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Immunology and Infection

Determinación de la inmunogenicidad de la vacuna utilizando células dendríticas derivadas de monocitos bovinos

Published: May 19, 2023 doi: 10.3791/64874
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1, 1, 1
1Animal Production and Health Section, Joint Food and Agriculture Organization (FAO)/International Atomic Energy Agency (IAEA) Centre of Nuclear Techniques in Food and Agriculture, International Atomic Energy Agency, 2Teaching and Research Farm Kremesberg, Clinical Unit for Herd Health Management in Ruminants, Department for Farm Animals and Veterinary Public Health, University of Veterinary Medicine, Vienna

Summary

La metodología describe la generación de células dendríticas derivadas de monocitos bovinos (MoDC) y su aplicación para la evaluación in vitro de candidatos antigénicos durante el desarrollo de posibles vacunas veterinarias en bovinos.

Abstract

Las células dendríticas (DC) son las células presentadoras de antígeno (APC) más potentes dentro del sistema inmunitario. Patrullan el organismo en busca de patógenos y desempeñan un papel único dentro del sistema inmune al vincular las respuestas inmunes innatas y adaptativas. Estas células pueden fagocitar y luego presentar antígenos capturados a las células inmunes efectoras, desencadenando una amplia gama de respuestas inmunes. Este documento demuestra un método estandarizado para la generación in vitro de células dendríticas derivadas de monocitos bovinos (MoDC) aisladas de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de ganado y su aplicación en la evaluación de la inmunogenicidad de la vacuna.

Se utilizó la clasificación celular magnética para aislar monocitos CD14+ de PBMC, y se utilizó la suplementación de medio de cultivo completo con interleucina (IL)-4 y factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) para inducir la diferenciación de monocitos CD14+ en MoDC naïve. La generación de MoDC inmaduros se confirmó mediante la detección de la expresión de marcadores de superficie celular del complejo mayor de histocompatibilidad II (MHC II), CD86 y CD40. Se utilizó una vacuna contra la rabia disponible comercialmente para pulsar los MoDC inmaduros, que posteriormente se cocultivaron con linfocitos naïve.

El análisis de citometría de flujo de las MoDC pulsadas por antígeno y el cocultivo de linfocitos reveló la estimulación de la proliferación de linfocitos T a través de la expresión de marcadores Ki-67, CD25, CD4 y CD8. El análisis de la expresión de ARNm de IFN-γ y Ki-67, utilizando PCR cuantitativa, mostró que los MoDCs podrían inducir el cebado específico de antígeno de linfocitos en este sistema de cocultivo in vitro . Además, la secreción de IFN-γ evaluada mediante ELISA mostró un título significativamente mayor (**p < 0,01) en el cocultivo de linfocitos MoDC pulsado por la vacuna antirrábica que en el cocultivo de linfocitos MoDC sin antígeno. Estos resultados muestran la validez de este ensayo in vitro MoDC para medir la inmunogenicidad de la vacuna, lo que significa que este ensayo se puede utilizar para identificar posibles candidatos a vacunas para el ganado antes de proceder con ensayos in vivo , así como en evaluaciones de inmunogenicidad de vacunas comerciales.

Introduction

La vacunación veterinaria representa un aspecto crucial de la cría y la salud de los animales, ya que contribuye a mejorar la seguridad alimentaria y el bienestar animal al conferir protección contra las enfermedades que afectan al sector ganadero a nivel mundial1. Un método in vitro eficaz para evaluar la inmunogenicidad de posibles vacunas candidatas ayudaría a acelerar el proceso de desarrollo y producción de vacunas. Por lo tanto, es necesario ampliar el campo de los ensayos inmunes con metodologías innovadoras basadas en estudios in vitro , ya que esto ayudaría a revelar la complejidad de los procesos inmunes relacionados con la inmunización y la infección por patógenos. Actualmente, la inmunización animal in vivo y los estudios de provocación, que requieren muestreos periódicos (por ejemplo, sangre y bazo), se utilizan para medir la inmunogenicidad de las vacunas candidatas y los adyuvantes. Estos ensayos son costosos, requieren mucho tiempo y tienen implicaciones éticas, porque en la mayoría de los casos, la eutanasia animal se lleva a cabo al final de los ensayos.

Como alternativa a los ensayos in vivo, se han utilizado células mononucleares de sangre periférica (PBMC) para evaluar las respuestas inmunitarias inducidas por la vacuna in vitro2. Las PBMC son una población heterogénea de células compuestas por 70%-90% de linfocitos, 10%-20% de monocitos y un número limitado de células dendríticas (DC, 1%-2%)3. Las PBMC albergan células presentadoras de antígeno (APC) como células B, monocitos y DC, que patrullan constantemente el organismo en busca de signos de infección o daño tisular. Las quimiocinas secretadas localmente facilitan el reclutamiento y la activación de APC en estos sitios al unirse a los receptores de la superficie celular. En el caso de los monocitos, las quimiocinas dirigen su destino para diferenciarse en CD o macrófagos4. Tan pronto como las CD encuentran y capturan un patógeno, migran a órganos linfoides secundarios, donde pueden presentar los antígenos peptídicos patógenos procesados utilizando proteínas de superficie de clase I o clase II del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) a las células T CD8+ o a las células T CD4+, respectivamente, desencadenando así una respuesta inmune 5,6.

El papel clave desempeñado por las CD en la orquestación de una respuesta inmune protectora contra diversos patógenos las convierte en un objetivo de investigación interesante para comprender los mecanismos inmunes intracelulares, especialmente cuando se diseñan vacunas y adyuvantes contra agentes infecciosos7. Dado que la fracción de CD que se puede obtener de PBMC es bastante pequeña (1% -2%), los monocitos se han utilizado para generar DC in vitro8. Estas CD derivadas de monocitos (MoDC) se desarrollaron inicialmente como una posible estrategia de tratamiento en la inmunoterapia contra el cáncer9. Más recientemente, los MoDC se han utilizado para la investigación de vacunas 10,11,12, y los monocitos clásicos son el subtipo predominante (89%) para la producción de MoDC 13. La producción de MoDCs in vitro se ha logrado previamente mediante la adición de factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) administrado en combinación con otras citocinas como la interleucina-4 (IL-4), el factor de necrosis tumoral α (TNF-α) o IL-1314,15,16.

El éxito de un ensayo in vitro de MoDC depende de la capacidad de los MoDC maduros estimulados por antígeno para modular el alcance y el tipo de respuesta inmune específica para el tipo de antígeno detectado17. El tipo de patógeno reconocido y presentado por los MoDC determina la diferenciación de las células CD4+ T auxiliares (Th) en células efectoras Th1, Th2 o Th17 y se caracteriza por un perfil de citoquinas secretoras específicas del patógeno. Se provoca una respuesta Th1 contra patógenos intracelulares y da como resultado la secreción de interferón-gamma (IFN-γ) y factor de necrosis tumoral beta (TNF-β), que modula la protección dependiente fagocítica. Una respuesta Th2 se desencadena contra organismos parásitos y se caracteriza por la secreción de IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, que inicia la protección humoral independiente fagocítica. Th17 ofrece protección dependiente de neutrófilos contra infecciones bacterianas y fúngicas extracelulares mediadas por la secreción de IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 y TNF-α 18,19,20,21. Sobre la base de estudios previos, se ha observado que no todos los patógenos caen dentro del perfil de citoquinas esperado. Por ejemplo, las MoDC dérmicas, en respuesta a la infección parasitaria por Leishmania, estimulan la secreción de IFN-γ de las células T CD4+ y las células T CD8+, induciendo así una respuesta Th1 proinflamatoriaprotectora 22.

También se ha demostrado que, en pollos MoDCs preparados con lipopolisacárido de Salmonella (LPS), pueden inducir una respuesta variable contra Salmonella typhimurium activando las respuestas Th1 y Th2, mientras que Salmonella gallinarum induce una respuesta Th2 sola, lo que podría explicar la mayor resistencia de este último hacia el aclaramiento de MoDC23. La activación de MoDCs contra Brucella canis (B. canis) también ha sido reportada tanto en MoDCs caninos como humanos, lo que significa que esto podría representar un mecanismo de infección zoonótica24. Las MoDC humanas preparadas con B. canis inducen una fuerte respuesta Th1 que confiere resistencia a la infección grave, mientras que las MoDC caninas inducen una respuesta Th17 dominante con una respuesta Th1 reducida, lo que posteriormente conduce al establecimiento de una infección crónica25. Los MoCD bovinos muestran una mayor afinidad por el virus de la fiebre aftosa (FMDV) conjugado con inmunoglobulina G (IgG) en comparación con el FMDV no conjugado solo, ya que los MoDC forman un complejo de anticuerpos virales en respuesta a los10 primeros. Tomados en conjunto, estos estudios muestran cómo se han utilizado los MoDC para analizar la complejidad de las respuestas inmunes durante la infección por patógenos. Las respuestas inmunes adaptativas pueden evaluarse mediante la cuantificación de marcadores específicos asociados con la proliferación de linfocitos. Ki-67, una proteína intracelular detectada sólo en células en división, es considerada como un marcador confiable para estudios de proliferación26, y de manera similar, CD25 expresado en la superficie de las células T durante la fase tardía de activación corresponde a la proliferación de linfocitos27,28.

