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Immunology and Infection

Determinazione dell'immunogenicità del vaccino utilizzando cellule dendritiche derivate da monociti bovini

Published: May 19, 2023 doi: 10.3791/64874
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1, 1, 1
1Animal Production and Health Section, Joint Food and Agriculture Organization (FAO)/International Atomic Energy Agency (IAEA) Centre of Nuclear Techniques in Food and Agriculture, International Atomic Energy Agency, 2Teaching and Research Farm Kremesberg, Clinical Unit for Herd Health Management in Ruminants, Department for Farm Animals and Veterinary Public Health, University of Veterinary Medicine, Vienna

Summary

La metodologia descrive la generazione di cellule dendritiche derivate da monociti bovini (MoDC) e la loro applicazione per la valutazione in vitro di candidati antigenici durante lo sviluppo di potenziali vaccini veterinari nei bovini.

Abstract

Le cellule dendritiche (DC) sono le cellule presentanti l'antigene (APC) più potenti all'interno del sistema immunitario. Pattugliano l'organismo alla ricerca di agenti patogeni e svolgono un ruolo unico all'interno del sistema immunitario collegando le risposte immunitarie innate e adattative. Queste cellule possono fagocitare e quindi presentare antigeni catturati alle cellule immunitarie effettrici, innescando una vasta gamma di risposte immunitarie. Questo articolo dimostra un metodo standardizzato per la generazione in vitro di cellule dendritiche derivate da monociti bovini (MoDC) isolate da cellule mononucleate del sangue periferico del bestiame (PBMC) e la loro applicazione nella valutazione dell'immunogenicità del vaccino.

La selezione cellulare su base magnetica è stata utilizzata per isolare i monociti CD14+ dalle PBMC e l'integrazione di terreno di coltura completo con interleuchina (IL)-4 e fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF) è stata utilizzata per indurre la differenziazione dei monociti CD14+ in MoDC naïve. La generazione di MoDC immature è stata confermata rilevando l'espressione dei marcatori di superficie cellulare del complesso maggiore di istocompatibilità II (MHC II), CD86 e CD40. Un vaccino antirabbico disponibile in commercio è stato utilizzato per pulsare i MoDC immaturi, che sono stati successivamente co-coltivati con linfociti naïve.

L'analisi citometrica a flusso delle MoDC pulsate dall'antigene e della co-coltura linfocitaria ha rivelato la stimolazione della proliferazione dei linfociti T attraverso l'espressione dei marcatori Ki-67, CD25, CD4 e CD8. L'analisi dell'espressione dell'mRNA di IFN-γ e Ki-67, utilizzando la PCR quantitativa, ha mostrato che i MoDC potrebbero indurre il priming antigene-specifico dei linfociti in questo sistema di co-coltura in vitro . Inoltre, la secrezione di IFN-γ valutata utilizzando ELISA ha mostrato un titolo significativamente più alto (**p < 0,01) nella co-coltura di linfociti MoDC pulsata dal vaccino antirabbico rispetto alla co-coltura di linfociti MoDC non pulsata dall'antigene. Questi risultati mostrano la validità di questo test MoDC in vitro per misurare l'immunogenicità del vaccino, il che significa che questo test può essere utilizzato per identificare potenziali candidati vaccini per i bovini prima di procedere con studi in vivo , nonché nelle valutazioni dell'immunogenicità dei vaccini commerciali.

Introduction

La vaccinazione veterinaria rappresenta un aspetto cruciale della zootecnia e della salute, in quanto contribuisce a migliorare la sicurezza alimentare e il benessere degli animali conferendo protezione contro le malattie che colpiscono il settore zootecnico a livello globale1. Un metodo efficace in vitro per valutare l'immunogenicità di possibili candidati vaccini contribuirebbe ad accelerare il processo di sviluppo e produzione del vaccino. È quindi necessario ampliare il campo dei saggi immunitari con metodologie innovative basate su studi in vitro, in quanto ciò contribuirebbe a svelare la complessità dei processi immunitari legati all'immunizzazione e all'infezione da patogeni. Attualmente, gli studi di immunizzazione e di provocazione animale in vivo , che richiedono campionamenti periodici (ad esempio, sangue e milza), vengono utilizzati per misurare l'immunogenicità dei vaccini candidati e degli adiuvanti. Questi test sono costosi, richiedono tempo e hanno implicazioni etiche, perché nella maggior parte dei casi, l'eutanasia animale viene effettuata entro la fine delle prove.

In alternativa ai test in vivo, le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono state utilizzate per valutare le risposte immunitarie indotte dal vaccino in vitro2. Le PBMC sono una popolazione eterogenea di cellule composta per il 70%-90% da linfociti, per il 10%-20% da monociti e da un numero limitato di cellule dendritiche (DC, 1%-2%)3. Le PBMC ospitano cellule presentanti l'antigene (APC) come cellule B, monociti e DC, che pattugliano costantemente l'organismo alla ricerca di segni di infezione o danno tissutale. Le chemochine secrete localmente facilitano il reclutamento e l'attivazione delle APC in questi siti legandosi ai recettori della superficie cellulare. Nel caso dei monociti, le chemochine dirigono il loro destino a differenziarsi in DC o macrofagi4. Non appena le DC incontrano e catturano un agente patogeno, migrano verso organi linfoidi secondari, dove possono presentare gli antigeni peptidici patogeni trasformati utilizzando proteine di superficie di classe I o di classe II del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) rispettivamente alle cellule T CD8+ o alle cellule T CD4+, innescando così una risposta immunitaria 5,6.

Il ruolo chiave svolto dalle DC nell'orchestrare una risposta immunitaria protettiva contro vari agenti patogeni le rende un interessante obiettivo di ricerca per la comprensione dei meccanismi immunitari intracellulari, specialmente quando si progettano vaccini e adiuvanti contro agenti infettivi7. Poiché la frazione di DC che può essere ottenuta dalle PBMC è piuttosto piccola (1% -2%), i monociti sono stati invece utilizzati per generare DC in vitro8. Queste DC derivate da monociti (MoDC) sono state inizialmente sviluppate come possibile strategia di trattamento nell'immunoterapia del cancro9. Più recentemente, i MoDC sono stati utilizzati per la ricerca sui vaccini 10,11,12 e i monociti classici sono il sottotipo predominante (89%) per la produzione di MoDC 13. La produzione di MoDC in vitro è stata precedentemente ottenuta attraverso l'aggiunta del fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF) somministrato in combinazione con altre citochine come l'interleuchina-4 (IL-4), il fattore di necrosi tumorale α (TNF-α) o IL-1314,15,16.

Il successo di un test MoDC in vitro si basa sulla capacità dei MoDC maturi stimolati dall'antigene di modulare l'estensione e il tipo di risposta immunitaria specifica per il tipo di antigene rilevato17. Il tipo di patogeno riconosciuto e presentato dalle MoDC determina la differenziazione delle cellule T helper (Th) CD4+ in cellule effettrici Th1, Th2 o Th17 ed è caratterizzato da un profilo di citochine secretorie specifiche per patogeno. Una risposta Th1 è suscitata contro i patogeni intracellulari e provoca la secrezione di interferone-gamma (IFN-γ) e fattore di necrosi tumorale beta (TNF-β), che modula la protezione fagocitico-dipendente. Una risposta Th2 viene attivata contro gli organismi parassiti ed è caratterizzata dalla secrezione di IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, che avvia la protezione umorale fagocitica-indipendente. Th17 offre protezione neutrofili-dipendente contro le infezioni batteriche e fungine extracellulari mediate dalla secrezione di IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 e TNF-α 18,19,20,21. Sulla base di studi precedenti, è stato notato che non tutti i patogeni rientrano nel profilo di citochine atteso. Ad esempio, le MoDC dermiche, in risposta all'infezione parassitaria da Leishmania, stimolano la secrezione di IFN-γ dalle cellule T CD4+ e dalle cellule T CD8+, inducendo così una risposta protettiva proinfiammatoria Th122.

È stato anche dimostrato che, nei MoDC di pollo innescati con Salmonella lipopolisaccaride (LPS), possono indurre una risposta variabile contro Salmonella typhimurium attivando sia le risposte Th1 che Th2, mentre Salmonella gallinarum induce una risposta Th2 da sola, il che potrebbe spiegare la maggiore resistenza di quest'ultima verso la clearance MoDC23. L'attivazione di MoDC contro Brucella canis (B. canis) è stata riportata anche in MoDC sia canine che umane, il che significa che questo potrebbe rappresentare un meccanismo di infezione zoonotica24. I MoDC umani innescati con B. canis inducono una forte risposta Th1 che conferisce resistenza a infezioni gravi, mentre i MoDC canini inducono una risposta Th17 dominante con una risposta Th1 ridotta, portando successivamente all'instaurazione di infezione cronica25. Le MoDC bovine mostrano una maggiore affinità per il virus dell'afta epizootica (FMDV) coniugato con immunoglobuline G (IgG) rispetto all'FMDV non coniugato da solo, poiché i MoDC formano un complesso di anticorpi virali in risposta ai primi10. Nel loro insieme, questi studi mostrano come le MoDC sono state utilizzate per analizzare la complessità delle risposte immunitarie durante l'infezione da patogeni. Le risposte immunitarie adattative possono essere valutate mediante la quantificazione di specifici marcatori associati alla proliferazione linfocitaria. Ki-67, una proteina intracellulare rilevata solo nelle cellule in divisione, è considerata un marker affidabile per gli studi di proliferazione26, e allo stesso modo, CD25 espresso sulla superficie delle cellule T durante la fase tardiva di attivazione corrisponde alla proliferazione linfocitaria27,28.

