрессия Ki-67 и CD25 с 16-го дня совместной культуры. Группа лечения (специфическая) определяется как лимфоциты, культивируемые с помощью RV-импульсных MoDC; неспецифическая группа соответствует лимфоцитам, культивируемым с неантиген-импульсными MoDC; контрольной группе соответствуют лимфоциты, культивируемые без MoDC. Горизонтальные полосы представляют собой среднее значение шести технических реплик. (A) Внутриклеточная экспрессия маркера Ki-67 CD8 Т-клетками и (B) CD4 Т-клетками. (C) Экспрессия маркера CD25 на клеточной поверхности CD8 Т-клетками и (D) CD4 Т-клетками. Сокращения: MODC = дендритные клетки, полученные из моноцитов крупного рогатого скота; RV = вакцина против бешенства. Эта цифра была изменена из Kangethe et al., 201811. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 8
Рисунок 8: Активация маркера Th1 (ИФН-γ и Ki-67) с помощью MoDC, примированных антигеном вируса бешенства, обнаруженная с помощью кПЦР и ИФА. Данные взяты от одного животного с шестью техническими репликами. Горизонтальные полосы представляют собой среднее значение. Три реплики ПЦР показаны в виде изменений складки по сравнению с наивными лимфоцитами после нормализации референсным геном GAPDH . (А) выражение ИФН-γ , (В) выражение Ki-67 . (C) Сравнение секреции ИФН-γ в супернатанте культуры между тремя группами лечения, обнаруженной с помощью ИФА. Специфическая группа определяется как лимфоциты, культивируемые с помощью RV-импульсных MoDC; неспецифическая группа соответствует лимфоцитам, культивируемым с неантиген-импульсными MoDC; контрольной группе соответствуют лимфоциты, культивируемые без MoDC. Сокращения: MODC = дендритные клетки, полученные из моноцитов крупного рогатого скота; RV = вакцина против бешенства. Эта цифра была изменена из Kangethe et al., 201811. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Реагентов Окончательная концентрация Объем на реакцию
Микс dNTP (10 мМ) 1 000 мкМ 1 мкл
Случайные гексамерные праймеры (50 нг/мкл) 25 мкМ 1 мкл
Шаблон РНК 0,1 – 1 мкг/мкл χ мкл (по мере необходимости)
Вода, свободная от РНКазы - χ мкл (по мере необходимости)
Конечный объем реакции - 10 мкл

Таблица 1: Состав мастер-смеси (смесь РНК-праймеров).

Реагентов Окончательная концентрация Объем на реакцию
Буфер RT 10x 1x 2 мкл
MgCl2 25 мМ 5 мМ 4 мкл
DTT 0,1 м 10 мМ 2 мкл
Ингибитор РНКазы 40 ЕД/мкл 2 U 1 мкл

Таблица 2: Реакционная смесь 2x ПЦР. Сокращения: RT = обратная транскриптаза; DTT = дитиотреитол.

Цитокин Вид Регистрационный номер Последовательность Длина Тм
ИФН-γ Бос Телец FJ263670 F- GTGGGCCTCTCTCTTCTCAGAA 234 80.5
R- GATCATCCACCGGAATTTGA
Ки-67 Бос Телец XM_015460791.2 F-AAGATTCCAGCGCCCATTCA 148 86.5
R-TGAGGAACGAACGACTGG
ГАПДЧ Бос Телец Sassu et al., 2020 F-CCTGGAGAAACCTGCCAAGT 214 85.5
R-GCCAAATTCATTGTCGTACCA

Таблица 3: Наборы праймеров, используемые для усиления50.