Este estudio demuestra un método estandarizado para la generación in vitro de MoCD de ganado vacuno seguido de su aplicación en un ensayo inmune in vitro utilizado para probar la inmunogenicidad de las vacunas. Se utilizó una vacuna antirrábica (VD) disponible comercialmente para validar la eficacia de este ensayo. La activación y proliferación de linfocitos T se midió mediante citometría de flujo, reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qPCR) y ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) mediante el análisis de marcadores de activación celular bien establecidos como Ki-67 y CD25 y la secreción de IFN-γ 28,29,30,31. No se realizan ensayos experimentales en animales o humanos durante el ensayo del MoDC.

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Protocol

La extracción de sangre es realizada por un servicio veterinario certificado de acuerdo con las directrices éticas de la Agencia Austriaca de Salud y Seguridad Alimentaria (AGES) y de conformidad con las normas aceptadas de bienestar animal32. El estudio recibió la aprobación ética del Ministerio de Agricultura de Austria. El diseño experimental para la generación de MoDCs y su posterior aplicación se ilustra en la Figura 1.

1. Producción de modCD ingenuos

NOTA: Se obtuvieron muestras de sangre entera de un solo ternero libre de patógenos mediante punción de vena yugular con vacutainers heparinizados (se utilizaron ocho tubos de sangre de 9 ml para este estudio). Transporta la sangre en una nevera. Almacenar las muestras a 2-4 °C para su uso posterior, o procesarlas inmediatamente. Mantenga la sangre girando para evitar la coagulación de la sangre. Esterilizar los vacutainers con etanol al 70%. Todos los siguientes experimentos se realizaron con una muestra biológica y seis réplicas técnicas.

  1. Centrifugación por gradiente de densidad para aislar las PBMC de la sangre heparinizada
    1. Mezclar bien la sangre invirtiéndola 10x.
    2. Con una pipeta de 10 ml, transfiera 20 ml de sangre heparinizada a un tubo estéril de 50 ml y dilúyalo con 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
    3. Pipetear 15 ml de medio de aislamiento de linfocitos a un tubo estéril de 50 ml.
      NOTA: Permita que el medio aislante de linfocitos alcance la temperatura ambiente antes del pipeteo.
    4. Incline el tubo de 50 ml que contiene el medio de aislamiento de linfocitos a una posición de 45°. Apunte la punta de una pipeta de 25 ml perpendicularmente y coloque cuidadosamente los 30 ml de PBS en sangre sobre el medio de aislamiento de linfocitos, sin mezclar los dos. Muy lentamente, vuelva a colocar el tubo de 50 ml en posición vertical.
    5. Centrífuga a 800 × g durante 35 min a 20 °C con aceleración máxima y sin frenado (función de deceleración desactivada).
    6. Utilice una pipeta Pasteur para recoger la capa de PBMC (la capa blanca delgada justo después de la primera capa de plasma) y transfiérala a un nuevo tubo de 50 ml.
      NOTA: La centrifugación por gradiente de densidad separa la sangre entera en diferentes capas. Como resultado, los eritrocitos se asientan en la parte inferior como un gránulo, las células mononucleares (PBMC) se asientan en la capa de interfaz y el plasma forma la capa superior. Los granulocitos se encuentran entre el pellet y la capa de PBMC.
    7. Lave las PBMC cosechadas 2 veces agregando PBS hasta un volumen de 40 ml y mezclando bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo. A continuación, centrifugar a 500 × g a 4 °C durante 7 min con aceleración máxima y desaceleración máxima.
    8. Deseche el sobrenadante por decantación, resuspenda el pellet en 15 ml de 1x tampón de cloruro de amonio-potasio (ACK) e incube a temperatura ambiente durante 10-15 min.
      NOTA: No incubar por más de 15 min. El tampón ACK disponible comercialmente se utiliza para garantizar la lisis de los glóbulos rojos residuales (RBC) presentes en la fracción PBMC.
    9. Añadir PBS hasta un volumen de 40 ml y, a continuación, centrifugar a 500 × g y 4 °C durante 7 min con aceleración y desaceleración máximas.
    10. Desechar el sobrenadante por decantación y repetir el paso 1.1.9.
    11. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 10 ml de medio de cultivo completo (a temperatura ambiente).
      NOTA: El medio de cultivo completo está compuesto por medio de cultivo celular RPMI 1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina.
  2. Separación magnética de las células CD14+/− de la población PBMC utilizando perlas magnéticas conjugadas CD14
    1. Contar las células con un contador celular hemocitómetro limpio utilizando 10 μL de suspensión celular mezclada con 10 μL de solución de azul de tripano (0,4%).
      NOTA: El colorante azul de tripano es un químico tóxico y potencialmente carcinógeno. Debe manipularse mientras se usa equipo de protección personal (EPP) para evitar el contacto, y los desechos deben desecharse en un contenedor hermético especializado en desechos tóxicos. Las células muertas aparecerán azules, mientras que las células vivas aparecerán claras bajo el microscopio.
    2. Centrifugar durante 7 min a 500 × g.
    3. Desechar el sobrenadante con una pipeta y resuspender el pellet en tampón de clasificación celular activado por fluorescencia (FACS) utilizando un volumen de 40 μL por cada 1 × 107 células. Mezclar bien con una pipeta.
      NOTA: El tampón FACS está compuesto por 2% de FBS y 2 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) disuelto en PBS.
    4. Añadir 5 μL de tampón de microperlas CD14 por 1 × 107 células, y mezclar bien con una pipeta.
    5. Incubar durante 30 min a 4-8 °C para la selección positiva de monocitos bovinos CD14+ 33. Vórtice cada 15 min durante el período de incubación.
    6. Paso opcional (para análisis de citometría de flujo): Añadir 10 μL de anticuerpo de tinción CD14-FITC (isotiocianato de fluoresceína) con posterior incubación durante 15 min a 4-8 °C. Consulte el análisis de citometría de flujo en el paso 5 para obtener más detalles.
    7. Añadir 1 ml de tampón FACS y centrifugar durante 7 min a 500 × g.
    8. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 500 μL de tampón FACS por 1 × 108 células.
    9. Inserte la columna de separación de células inmunomagnéticas en el separador (soporte de columna magnética) y coloque un tubo de recolección de 15 ml debajo de la salida de la columna para recoger el flujo.
    10. Lave la columna con 1 ml de tampón FACS desgasificado. Después del enjuague, reemplace el tubo usado de 15 ml por uno nuevo.
    11. Dejar pasar la suspensión celular (a partir del paso 1.2.8) a través de la columna pipeteando 1 × 108 celdas en 500 μL de tampón a la vez.
      NOTA: Preste atención a no generar burbujas de aire mientras mezcla las celdas antes de permitirlas pasar por la columna.
    12. Enjuague la columna 3 veces con 3 ml de tampón FACS desgasificado cada vez.
    13. Recoja el flujo y etiquete esta primera fracción eluyida como la fracción de células CD14− (PBMC menos monocitos CD14+ ); Esto también se denomina fracción de linfocitos naïve.
      NOTA: Las células CD14− se mantienen en un medio de cultivo completo hasta que se producen las MoDC pulsadas por antígeno.
    14. Retire la columna del separador.
    15. Coloque un nuevo tubo estéril de 15 ml debajo de la columna para la recolección del efluente.
    16. Pipetear 5 ml de tampón FACS en la columna e inmediatamente empujarlo a través de un émbolo.
    17. Recoja el flujo y etiquete esta segunda fracción eluyida como la fracción de células CD14+ ; Esto también se llama fracción de monocitos ingenua.
    18. Agregue un medio de cultivo completo a los monocitos CD14+ cosechados para alcanzar 1 × 106 células/ml.
      NOTA: Cuente las células vivas en la fracción de células CD14+ eluyidas para estimar el volumen de medio de cultivo completo requerido para alcanzar el recuento de células deseado.
    19. Tome una placa estéril de 24 pocillos y agregue 1 ml de la suspensión celular (1 × 106 células/ml) a cada pocillo.
  3. Diferenciación de los monocitos naïve CD14+ en MoDCs naïve mediante la adición de un cóctel de citoquinas p/v al 3% (GM-CSF + IL-4) con un total de 5 días de incubación
    1. Complemente cada pocillo que contenga monocitos CD14+ con 40 μL (3% p/v) del cóctel de citoquinas proporcionado en el kit.
    2. Incubar la placa en una incubadora humidificada con 5% deCO2 y a 37 °C durante 48 h.
    3. El día 2, transferir la mitad del contenido de cada pocillo (500 μL) utilizando una pipeta a tubos individuales de 1,5 ml, y centrifugar a 500 × g a 4 °C durante 7 min.
    4. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 500 μL de medio de cultivo fresco completo.
    5. Transfiera 500 μL de esta suspensión celular del paso 1.3.4 a cada pocillo designado de modo que el volumen final sea de 1 ml.
    6. Enriquecer cada pocillo con 20 μL de cóctel de citoquinas.
    7. Incubar el cultivo durante 72 h en una incubadora humidificada con 5% deCO2 y a 37 °C.
    8. Después de la incubación el día 5, retire la placa de la incubadora.
      NOTA: Cada pocillo contendrá 1 ml de una suspensión celular de MoDC ingenuos. El número de MoDCs será un porcentaje (~20%) de los monocitos originales plateados (1 × 106/mL).