Questo studio dimostra un metodo standardizzato per la generazione in vitro di MoDC per bovini seguita dalla loro applicazione in un test immunitario in vitro utilizzato per testare l'immunogenicità dei vaccini. Un vaccino antirabbico disponibile in commercio (RV) è stato utilizzato per convalidare l'efficacia di questo test. L'attivazione e la proliferazione dei linfociti T sono state misurate mediante citometria a flusso, reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (qPCR) e saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) attraverso l'analisi di marcatori di attivazione cellulare ben consolidati come Ki-67 e CD25 e la secrezione di IFN-γ 28,29,30,31. Durante il test MoDC non vengono eseguite prove sperimentali su animali o sull'uomo.

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Protocol

La raccolta del sangue viene eseguita da un servizio veterinario certificato in conformità con le linee guida etiche dell'Agenzia austriaca per la salute e la sicurezza alimentare (AGES) e in conformità con gli standard accettati in materia di benessere degli animali32. Lo studio ha ricevuto l'approvazione etica dal Ministero dell'Agricoltura austriaco. Il progetto sperimentale per la generazione di MoDC e la sua successiva applicazione è illustrato nella Figura 1.

1. Produzione di MoDC ingenui

NOTA: I campioni di sangue intero sono stati ottenuti da un singolo vitello privo di agenti patogeni mediante puntura della vena giugulare con vacutainers eparinizzati. Trasportare il sangue in una ghiacciaia. Conservare i campioni a 2-4 °C per un uso successivo o lavorarli immediatamente. Mantenere il sangue in rotazione per evitare la coagulazione del sangue. Sterilizzare i vacutainers con etanolo al 70%. Tutti i seguenti esperimenti sono stati eseguiti con un campione biologico e sei repliche tecniche.

  1. Centrifugazione a gradiente di densità per isolare le PBMC dal sangue eparinizzato
    1. Mescolare bene il sangue invertendolo di 10x.
    2. Utilizzando una pipetta da 10 ml, trasferire 20 ml di sangue eparinizzato in una provetta sterile da 50 ml e diluirla con 10 ml di soluzione salina tamponata fosfato (PBS).
    3. Pipettare 15 mL di terreno di isolamento dei linfociti fino a un tubo sterile da 50 ml.
      NOTA: Lasciare che il mezzo di isolamento dei linfociti raggiunga la temperatura ambiente prima del pipettaggio.
    4. Inclinare il tubo da 50 mL contenente il mezzo di isolamento dei linfociti in posizione 45°. Puntare la punta di una pipetta da 25 ml perpendicolarmente e posizionare con cura i 30 ml di sangue-PBS sopra il mezzo di isolamento dei linfociti, senza mescolare i due. Molto lentamente, riportare il tubo da 50 mL in posizione verticale.
    5. Centrifugare a 800 × g per 35 minuti a 20 °C con accelerazione massima e senza freno (funzione di decelerazione disattivata).
    6. Utilizzare una pipetta Pasteur per raccogliere lo strato di PBMC (il sottile strato bianco subito dopo il primo strato di plasma) e trasferirlo in una nuova provetta da 50 ml.
      NOTA: La centrifugazione a gradiente di densità separa il sangue intero in diversi strati. Di conseguenza, gli eritrociti si depositano sul fondo come un pellet, le cellule mononucleate (PBMC) si depositano nello strato di interfaccia e il plasma forma lo strato superiore. I granulociti si trovano tra il pellet e lo strato di PBMC.
    7. Lavare i PBMC raccolti 2 volte aggiungendo PBS fino a un volume di 40 ml e mescolando accuratamente pipettando su e giù. Quindi, centrifugare a 500 × g a 4 °C per 7 minuti con la massima accelerazione e la massima decelerazione.
    8. Scartare il surnatante per decantazione, risospendere il pellet in 15 ml di 1x tampone ammonio-cloruro-potassio (ACK) e incubare a temperatura ambiente per 10-15 minuti.
      NOTA: Non incubare per più di 15 min. Il tampone ACK disponibile in commercio viene utilizzato per garantire la lisi dei globuli rossi residui (RBC) presenti nella frazione PBMC.
    9. Aggiungere PBS fino a un volume di 40 ml, quindi centrifugare a 500 × g e 4 °C per 7 minuti con accelerazione e decelerazione massime.
    10. Scartare il surnatante mediante decantazione e ripetere il punto 1.1.9.
    11. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 10 ml di terreno di coltura completo (a temperatura ambiente).
      NOTA: Il terreno di coltura completo è composto da terreno di coltura cellulare RPMI 1640 integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di penicillina-streptomicina.
  2. Separazione magnetica delle cellule CD14+/− dalla popolazione PBMC mediante sfere magnetiche coniugate CD14
    1. Contare le cellule con un contatore di cellule emocitometriche pulito utilizzando 10 μL di sospensione cellulare miscelata con 10 μL di soluzione di tripano blu (0,4%).
      NOTA: Il colorante blu di Trypan è una sostanza chimica tossica e potenzialmente cancerogena. Deve essere maneggiato indossando dispositivi di protezione individuale (DPI) per evitare il contatto e i rifiuti devono essere gettati in un contenitore ermetico specializzato per rifiuti tossici. Le cellule morte appariranno blu, mentre le cellule vive appariranno chiare al microscopio.
    2. Centrifugare per 7 min a 500 × g.
    3. Scartare il surnatante con una pipetta e risospendere il pellet in un tampone di selezione cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) utilizzando un volume di 40 μL per ogni 1 × 107 celle. Mescolare accuratamente con una pipetta.
      NOTA: Il tampone FACS è composto dal 2% di FBS e 2 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) disciolti in PBS.
    4. Aggiungere 5 μL di tampone microbead CD14 per 1 × 107 celle e mescolare accuratamente con una pipetta.
    5. Incubare per 30 minuti a 4-8 °C per la selezione positiva dei monociti CD14+ bovini33. Vortice ogni 15 minuti durante il periodo di incubazione.
    6. Fase facoltativa (per l'analisi della citometria a flusso): aggiungere 10 μL di anticorpo colorante CD14-FITC (isotiocianato di fluoresceina) con successiva incubazione per 15 minuti a 4-8 °C. Fare riferimento all'analisi della citometria a flusso nel passaggio 5 per i dettagli.
    7. Aggiungere 1 mL di tampone FACS e centrifugare per 7 minuti a 500 × g.
    8. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 500 μL di tampone FACS per 1 × 108 cellule.
    9. Inserire la colonna di separazione cellulare immunomagnetica nel separatore (portacolonna magnetica) e posizionare un tubo di raccolta da 15 mL sotto l'uscita della colonna per raccogliere il flusso passante.
    10. Lavare la colonna con 1 mL di tampone FACS degassato. Dopo il risciacquo, sostituire il tubo da 15 ml usato con uno nuovo.
    11. Lasciare passare la sospensione cellulare (dal punto 1.2.8) attraverso la colonna pipettando 1 × 108 celle in 500 μL di tampone alla volta.
      NOTA: prestare attenzione a non generare bolle d'aria mentre si mescolano le celle prima di lasciarle passare attraverso la colonna.
    12. Risciacquare la colonna 3x con 3 ml di tampone FACS degassato ogni volta.
    13. Raccogliere il flusso ed etichettare questa prima frazione eluita come frazione cellulare CD14− (PBMC meno monociti CD14+ ); Questo è anche chiamato la frazione linfocitaria naïve.
      NOTA: Le cellule CD14− vengono mantenute in terreno di coltura completo fino a quando non vengono prodotte MoDC pulsate dall'antigene.
    14. Rimuovere la colonna dal separatore.
    15. Posizionare un nuovo tubo sterile da 15 ml sotto la colonna per la raccolta dell'effluente.
    16. Pipettare 5 mL di tampone FACS nella colonna e spingerlo immediatamente attraverso usando uno stantuffo.
    17. Raccogliere il flusso ed etichettare questa seconda frazione eluita come frazione cellulare CD14+ ; Questa è anche chiamata frazione monocitaria naïve.
    18. Aggiungere un terreno di coltura completo ai monociti CD14+ raccolti per ottenere 1 × 106 cellule/ml.
      NOTA: Contare le cellule vive nella frazione cellulare CD14+ eluita per stimare il volume del terreno di coltura completo necessario per ottenere la conta cellulare desiderata.
    19. Prendere una piastra sterile a 24 pozzetti e aggiungere 1 mL della sospensione cellulare (1 × 106 cellule/ml) a ciascun pozzetto.
  3. Differenziazione dei monociti naïve CD14+ in MoDC naïve mediante l'aggiunta del 3% p/v di cocktail di citochine (GM-CSF + IL-4) con un totale di 5 giorni di incubazione
    1. Integrare ciascun pozzetto contenente monociti CD14+ con 40 μL (3% p/v) del cocktail di citochine fornito nel kit.
    2. Incubare la piastra in un incubatore umidificato con 5% di CO2 e a 37 °C per 48 h.
    3. Il giorno 2, trasferire metà del contenuto di ciascun pozzetto (500 μL) utilizzando una pipetta in singoli tubi da 1,5 ml e centrifugare a 500 × g a 4 °C per 7 minuti.
    4. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 500 μL di terreno di coltura completo fresco.
    5. Trasferire 500 μL di questa sospensione cellulare dal punto 1.3.4 a ciascun pozzetto designato in modo che il volume finale sia di 1 ml.
    6. Arricchire ogni pozzetto con 20 μL di cocktail di citochine.
    7. Incubare la coltura per 72 ore in un incubatore umidificato con il 5% di CO2 e a 37 °C.
    8. Dopo l'incubazione del giorno 5, rimuovere la piastra dall'incubatore.
      NOTA: Ogni pozzetto conterrà 1 mL di sospensione cellulare di MoDC naïve. Il numero di MoDC sarà una percentuale (~20%) dei monociti originali placcati (1 × 106/ml).