Реагентов Окончательная концентрация Объем на реакцию
Супермикс 1x 5 мкл
Прямой праймер (5 мкМ) 250/ 125 нМ 1 мкл
Обратные праймеры (5 мкМ) 250/ 125 нМ 1 мкл
кДНК 1:10 разбавленная 1.25 нг 2 мкл
Вода, не содержащая нуклеаз - 1 мкл
Конечный объем реакции - 10 мкл

Таблица 4: мастер-микс для кПЦР

Трубка No. Концентрация Стандарта Серийное разбавление
1 50 нг/мл 50 мкл стандартного + 350 мкл буфера для стирки
2 12,5 нг/мл 150 мкл из тюбика 1 + 450 мкл буфера для стирки
3 6,25 нг/мл 250 мкл из тюбика 2 + 250 мкл буфера для стирки
4 3,13 нг/мл 250 мкл из тюбика 3 + 250 мкл буфера для стирки
5 1,56 нг/мл 250 мкл из тюбика 4 + 250 мкл буфера для стирки
6 0,78 нг/мл 250 мкл из тюбика 5 + 250 мкл буфера для стирки
7 0,2 нг/мл 150 мкл из тюбика 6 + 450 мкл буфера для стирки
8 0,1 нг/мл 250 мкл из тюбика 7 + 250 мкл буфера для стирки
9 0,025 нг/мл 100 мкл из тюбика 8 + 300 мкл буфера для стирки

Таблица 5: Серия стандартного разбавления ИФН-γ

Дополнительный файл 1: Протоколы синтеза комплементарной ДНК, количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (кПЦР) и иммуноферментного анализа (ИФА). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S1: Способность к поглощению антигена MoDC при различных концентрациях цитокинового коктейля и при 3 или 5 днях культивирования. Различные концентрации (5% мас./об. и 3% мас./об.) цитокинового коктейля, содержащего GM-CSF и IL-4, были протестированы либо с 3-дневным, либо с 5-дневным культивированием для оценки наилучшей комбинации для получения высокоэффективных MoDC поглощения антигена (с использованием молекулы-индикатора FITC-декстран). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S2: Прайминг CD4 и CD8 дифтерийным анатоксином (DT) и вирусом блютанга серотипа 4 (BTV). Экспрессия Ki-67 клетками CD8 после пульсации с (A) DT и (C) BTV и экспрессия Ki-67 клетками CD4 после пульсации с (B) DT и (D) BVT на 16-й день. Сравнения проводились с культурами, импульсированными DT и BVT (специфическими), (C, D) с CD40L, а также с неспецифическими прайминговыми и контрольными обработками. Горизонтальные полосы показывают среднее значение. *p < 0,05, **p < 0,01 по критерию Манна-Уитни. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Это исследование демонстрирует стандартизированный метод in vitro для получения и фенотипирования МО крупного рогатого скота и их последующего использования для измерения иммуногенности вакцины коммерческой вакцины (например, RV). MoDC крупного рогатого скота можно использовать в качестве инструмента для скрининга потенциальных вакцинных антигенов против болезней крупного рогатого скота и прогнозирования их потенциального клинического воздействия на основе иммунных ответов, прежде чем переходить к испытаниям in vivo на животных. Полученные МОД были идентифицированы на основе их морфологических, фенотипических и функциональных характеристик. Мы показали, что MoDC, полученные из CD14+ моноцитов крупного рогатого скота, проявляют особенности, наблюдаемые в DC, такие как расширенные дендриты, экспрессия маркеров клеточной поверхности для презентации антигена, таких как MHC II, экспрессия костимулирующих молекул на MoDC, таких как CD40 и CD86, эндоцитарная активность и способность активировать наивные лимфоциты.

Среды для культивирования клеток, используемые в этом эксперименте (DMEM и RPMI), широко используются для дифференцировки и культивирования клеток, при этом RPMI чаще используется для дифференцировки моноцитов36. Добавление RPMI с FBS или HS (лошадиной сывороткой) не влияет на дифференцировку моноцитов37. Рекомбинантные добавки GM-CSF и IL-4 обеспечивают воспалительное состояние, которое вызывает дифференцировку моноцитов и обычно используется для производства функционально жизнеспособных MoDC, способных поглощать антиген и демонстрировать его иммунным клеткам38,39. В этом исследовании среда RPMI 1640, дополненная 10% FBS (полная питательная среда), 1% пенициллин-стрептомицин и добавление коммерчески доступного коктейля цитокинов (GM-CSF плюс IL-4), индуцировала дифференцировку моноцитов крупного рогатого скота, что привело к образованию жизнеспособных MoDC. Когда сгенерированные MoDC инкубировали с RV перед совместным культивированием с наивными лимфоцитами, они индуцировали Т-клеточно-зависимый иммунный ответ, специфичный против RV, доказывая, что зрелые MoDC могут адекватно представлять антигены RV лимфоцитам, которые никогда не сталкивались с RV. Это важнейшая характеристика адаптивного иммунитета, которую мы теперь можем воспроизвести в лаборатории.