2. Ensayo de actividad endocítica MoDC

NOTA: El ensayo de captación de antígenos o el ensayo de actividad endocítica mide la capacidad de los MoDC ingenuos para internalizar material extraño. Realizar el ensayo utilizando MoDCs naïve cultivadas con cóctel de citoquinas al 3% p/v y con 5 días de incubación, como se describió anteriormente34.

  1. Recolecte la suspensión de células MoDC ingenua de la placa de 24 pocillos y transfiérala a un tubo de 15 ml; también recoja las células residuales enjuagando los pocillos con PBS.
  2. Centrífuga durante 500 × g durante 7 min. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 mL de medio de cultivo suplementado con FBS al 1%.
  3. Contar las células MoDC vivas para estimar el volumen de medio requerido para alcanzar el recuento de células deseado (2 × 105 células/ml).
  4. Cultivar las MoDC naïve en 100 μL de medio de cultivo completo en una placa de 24 pocillos con una concentración celular final de 2 × 105 células/ml.
  5. Complementar cada pocillo con 1 mg/ml de dextrano conjugado con FITC (sonda fluorescente utilizada como marcador de endocitosis).
    NOTA: El FITC-dextrano actúa como una sonda fluorescente y se utiliza como un trazador de endocitosis.
  6. Cubrir el plato e incubar en la oscuridad al 5% deCO2 y 37 °C durante 60 min.
    NOTA: Para el control de fondo, incubar las células MoDC adicionales (2 × 105 células/ml) con 1 mg/ml de FITC-dextrano en hielo, ya que este tipo de incubación impide la entrada de la molécula trazadora (FITC-dextrano) en las células.
  7. Después de la incubación, transfiera inmediatamente la placa de 24 pocillos en hielo para detener la endocitosis de FITC-dextrano.
  8. Lave las celdas con tampón FACS helado.
  9. Cosechar, centrifugar y resuspender el pellet en 500 μL de tampón FACS.
  10. Analizar la intensidad de fluorescencia del FITC-dextrano dentro de las células mediante citometría de flujo. Consulte el análisis por citometría de flujo en el paso 5.2 para obtener más información.

3. Generación de MoDCs pulsados por antígeno

NOTA: Una vacuna comercialmente disponible y clínicamente aprobada contra el virus de la rabia (VD) puede inducir la diferenciación de las MoDC naïve en MoDC portadoras de antígenos maduros. Use 0.1% (~ 1 μL) de una dosis única de vacunación contra el VD para generar MoDC pulsados por antígeno. Además, se prefiere producir MoDC pulsados por RV en la misma placa de cultivo utilizada (en el paso 1.3.8) para generar MoDC ingenuos porque la transferencia de los MoDC ingenuos a una nueva placa de 24 pocillos los afectará negativamente.

  1. A partir del paso 1.3.8) Añadir 1 μL/ml de suspensión del VD a 1 ml de cultivo de MoDC naïve en la placa de 24 pocillos e incubar durante 48 h al 5% deCO2 y 37 °C.
    NOTA: Los MoDC ingenuos cultivados sin estimulación del VD se utilizan como control de fondo (y como estimulación no específica para el cocultivo con linfocitos en los siguientes pasos).
  2. Después de la incubación, el día 7, mantenga la placa de 24 pocillos que contiene los MoDC pulsados por antígeno en hielo durante 10 minutos.
  3. Agregue 1 ml de PBS helado por pocillo. Mezclar bien cada pocillo mediante pipeteo y transferir la suspensión a un tubo de 15 ml.
  4. Lave los pocillos con 2 ml de PBS helado para recoger las células residuales que quedan dentro de cada pocillo.
  5. Transfiera el contenido a sus respectivos tubos y centrifugue la suspensión celular a 500 × g durante 7 min.
  6. Desechar el sobrenadante, resuspender el pellet celular (MoDC pulsadas por antígeno) en medio de cultivo completo y ajustar el volumen a una concentración celular final de 1 × 105 células/ml.
    NOTA: Cuente las células vivas para estimar el volumen de medio requerido para alcanzar el recuento de células deseado. Use MoDC pulsadas por RV desde el día 7 para el sistema de cocultivo de linfocitos MoDC.

4. Cocultivo de linfocitos MoDC

NOTA: El sistema de cocultivo de linfocitos MoDC in vitro determina la capacidad de los MoDC para preparar linfocitos específicos de antígeno. Los diferentes grupos de tratamiento de células después de 16 días de cocultivo incluyen específicos, no específicos y control. El grupo específico se define como linfocitos cocultivados con MoDC pulsados por RV; el grupo no específico se define como linfocitos cocultivados con MoCD no pulsadas por antígeno; y el grupo control se define como linfocitos cultivados sin MoDC.

  1. Añadir medio de cultivo completo a la fracción de linfocitos naïve eluyentes (células CD14− ) para alcanzar una concentración celular de 2 × 106 células/ml.
    NOTA: Cuente las células vivas en el cultivo celular CD14− que se han mantenido en medio de cultivo completo en una placa de 24 pocillos desde su recolección para estimar el volumen de medio requerido para alcanzar el recuento celular deseado.
  2. El día 7, tome una placa estéril de 24 pocillos y siembre los pocillos con 1 ml de suspensión de células linfocitarias naïve (2 × 106 células/ml) más 1 ml de suspensión de MoDC pulsada por antígeno o no pulsada por antígeno (1 × 105 células/ml).
    NOTA: El volumen total en cada pocillo será de 2 ml con una proporción de 1:20 MoDCs a linfocitos por pocillo.
  3. Incubar la placa durante 48 h a 37 °C y 5% deCO2.
  4. Enriquecimiento y reestimulación del cultivo con MoDC pulsados por antígeno
    1. Después de la incubación del cocultivo de linfocitos MoDC pulsados por antígeno, el día 9, complementar cada pocillo con 20 ng/ml de IL-2 recombinante y continuar incubando durante otras 120 h (5 días de incubación).
    2. El día 14, transferir 1 ml del cocultivo a un tubo estéril de 1,5 ml y centrifugar a 500 × g durante 7 min.
    3. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular con 1 ml de MoDC pulsadas o no pulsadas por antígeno (1 × 105 células/ml). Mezclar suavemente mediante pipeteo y transferir las suspensiones celulares a sus pozos designados.
      NOTA: En este paso, el volumen total en cada pocillo es de 2 ml.
    4. Continuar con la incubación al 5% deCO2 y 37 °C durante 48 h. Después de la incubación el día 16, el cocultivo está listo para el análisis mediante citometría de flujo, qPCR y ELISA.
      NOTA: Por cada 2 ml en cada pocillo del cocultivo de linfocitos MoDC, se tiñe 1 ml de células resuspendidas para citometría de flujo, 1 ml se usa para la extracción de ARN y los sobrenadantes de ambos se usan para ELISA.

5. Análisis citométrico de flujo

NOTA: Tiñe las células con marcadores apropiados/mAb antes de ejecutar las muestras en un citómetro de flujo. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre los reactivos (mAb de tinción y controles de isotipo), el kit, el instrumento y el software utilizados para el análisis de citometría de flujo.