2. Saggio dell'attività endocitica MoDC

NOTA: Il test di assorbimento dell'antigene o l'analisi dell'attività endocitica misura la capacità dei MoDC ingenui di internalizzare materiale estraneo. Eseguire il test utilizzando MoDC naïve coltivate con cocktail di citochine al 3% p/v e con 5 giorni di incubazione, come descritto in precedenza34.

  1. Raccogliere l'ingenua sospensione cellulare MoDC dalla piastra a 24 pozzetti e trasferirla in un tubo da 15 ml; raccogliere anche eventuali cellule residue risciacquando i pozzetti con PBS.
  2. Centrifuga per 500 × g per 7 min. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 1 ml di terreno di coltura integrato con FBS all'1%.
  3. Contare le cellule MoDC vive per stimare il volume di terreno necessario per ottenere la conta cellulare desiderata (2 × 105 cellule / ml).
  4. Coltura dei MoDC naïve in 100 μL di terreno di coltura completo in una piastra a 24 pozzetti con una concentrazione cellulare finale di 2 × 105 cellule/ml.
  5. Integrare ciascun pozzetto con 1 mg/mL di destrano coniugato con FITC (sonda fluorescente utilizzata come tracciante dell'endocitosi).
    NOTA: Il FITC-destrano agisce come una sonda fluorescente e viene utilizzato come tracciante per endocitosi.
  6. Coprire la piastra e incubare al buio al 5% di CO2 e 37 °C per 60 minuti.
    NOTA: Per il controllo di fondo, incubare le cellule MoDC aggiuntive (2 × 105 cellule/ml) con 1 mg/ml di FITC-destrano su ghiaccio, poiché questo tipo di incubazione impedisce l'ingresso della molecola tracciante (FITC-destrano) nelle cellule.
  7. Dopo l'incubazione, trasferire immediatamente la piastra a 24 pozzetti sul ghiaccio per fermare l'endocitosi del FITC-destrano.
  8. Lavare le celle con tampone FACS ghiacciato.
  9. Raccogliere, centrifugare e risospendere il pellet in 500 μL di tampone FACS.
  10. Analizzare l'intensità di fluorescenza del destrano FITC all'interno delle cellule utilizzando la citometria a flusso. Fare riferimento all'analisi della citometria a flusso nel passaggio 5.2 per i dettagli.

3. Generazione di MoDC pulsate dall'antigene

NOTA: Un vaccino disponibile in commercio e clinicamente approvato contro il virus della rabbia (RV) può indurre la differenziazione di MoDC naïve in MoDC mature presentanti l'antigene. Utilizzare lo 0,1% (~1 μL) di una singola dose di vaccinazione RV per generare MoDC pulsate dall'antigene. Inoltre, si preferisce produrre MoDC a impulsi RV nella stessa piastra di coltura utilizzata (nella fase 1.3.8) per generare MoDC naïve perché il trasferimento dei MoDC naïve su una nuova piastra a 24 pozzetti li influenzerà negativamente.

  1. Dal punto 1.3.8) Aggiungere 1 μL/mL di sospensione RV a 1 mL di coltura MoDC naïve nella piastra a 24 pozzetti e incubare per 48 ore al 5% di CO2 e 37 °C.
    NOTA: I MoDC naive coltivati senza stimolazione RV vengono utilizzati come controllo di fondo (e come stimolazione non specifica per la co-coltura con linfociti nelle fasi successive).
  2. Dopo l'incubazione, il giorno 7, tenere la piastra a 24 pozzetti contenente i MoDC pulsati dall'antigene sul ghiaccio per 10 minuti.
  3. Aggiungere 1 mL di PBS ghiacciato per pozzetto. Mescolare accuratamente ogni pozzetto mediante pipettaggio e trasferire la sospensione in un tubo da 15 ml.
  4. Lavare i pozzetti con 2 ml di PBS ghiacciato per raccogliere le cellule residue rimaste all'interno di ciascun pozzetto.
  5. Trasferire il contenuto nelle rispettive provette e centrifugare la sospensione cellulare a 500 × g per 7 minuti.
  6. Scartare il surnatante, risospendere il pellet cellulare (MoDC pulsate dall'antigene) in un terreno di coltura completo e regolare il volume a una concentrazione cellulare finale di 1 × 105 cellule / ml.
    NOTA: Contare le cellule vive per stimare il volume di terreno necessario per ottenere il conteggio delle cellule desiderato. Utilizzare MoDC pulsate RV dal giorno 7 per il sistema di co-coltura MoDC-linfociti.

4. Co-coltura MoDC-linfociti

NOTA: Il sistema di co-coltura in vitro MoDC-linfociti determina la capacità delle MoDC di innescare i linfociti antigene-specifici. I diversi gruppi di trattamento delle cellule dopo 16 giorni di co-coltura includono specifici, non specifici e di controllo. Il gruppo specifico è definito come linfociti co-coltivati con MoDC pulsate RV; il gruppo non specifico è definito come linfociti co-coltivati con MoDC non pulsate dall'antigene; e il gruppo di controllo è definito come linfociti coltivati senza MoDC.

  1. Aggiungere terreno di coltura completo alla frazione linfocitaria naïve eluita (cellule CD14− ) per ottenere una concentrazione cellulare di 2 × 106 cellule/ml.
    NOTA: Contare le cellule vive nella coltura cellulare CD14− che sono state mantenute in terreno di coltura completo in una piastra a 24 pozzetti dalla loro raccolta per stimare il volume di terreno necessario per ottenere la conta cellulare desiderata.
  2. Il giorno 7, prendere una piastra sterile da 24 pozzetti e seminare i pozzetti con 1 mL di sospensione di cellule linfocitarie naïve (2 × 106 celle/ml) più 1 mL di sospensione MoDC pulsata dall'antigene o non pulsata dall'antigene (1 × 105 celle/ml).
    NOTA: Il volume totale in ciascun pozzetto sarà di 2 ml con un rapporto di 1:20 MoDC per linfociti per pozzetto.
  3. Incubare la piastra per 48 ore a 37 °C e 5% CO2.
  4. Arricchimento e restimolazione della coltura con MoDC pulsate dall'antigene
    1. Dopo l'incubazione della co-coltura di linfociti MoDC pulsata dall'antigene, il giorno 9, integrare ciascun pozzetto con 20 ng / mL ricombinante IL-2 e continuare a incubare per altre 120 ore (5 giorni di incubazione).
    2. Il giorno 14, trasferire 1 mL di co-coltura in una provetta sterile da 1,5 mL e centrifugare a 500 × g per 7 minuti.
    3. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare con 1 mL di MoDC pulsate dall'antigene o non pulsate (1 × 105 celle/ml). Mescolare delicatamente mediante pipettaggio e trasferire le sospensioni cellulari nei pozzetti designati.
      NOTA: In questa fase, il volume totale in ciascun pozzetto è di 2 ml.
    4. Continuare con l'incubazione al 5% di CO2 e 37 °C per 48 ore. Dopo l'incubazione il giorno 16, la co-coltura è pronta per l'analisi utilizzando citometria a flusso, qPCR ed ELISA.
      NOTA: Per ogni 2 ml in ciascun pozzetto della co-coltura di linfociti MoDC, 1 mL di cellule risospese viene colorato per la citometria a flusso, 1 mL viene utilizzato per l'estrazione dell'RNA e i surnatanti di entrambi vengono utilizzati per ELISA.

5. Analisi citometrica a flusso

NOTA: Colorare le cellule con marcatori/mAb appropriati prima di eseguire i campioni su un citometro a flusso. Fare riferimento alla Tabella dei materiali per i dettagli sui reagenti (controlli mAb e isotipi di colorazione), kit, strumento e software utilizzati per l'analisi della citometria a flusso.