Мы наблюдали, что более высокая концентрация цитокинового коктейля (5%) в сочетании с более длительным временем инкубации (5 дней) продуцировала MoDC с более низкой эндоцитарной способностью к поглощению антигена, чем те, кто получал более низкую концентрацию цитокинового коктейля (3%) с тем же временем инкубации (5 дней), как показано на дополнительном рисунке S1. Следовательно, мы приходим к выводу, что более низкая концентрация цитокинового коктейля (например, 3%) в течение 5 дней инкубации является оптимальной для получения функционально мощных MoDC. Маркеры клеточной поверхности, такие как MHC II, CD40 и CD86, присутствуют на APC, и их активация указывает на функциональную активацию клеток40,41,4 2. Мы продемонстрировали повышенную экспрессию MHC II, CD40 и CD86 после дифференцировки моноцитов в наивные MoDC с использованием цитокинового коктейля (рис. 4).

Оптимизация соотношения наивных лимфоцитов и MoDC в культуральной системе является ключевым фактором, влияющим на результат анализа MoDC, при этом различные соотношения MoDC и лимфоцитов индуцируют различные реакции лимфоцитов43. Однако, оценив соотношение MoDC и лимфоцитов 1:10-1:40, мы заметили, что увеличение концентрации MoDC не увеличивает активацию лимфоцитов, и в конечном итоге мы остановились на оптимальном соотношении 1:20, что аналогично ранее опубликованным исследованиям44,45. Следует отметить, что элюированная наивная фракция лимфоцитов может содержать неспецифически активированные Т-клетки; Поэтому крайне важно иметь контрольную группу, соответствующую только наивной культуре лимфоцитов.

Активированные CD4+ и CD8+ Т-клетки экспрессируют специфические маркеры и секретируют различные цитокины, а их количественное определение указывает на иммунную активацию. Внутриклеточная экспрессия Ki-67, хорошо охарактеризованного маркера иммунной активации, была повышена в этой кокультуре MoDC-лимфоцитов 29,46. Аналогичным образом, в этом исследовании усиленная секреция ИФН-γ лимфоцитами указывала на ответ Th1, вызванный антигеном RV30,31,47. Экспрессия IL-2 CD4+ Т-клетками также является хорошим маркером для визуализации активации Т-клеток; однако его включение на 9-й день кокультуры MoDC-лимфоцитов сделало его неподходящей мишенью для измерения пролиферации лимфоцитов для этого исследования48. Ранее было показано, что активация CD25 в присутствии IL-2 определяет прайминг как CD4+, так и CD8+ Т-клеток и использовалась в этом исследовании для измерения прайминга наивных лимфоцитов RV-импульсными MoDCs28.

Цитотоксические CD8 Т-клетки являются основными эффекторными клетками против внутриклеточных вакцинных антигенов или вирусных патогенов49. Измеряя маркеры активации лимфоцитов (Ki-67 и CD25) и экспрессию цитокинов (ИФН-γ), мы обнаружили, что нагруженные антигеном MoDC имели значительную (p < 0,01) активацию как CD8, так и CD4 Т-клеточных ответов, при этом ответ CD8 и поляризация Th1 были более распространены против антигена RV. Важным фактором, который необходимо учитывать при разработке анализа MoDC для адъювантно-конъюгированных вакцин, являются адъювант-индуцированные реакции лимфоцитов. Мы рекомендуем использовать контрольную группу (адъювантный контроль), состоящую только из адъюванта, чтобы устранить любые фоновые сигналы. Эта установка также может быть использована для измерения эффекта различных адъювантов, которые могут усиливать реакцию лимфоцитов на низкоиммуногенный антиген, что имеет решающее значение для защиты во время исследований in vivo .