  1. Protocolo de tinción del citómetro de flujo
    NOTA: Realice la tinción de la superficie celular para las PBMC y los linfocitos y monocitos naïve utilizando anti-CD14 mAb (paso 1.2.6). Para la tinción de la superficie celular de MoDC ingenuas, use mAb anti-CD86-específico, anti-CD40-específico y anti-MHC II-específico. Para la tinción de la superficie celular de las células del día 16 cocultivos, use anti-CD4, anti-CD8, anti-CD25 mAbs; para la tinción intracelular, use anti-Ki-67 mAb. Además, tiñe las células con control de isotipo negativo mAb o sin mAb (FMO: fluorescente menos uno). La principal diferencia al teñir los marcadores superficiales e intracelulares es que para los marcadores de superficie celular, las células deben teñirse con mAb de superficie específica antes de la tinción viva / muerta (L / D) o cualquier otro proceso. Sin embargo, la tinción intracelular se realiza después de la tinción L / D y requiere un paso de fijación más permeabilización para permitir la penetración intracelular.
    1. Transfiera 1 ml de suspensión celular a un tubo estéril de 1,5 ml con una pipeta y centrifugar durante 10 minutos a 500 × g.
      NOTA: Después de la centrifugación, al procesar las células del cocultivo de linfocitos MoDC, guarde el sobrenadante para el análisis ELISA.
    2. Resuspender el pellet en 1 ml de PBS y transferirlo a un tubo de 15 ml. Recoja las células residuales usando 1 ml de PBS y combínelo con el pellet resuspendido.
    3. Añadir 10 ml de PBS al tubo de 15 ml que contiene las células, mezclar por pipeteo y centrifugar durante 7 min a 850 x g.
    4. Deseche el sobrenadante y repita el paso 5.1.3.
    5. Desechar el sobrenadante y resuspender cuidadosamente el pellet celular con la suspensión residual (aproximadamente 180 μL) que queda después de decantar el sobrenadante.
    6. Transfiera la suspensión celular a una placa de 96 pocillos con fondo en V y selle los pozos para evitar derrames.
    7. Centrifugar la placa a 1.400 × g durante 5 min. Después de la centrifugación, mueva la placa sobre un contenedor de residuos para vaciar los pocillos de líquido y golpee la placa con papel absorbente para garantizar la eliminación del exceso de líquido.
    8. Añadir 25 μL de mezcla maestra de tinción superficial por pocillo y mezclar suavemente con una pipeta, seguida de incubación a 4 °C durante 30 min.
      NOTA: Para preparar la mezcla maestra de tinción superficial para un solo pocillo, agregue 2,5 μL de mAb superficial a 20 μL de tampón FACS.
    9. Añadir 200 μL de tampón FACS por pocillo y centrifugar a 1.400 × g durante 5 min. Después de la centrifugación, vacíe los pocillos de líquido por decantación y golpee la placa con papel absorbente para eliminar el exceso de líquido.
    10. Añadir 100 μL de solución de tinción L/D por pocillo. Mezclar bien con una pipeta, seguida de la incubación a 4 °C durante 15 minutos en la oscuridad.
      NOTA: Para un solo pocillo, disuelva 0,25 μL de colorante L/D en 100 μL de tampón FACS. El tinte L/D ayuda a distinguir entre células vivas y muertas.
    11. Añadir 100 μL de tampón FACS. Cubra los pocillos con la tapa y centrifugue la placa durante 1.400 × g durante 5 min. Deseche el sobrenadante por decantación y golpee la placa con papel absorbente.
    12. Repita el paso 5.1.11.
    13. Añadir 50 μL de solución de fijación por pocillo (suministrado con el kit) y mezclar con una pipeta antes de incubar la placa a temperatura ambiente en la oscuridad durante 10 min.
    14. Agregue 150 μL del tampón de permeabilización y lavado (PW) 1x provisto con el kit y cubra los pocillos con la tapa.
      NOTA: Para preparar 10 ml de 1x tampón PW, diluir 1 ml de tampón permanente 10x en 10 ml dedH2O.
    15. Centrifugar la placa a 1.400 × g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante por decantación y golpee la placa con papel absorbente.
    16. Añadir 200 μL de 1x PW, seguido de centrifugación a 1.400 × g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante por decantación y golpee la placa con papel absorbente.
    17. Para la tinción intracelular, agregue 25 μL de mezcla maestra de tinción intracelular (Ki-67 mAb antihumano) por pocillo. Mezclar bien e incubar el plato durante 30 min a 4 °C o en hielo en la oscuridad.
      NOTA: Para preparar la mezcla maestra de tinción intracelular para un solo pocillo, agregue 1 μL de Ki-67 mAb a 24 μL de 1x PW. El marcador de tinción intracelular se utiliza solo cuando se procesan células del cocultivo del día 16. La tinción intracelular no se realiza mientras se procesan PBMC, linfocitos naïve, monocitos y MoDC ingenuos.
    18. Después de la incubación, agregue 200 μL de 1x PW a cada pocillo. Mezclar con una pipeta y centrifugar durante 1.400 × g durante 5 min. Deseche el sobrenadante por decantación y golpee la placa con papel absorbente.
    19. Añadir 200 μL de tampón FACS, seguido de centrifugación a 1.400 × g durante 5 min. Deseche el sobrenadante por decantación y golpee el plato sobre papel absorbente.
    20. Resuspender el pellet celular en 200 μL de tampón FACS y transferir el contenido de cada pocillo a tubos de citómetro de flujo estéril separados. Utilice 300 μL de tampón FACS por pocillo para recoger las células residuales. Las células ahora están listas para el análisis de citometría de flujo.
  2. Ejecución de la muestra en un citómetro de flujo
    NOTA: Las muestras se ejecutaron en un citómetro de flujo (utilizando láseres de 488 nm, 638 nm y 405 nm) de acuerdo con el manual del fabricante35. Consulte el manual para obtener más información, solución de problemas y personalización del protocolo.
    1. Realice procedimientos de limpieza de rutina antes y después de leer las muestras.
      NOTA: No se salte una posición mientras carga los tubos en el instrumento.
      1. Para el ciclo de limpieza, utilice un total de cuatro tubos, con el primer tubo que contiene el reactivo de limpieza de flujo y los tres tubos restantes que contienen dH2O; cada tubo tendrá 3 mL. Durante la ejecución de limpieza, adquiera datos con un caudal medio durante aproximadamente 1 minuto capturando 100.000 eventos por tubo por debajo de 330 V para dispersión directa (FSC) contra 265 V para dispersión lateral (SSC).
        NOTA: No se deben reportar residuos o eventos celulares durante la limpieza; Si esto sucede, vuelva a realizar el paso de limpieza. Para ejecutar las muestras, asegúrese de que todas las muestras estén en una suspensión homogénea antes de adquirir los datos, ya que esto garantiza una lectura precisa.
    2. Para conectar y encender el citómetro, haga clic en el botón Aplicación ubicado en la esquina izquierda de la barra de título. En el menú desplegable de la aplicación , seleccione la opción Citometría y haga clic en la opción Encender.
      NOTA: En el menú desplegable de la aplicación , la opción Abrir permite a los usuarios navegar a través de los ensayos preprogramados, mientras que la opción Nuevo protocolo permite a los usuarios crear nuevos protocolos.
    3. Cargue inicialmente la muestra de control negativo en el soporte multitubo. Seleccione Nuevo protocolo y observe la lista de trabajo en el lado izquierdo del espacio de trabajo /pantalla.
    4. En la lista de trabajo, defina la posición de la muestra en el soporte multitubo y asigne un nombre a la muestra y el protocolo para su identificación.
    5. Desde el panel de hardware ubicado en el lado izquierdo del espacio de trabajo, ajuste y seleccione múltiples parámetros, como los detectores (FSC, SSC y 10 rangos de fluorescencia), los voltajes (V ) y las ganancias de los fotomultiplicadores, y el área-altura-ancho (AHW) de la señal.
      NOTA: Los siguientes ajustes para los detectores se seleccionaron en función del experimento y el instrumento utilizado: FSC-AHW: AHW, V: 270, G: 5; SSC-AHW: A, V: 350, G: 10; FL1 (CD8/FITC Dextran)-AHW: A, V: 400, G: 1; FL2 (CD25/PE)-AHW: A, V: 500, G: 1; FL6 (CD4/Alexa Fluor 647)-AHW: A, V: 700, G: 1; FL7 (Ki-67/Alexa Fluor 700)-AHW: A, V: 625, G: 1; FL9 (L/D)-AHW: A, V: 425, G: 1.
    6. Desde el Panel de control de adquisición de instrumentos situado debajo de la barra de título, ajuste las opciones de caudal (medio), Tiempo (5 min) y Eventos (consulte el paso 5.2.8) que desea detectar. Haga clic en la opción Adquirir Single para permitir que el instrumento dibuje/ejecute la muestra y muestre la vista previa en tiempo real de los eventos detectados.
    7. Desde la vista previa en tiempo real, ajuste el umbral de fluorescencia (voltaje y ganancia) y el tamaño de la celda para eventualmente dibujar puertas alrededor de la población celular deseada mientras excluye cualquier residuo celular.
      NOTA: FSC ayuda a distinguir las células en función del tamaño, lo que permite a los usuarios diferenciar entre las células del sistema inmune, como los monocitos y los linfocitos; los monocitos son más grandes y muestran una mayor intensidad de FSC en comparación con los linfocitos.
    8. Adquirir aproximadamente un total de 5.000 MoDC en vivo, 50.000 linfocitos vivos y 50.000 eventos de monocitos en vivo.
    9. Una vez ajustados todos los parámetros en referencia a la muestra de control negativo, haga clic en Detener y guarde el protocolo.
    10. Ahora cargue todas las muestras en el cargador multitubular. Defina cada muestra en la lista de trabajo y aplique los parámetros ajustados en referencia al control negativo a todas las muestras dentro del experimento. Haga clic en la opción Adquirir para permitir que todas las muestras del experimento se ejecuten consecutivamente.
    11. Una vez adquiridos los datos de todas las muestras, guardar y transformar en datos legibles utilizando un software de análisis de datos adecuado que permita la generación de histogramas biparamétricos y monoparamétricos secuenciales.