  1. Protocollo di colorazione del citometro a flusso
    NOTA: Eseguire la colorazione della superficie cellulare per le PBMC e i linfociti e i monociti naïve utilizzando mAb anti-CD14 (punto 1.2.6). Per la colorazione della superficie cellulare di MoDC naïve, utilizzare mAb anti-CD86-specifici, anti-CD40-specifici e anti-MHC II-specifici. Per la colorazione della superficie cellulare delle cellule dalle co-colture del giorno 16, utilizzare mAbs anti-CD4, anti-CD8, anti-CD25; per la colorazione intracellulare, utilizzare anti-Ki-67 mAb. Inoltre, colorare le cellule con mAb di controllo isotipo negativo o senza mAb (FMO: fluorescente meno uno). La differenza principale durante la colorazione per marcatori superficiali e intracellulari è che per i marcatori di superficie cellulare, le cellule devono essere colorate con mAb superficiale specifico prima della colorazione viva / morta (L / D) o di qualsiasi altro processo. Tuttavia, la colorazione intracellulare viene eseguita dopo la colorazione L / D e richiede una fase di fissazione più permeabilizzazione per consentire la penetrazione intracellulare.
    1. Trasferire 1 mL di sospensione cellulare in un tubo sterile da 1,5 mL utilizzando una pipetta e centrifugare per 10 minuti a 500 × g.
      NOTA: Dopo la centrifugazione, durante l'elaborazione delle cellule dalla co-coltura di linfociti MoDC, conservare il surnatante per l'analisi ELISA.
    2. Risospendere il pellet in 1 mL di PBS e trasferirlo in un tubo da 15 ml. Raccogliere le cellule residue utilizzando 1 mL di PBS e combinarlo con il pellet risospeso.
    3. Aggiungere 10 mL di PBS al tubo da 15 mL contenente le celle, miscelare mediante pipettaggio e centrifugare per 7 minuti a 850 x g.
    4. Scartare il surnatante e ripetere il punto 5.1.3.
    5. Scartare il surnatante e risospendere con cautela il pellet cellulare con la sospensione residua (circa 180 μL) rimasta dopo la decantazione del surnatante.
    6. Trasferire la sospensione della cella su una piastra a V da 96 pozzetti e sigillare i pozzetti per evitare fuoriuscite.
    7. Centrifugare la piastra a 1.400 × g per 5 min. Dopo la centrifugazione, scorrere la piastra su un contenitore di rifiuti per svuotare i pozzetti di liquido e picchiettare la piastra su carta assorbente per garantire la rimozione del liquido in eccesso.
    8. Aggiungere 25 μL di miscela master di colorazione superficiale per pozzetto e mescolare delicatamente con una pipetta, quindi incubare a 4 °C per 30 minuti.
      NOTA: Per preparare la miscela master di colorazione superficiale per un singolo pozzetto, aggiungere 2,5 μL di mAb superficiale a 20 μL di tampone FACS.
    9. Aggiungere 200 μL di tampone FACS per pozzetto e centrifugare a 1.400 × g per 5 minuti. Dopo la centrifugazione, svuotare i pozzetti del liquido decantando e picchiettare la piastra su carta assorbente per rimuovere il liquido in eccesso.
    10. Aggiungere 100 μL di soluzione colorante L/D per pozzetto. Mescolare accuratamente con una pipetta, quindi incubare a 4 °C per 15 minuti al buio.
      NOTA: Per un singolo pozzetto, sciogliere 0,25 μL di colorante L/D in 100 μL di tampone FACS. Il colorante L / D aiuta a distinguere tra cellule vive e morte.
    11. Aggiungere 100 μL di tampone FACS. Coprire i pozzetti con il coperchio e centrifugare la piastra per 1.400 × g per 5 minuti. Scartare il surnatante decantando e picchiettare la piastra su carta assorbente.
    12. Ripetere il passaggio 5.1.11.
    13. Aggiungere 50 μL di soluzione di fissaggio per pozzetto (fornito con il kit) e mescolare con una pipetta prima di incubare la piastra a temperatura ambiente al buio per 10 minuti.
    14. Aggiungere 150 μL del tampone di permeabilizzazione-lavaggio (PW) 1x fornito con il kit e coprire i pozzetti con il coperchio.
      NOTA: Per preparare 10 mL di tampone 1x PW, diluire 1 mL di tampone permanente 10x in 10 mL di dH2O.
    15. Centrifugare la piastra a 1.400 × g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante decantando e picchiettare la piastra su carta assorbente.
    16. Aggiungere 200 μL di 1x PW, seguito da centrifugazione a 1.400 × g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante decantando e picchiettare la piastra su carta assorbente.
    17. Per la colorazione intracellulare, aggiungere 25 μL di master mix di colorazione intracellulare (anti-umano Ki-67 mAb) per pozzetto. Mescolare bene e incubare la piastra per 30 minuti a 4 °C o sul ghiaccio al buio.
      NOTA: Per preparare la miscela master di colorazione intracellulare per un singolo pozzetto, aggiungere 1 μL di Ki-67 mAb a 24 μL di 1x PW. Il marcatore di colorazione intracellulare viene utilizzato solo durante l'elaborazione delle cellule dalla co-coltura del giorno 16. La colorazione intracellulare non viene eseguita durante l'elaborazione di PBMC, linfociti naïve, monociti e MoDC naïve.
    18. Dopo l'incubazione, aggiungere 200 μL di 1x PW a ciascun pozzetto. Mescolare con una pipetta e centrifugare per 1.400 × g per 5 minuti. Scartare il surnatante decantando e picchiettare la piastra su carta assorbente.
    19. Aggiungere 200 μL di tampone FACS, seguito da centrifugazione a 1.400 × g per 5 minuti. Scartare il surnatante decantando e picchiettarlo sulla piastra su carta assorbente.
    20. Risospendere il pellet cellulare in 200 μL di tampone FACS e trasferire il contenuto di ciascun pozzetto in tubi citometrici a flusso sterile separati. Utilizzare 300 μL di tampone FACS per pozzetto per raccogliere le celle residue. Le cellule sono ora pronte per l'analisi citometrica a flusso.
  2. Esecuzione del campione su un citometro a flusso
    NOTA: I campioni sono stati eseguiti su un citometro a flusso (utilizzando laser da 488 nm, 638 nm e 405 nm) secondo il manuale del produttore35. Fare riferimento al manuale per i dettagli, la risoluzione dei problemi e la personalizzazione del protocollo.
    1. Eseguire le procedure di pulizia di routine prima e dopo aver letto i campioni.
      NOTA: Non saltare una posizione durante il caricamento dei tubi nello strumento.
      1. Per il ciclo di pulizia, utilizzare un totale di quattro provette, con la prima provetta contenente il reagente di pulizia del flusso e le restanti tre provette contenenti dH2O; ogni tubo avrà 3 ml. Durante la pulizia, acquisisci dati con una portata media per circa 1 minuto catturando 100.000 eventi per tubo sotto i 330 V per la diffusione diretta (FSC) contro i 265 V per la dispersione laterale (SSC).
        NOTA: nessun detrito o evento cellulare deve essere segnalato durante la pulizia; In questo caso, eseguire nuovamente il passaggio di pulizia. Per eseguire i campioni, assicurarsi che tutti i campioni siano in una sospensione omogenea prima di acquisire i dati perché ciò garantisce una lettura accurata.
    2. Per collegare e accendere il citometro, fare clic sul pulsante Applicazione situato nell'angolo sinistro della barra del titolo. Dal menu a discesa dell'applicazione, selezionare l'opzione Citometria e fare clic sull'opzione Accensione.
      NOTA: dal menu a discesa dell'applicazione , l'opzione Apri consente agli utenti di sfogliare i test preprogrammati, mentre l'opzione Nuovo protocollo consente agli utenti di creare nuovi protocolli.
    3. Caricare inizialmente il campione di controllo negativo nel supporto multitubo. Selezionare Nuovo protocollo e osservare l'elenco di lavoro sul lato sinistro dell'area di lavoro/schermo.
    4. Nell'elenco di lavoro, definire la posizione del campione nel supporto multitubo e assegnare un nome al campione e al protocollo per l'identificazione.
    5. Dal pannello hardware situato sul lato sinistro dell'area di lavoro, regolare e selezionare più parametri come i rilevatori (FSC, SSC e 10 intervalli di fluorescenza), le tensioni (V ) e i guadagni dei fotomoltiplicatori e l'area-altezza-larghezza (AHW) del segnale.
      NOTA: Le seguenti impostazioni per i rivelatori sono state selezionate in base all'esperimento e allo strumento utilizzato: FSC-AHW: AHW, V: 270, G: 5; SSC-AHW: A, V: 350, G: 10; FL1 (Destrano CD8/FITC)-AHW: A, V: 400, G: 1; FL2 (CD25/PE)-AHW: A, V: 500, G: 1; FL6 (CD4/Alexa Fluor 647)-AHW: A, V: 700, G: 1; FL7 (Ki-67/Alexa Fluor 700)-AHW: A, V: 625, G: 1; FL9 (L/D)-AHW: A, V: 425, G: 1.
    6. Dal pannello di controllo per l'acquisizione dello strumento situato sotto la barra del titolo, regolare le opzioni per la portata (media), il tempo (5 min) e gli eventi (vedere il punto 5.2.8) che si desidera rilevare. Clicca sull'opzione Acquisisci singolo per permettere allo strumento di disegnare/eseguire il campione e mostrare l'anteprima in tempo reale degli eventi rilevati.
    7. Dall'anteprima in tempo reale, regolare la soglia di fluorescenza (tensione e guadagno) e la dimensione della cella per disegnare eventualmente porte intorno alla popolazione cellulare desiderata escludendo eventuali detriti cellulari.
      NOTA: FSC aiuta a distinguere le cellule in base alle dimensioni, consentendo così agli utenti di distinguere tra le cellule del sistema immunitario, come monociti e linfociti; i monociti sono più grandi e mostrano una maggiore intensità FSC rispetto ai linfociti.
    8. Acquisire circa un totale di 5.000 eventi di MoDC vivi, 50.000 di linfociti vivi e 50.000 eventi di monociti vivi.
    9. Una volta regolati tutti i parametri in riferimento al campione di controllo negativo, fare clic su Stop e salvare il protocollo.
    10. Ora carica tutti i campioni sul caricatore multitubo. Definire ogni campione nell'elenco di lavoro e applicare i parametri regolati in riferimento al controllo negativo a tutti i campioni all'interno dell'esperimento. Fare clic sull'opzione Acquisisci per consentire l'esecuzione consecutiva di tutti gli esempi dell'esperimento.
    11. Una volta acquisiti i dati di tutti i campioni, salvarli e trasformarli in dati leggibili utilizzando un apposito software di analisi dei dati che consente la generazione di istogrammi sequenziali biparametrici e monoparametrici.