В этом исследовании есть некоторые ограничения, которые мы хотим выделить. Экспериментальные данные для каждого анализа были получены от одного животного с шестью техническими репликами. Наличие большего числа биологических реплик было бы полезно для минимизации ошибок и обеспечения повышенной статистической надежности и результатов с более высокой точностью. Тем не менее, в предыдущей публикации11 этот анализ также был протестирован и валидирован с использованием дифтерийного анатоксина (дополнительный рисунок S2A, B) и коммерческой вакцины против вируса блютанга серотипа 4 (дополнительный рисунок S2C, D) с тремя и двумя биологическими животными соответственно. Кроме того, сравнение результатов, полученных в ходе этого исследования in vitro, с исследованием in vivo помогло бы дополнительно подтвердить подлинность этого иммунного анализа, что, в свою очередь, ускорило бы процесс внедрения этого анализа in vitro MoDC в качестве рутинного теста при производстве вакцин и контроле качества. Наконец, экспрессия CD14 в MoDC не исследовалась, поскольку литература непоследовательна в отношении этого аспекта, особенно при сравнении MoDC от разных видов животных.

В заключение мы сообщаем об анализе MoDC крупного рогатого скота in vitro , который можно использовать для измерения иммуногенности, вызванной вакциной. Этот анализ MoDC также может быть оценен с использованием различных методов, включая проточную цитометрию, ИФА и кПЦР. Наличие нескольких методов оценки маркеров активации имеет решающее значение в районах с ограниченными ресурсами, где проточный цитометр может быть недоступен. Этот анализ может быть включен в качестве этапа контроля качества национальными ветеринарными лабораториями, которые производят большие партии вакцин против крупного рогатого скота. Кроме того, его можно использовать для идентификации потенциальных вакцинных антигенов во время разработки новых вакцин против крупного рогатого скота и даже для выбора адъюванта для использования перед испытанием на животных. Все эти факторы будут способствовать более этичному и доступному подходу к разработке и использованию вакцин против крупного рогатого скота.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликтов интересов, которые необходимо раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарим д-ра Эвелин Водак и д-ра Анжелику Лойстч (AGES) за их поддержку в определении состояния здоровья животных и за предоставление BTV, д-ра Бернхарда Райнелта за предоставление крови крупного рогатого скота, а также д-ра Бхарани Сеттипалли и д-ра Уильяма Дандона из МАГАТЭ за полезные советы по экспериментам с ПЦР в реальном времени и редактированию языка, соответственно.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACK Lysing Buffer Gibco, Thermo Fisher A1049201 Ammonium-Chloride-Potassium buffer for lysis of residual RBCs in harvested PBMC Fraction
BD Vacutainer Heparin Tubes Becton, Dickinson (BD) and Company 366480 10 mL, additive sodium heparin 158 USP units, glass tube, 16 x 100 mm size
Bovine Dendritic Cell Growth Kit Bio-Rad, UK PBP015KZZ Cytokine cocktail composed of recombinant bovine IL-4 and GM-CSF
Bovine IFN-γ ELISA Kit Bio-Rad MCA5638KZZ Kit use for measuring IFN-γ expression in culture supernatant
CD14 Antibody Bio-Rad MCA2678F Mouse anti-bovine CD14 monoclonal antibody, clone CC-G33, isotype IgG1
CD25 Antibody Bio-Rad MCA2430PE Mouse anti bovine CD25 monoclonal antibody, clone IL-A11, isotype IgG1
CD4 Antibody Bio-Rad MCA1653A647 Mouse anti bovine CD4 monoclonal antibody, clone CC8, isotype IgG2a
CD40 Antibody Bio-Rad MCA2431F Mouse anti-bovine CD40 monoclonal antibody, clone IL-A156, isotype IgG1
CD8 Antibody Bio-Rad MCA837F Mouse anti bovine CD8 monoclonal antibody, clone CC63, isotype IgG2a
CD86 Antibody Bio-Rad MCA2437PE Mouse anti-bovine CD86 monoclonal antibody, clone IL-A190, isotype IgG1