6. Análisis de expresión de ARN mensajero (ARNm)

  1. Extracción de ARN
    NOTA: Extraiga el ARN total del cocultivo de linfocitos MoDC pulsados por antígeno (específico), el cocultivo de linfocitos MoDC no pulsados con antígeno (no específico), el cultivo de linfocitos sin MoDC (control) y de linfocitos naïve (células CD14− aisladas antes del cocultivo). Para la extracción de ARN, prepare etanol con agua libre de RNasa. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre el kit de extracción y los reactivos.
    1. Transfiera 1 ml de suspensión celular de la placa de cocultivo de linfocitos MoDC (~1 × 106 células/ml) a un tubo estéril estéril de 1,5 ml con una pipeta y centrifugar durante 10 min a 500 × g.
    2. Guarde el sobrenadante para ELISA. Resuspender el pellet celular en 1 ml de PBS y transferirlo a un tubo de 15 ml. Recoja cualquier célula residual usando 1 ml de PBS.
    3. Centrifugar durante 10 min a 500 × g.
      NOTA: Todas las muestras deben manipularse delicadamente como células vivas hasta que la lisis celular se lleve a cabo utilizando el tampón de lisis proporcionado en el kit. La muerte celular libera RNasas que hidrolizan rápidamente las plantillas de ARN necesarias para la cuantificación aguas abajo. El tampón RLT lisa las células en una solución que inhibe las RNasas.
    4. Agregue 350 μL de tampón de lisis a cada pocillo vacío e incube durante 2-3 minutos para lisar las células adherentes que no se cosecharon en los pasos anteriores.
    5. Una vez completada la centrifugación de la etapa 6.1.3, desechar el sobrenadante y combinar el pellet celular con los 350 μL de tampón de lisis añadidos en el paso 6.1.4.
      NOTA: En este punto, es posible almacenar los tubos a -80 °C o proceder con la extracción de ARN (siguiendo los pasos).
    6. Pipetear 350 μL de etanol al 70% al lisado en la etapa 6.1.5. El volumen final por muestra es de 700 μL.
    7. Inserte la columna de extracción dentro de un tubo de recolección de 2 ml (incluido con el kit).
    8. Transfiera los 700 μL de muestra por columna de extracción y centrifuga a 10.000 × g durante 15 s. Deseche el flujo en el tubo de recolección y vuelva a colocarlo en la columna de centrifugado.
    9. En la columna de extracción, agregue 350 μL de tampón de lavado estricto (incluido en el kit) y centrifugar a más de 10,000 × g durante 15 s. Deseche el flujo continuo.
    10. Añadir 80 μL de mezcla de incubación de DNasa I por muestra sobre la membrana de la columna de extracción y dejar reposar durante 15 min a 20-30 °C.
      NOTA: Para preparar la mezcla de incubación de DNasa I por muestra, agregue 10 μL de solución madre de DNasa I a 70 μL de tampón DNasa para un volumen final de 80 μL. Mezcle bien invirtiendo el tubo varias veces, seguido de un breve giro en la centrífuga.
    11. Lavar la columna de extracción con 350 μL de tampón de lavado estricto, seguido de centrifugación a 10.000 × g durante 15 min. Deseche el flujo en el tubo de recolección después de la centrifugación.
    12. Lavar la columna de extracción 2x con 500 μL de tampón de lavado suave cada vez y con centrifugación a 10.000 × g durante 15 s y una segunda vez durante 2 min. Deseche el flujo después de cada centrifugación.
    13. Centrifugar la columna a velocidad máxima durante 1 min para secar la membrana y desechar el tubo de recolección.
    14. Coloque la columna de extracción en un nuevo tubo de recolección de 1,5 ml.
    15. Pipetear 50 μL de agua libre de RNasa sobre la membrana de la columna e incubar durante 3-5 min a temperatura ambiente.
      NOTA: Para concentraciones de ARN inferiores a 100 ng, reducir el volumen de elución a 30 μL y volver a eluyir la membrana de la columna de extracción utilizando el producto de la primera elución para concentrar el producto final.
    16. Centrifugar a 10.000 × g durante 1 min para eluyir el ARN.
    17. Mida la concentración de ARN detectando la absorbancia a 260 nm utilizando 0,5-2 μL de muestra. Ajuste la concentración final de ARN a 0.1-1 μg/μL usando agua libre de RNasa.
    18. Conservar las alícuotas de ARN a −80 °C para su uso posterior.
  2. Síntesis de ADN complementario
    1. Sintetice ADN complementario (ADNc) a partir del ARN plantilla extraído de acuerdo con el protocolo del fabricante proporcionado con el kit (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles).
      NOTA: En la Tabla 1 y la Tabla 2 se muestra un resumen de los reactivos y los volúmenes utilizados. Un protocolo completo se detalla en el Archivo Suplementario 1.
  3. Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real
    1. Para qPCR, ejecute las muestras de ADNc por triplicado. Cuantificar los niveles de transcripción del ARNm bovino para Ki-67 e IFN-γ utilizando conjuntos de cebadores específicos en referencia al gen GAPDH , como se muestra en la Tabla 3.
      NOTA: Un protocolo completo se detalla en el Archivo Suplementario 1.

7. Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

  1. Procesar los sobrenadantes de cultivo recolectados ricos en proteínas secretoras para la cuantificación de IFN-γ a través de ELISA.
    NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre el uso del kit. Un protocolo completo se detalla en el Archivo Suplementario 1.

8. Análisis estadístico

  1. Analizar los datos y hacer ilustraciones gráficas de diseño experimental utilizando software comercial. Utilice una prueba no paramétrica no pareada para el análisis comparativo. Considere que los valores de p < 0.05 son estadísticamente significativos.

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Representative Results

Esta metodología describe la generación in vitro de MoDCs de ganado para la evaluación de antígenos vacunales candidatos antes de realizar estudios in vivo. La Figura 1 ilustra el esquema experimental de generación de MoDC bovino y la aplicación de los MoDC para el ensayo in vitro. Utilizando la técnica de clasificación celular de base magnética, fue posible recolectar aproximadamente 26 millones de miocitos CD14 + de las PBMC recolectadas, que previamente se aislaron de 50 ml de sangre de ganado. La fracción celular eluyente libre de monocitos CD14+ fue rica en linfocitos y se utilizó como fuente de linfocitos CD4+ y CD8+ naïve (fracción de células linfocitarias CD14−).

La fracción de monocitos naïve estaba compuesta por 98% de células monocitarias CD14+ , como se observó después de la tinción de células CD14 y la citometría de flujo (Figura 2A, B). Las células de monocitos naïve purificadas, cuando se sometieron a cultivo en presencia del cóctel de citoquinas al 3% (GM-CSF e IL-4) con una incubación posterior de 5 días, se diferenciaron en un fenotipo similar a DC. A partir de un cultivo inicial de 26 millones de monocitos CD14+ , se pudo obtener un total de aproximadamente 12 millones de MoDCs después de 5 días de incubación. Los MoDCs naïve fueron funcionalmente capaces de captación de antígenos, como se observó utilizando el análisis de citometría de flujo de FITC-dextrano (Figura 3). Además, los MoDCs naïve se caracterizaron fenotípicamente evaluando la expresión de MHC clase II y marcadores coestimuladores de superficie celular CD86 y CD40, que validaron el fenotipo tipo tipo DC (Figura 4).

La estimulación pulsada por antígeno de los MoDC ingenuos se logró cultivándolos en presencia de RV inactivados durante 2 días. La activación de linfocitos naïve (la fracción de células CD14− ) se logró mediante el cocultivo de linfocitos MoDC pulsados por antígeno con la posterior suplementación de IL-2. Durante el cocultivo de linfocitos MoDC en el día 9, se observó un cambio morfológico en los MoDC pulsados por RV, ya que mostraron extensión de dendritas, que es una característica de la maduración de MoDC (Figura 5). El día 14, la activación de linfocitos se mejoró mediante la reestimulación del cocultivo mediante la adición de MoDC pulsados por RV recién producidos del mismo animal.

En comparación con el cocultivo de linfocitos MoDC no pulsados, se demostró un aumento significativo (p < 0,01) en la proliferación de linfocitos mediante la regulación positiva de los marcadores de activación Ki-67 y CD25 en las células T CD4+ y CD8+ el día 16 en el cocultivo pulsado de linfocitos MoDC (Figura 6). Las células T CD8+ de los cocultivos maduros de MoDC pulsados por RV exhibieron una regulación positiva de ocho veces (p < 0,01) de Ki-67 en comparación con el grupo no específico (Figura 7A). Las células T CD4+ en el mismo cocultivo mostraron un aumento de siete veces (p < 0,01) en Ki-67 en comparación con los controles (Figura 7B). Esto demuestra la capacidad de los MoDC preparados para RV para presentar con éxito el antígeno RV a los linfocitos naïve y posteriormente activarlos en una condición in vitro, similar a lo que sucede en un animal vivo. Además de analizar las células mediante citometría de flujo, los cocultivos también se sometieron a qPCR y ELISA para cuantificar la activación de linfocitos específicos del VD mediante transcripción de ARN (Ki-67 e IFN-γ) y secreción extracelular (IFN-γ), respectivamente (Figura 8). Estos métodos de detección adicionales también se pueden utilizar como pruebas confirmatorias para validar aún más los resultados de la citometría de flujo. La expresión de ARN para Ki-67 e IFN-γ demostrada por qPCR y los niveles de IFN-γ demostrados por ELISA mostraron patrones similares de aumento, lo que indica proliferación de linfocitos, en el cocultivo de antígeno específico en comparación con el grupo de tratamiento no específico. Por lo tanto, los resultados de qPCR y ELISA se correlacionaron con los resultados de la citometría de flujo. La qPCR mostró un aumento del >30% en la expresión de IFN-γ y un aumento del >5% en la expresión de Ki-67 en todos los cocultivos utilizando GAPDH como calibrador (Figura 8A, B). Se midió una concentración significativamente mayor de IFN-γ secretada (**p > 0,01) con ELISA utilizando sobrenadantes de cultivo del cocultivo de linfocitos MoDC pulsados por RV en comparación con el grupo de tratamiento no específico (Figura 8C).