6. Analisi dell'espressione dell'RNA messaggero (mRNA)

  1. Estrazione dell'RNA
    NOTA: Estrarre l'RNA totale dalla co-coltura di linfociti MoDC-pulsata dall'antigene (specifica), dalla co-coltura di linfociti MoDC non pulsata dall'antigene (non specifica), dalla coltura linfocitaria senza MoDC (controllo) e dai linfociti naïve (cellule CD14− isolate prima della co-coltura). Per l'estrazione dell'RNA, preparare l'etanolo utilizzando acqua priva di RNasi. Fare riferimento alla tabella dei materiali per i dettagli sul kit di estrazione e sui reagenti.
    1. Trasferire 1 mL di sospensione cellulare dalla piastra di cocoltura linfocitaria MoDC (~1 × 106 cellule/ml) in una provetta sterile sterile da 1,5 mL utilizzando una pipetta e centrifugare per 10 minuti a 500 × g.
    2. Salvare il surnatante per ELISA. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di PBS e trasferirlo in un tubo da 15 ml. Raccogliere eventuali cellule residue utilizzando 1 mL di PBS.
    3. Centrifugare per 10 min a 500 × g.
      NOTA: Tutti i campioni devono essere trattati delicatamente come cellule viventi fino a quando non viene eseguita la lisi cellulare utilizzando il tampone di lisi fornito nel kit. La morte cellulare rilascia RNasi che idrolizzano rapidamente i modelli di RNA necessari per la quantificazione a valle. Il tampone RLT lisa le cellule in una soluzione che inibisce le RNasi.
    4. Aggiungere 350 μL di tampone di lisi a ciascun pozzetto vuoto e incubare per 2-3 minuti per lisare le cellule aderenti che non sono state raccolte nelle fasi precedenti.
    5. Una volta completata la centrifugazione nella fase 6.1.3, eliminare il surnatante e combinare il pellet cellulare con i 350 μL di tampone di lisi aggiunti al punto 6.1.4.
      NOTA: A questo punto è possibile conservare le provette a -80 °C o procedere con l'estrazione dell'RNA (fasi successive).
    6. Pipettare 350 μL di etanolo al 70% al lisato al punto 6.1.5. Il volume finale per campione è di 700 μL.
    7. Inserire la colonna di estrazione all'interno di una provetta di raccolta da 2 mL (fornita con il kit).
    8. Trasferire i 700 μL di campione per colonna di estrazione e centrifugare a 10.000 × g per 15 s. Scartare il flusso nel tubo di raccolta e reinserirlo nella colonna di rotazione.
    9. Nella colonna di aspirazione, aggiungere 350 μL di tampone di lavaggio rigoroso (fornito nel kit) e centrifugare a più di 10.000 × g per 15 s. Eliminare il flusso continuo.
    10. Aggiungere 80 μL di miscela di incubazione DNasi I per campione sulla membrana della colonna di estrazione e lasciarla impostare per 15 minuti a 20-30 °C.
      NOTA: Per preparare la miscela di incubazione DNasi I per campione, aggiungere 10 μL di soluzione madre di DNasi I a 70 μL di tampone DNasi per un volume finale di 80 μL. Mescolare accuratamente capovolgendo il tubo più volte, seguito da un breve giro nella centrifuga.
    11. Lavare la colonna di estrazione con 350 μL di tampone di lavaggio rigoroso, seguito da centrifugazione a 10.000 × g per 15 minuti. Scartare il flusso nel tubo di raccolta dopo la centrifugazione.
    12. Lavare la colonna di estrazione 2x con 500 μL di tampone di lavaggio delicato ogni volta e con centrifugazione a 10.000 × g per 15 s e una seconda volta per 2 min. Scartare il flusso dopo ogni centrifugazione.
    13. Centrifugare la colonna alla massima velocità per 1 minuto per asciugare la membrana e gettare il tubo di raccolta.
    14. Posizionare la colonna di estrazione in una nuova provetta di raccolta da 1,5 ml.
    15. Pipettare 50 μL di acqua priva di RNasi sulla membrana della colonna e incubare per 3-5 minuti a temperatura ambiente.
      NOTA: Per concentrazioni di RNA inferiori a 100 ng, ridurre il volume di eluizione a 30 μL e rieluire la membrana della colonna di estrazione utilizzando il prodotto della prima eluizione per concentrare il prodotto finale.
    16. Centrifugare a 10.000 × g per 1 minuto per eluire l'RNA.
    17. Misurare la concentrazione di RNA rilevando l'assorbanza a 260 nm utilizzando 0,5-2 μL di campione. Regolare la concentrazione finale di RNA a 0,1-1 μg/μL utilizzando acqua priva di RNasi.
    18. Conservare le aliquote di RNA a -80 °C per un uso successivo.
  2. Sintesi di DNA complementare
    1. Sintetizzare DNA complementare (cDNA) dall'RNA modello estratto secondo il protocollo del produttore fornito con il kit (fare riferimento alla Tabella dei materiali per i dettagli).
      NOTA: Un riassunto dei reagenti e dei volumi utilizzati è riportato nelle tabelle 1 e 2. Un protocollo completo è dettagliato nel file supplementare 1.
  3. Reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale
    1. Per la qPCR, eseguire i campioni di cDNA in triplice copia. Quantificare i livelli di trascrizione dell'mRNA bovino per Ki-67 e IFN-γ utilizzando specifici set di primer in riferimento al gene GAPDH , come mostrato nella Tabella 3.
      NOTA: un protocollo completo è descritto in dettaglio nel file supplementare 1.

7. Saggio immunoassorbente enzimatico

  1. Processare i supernatanti di coltura raccolti ricchi di proteine secretorie per la quantificazione dell'IFN-γ tramite ELISA.
    NOTA: Fare riferimento alla tabella dei materiali per i dettagli sull'uso del kit. Un protocollo completo è dettagliato nel file supplementare 1.

8. Analisi statistica

  1. Analizzare i dati e realizzare illustrazioni grafiche di progettazione sperimentale utilizzando software commerciali. Utilizzare un test non parametrico non accoppiato per l'analisi comparativa. Si considerino valori P < 0,05 come statisticamente significativi.

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Representative Results

Questa metodologia descrive la generazione in vitro di MoDC bovini per la valutazione degli antigeni vaccinali candidati prima di eseguire studi in vivo. La figura 1 illustra lo schema sperimentale della generazione di MoDC bovini e l'applicazione dei MoDC per il saggio in vitro. Utilizzando la tecnica di selezione cellulare basata sul magnetismo, è stato possibile raccogliere circa 26 milioni di miociti CD14+ dalle PBMC raccolte, che in precedenza erano isolate da 50 ml di sangue bovino. La frazione cellulare eluita priva di monociti CD14+ era ricca di linfociti ed è stata utilizzata come fonte di cellule T CD4+ e CD8+ naïve (frazione di cellule linfocitarie CD14−).

La frazione monocitaria naïve era composta per il 98% da cellule monocitarie CD14+, come osservato dopo colorazione delle cellule CD14 e citometria a flusso (Figura 2A,B). Le cellule monocitarie naïve purificate, sottoposte a coltura in presenza del cocktail di citochine al 3% (GM-CSF e IL-4) con successiva incubazione di 5 giorni, si sono differenziate in un fenotipo DC-like. Da una coltura iniziale di 26 milioni di monociti CD14+, un totale di circa 12 milioni di MoDC potrebbero essere ottenuti dopo 5 giorni di incubazione. I MoDC naïve erano funzionalmente in grado di assorbire l'antigene, come osservato utilizzando l'analisi della citometria a flusso di destrano FITC (Figura 3). Inoltre, le MoDC naïve sono state caratterizzate fenotipicamente valutando l'espressione di MHC di classe II e marcatori co-stimolatori di superficie cellulare CD86 e CD40, che hanno convalidato il fenotipo DC-simile (Figura 4).

La stimolazione pulsata dall'antigene dei MoDC naïve è stata ottenuta coltivandoli in presenza di RV inattivato per 2 giorni. L'attivazione dei linfociti naïve (la frazione cellulare CD14− ) è stata ottenuta mediante co-coltura di linfociti MoDC pulsati dall'antigene con la successiva integrazione di IL-2. Durante la co-coltura MoDC-linfociti il giorno 9, è stato osservato un cambiamento morfologico nei MoDC pulsati RV, poiché hanno mostrato l'estensione dei dendriti, che è una caratteristica della maturazione MoDC (Figura 5). Il giorno 14, l'attivazione dei linfociti è stata potenziata stimolando nuovamente la co-coltura attraverso l'aggiunta di MoDC pulsate RV di nuova produzione dallo stesso animale.

Rispetto alla co-coltura non pulsata MoDC-linfociti, un aumento significativo (p < 0,01) della proliferazione dei linfociti è stato dimostrato dalla sovraregolazione dei marcatori di attivazione Ki-67 e CD25 su entrambe le cellule T CD4+ e CD8+ il giorno 16 nella co-coltura pulsata MoDC-linfociti (Figura 6). Le cellule T CD8+ delle co-colture mature di MoDC pulsate RV hanno mostrato una sovraregolazione di otto volte (p < 0,01) di Ki-67 rispetto al gruppo non specifico (Figura 7A). Le cellule T CD4+ nella stessa co-coltura hanno mostrato un aumento di sette volte (p < 0,01) in Ki-67 rispetto ai controlli (Figura 7B). Ciò dimostra la capacità dei MoDC innescati da RV di presentare con successo l'antigene RV ai linfociti naïve e successivamente attivarli in una condizione in vitro, simile a ciò che accade in un animale vivo. Oltre ad analizzare le cellule utilizzando la citometria a flusso, le co-colture sono state anche sottoposte a qPCR ed ELISA per quantificare l'attivazione dei linfociti specifici per RV utilizzando rispettivamente la trascrizione dell'RNA (Ki-67 e IFN-γ) e la secrezione extracellulare (IFN-γ) (Figura 8). Questi metodi di rilevamento aggiuntivi possono anche essere utilizzati come test di conferma per convalidare ulteriormente i risultati della citometria a flusso. L'espressione di RNA per Ki-67 e IFN-γ dimostrata da qPCR e i livelli di IFN-γ dimostrati da ELISA hanno mostrato modelli simili di aumento, che indicano la proliferazione dei linfociti, nella co-coltura antigene-specifica rispetto al gruppo di trattamento non specifico. Pertanto, i risultati di qPCR ed ELISA erano correlati con i risultati della citometria a flusso. La qPCR ha mostrato un aumento del >30% nell'espressione di IFN-γ e un aumento del >5% nell'espressione di Ki-67 in tutte le co-colture che utilizzano GAPDH come calibratore (Figura 8A,B). Una concentrazione significativamente più elevata di IFN-γ secreta (**p > 0,01) è stata misurata con ELISA utilizzando surnatanti di coltura dalla co-coltura di linfociti MoDC pulsata RV rispetto al gruppo di trattamento non specifico (Figura 8C).