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System Bio-Rad - Thermal cycler PCR machine
Corning Centrifuge Tube Falcon Corning  352096 & 352070 15 mL and 50 mL, high-clarity poypropylene conical bottom, graduated, sterial, seal screw cap, falcon tube
Cytofix/Cytoperm Plus BD Bio Sciences 555028 Fixation/permeabilization kit with BD golgiPlug, use for flow cytometer cell staining
Ethanol Sigma Aldrich 1009832500 Absolute for analysis EMSURE ACS,ISO, Reag. Ph Eur
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco, Thermo Fisher 10500064 Qualified, heat inactivated
Ficoll Plaque PLUS GE Health care Life Sciences, USA 341691 Lymphocyte-isolation medium
FlowClean Cleaning Agent Beckman Coulter, Life Sciences A64669 500 mL
FlowJo FlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, USA - Flow cytometer Histogram software
FlowTubes/ FACS  (Fluorescence-activated single-cell sorting) Tube Falcon Corning  352235 5 mL, sterial, round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap, use in flow cytometry analysis
Fluoresceinisothiocynat-Dextran Sigma Aldrich, Germany 60842-46-8 FITC-dextran MW
Gallios Flow Cytometer Beckman Coulter - Flow cytometer machine
Hard-Shell 96-Well PCR Plates Bio-Rad HSP9601 96 well, low profile, thin wall, skirted, white/clear
Human CD14 MicroBeads Miltenyi Bioteck, Germany 130-050-201 2 mL microbeads conjugated to monoclonal anti-human CD14 antibody isotype IgG2a, used for selection of bovine monocytes from PBMCs
Kaluza Beckman Coulter, Germany - Flow cytometer multicolor data analysis software
MACS Column Miltenyi Bioteck, Germany 130-042-401 Magnetic activated cell sorting or immune magentic cell separation colum for separation of various CD14 cell population based on cell surface antigens
MHC Class II DQ DR Polymorphic Antibody Bio-Rad MCA2228F Mouse anti-sheep MHC Class II DQ DR Polymorphic:FITC, clone 49.1, isotype IgG2a, cross reactive with bovine
Microcentrifuge Tube Sigma Aldrich HS4325 1.5 mL, conical bottom, graduated, sterial tube
Microsoft Power Point Microsoft - The graphical illustrations of experimental design
Mouse IgG1 Negative Control:FITC for CD14, CD40 Antibody Bio-Rad MCA928F Isotype control CD14 and CD40 monoclonal antibody 
Mouse IgG1 Negative Control:PE for CD86 Antibody Bio-Rad MCA928PE Isotype control CD86 monoclonal antibody 
Mouse IgG1 Negative Control:RPE for CD25 Antibody Bio-Rad MCA928PE Isotype control CD25 monoclonal antibody 
Mouse IgG2a Negative Control:FITC for MHC Class II Antibody Bio-Rad MCA929F Isotype control for MHC class II monoclonal antibody 
Nobivac Rabies MSD Animal Health, UK - 1 µL/mL of cell cultured inactivated vaccine containing > 2 I.U./mL Rabies virus strain
Optical seals Bi0-Rad TCS0803 0.2 mL flat PCR tube 8-cap strips, optical, ultraclear, compatible for qPCR machine
Penicillin-Streptomycin Gibco, Thermo Fisher 15140122 100 mL
Phosphate Buffer Saline (PBS) Gibco, Thermo Fisher 10010023 pH 7.4, 1x concentration
Prism - GraphPad 5 Software  Dotmatics - Statistical software
Purified Anti-human Ki-67 antibody Biolegend, USA 350501 Monoclonal antibody, cross reactive with cow, clone ki-67
Purified Mouse IgG1 k Isotype Ctrl Antibody Biolegend 400101 Isotype control for Ki-67 monoclonal antibody
READIDROP Propidium Iodide BD Bio Sciences 1351101 Live/dead cell marker used for flow cytometry, amine reactive dye
Recombinant Human IL-2 Protein R&D System, USA 202-IL-010/CF Interleukin-2, 20 ng/ml
RNeasy Mini Kit Qiagen 74106 Kit use for extraction of total RNA; RLT buffer = lysis buffer; RW1 buffer = stringent guanidine-containing washing buffer; RDD buffer = DNase buffer; RPE buffer = mild wash buffer; RNaseOUT = RNase inhibitor.
RPMI 1640 Medium Sigma Aldrich R8758 Cell culture media with L-glutamine and sodium bicarbonate