Figure 1
Figura 1: Diseño experimental del ensayo in vitro basado en MoDC bovino. (A) Recolección y clasificación celular de las fracciones de células de monocitos CD14+ y linfocitos CD14− de PBMC bovinas. La sangre de ganado se procesa por centrifugación por gradiente de densidad para recolectar PBMC, seguida de clasificación celular magnética utilizando columnas de separación celular inmunomagnética y el posterior cultivo de la fracción de células monocíclicas CD14+ no deseada recolectada en medio RPMI 1640 suplementado. (B) La producción de MoDCs utilizando cóctel de citoquinas al 3% (GM-CSF + IL-4) con 5 días de incubación y cocultivo de linfocitos MoDC. El día 0, los monocitos se cultivan en presencia del cóctel de citoquinas y se incuban durante 48 h para inducir la diferenciación. El día 2, el cultivo se reestimula con el mismo cóctel de citoquinas, seguido de la incubación durante 72 h, lo que conduce a la producción de MoDC ingenuos. El día 5, el antígeno de la vacuna (vacuna antirrábica) se agrega al cultivo celular MoDC naïve, seguido de una incubación de 48 h. El día 7, se realiza el cocultivo de MoDCs pulsadas por antígeno con linfocitos naïve (la fracción de células CD14−), seguido de la incubación. El día 9, IL-2 se agrega a la co-cultura. El día 14, el enriquecimiento/reestimulación de los linfocitos activados/cebados se realiza mediante la adición de MoDCs pulsados por antígeno, seguido de incubación durante 48 h. Por último, el día 16, las células y el sobrenadante de cultivo se cosechan para el ensayo de proliferación de linfocitos. Abreviaturas: MODCs = células dendríticas derivadas de monocitos bovinos; PBMCs = células mononucleares de sangre periférica; GM-CSF = factor estimulante de colonias de granulocitos, macrófagos y macrófagos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Morfología y pureza de monocitos bovinos CD14+ cosechados de PBMCs utilizando microperlas anti-CD14-conjugadas. (A) Morfología de monocitos bovinos incubados durante 4 h a 37 °C en medio de cultivo completo para eliminar microperlas, fijados en portaobjetos recubiertos de polilisina y teñidos con tinción de Giemsa modificada. Barra de escala = 50 μm. (B) Histograma de citometría de flujo que muestra la fracción celular CD14+ eluyente con un nivel de pureza del 98,6% observado utilizando anticuerpos anti-CD14 (rojo) y anticuerpos de control de isotipo IgG1 de ratón conjugados con FITC (verde). Abreviaturas: PBMCs = células mononucleares de sangre periférica; FITC cont = control de isotiocianato de fluoresceína. Esta cifra ha sido modificada de Kangethe et al., 201811. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Actividad endocítica de los MoDCs bovinos generados in vitro. Histograma de citometría de flujo que muestra la captación de la molécula trazadora (FITC-dextrano) por las MoDC naïve del día 5. Los MoDC se incubaron a 37 °C durante 60 min con la molécula trazadora (azul) y los MoDC se incubaron en hielo con la molécula trazadora (gris) utilizada como control de fondo. Abreviaturas: MODCs = células dendríticas derivadas de monocitos bovinos; FITC = isotiocianato de fluoresceína. Esta cifra ha sido modificada de Kangethe et al., 201811. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Fenotipado de marcadores de superficie celular específicos de MoDC bovino generados in vitro. Histogramas de citometría de flujo para (A) estrategias de activación de MoDCs y para (B) MoDCs naïve día 5 teñidas con tres diferentes DC-specificmAbs (azul), incluyendo los siguientes: mAb MHC II anti-ovino, anti-bovino CD86 mAb y anti-bovino CD40 mAb. Todos comparados con sus correspondientes controles de isotipo (rojo). Abreviaturas: DC = células dendríticas; MODCs = CD derivadas de monocitos bovinos; MHC II = complejo mayor de histocompatibilidad II. Esta cifra ha sido modificada de Kangethe et al., 201811. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Signos de maduración de las MoDC producidas in vitro durante el cocultivo de linfocitos MoDC. Observación de la característica estructura dendrítica extendida mediante MoDCs pulsadas por antígeno con microscopía invertida en el día 9 del cocultivo de linfocitos MoDC. (A) MoDCs maduros dentro de un área altamente confluente de linfocitos cocultivados. (B) Los MoDC maduros son fácilmente distinguibles en un área con menos linfocitos en cocultivo. Barras de escala = 50 μm. Abreviatura: MODCs = células dendríticas derivadas de monocitos bovinos. Esta cifra ha sido modificada de Kangethe et al., 201811. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Estrategia de activación secuencial adoptada para diagramas de puntos contra la expresión de Ki-67 y CD25 por linfocitos en cocultivo de linfocitos MoDC. (A) Laestrategia completa de activación para las células recolectadas a partir del día 16 del cocultivo de linfocitos MoDC. (B) La expresión de Ki-67 de linfocitos dependientes de CD4+ y (C) de linfocitos CD8+ en comparación con el control FMO (sin mAb) y el mAb de control de isotipo IgG1-k de ratón. La expresión de CD25 en linfocitos CD8+ y (E) CD4+ cerrados (D) en comparación con el mAb de control del isotipo IgG1 de ratón. El grupo de tratamiento representa específicamente linfocitos cocultivados con MoDC pulsadas por RV, mientras que el control representa linfocitos cultivados en ausencia de MoDC. Abreviaturas: MODCs = células dendríticas derivadas de monocitos bovinos; FMO = fluorescente menos uno; RV = vacuna contra la rabia. Esta cifra ha sido modificada de Kangethe et al., 201811. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Análisis de datos de citometría de flujo de la expresión de Ki-67 y CD25 por linfocitos CD4+ y CD8+ después del cebado con el antígeno. Expresión de Ki-67 y CD25 desde el día 16 de cocultivo. El grupo de tratamiento (específico) se define como linfocitos cultivados con DCD pulsadas por RV; el grupo no específico corresponde a linfocitos cultivados con MoDCs no pulsadas por antígeno; el grupo control corresponde a linfocitos cultivados sin MoDCs. Las barras horizontales representan la media de seis réplicas técnicas. (A) Expresión intracelular del marcador Ki-67 por linfocitos T CD8 y (B) por linfocitos T CD4. (C) Expresión de la superficie celular del marcador CD25 por linfocitos T CD8 y (D) por linfocitos T CD4. Abreviaturas: MODCs = células dendríticas derivadas de monocitos bovinos; RV = vacuna contra la rabia. Esta cifra ha sido modificada de Kangethe et al., 201811. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Activación del marcador Th1 (IFN-γ y Ki-67) por MoDCs preparados con el antígeno del virus de la rabia, detectados a través de qPCR y ELISA. Datos tomados de un animal con seis réplicas técnicas. Las barras horizontales representan la media. Tres réplicas de PCR se muestran como cambios en el pliegue en comparación con los linfocitos naïve después de la normalización con un gen de referencia GAPDH . (A) expresión IFN-γ , (B) expresión Ki-67 . (C) Comparación de la secreción de IFN-γ en el sobrenadante de cultivo entre tres grupos de tratamiento, según lo detectado por ELISA. El grupo específico se define como linfocitos cultivados con MoDC pulsados por RV; el grupo no específico corresponde a linfocitos cultivados con MoDCs no pulsadas por antígeno; el grupo control corresponde a linfocitos cultivados sin MoDCs. Abreviaturas: MODCs = células dendríticas derivadas de monocitos bovinos; RV = vacuna contra la rabia. Esta cifra ha sido modificada de Kangethe et al., 201811. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Reactivos Concentración final Volumen Por reacción
Mezcla de dNTPs (10 mM) 1.000 μM 1 μL
Cebadores hexamémeros aleatorios (50 ng/μL) 25 μM 1 μL
Plantilla de ARN 0.1 – 1 μg/μL χ μL (según sea necesario)
Agua libre de ARNasa - χ μL (según sea necesario)
Volumen de reacción final - 10 μL

Tabla 1: Composición de la mezcla maestra (mezcla de cebador de ARN).

Reactivos Concentración final Volumen Por reacción
Búfer RT 10x 1x 2 μL
MgCl2 25 mM 5 mM 4 μL
TDT 0,1 M 10 mM 2 μL
Inhibidor de la ARNasa 40 U/μL 2 U 1 μL

Tabla 2: La mezcla de reacción 2x PCR. Abreviaturas: RT = transcriptasa inversa; TDT = ditiothreitol.