Figure 1
Figura 1: Progettazione sperimentale del saggio in vitro basato su MoDC bovino. (A) Raccolta e selezione cellulare delle frazioni di cellule monocitarie CD14+ e CD14− dei linfociti dalle PBMC bovine. Il sangue bovino viene processato mediante centrifugazione a gradiente di densità per raccogliere PBMC, seguita da selezione cellulare magnetica utilizzando colonne di separazione cellulare immunomagnetica e successiva coltura della frazione di cellule monocitarie naïve CD14+ raccolta in terreno RPMI 1640 integrato. (B) La produzione di MoDC utilizzando cocktail di citochine al 3% (GM-CSF + IL-4) con 5 giorni di incubazione e co-coltura di linfociti MoDC. Il giorno 0, i monociti vengono coltivati in presenza del cocktail di citochine e incubati per 48 ore per indurre la differenziazione. Il giorno 2, la coltura viene restimulata con lo stesso cocktail di citochine, seguita dall'incubazione per 72 ore, che porta alla produzione di MoDC naif. Il giorno 5, l'antigene del vaccino (vaccino antirabbico) viene aggiunto alla coltura cellulare MoDC naïve, seguita da 48 ore di incubazione. Il giorno 7 viene eseguita la co-coltura di MoDC pulsate dall'antigene con linfociti naïve (la frazione cellulare CD14), seguita dall'incubazione. Il giorno 9, IL-2 viene aggiunto alla co-cultura. Il giorno 14, l'arricchimento/restimolazione dei linfociti attivati/innescati viene eseguito mediante l'aggiunta di MoDC pulsate dall'antigene, seguita dall'incubazione per 48 ore. Infine, il giorno 16, le cellule e il surnatante di coltura vengono prelevati per il test di proliferazione dei linfociti. Abbreviazioni: MODCs = cellule dendritiche derivate da monociti bovini; PBMCs = cellule mononucleate del sangue periferico; GM-CSF = fattore stimolante granulociti-macrofagi-colonie. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Morfologia e purezza dei monociti CD14+ bovini prelevati dalle PBMC utilizzando microsfere coniugate anti-CD14. (A) Morfologia dei monociti bovini incubati per 4 ore a 37 °C in terreno di coltura completo per rimuovere le microsfere, fissati su vetrini rivestiti di polilisina e colorati con colorante Giemsa modificato. Barra della scala = 50 μm. (B) Istogramma di citometria a flusso che mostra la frazione cellulare CD14+ eluita con un livello di purezza del 98,6% osservato utilizzando anticorpi anti-CD14 (rosso) e anticorpi di controllo dell'isotipo IgG1 del topo coniugati con FITC (verde). Abbreviazioni: PBMCs = cellule mononucleate del sangue periferico; FITC cont = controllo dell'isotiocianato di fluoresceina. Questa cifra è stata modificata da Kangethe et al., 201811. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Attività endocitica delle MoDC bovine generate in vitro. Istogramma di citometria a flusso che mostra l'assorbimento della molecola tracciante (FITC-destrano) entro il giorno 5 MoDC naïve. MoDC incubati a 37 °C per 60 minuti con la molecola tracciante (blu) e MoDC incubati su ghiaccio con la molecola tracciante (grigia) utilizzata come controllo di fondo. Abbreviazioni: MODCs = cellule dendritiche derivate da monociti bovini; FITC = isotiocianato di fluoresceina. Questa cifra è stata modificata da Kangethe et al., 201811. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Fenotipizzazione di marcatori di superficie cellulare MoDC bovini generati in vitro. Istogrammi di citometria a flusso per (A) strategie di gating di MoDC e per (B) MoDC naïve del giorno 5 colorati con tre diversi mAb DC-specifici (blu), tra cui: mAb MHC II anti-pecora, mAb CD86 anti-bovino e CD40 mAb anti-bovino. Tutti confrontati con i loro corrispondenti controlli isotipo (rosso). Abbreviazioni: DC = cellule dendritiche; MODC = DC derivate dai monociti bovini; MHC II = complesso maggiore di istocompatibilità II. Questa cifra è stata modificata da Kangethe et al., 201811. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Segni di maturazione delle MoDC prodotte in vitro durante la co-coltura MoDC-linfociti. Osservazione della caratteristica struttura dendritica estesa mediante MoDC pulsate dall'antigene con microscopia invertita al giorno 9 della co-coltura MoDC-linfociti. (A) MoDC mature all'interno di un'area altamente confluente di linfociti co-coltivati. (B) I MoDC maturi sono facilmente distinguibili in un'area con meno linfociti in co-coltura. Barre della scala = 50 μm. Abbreviazione: MODCs = cellule dendritiche derivate da monociti bovini. Questa cifra è stata modificata da Kangethe et al., 201811. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Strategia di gating sequenziale adottata per dot plot contro l'espressione di Ki-67 e CD25 da parte dei linfociti in co-coltura di linfociti MoDC. (A) La strategia completa di gating per le cellule raccolte dal giorno 16 MoDC-co-coltura di linfociti. (B) L'espressione di Ki-67 da linfociti CD4+-dipendenti e (C) da linfociti CD8+ confrontata con il controllo FMO (senza mAb) e il controllo dell'isotipo IgG1-k mAb di topo. L'espressione di CD25 sui linfociti CD8+ e (E) CD4+ dipendenti rispetto al mAb di controllo dell'isotipo IgG1 del topo. Il gruppo di trattamento rappresenta specificamente i linfociti co-coltivati con MoDC pulsate RV, mentre il controllo rappresenta i linfociti coltivati in assenza di MoDC. Abbreviazioni: MODCs = cellule dendritiche derivate da monociti bovini; FMO = fluorescente meno uno; RV = vaccino antirabbico. Questa cifra è stata modificata da Kangethe et al., 201811. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Analisi dei dati di citometria a flusso dell'espressione di Ki-67 e CD25 da parte dei linfociti CD4+ e CD8+ dopo priming con l'antigene. Espressione di Ki-67 e CD25 dalla co-cultura del giorno 16. Il gruppo di trattamento (specifico) è definito come linfociti coltivati con MoDC pulsate RV; il gruppo non specifico corrisponde a linfociti coltivati con MoDC non pulsate dall'antigene; il gruppo di controllo corrisponde a linfociti coltivati senza MoDC. Le barre orizzontali rappresentano la media di sei repliche tecniche. (A) Espressione intracellulare del marcatore Ki-67 da parte delle cellule T CD8 e (B) da parte delle cellule T CD4. (C) Espressione della superficie cellulare del marcatore CD25 da parte delle cellule T CD8 e (D) da parte delle cellule T CD4. Abbreviazioni: MODCs = cellule dendritiche derivate da monociti bovini; RV = vaccino antirabbico. Questa cifra è stata modificata da Kangethe et al., 201811. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 8
Figura 8: Attivazione del marcatore Th1 (IFN-γ e Ki-67) da parte di MoDC innescato con l'antigene del virus della rabbia, come rilevato tramite qPCR ed ELISA. Dati prelevati da un animale con sei repliche tecniche. Le barre orizzontali rappresentano la media. Tre repliche della PCR mostrate come cambiamenti di piega rispetto ai linfociti naïve dopo la normalizzazione con un gene di riferimento GAPDH . (A) Espressione IFN-γ , (B) Espressione Ki-67 . (C) Confronto della secrezione di IFN-γ nel surnatante di coltura tra tre gruppi di trattamento, come rilevato da ELISA. Il gruppo specifico è definito come linfociti coltivati con MoDC pulsate RV; il gruppo non specifico corrisponde a linfociti coltivati con MoDC non pulsate dall'antigene; il gruppo di controllo corrisponde a linfociti coltivati senza MoDC. Abbreviazioni: MODCs = cellule dendritiche derivate da monociti bovini; RV = vaccino antirabbico. Questa cifra è stata modificata da Kangethe et al., 201811. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Reagenti Concentrazione finale Volume Per reazione
Miscela dNTPs (10 mM) 1.000 μM 1 μL
Primer Hexamer Random (50 ng/μL) 25 μM 1 μL
Modello di RNA 0,1 – 1 μg/μL χ μL (se necessario)
Acqua senza RNAsi - χ μL (se necessario)
Volume di reazione finale - 10 μL

Tabella 1: Composizione del master mix (RNA primer mix).

Reagenti Concentrazione finale Volume Per reazione
Buffer RT 10x 1x 2 μL
MgCl2 25 mM 5 mM 4 μL
DTT 0,1 M 10 mM 2 μL
Inibitore della RNAsi 40 U/μL 2 U 1 μL

Tabella 2: La miscela di reazione 2x PCR. Abbreviazioni: RT = trascrittasi inversa; DTT = ditiotreitolo.