SMART-servier medical art  Les Laboratories Servier - Licensed under a creative commons attribution 3.0 unported license
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 172-5270 2x qPCR mix conatins dNTPs, Ss07d fusion polymerase, MgCl2, SYBR Green I supermix = supermix, ROX normalization dyes.
SuperScript III First-Strand Synthesis System Invitrogen, Thermo Fisher 18080051 Kit for cDNA synthsis
Tissue Culture Test plate 24 TPP, Switzerland 92024 24 well plate, sterilized by radiation , growth enhanced treated, volume 3.18 mL
Trypan Blue Solution Gibco, Thermo Fisher 15250061 0.4%, 100 mL, dye to assess cell viability
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Invitrogen, Thermo Fisher 10977023 0.1 µm membrane filtered distilled water
VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes Thermo Fisher Scientific 15206067 VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes have a green top and contain spray-dried lithium, sodium or ammonium heparin on the inner walls and are usedin clinical chemistry, immunology and serology. The anticoagulant heparin activates antithrombin, which blocks the clotting cascade and thus produces a whole blood/plasma sample.
Water Sigma Aldrich W3500-1L Sterile-filtered, bioReagent suitable for cell culture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roth, J. A., Sandbulte, M. R. The role of veterinary vaccines in livestock production, animal health, and public health. In Veterinary Vaccines: Principles and Applications. Metwally, S., El Idrissi, A., Viljoen, G. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 1-10 (2021).
  2. Roberts, N. J., Douglas, R. G., Simons, R. M., Diamond, M. E. Virus-induced interferon production by human macrophages. The Journal of Immunology. 123 (1), 365-369 (1979).
  3. Kleiveland, C. R. Peripheral blood mononuclear cells. The Impact of Food Bioactives on Health: In Vitro and Ex Vivo Models. Verhoeckx, K., Cotter, P., López-Expósito, I., Kleiveland, C., Lea, T., Mackie, A., Requena, T., Swiatecka, D., Wichers, H. , Springer. Cham, Switzerland. 161-167 (2015).
  4. Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 762-774 (2011).
  5. Domínguez, P. M., Ardavín, C. Differentiation and function of mouse monocyte-derived dendritic cells in steady state and inflammation. Immunological Reviews. 234 (1), 90-104 (2010).
  6. Steinman, R. M. Linking innate to adaptive immunity through dendritic cells. Novartis Foundation Symposium. 279, 101-109 (2006).
  7. Vandebriel, R. J., Hoefnagel, M. H. N. Dendritic cell-based in vitro assays for vaccine immunogenicity. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 8 (9), 1323-1325 (2012).
  8. Hopewell, E. L., Cox, C. Manufacturing dendritic cells for immunotherapy: Monocyte enrichment. Molecular Therapy. Methods and Clinical Development. 16, 155-160 (2020).
  9. Morse, M. A., Zhou, L. -J., Tedder, T. F., Lyerly, H. K., Smith, C. Generation of dendritic cells in vitro from peripheral blood mononuclear cells with granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor, interleukin-4, and tumor necrosis factor-alpha for use in cancer immunotherapy. Annals of Surgery. 226 (1), 6-16 (1997).
  10. Robinson, L., et al. Foot-and-mouth disease virus exhibits an altered tropism in the presence of specific immunoglobulins, enabling productive infection and killing of dendritic cells. Journal of Virology. 85 (5), 2212-2223 (2011).
  11. Kangethe, R. T., Pichler, R., Chuma, F. N. J., Cattoli, G., Wijewardana, V. Bovine monocyte derived dendritic cell based assay for measuring vaccine immunogenicity in vitro. Veterinary Immunology and Immunopathology. 197, 39-48 (2018).
  12. Harwood, L. J., Gerber, H., Sobrino, F., Summerfield, A., McCullough, K. C. Dendritic cell internalization of foot-and-mouth disease virus: Influence of heparan sulfate binding on virus uptake and induction of the immune response. Journal of Virology. 82 (13), 6379-6394 (2008).