Citoquina Especie Número de Acceso Secuencia Largura Tm
IFN-γ Bos taurus FJ263670 F- GTGGGCCTCTCTCTCTCAGAA 234 80.5
R- GATCATCCACCGGAATTTGA
Ki-67 Bos taurus XM_015460791.2 F-AAGATTCCAGCGCCCATTCA 148 86.5
R-TGAGGAACGAACACGACTGG
GAPDH Bos taurus Sassu et al., 2020 F-CCTGGAGAAACCTGCCAAGT 214 85.5
R-GCCAAATTCATTGTCGTACCA

Tabla 3: Conjuntos de cebadores utilizados para la amplificación50.

Reactivos Concentración final Volumen Por reacción
Supermezcla 1x 5 μL
Cebador directo (5 μM) 250/ 125 nM 1 μL
Cebadores inversos (5 μM) 250/ 125 nM 1 μL
ADNc 1:10 diluido 1,25 ng 2 μL
Agua libre de nucleasas - 1 μL
Volumen de reacción final - 10 μL

Tabla 4: Mezcla maestra de qPCR

Tubo No. Concentración de Estándar Dilución en serie
1 50 ng/ml 50 μL de tampón estándar + 350 μL de tampón de lavado
2 12,5 ng/ml 150 μL del tubo 1 + 450 μL de tampón de lavado
3 6,25 ng/ml 250 μL del tubo 2 + 250 μL de tampón de lavado
4 3,13 ng/ml 250 μL del tubo 3 + 250 μL de tampón de lavado
5 1,56 ng/ml 250 μL del tubo 4 + 250 μL de tampón de lavado
6 0,78 ng/ml 250 μL del tubo 5 + 250 μL de tampón de lavado
7 0,2 ng/ml 150 μL del tubo 6 + 450 μL de tampón de lavado
8 0,1 ng/ml 250 μL del tubo 7 + 250 μL de tampón de lavado
9 0.025 ng/mL 100 μL del tubo 8 + 300 μL de tampón de lavado

Tabla 5: Serie de dilución estándar de IFN-γ

Archivo complementario 1: Protocolos para la síntesis de ADN complementario, reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qPCR) y ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S1: La capacidad de captación de antígenos MoDCs con diferentes concentraciones del cóctel de citoquinas y con 3 días o 5 días de cultivo. Se probaron diferentes concentraciones (5% p/v y 3% p/v) del cóctel de citoquinas que contenía GM-CSF e IL-4 con 3 días o 5 días de cultivo para evaluar la mejor combinación para generar MoDCs de captación de antígenos de alto rendimiento (utilizando la molécula trazadora FITC-dextrano). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S2: cebado CD4 y CD8 con toxoide diftérico (DT) y serotipo 4 del virus de la lengua azul (BTV). La expresión de Ki-67 por las células CD8 después de pulsar con (A) DT y (C) BTV y la expresión de Ki-67 por las células CD4 después de pulsar con (B) DT y (D) BVT en el día 16. Se realizaron comparaciones con cultivos pulsados con TD y BVT (específicos), (C,D) con CD40L, y con tratamientos de cebado y control inespecíficos. Las barras horizontales indican la media. *p < 0,05, **p < 0,01 según una prueba de Mann-Whitney. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Este estudio demuestra un método in vitro estandarizado para generar y fenotipificar MoCD bovinos y su posterior uso en la medición de la inmunogenicidad de la vacuna de una vacuna comercial (por ejemplo, RV). Los MoDC bovinos se pueden utilizar como una herramienta para detectar posibles antígenos de vacunas contra enfermedades del ganado y predecir su posible impacto clínico en función de las respuestas inmunes antes de proceder a ensayos in vivo en animales. Los MoDCs generados fueron identificados en base a sus características morfológicas, fenotípicas y funcionales. Demostramos que los MoDCs derivados de monocitos CD14+ de ganado exhibieron características observadas en DCs, tales como dendritas extendidas, la expresión de marcadores de superficie celular para la presentación de antígenos como MHC II, la expresión de moléculas coestimuladoras en MoDCs como CD40 y CD86, actividad endocítica y la capacidad de activar linfocitos naïve.

Los medios de cultivo celular utilizados en este experimento (DMEM y RPMI) son ampliamente utilizados para la diferenciación y el cultivo celular, siendo RPMI adoptado con mayor frecuencia para la diferenciación de monocitos36. La suplementación con RPMI con FBS o HS (suero de caballo) no afecta la diferenciación de monocitos37. La suplementación recombinante de GM-CSF e IL-4 proporciona una condición inflamatoria que desencadena la diferenciación de monocitos y se utiliza rutinariamente para la producción de MoDCs funcionalmente viables capaces de captación y presentación de antígenos a las células inmunes38,39. En este estudio, el medio RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS (medio de cultivo completo), 1% de penicilina-estreptomicina y la adición de un cóctel de citoquinas disponible comercialmente (GM-CSF más IL-4) indujo la diferenciación de monocitos bovinos, lo que resultó en la producción de MoDC viables. Cuando las MoDC generadas se incubaron con RV antes de cocultivar con linfocitos naïve, indujeron una respuesta inmune dependiente de células T específica contra RV, lo que demuestra que las MoDC maduras pueden presentar adecuadamente antígenos de RV a linfocitos que nunca se han encontrado con RV. Esta es una característica crucial de la inmunidad adaptativa que ahora podemos replicar en el laboratorio.

Observamos que una mayor concentración de cóctel de citoquinas (5%) junto con un tiempo de incubación más largo (5 días) produjo MoDCs con menor capacidad endocítica para la captación de antígenos que aquellos tratados con una menor concentración de cóctel de citoquinas (3%) con el mismo tiempo de incubación (5 días), como se muestra en la Figura Suplementaria S1. Por lo tanto, concluimos que una menor concentración de cóctel de citoquinas (por ejemplo, 3%) con 5 días de incubación es óptima para producir MoDC funcionalmente potentes. Los marcadores de superficie celular como MHC II, CD40 y CD86 están presentes en los APC, y su regulación positiva indica la activación celular funcional40,41,4 2. Demostramos una mayor expresión de MHC II, CD40 y CD86 después de la diferenciación de monocitos en MoDC naïve utilizando el cóctel de citoquinas (Figura 4).

La optimización de la proporción de linfocitos naïve y MoDCs en un sistema de cultivo es un factor clave que influye en el resultado del ensayo de MoDC, con diferentes proporciones de MoDC a linfocitos que inducen respuestas linfocitarias variadas43. Sin embargo, después de evaluar las proporciones de MoDC a linfocitos de 1:10-1:40, observamos que el aumento de la concentración de MoDCs no aumentaba la activación de linfocitos, y finalmente nos establecimos en una relación óptima de 1:20, que es similar a los estudios previamente reportados44,45. Cabe señalar que la fracción de linfocitos naïve eluyente puede contener células T activadas no específicamente; Por lo tanto, es imperativo tener un grupo de control que corresponda solo al cultivo de linfocitos naïve.

Las células T CD4+ y CD8+ activadas expresan marcadores específicos y secretan una variedad de citoquinas, y su cuantificación indica activación inmune. La expresión intracelular de Ki-67, un marcador de activación inmune bien caracterizado, fue regulada al alza en este cocultivo de linfocitos MoDC29,46. Del mismo modo, en este estudio, la secreción mejorada de IFN-γ por los linfocitos indicó una respuesta Th1 provocada contra el antígeno del VD30,31,47. La expresión de IL-2 por las células T CD4 + también es un buen marcador para visualizar la activación de las células T; sin embargo, su incorporación en el día 9 del cocultivo de linfocitos MoDC lo convirtió en un objetivo inadecuado para medir la proliferación de linfocitos para este estudio48. Se ha demostrado previamente que la regulación positiva de CD25 en presencia de IL-2 determina el cebado de las células T CD4 + y CD8 + y se utilizó en este estudio para medir el cebado de linfocitos naïve por MoDC pulsados por RV28.

Las células T CD8 citotóxicas son las principales células efectoras contra antígenos vacunales intracelulares o patógenos virales49. Al medir los marcadores de activación de linfocitos (Ki-67 y CD25) y la expresión de citoquinas (IFN-γ), encontramos que los MoDC cargados de antígeno tenían una activación significativa (p < 0.01) de las respuestas de las células T CD8 y CD4, siendo la respuesta CD8 y la polarización Th1 más prevalentes contra el antígeno RV. Un factor importante que debe tenerse en cuenta al diseñar un ensayo de MoDC para vacunas conjugadas con adyuvantes son las respuestas de linfocitos inducidas por adyuvantes. Recomendamos usar un grupo de control (control adyuvante) compuesto solo por adyuvante para eliminar cualquier señal de fondo. Esta configuración también se puede utilizar para medir el efecto de diferentes adyuvantes que pueden amplificar las respuestas de los linfocitos hacia un antígeno de baja inmunogeneración, que es crucial para la protección durante los estudios in vivo .