Citochina Specie Numero di adesione Sequenza Lunghezza Tm
IFN-γ Bos taurus FJ263670 F- GTGGGCCTCTCCTCAGAA 234 80.5
R- GATCATCCACCGGAATTTGA
Ki-67 · Bos taurus XM_015460791.2 F-AAGATTCCAGCGCCCATTCA 148 86.5
R-TGAGGAACGAACACGACTGG
GAPDH Bos taurus Sassu et al., 2020 F-CCTGGAGAAACCTGCCAAGT 214 85.5
R-GCCAAATTCATTGTCGTACCA

Tabella 3: Set di primer utilizzati per l'amplificazione50.

Reagenti Concentrazione finale Volume Per reazione
Supermix 1x 5 μL
Primer anteriore (5 μM) 250/ 125 nM 1 μL
Primer inversi (5 μM) 250/ 125 nM 1 μL
cDNA 1:10 diluito 1,25 ng 2 μL
Acqua senza nucleasi - 1 μL
Volume di reazione finale - 10 μL

Tabella 4: master mix qPCR

Tubo n. Concentrazione di Standard Diluizione seriale
1 50 ng/mL 50 μL di tampone standard + 350 μL di tampone di lavaggio
2 12,5 ng/mL 150 μL dal tubo 1 + 450 μL di tampone di lavaggio
3 6,25 ng/mL 250 μL dal tubo 2 + 250 μL di tampone di lavaggio
4 3,13 ng/mL 250 μL dal tubo 3 + 250 μL di tampone di lavaggio
5 1,56 ng/mL 250 μL dal tubo 4 + 250 μL di tampone di lavaggio
6 0,78 ng/mL 250 μL dal tubo 5 + 250 μL di tampone di lavaggio
7 0,2 ng/mL 150 μL dal tubo 6 + 450 μL di tampone di lavaggio
8 0,1 ng/mL 250 μL dal tubo 7 + 250 μL di tampone di lavaggio
9 0,025 ng/mL 100 μL dal tubo 8 + 300 μL di tampone di lavaggio

Tabella 5: Serie di diluizioni standard IFN-γ

File supplementare 1: Protocolli per la sintesi di DNA complementare, reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (qPCR) e saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA). Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S1: La capacità di assorbimento dell'antigene MoDC con diverse concentrazioni del cocktail di citochine e con 3 giorni o 5 giorni di coltura. Diverse concentrazioni (5% p/v e 3% p/v) del cocktail di citochine contenente GM-CSF e IL-4 sono state testate con 3 giorni o 5 giorni di coltura per valutare la migliore combinazione per generare MoDC di assorbimento dell'antigene ad alte prestazioni (utilizzando la molecola tracciante FITC-destrano). Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S2: priming CD4 e CD8 con tossoide difterico (DT) e sierotipo 4 del virus della febbre catarrale degli ovini (BTV). L'espressione di Ki-67 da parte delle cellule CD8 dopo pulsazione con (A) DT e (C) BTV e l'espressione di Ki-67 da parte delle cellule CD4 dopo pulsazione con (B) DT e (D) BVT al giorno 16. Sono stati effettuati confronti con colture pulsate con DT e BVT (specifico), (C, D) con CD40L e con trattamenti di priming e controllo non specifici. Le barre orizzontali indicano la media. *p < 0,05, **p < 0,01 secondo un test di Mann-Whitney. Clicca qui per scaricare questo file.

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Discussion

Questo studio dimostra un metodo standardizzato in vitro per generare e fenotipizzare MoDC bovine e il loro successivo utilizzo nella misurazione dell'immunogenicità del vaccino di un vaccino commerciale (ad esempio, RV). I MoDC bovini possono essere utilizzati come strumento per lo screening di potenziali antigeni vaccinali contro le malattie del bestiame e prevedere il loro potenziale impatto clinico sulla base delle risposte immunitarie prima di procedere verso studi in vivo sugli animali. I MoDC generati sono stati identificati in base alle loro caratteristiche morfologiche, fenotipiche e funzionali. Abbiamo dimostrato che le MoDC derivate dai monociti CD14+ del bestiame mostravano caratteristiche osservate nelle DC, come i dendriti estesi, l'espressione di marcatori di superficie cellulare per la presentazione dell'antigene come MHC II, l'espressione di molecole co-stimolatorie su MoDC come CD40 e CD86, l'attività endocitica e la capacità di attivare i linfociti naïve.

I terreni di coltura cellulare utilizzati in questo esperimento (DMEM e RPMI) sono ampiamente utilizzati per la differenziazione e la coltivazione cellulare, con RPMI che è più frequentemente adottato per la differenziazione monocitaria36. L'integrazione di RPMI con FBS o HS (siero equino) non influisce sulla differenziazione dei monociti37. La supplementazione ricombinante di GM-CSF e IL-4 fornisce una condizione infiammatoria che innesca la differenziazione dei monociti e viene abitualmente utilizzata per la produzione di MoDC funzionalmente vitali in grado di assorbimento e presentazione dell'antigene alle cellule immunitarie38,39. In questo studio, RPMI 1640 terreno integrato con il 10% di FBS (terreno di coltura completo), l'1% di penicillina-streptomicina e l'aggiunta di un cocktail di citochine disponibile in commercio (GM-CSF più IL-4) ha indotto la differenziazione dei monociti bovini, con conseguente produzione di MoDC vitali. Quando i MoDC generati sono stati incubati con RV prima di co-coltivare con linfociti naïve, hanno indotto una risposta immunitaria dipendente dalle cellule T specifica contro RV, dimostrando che i MoDC maturi possono presentare adeguatamente antigeni RV a linfociti che non hanno mai incontrato RV. Questa è una caratteristica cruciale dell'immunità adattativa che ora possiamo replicare in laboratorio.

Abbiamo osservato che una maggiore concentrazione di cocktail di citochine (5%) accoppiata con un tempo di incubazione più lungo (5 giorni) ha prodotto MoDC con minore capacità endocitica per l'assorbimento dell'antigene rispetto a quelli trattati con una concentrazione inferiore di cocktail di citochine (3%) con lo stesso tempo di incubazione (5 giorni), come mostrato nella figura supplementare S1. Quindi, concludiamo che una concentrazione inferiore di cocktail di citochine (ad esempio, il 3%) con 5 giorni di incubazione è ottimale per produrre MoDC funzionalmente potenti. Marcatori di superficie cellulare come MHC II, CD40 e CD86 sono presenti sulle APC e la loro sovraregolazione indica l'attivazione cellulare funzionale40,41,4 2. Abbiamo dimostrato una maggiore espressione di MHC II, CD40 e CD86 dopo differenziazione monocitaria in MoDC naïve usando il cocktail di citochine (Figura 4).

L'ottimizzazione del rapporto tra linfociti naïve e MoDC in un sistema di coltura è un fattore chiave che influenza l'esito del test MoDC, con diversi rapporti tra MoDC e linfociti che inducono risposte linfocitarie variabili43. Tuttavia, dopo aver valutato i rapporti tra MoDC e linfociti di 1: 10-1: 40, abbiamo osservato che l'aumento della concentrazione di MoDC non ha aumentato l'attivazione dei linfociti e alla fine abbiamo optato per un rapporto ottimale di 1: 20, che è simile agli studi precedentemente riportati44,45. Va notato che la frazione linfocitaria naïve eluita potrebbe contenere cellule T non specificamente attivate; Pertanto, è imperativo avere un gruppo di controllo corrispondente solo alla coltura naïve dei linfociti.

Le cellule T CD4+ e CD8+ attivate esprimono marcatori specifici e secernono una varietà di citochine e la loro quantificazione indica l'attivazione immunitaria. L'espressione intracellulare di Ki-67, un marcatore di attivazione immunitaria ben caratterizzato, è stata sovraregolata in questa co-coltura di linfociti MoDC29,46. Analogamente in questo studio, l'aumentata secrezione di IFN-γ da parte dei linfociti ha indicato una risposta Th1 suscitata contro l'antigene RV30,31,47. L'espressione di IL-2 da parte delle cellule T CD4+ è anche un buon marcatore per visualizzare l'attivazione delle cellule T; tuttavia, la sua incorporazione al giorno 9 della co-coltura MoDC-linfociti lo ha reso un bersaglio inadatto per misurare la proliferazione dei linfociti per questo studio48. La sovraregolazione di CD25 in presenza di IL-2 ha precedentemente dimostrato di determinare il priming di entrambe le cellule T CD4+ e CD8+ ed è stata utilizzata in questo studio per misurare il priming dei linfociti naïve da parte di MoDC pulsate RV28.

Le cellule T CD8 citotossiche sono le principali cellule effettrici contro gli antigeni intracellulari dei vaccini o i patogeni virali49. Misurando i marcatori di attivazione dei linfociti (Ki-67 e CD25) e l'espressione delle citochine (IFN-γ), abbiamo scoperto che i MoDC caricati con antigene avevano un'attivazione significativa (p < 0,01) delle risposte delle cellule T CD8 e CD4, con la risposta CD8 e la polarizzazione Th1 più prevalenti contro l'antigene RV. Un fattore importante che deve essere considerato quando si progetta un test MoDC per vaccini coniugati adiuvanti sono le risposte dei linfociti indotte da adiuvanti. Si consiglia di utilizzare un gruppo di controllo (controllo adiuvante) composto da solo adiuvante per eliminare eventuali segnali di fondo. Questa configurazione può anche essere utilizzata per misurare l'effetto di diversi adiuvanti che possono amplificare le risposte dei linfociti verso un antigene a bassa immunogenia, che è cruciale per la protezione durante gli studi in vivo .