  13. Hussen, J., et al. Phenotypic and functional heterogeneity of bovine blood monocytes. PLoS One. 8 (8), 71502 (2013).
  14. Shi, Y., et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and T-cell responses: What we do and don't know. Cell Research. 16 (2), 126-133 (2006).
  15. Zhou, L. -J., Tedder, T. F. CD14+ blood monocytes can differentiate into functionally mature CD83+ dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (6), 2588-2592 (1996).
  16. Bautista, E. M., Nfon, C., Ferman, G. S., Golde, W. T. IL-13 replaces IL-4 in development of monocyte derived dendritic cells (MoDC) of swine. Veterinary Immunology and Immunopathology. 115 (1-2), 56-67 (2007).
  17. León, B., Ardavín, C. Monocyte-derived dendritic cells in innate and adaptive immunity. Immunology and Cell Biology. 86 (4), 320-324 (2008).
  18. Berger, A. Th1 and Th2 responses: What are they. British Medical Journal. 321 (7258), 424 (2000).
  19. Romagnani, S. Th1/th2 cells. Inflammatory Bowel Diseases. 5 (4), 285-294 (1999).
  20. Kaiko, G. E., Horvat, J. C., Beagley, K. W., Hansbro, P. M. Immunological decision-making: How does the immune system decide to mount a helper T-cell response. Immunology. 123 (3), 326-338 (2008).
  21. Duckworth, B. C., Groom, J. R. Conversations that count: Cellular interactions that drive T cell fate. Immunological Reviews. 300 (1), 203-219 (2021).
  22. León, B., López-Bravo, M., Ardavín, C. Monocyte-derived dendritic cells formed at the infection site control the induction of protective T helper 1 responses against Leishmania. Immunity. 26 (4), 519-531 (2007).
  23. Singh, D., et al. Differential responses of chicken monocyte-derived dendritic cells infected with Salmonella gallinarum and Salmonella typhimurium. Scientific Reports. 11, 17214 (2021).
  24. Pujol, M., et al. Variability in the response of canine and human dendritic cells stimulated with Brucella canis. Veterinary Research. 48, 72 (2017).
  25. Pujol, M., Borie, C., Montoya, M., Ferreira, A., Vernal, R. Brucella canis induces canine CD4+ T cells multi-cytokine Th1/Th17 production via dendritic cell activation. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 62, 68-75 (2019).
  26. Lašťovička, J., Rataj, M., Bartůňková, J. Assessment of lymphocyte proliferation for diagnostic purpose: Comparison of CFSE staining, Ki-67 expression and 3H-thymidine incorporation. Human Immunology. 77 (12), 1215-1222 (2016).
  27. Reddy, M., Eirikis, E., Davis, C., Davis, H. M., Prabhakar, U. Comparative analysis of lymphocyte activation marker expression and cytokine secretion profile in stimulated human peripheral blood mononuclear cell cultures: An in vitro model to monitor cellular immune function. Journal of Immunological Methods. 293 (1-2), 127-142 (2004).
  28. Shatrova, A. N., et al. Time-dependent regulation of IL-2R α-chain (CD25) expression by TCR signal strength and IL-2-induced STAT5 signaling in activated human blood T lymphocytes. PLoS One. 11 (12), 0167215 (2016).
  29. Shedlock, D. J., et al. Ki-67 staining for determination of rhesus macaque T cell proliferative responses ex vivo. Cytometry, Part A. 77 (3), 275-284 (2010).
  30. Yen, H. -R., et al. Tc17 CD8 T cells: Functional plasticity and subset diversity. Journal of Immunology. 183 (11), 7161-7168 (2009).
  31. Kawamura, I., et al. IFN-gamma-producing ability as a possible marker for the protective T cells against Mycobacterium bovis BCG in mice. Journal of Immunology. 148 (9), 2887-2893 (1992).
  32. Federal Ministry Republic of Austria. Agriculture, Forestry, Regions and Water Management. The Federal Act on Animal Welfare (Tierschutzgesetz - TSchG). Federal Law Gazette I 2004/118. , Available from: https://info.bml.gv.at/en/topics/agriculture/agriculture-in-austria/animal-production-in-austria/animal-welfare-act.html (2005).