Hay algunas limitaciones en este estudio que queremos destacar. Los datos experimentales para cada ensayo se derivaron de un solo animal con seis réplicas técnicas. Tener un mayor número de réplicas biológicas sería beneficioso para minimizar los errores y proporcionar una mayor fiabilidad estadística y resultados con mayor precisión. Sin embargo, en una publicación anterior11, este ensayo también fue probado y validado utilizando un toxoide diftérico (Figura Suplementaria S2A,B) y una vacuna comercial contra el virus de la lengua azul serotipo 4 (Figura Suplementaria S2C,D) con tres y dos animales biológicos, respectivamente. Además, comparar los resultados obtenidos de este estudio in vitro con un estudio in vivo ayudaría a validar adicionalmente la autenticidad de este ensayo inmune, lo que, a su vez, aceleraría el proceso de implementación de este ensayo in vitro MoDC como prueba de rutina en la producción de vacunas y control de calidad. Por último, no se investigó la expresión de CD14 en MoDCs, ya que la literatura es inconsistente con respecto a este aspecto, especialmente cuando se comparan MoDCs de diferentes especies animales.

En conclusión, informamos un ensayo in vitro de MoDC bovino que se puede utilizar para medir la inmunogenicidad inducida por la vacuna. Este ensayo de MoDC también se puede evaluar utilizando varios métodos, incluyendo citometría de flujo, ELISA y qPCR. Tener múltiples métodos para evaluar los marcadores de activación es crucial en áreas con recursos limitados donde un citómetro de flujo puede no estar fácilmente disponible. Este ensayo puede ser incluido como un paso de control de calidad por los laboratorios veterinarios nacionales que producen grandes lotes de vacunas bovinas. Además, se puede utilizar para identificar posibles antígenos vacunales durante el desarrollo de nuevas vacunas bovinas e incluso para seleccionar qué adyuvante utilizar antes de un ensayo con animales. Todos estos factores contribuirán a un enfoque más ético y asequible para desarrollar y utilizar vacunas bovinas.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Acknowledgments

Eveline Wodak y la Dra. Angelika Loistch (AGES) por su apoyo para determinar el estado de salud de los animales y por proporcionar BTV, al Dr. Bernhard Reinelt por proporcionar sangre bovina, y al Dr. Bharani Settypalli y al Dr. William Dundon del OIEA por su útil asesoramiento sobre los experimentos de PCR en tiempo real y la edición del idioma, respectivamente.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACK Lysing Buffer Gibco, Thermo Fisher A1049201 Ammonium-Chloride-Potassium buffer for lysis of residual RBCs in harvested PBMC Fraction
BD Vacutainer Heparin Tubes Becton, Dickinson (BD) and Company 366480 10 mL, additive sodium heparin 158 USP units, glass tube, 16 x 100 mm size
Bovine Dendritic Cell Growth Kit Bio-Rad, UK PBP015KZZ Cytokine cocktail composed of recombinant bovine IL-4 and GM-CSF
Bovine IFN-γ ELISA Kit Bio-Rad MCA5638KZZ Kit use for measuring IFN-γ expression in culture supernatant
CD14 Antibody Bio-Rad MCA2678F Mouse anti-bovine CD14 monoclonal antibody, clone CC-G33, isotype IgG1
CD25 Antibody Bio-Rad MCA2430PE Mouse anti bovine CD25 monoclonal antibody, clone IL-A11, isotype IgG1
CD4 Antibody Bio-Rad MCA1653A647 Mouse anti bovine CD4 monoclonal antibody, clone CC8, isotype IgG2a
CD40 Antibody Bio-Rad MCA2431F Mouse anti-bovine CD40 monoclonal antibody, clone IL-A156, isotype IgG1
CD8 Antibody Bio-Rad MCA837F Mouse anti bovine CD8 monoclonal antibody, clone CC63, isotype IgG2a
CD86 Antibody Bio-Rad MCA2437PE Mouse anti-bovine CD86 monoclonal antibody, clone IL-A190, isotype IgG1
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System Bio-Rad - Thermal cycler PCR machine
Corning Centrifuge Tube Falcon Corning  352096 & 352070 15 mL and 50 mL, high-clarity poypropylene conical bottom, graduated, sterial, seal screw cap, falcon tube
Cytofix/Cytoperm Plus BD Bio Sciences 555028 Fixation/permeabilization kit with BD golgiPlug, use for flow cytometer cell staining
Ethanol Sigma Aldrich 1009832500 Absolute for analysis EMSURE ACS,ISO, Reag. Ph Eur
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco, Thermo Fisher 10500064 Qualified, heat inactivated
Ficoll Plaque PLUS GE Health care Life Sciences, USA 341691 Lymphocyte-isolation medium
FlowClean Cleaning Agent Beckman Coulter, Life Sciences A64669 500 mL
FlowJo FlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, USA - Flow cytometer Histogram software
FlowTubes/ FACS  (Fluorescence-activated single-cell sorting) Tube Falcon Corning  352235 5 mL, sterial, round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap, use in flow cytometry analysis
Fluoresceinisothiocynat-Dextran Sigma Aldrich, Germany 60842-46-8 FITC-dextran MW
Gallios Flow Cytometer Beckman Coulter - Flow cytometer machine
Hard-Shell 96-Well PCR Plates Bio-Rad HSP9601 96 well, low profile, thin wall, skirted, white/clear
Human CD14 MicroBeads Miltenyi Bioteck, Germany 130-050-201 2 mL microbeads conjugated to monoclonal anti-human CD14 antibody isotype IgG2a, used for selection of bovine monocytes from PBMCs
Kaluza Beckman Coulter, Germany - Flow cytometer multicolor data analysis software
MACS Column Miltenyi Bioteck, Germany 130-042-401 Magnetic activated cell sorting or immune magentic cell separation colum for separation of various CD14 cell population based on cell surface antigens
MHC Class II DQ DR Polymorphic Antibody Bio-Rad MCA2228F Mouse anti-sheep MHC Class II DQ DR Polymorphic:FITC, clone 49.1, isotype IgG2a, cross reactive with bovine
Microcentrifuge Tube Sigma Aldrich HS4325 1.5 mL, conical bottom, graduated, sterial tube
Microsoft Power Point Microsoft - The graphical illustrations of experimental design
Mouse IgG1 Negative Control:FITC for CD14, CD40 Antibody Bio-Rad MCA928F Isotype control CD14 and CD40 monoclonal antibody 
Mouse IgG1 Negative Control:PE for CD86 Antibody Bio-Rad MCA928PE Isotype control CD86 monoclonal antibody 
Mouse IgG1 Negative Control:RPE for CD25 Antibody Bio-Rad MCA928PE Isotype control CD25 monoclonal antibody 
Mouse IgG2a Negative Control:FITC for MHC Class II Antibody Bio-Rad MCA929F Isotype control for MHC class II monoclonal antibody 
Nobivac Rabies MSD Animal Health, UK - 1 µL/mL of cell cultured inactivated vaccine containing > 2 I.U./mL Rabies virus strain
Optical seals Bi0-Rad TCS0803 0.2 mL flat PCR tube 8-cap strips, optical, ultraclear, compatible for qPCR machine
Penicillin-Streptomycin Gibco, Thermo Fisher 15140122 100 mL
Phosphate Buffer Saline (PBS) Gibco, Thermo Fisher 10010023 pH 7.4, 1x concentration
Prism - GraphPad 5 Software  Dotmatics - Statistical software
Purified Anti-human Ki-67 antibody Biolegend, USA 350501 Monoclonal antibody, cross reactive with cow, clone ki-67
Purified Mouse IgG1 k Isotype Ctrl Antibody Biolegend 400101 Isotype control for Ki-67 monoclonal antibody
READIDROP Propidium Iodide BD Bio Sciences 1351101 Live/dead cell marker used for flow cytometry, amine reactive dye
Recombinant Human IL-2 Protein R&D System, USA 202-IL-010/CF Interleukin-2, 20 ng/ml
RNeasy Mini Kit Qiagen 74106 Kit use for extraction of total RNA; RLT buffer = lysis buffer; RW1 buffer = stringent guanidine-containing washing buffer; RDD buffer = DNase buffer; RPE buffer = mild wash buffer; RNaseOUT = RNase inhibitor.
RPMI 1640 Medium Sigma Aldrich R8758 Cell culture media with L-glutamine and sodium bicarbonate
SMART-servier medical art  Les Laboratories Servier - Licensed under a creative commons attribution 3.0 unported license
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 172-5270 2x qPCR mix conatins dNTPs, Ss07d fusion polymerase, MgCl2, SYBR Green I supermix = supermix, ROX normalization dyes.
SuperScript III First-Strand Synthesis System Invitrogen, Thermo Fisher 18080051 Kit for cDNA synthsis
Tissue Culture Test plate 24 TPP, Switzerland 92024 24 well plate, sterilized by radiation , growth enhanced treated, volume 3.18 mL
Trypan Blue Solution Gibco, Thermo Fisher 15250061 0.4%, 100 mL, dye to assess cell viability
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Invitrogen, Thermo Fisher 10977023 0.1 µm membrane filtered distilled water
VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes Thermo Fisher Scientific 15206067 VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes have a green top and contain spray-dried lithium, sodium or ammonium heparin on the inner walls and are usedin clinical chemistry, immunology and serology. The anticoagulant heparin activates antithrombin, which blocks the clotting cascade and thus produces a whole blood/plasma sample.
Water Sigma Aldrich W3500-1L Sterile-filtered, bioReagent suitable for cell culture

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Determinación de la inmunogenicidad de la vacuna utilizando células dendríticas derivadas de monocitos bovinos
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