Ci sono alcune limitazioni in questo studio che vogliamo evidenziare. I dati sperimentali per ciascun test sono stati derivati da un singolo animale con sei repliche tecniche. Avere un numero maggiore di repliche biologiche sarebbe utile per ridurre al minimo gli errori e fornire una maggiore affidabilità statistica e risultati con maggiore precisione. Tuttavia, in una precedente pubblicazione11, questo test è stato anche testato e convalidato utilizzando un tossoide difterico (figura supplementare S2A,B) e un vaccino commerciale contro il sierotipo 4 del virus della febbre catarrale degli ovini (figura supplementare S2C,D) con tre e due animali biologici, rispettivamente. Inoltre, il confronto dei risultati ottenuti da questo studio in vitro con uno studio in vivo aiuterebbe a convalidare ulteriormente l'autenticità di questo test immunitario, che, a sua volta, accelererebbe il processo di implementazione di questo test MoDC in vitro come test di routine nella produzione di vaccini e nel controllo di qualità. Infine, l'espressione di CD14 nelle MoDC non è stata studiata, poiché la letteratura è incoerente riguardo a questo aspetto, specialmente quando si confrontano MoDC di diverse specie animali.

In conclusione, riportiamo un test MoDC bovino in vitro che può essere utilizzato per misurare l'immunogenicità indotta dal vaccino. Questo test MoDC può anche essere valutato utilizzando vari metodi, tra cui citometria a flusso, ELISA e qPCR. Avere più metodi per valutare i marcatori di attivazione è fondamentale in aree con risorse limitate in cui un citometro a flusso potrebbe non essere prontamente disponibile. Questo test può essere incluso come fase di controllo di qualità dai laboratori veterinari nazionali che producono grandi lotti di vaccini bovini. Inoltre, può essere utilizzato per identificare potenziali antigeni vaccinali durante lo sviluppo di nuovi vaccini bovini e persino per selezionare quale adiuvante utilizzare prima di una sperimentazione animale. Tutti questi fattori contribuiranno a un approccio più etico e conveniente allo sviluppo e all'utilizzo di vaccini bovini.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo la dottoressa Eveline Wodak e la dottoressa Angelika Loistch (AGES) per il loro supporto nel determinare lo stato di salute degli animali e per aver fornito BTV, il dottor Bernhard Reinelt per aver fornito sangue bovino e il dottor Bharani Settypalli e il dottor William Dundon dell'AIEA per consigli utili rispettivamente sugli esperimenti di PCR in tempo reale e sull'editing linguistico.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACK Lysing Buffer Gibco, Thermo Fisher A1049201 Ammonium-Chloride-Potassium buffer for lysis of residual RBCs in harvested PBMC Fraction
BD Vacutainer Heparin Tubes Becton, Dickinson (BD) and Company 366480 10 mL, additive sodium heparin 158 USP units, glass tube, 16 x 100 mm size
Bovine Dendritic Cell Growth Kit Bio-Rad, UK PBP015KZZ Cytokine cocktail composed of recombinant bovine IL-4 and GM-CSF
Bovine IFN-γ ELISA Kit Bio-Rad MCA5638KZZ Kit use for measuring IFN-γ expression in culture supernatant
CD14 Antibody Bio-Rad MCA2678F Mouse anti-bovine CD14 monoclonal antibody, clone CC-G33, isotype IgG1
CD25 Antibody Bio-Rad MCA2430PE Mouse anti bovine CD25 monoclonal antibody, clone IL-A11, isotype IgG1
CD4 Antibody Bio-Rad MCA1653A647 Mouse anti bovine CD4 monoclonal antibody, clone CC8, isotype IgG2a
CD40 Antibody Bio-Rad MCA2431F Mouse anti-bovine CD40 monoclonal antibody, clone IL-A156, isotype IgG1
CD8 Antibody Bio-Rad MCA837F Mouse anti bovine CD8 monoclonal antibody, clone CC63, isotype IgG2a
CD86 Antibody Bio-Rad MCA2437PE Mouse anti-bovine CD86 monoclonal antibody, clone IL-A190, isotype IgG1
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System Bio-Rad - Thermal cycler PCR machine
Corning Centrifuge Tube Falcon Corning  352096 & 352070 15 mL and 50 mL, high-clarity poypropylene conical bottom, graduated, sterial, seal screw cap, falcon tube
Cytofix/Cytoperm Plus BD Bio Sciences 555028 Fixation/permeabilization kit with BD golgiPlug, use for flow cytometer cell staining
Ethanol Sigma Aldrich 1009832500 Absolute for analysis EMSURE ACS,ISO, Reag. Ph Eur
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco, Thermo Fisher 10500064 Qualified, heat inactivated
Ficoll Plaque PLUS GE Health care Life Sciences, USA 341691 Lymphocyte-isolation medium
FlowClean Cleaning Agent Beckman Coulter, Life Sciences A64669 500 mL
FlowJo FlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, USA - Flow cytometer Histogram software
FlowTubes/ FACS  (Fluorescence-activated single-cell sorting) Tube Falcon Corning  352235 5 mL, sterial, round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap, use in flow cytometry analysis
Fluoresceinisothiocynat-Dextran Sigma Aldrich, Germany 60842-46-8 FITC-dextran MW
Gallios Flow Cytometer Beckman Coulter - Flow cytometer machine
Hard-Shell 96-Well PCR Plates Bio-Rad HSP9601 96 well, low profile, thin wall, skirted, white/clear
Human CD14 MicroBeads Miltenyi Bioteck, Germany 130-050-201 2 mL microbeads conjugated to monoclonal anti-human CD14 antibody isotype IgG2a, used for selection of bovine monocytes from PBMCs
Kaluza Beckman Coulter, Germany - Flow cytometer multicolor data analysis software
MACS Column Miltenyi Bioteck, Germany 130-042-401 Magnetic activated cell sorting or immune magentic cell separation colum for separation of various CD14 cell population based on cell surface antigens
MHC Class II DQ DR Polymorphic Antibody Bio-Rad MCA2228F Mouse anti-sheep MHC Class II DQ DR Polymorphic:FITC, clone 49.1, isotype IgG2a, cross reactive with bovine
Microcentrifuge Tube Sigma Aldrich HS4325 1.5 mL, conical bottom, graduated, sterial tube
Microsoft Power Point Microsoft - The graphical illustrations of experimental design
Mouse IgG1 Negative Control:FITC for CD14, CD40 Antibody Bio-Rad MCA928F Isotype control CD14 and CD40 monoclonal antibody 
Mouse IgG1 Negative Control:PE for CD86 Antibody Bio-Rad MCA928PE Isotype control CD86 monoclonal antibody 
Mouse IgG1 Negative Control:RPE for CD25 Antibody Bio-Rad MCA928PE Isotype control CD25 monoclonal antibody 
Mouse IgG2a Negative Control:FITC for MHC Class II Antibody Bio-Rad MCA929F Isotype control for MHC class II monoclonal antibody 
Nobivac Rabies MSD Animal Health, UK - 1 µL/mL of cell cultured inactivated vaccine containing > 2 I.U./mL Rabies virus strain
Optical seals Bi0-Rad TCS0803 0.2 mL flat PCR tube 8-cap strips, optical, ultraclear, compatible for qPCR machine
Penicillin-Streptomycin Gibco, Thermo Fisher 15140122 100 mL
Phosphate Buffer Saline (PBS) Gibco, Thermo Fisher 10010023 pH 7.4, 1x concentration
Prism - GraphPad 5 Software  Dotmatics - Statistical software
Purified Anti-human Ki-67 antibody Biolegend, USA 350501 Monoclonal antibody, cross reactive with cow, clone ki-67
Purified Mouse IgG1 k Isotype Ctrl Antibody Biolegend 400101 Isotype control for Ki-67 monoclonal antibody
READIDROP Propidium Iodide BD Bio Sciences 1351101 Live/dead cell marker used for flow cytometry, amine reactive dye
Recombinant Human IL-2 Protein R&D System, USA 202-IL-010/CF Interleukin-2, 20 ng/ml
RNeasy Mini Kit Qiagen 74106 Kit use for extraction of total RNA; RLT buffer = lysis buffer; RW1 buffer = stringent guanidine-containing washing buffer; RDD buffer = DNase buffer; RPE buffer = mild wash buffer; RNaseOUT = RNase inhibitor.
RPMI 1640 Medium Sigma Aldrich R8758 Cell culture media with L-glutamine and sodium bicarbonate
SMART-servier medical art  Les Laboratories Servier - Licensed under a creative commons attribution 3.0 unported license
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 172-5270 2x qPCR mix conatins dNTPs, Ss07d fusion polymerase, MgCl2, SYBR Green I supermix = supermix, ROX normalization dyes.
SuperScript III First-Strand Synthesis System Invitrogen, Thermo Fisher 18080051 Kit for cDNA synthsis
Tissue Culture Test plate 24 TPP, Switzerland 92024 24 well plate, sterilized by radiation , growth enhanced treated, volume 3.18 mL
Trypan Blue Solution Gibco, Thermo Fisher 15250061 0.4%, 100 mL, dye to assess cell viability
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Invitrogen, Thermo Fisher 10977023 0.1 µm membrane filtered distilled water
VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes Thermo Fisher Scientific 15206067 VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes have a green top and contain spray-dried lithium, sodium or ammonium heparin on the inner walls and are usedin clinical chemistry, immunology and serology. The anticoagulant heparin activates antithrombin, which blocks the clotting cascade and thus produces a whole blood/plasma sample.
Water Sigma Aldrich W3500-1L Sterile-filtered, bioReagent suitable for cell culture

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Valore vuoto numero 195
Determinazione dell'immunogenicità del vaccino utilizzando cellule dendritiche derivate da monociti bovini
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Liaqat, F., Kangethe, R. T.,… More

Liaqat, F., Kangethe, R. T., Pichler, R., Liu, B., Huber, J., Wijewardana, V., Cattoli, G., Porfiri, L. Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (195), e64874, doi:10.3791/64874 (2023).

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