  33. Corripio-Miyar, Y., et al. Phenotypic and functional analysis of monocyte populations in cattle peripheral blood identifies a subset with high endocytic and allogeneic T-cell stimulatory capacity. Veterinary Research. 46, 112 (2015).
  34. Wijewardana, V., et al. Generation of canine dendritic cells from peripheral blood monocytes without using purified cytokines. Veterinary Immunology and Immunopathology. 114 (1-2), 37-48 (2006).
  35. Gallios Flow Cytometer with Kaluza for Gallios Software. Instructions for Use. Beckman Coulter. , Available from: http://www.cytometrie-imagerie-saint-antoine.org/media/3924/Kaluza.Gallos.pdf (2014).
  36. Švajger, U., Jeras, M. Optimal dendritic cell differentiation in rpmi media requires the absence of HEPES buffer. Immunological Investigations. 40 (4), 413-426 (2011).
  37. Chometon, T. Q., et al. A protocol for rapid monocyte isolation and generation of singular human monocyte-derived dendritic cells. PLoS One. 15 (4), 0231132 (2020).
  38. Blanco, F. C., et al. Semi-stable production of bovine IL-4 and GM-CSF in the mammalian episomal expression system. Journal of Veterinary Research. 65 (3), 315-321 (2021).
  39. Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. Journal of Experimental Medicine. 179 (4), 1109-1118 (1994).
  40. Cho, K. -J., Roche, P. A. Regulation of MHC class II-peptide complex expression by ubiquitination. Frontiers in Immunology. 4, 369 (2013).
  41. Sansom, D. M., Manzotti, C. N., Zheng, Y. What's the difference between CD80 and CD86. Trends in Immunology. 24 (6), 313-318 (2003).
  42. Han Lee, G., et al. The role of CD40 expression in dendritic cells in cancer biology; a systematic review. Current Cancer Drug Targets. 14 (7), 610-620 (2014).
  43. Tanaka, H., Demeure, C. E., Rubio, M., Delespesse, G., Sarfati, M. Human monocyte-derived dendritic cells induce naive T cell differentiation into T helper cell type 2 (Th2) or Th1/Th2 effectors: Role of stimulator/responder ratio. Journal of Experimental Medicine. 192 (3), 405-412 (2000).
  44. Klechevsky, E., et al. Cross-priming CD8+ T cells by targeting antigens to human dendritic cells through DCIR. Blood. 116 (10), 1685-1697 (2010).
  45. Schlienger, K., Craighead, N., Lee, K. P., Levine, B. L., June, C. H. Efficient priming of protein antigen-specific human CD4+ T cells by monocyte-derived dendritic cells. Blood. 96 (10), 3490-3498 (2000).
  46. Soares, A., et al. Novel application of Ki67 to quantify antigen-specific in vitro lymphoproliferation. Journal of Immunological Methods. 362 (1-2), 43-50 (2010).
  47. Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations. Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2009).
  48. Bachmann, M. F., Oxenius, A. Interleukin 2: From immunostimulation to immunoregulation and back again. EMBO Reports. 8 (12), 1142-1148 (2007).
  49. Koup, R. A., Douek, D. C. Vaccine design for CD8 T lymphocyte responses. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 1 (1), 007252 (2011).
  50. Sassu, E. L., et al. Development and evaluation of a real-time PCR panel for the detection of 20 immune markers in cattle and sheep. Veterinary Immunology and Immunopathology. 227, 110092 (2020).

Tags

Пустое значение выпуск 195
Определение иммуногенности вакцины с использованием дендритных клеток, полученных из моноцитов крупного рогатого скота
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liaqat, F., Kangethe, R. T.,… More

Liaqat, F., Kangethe, R. T., Pichler, R., Liu, B., Huber, J., Wijewardana, V., Cattoli, G., Porfiri, L. Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (195), e64874, doi:10.3791/64874 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter