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Immunology and Infection

소 단핵구 유래 수지상 세포를 이용한 백신 면역원성 측정

Published: May 19, 2023 doi: 10.3791/64874
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1, 1, 1
1Animal Production and Health Section, Joint Food and Agriculture Organization (FAO)/International Atomic Energy Agency (IAEA) Centre of Nuclear Techniques in Food and Agriculture, International Atomic Energy Agency, 2Teaching and Research Farm Kremesberg, Clinical Unit for Herd Health Management in Ruminants, Department for Farm Animals and Veterinary Public Health, University of Veterinary Medicine, Vienna

Summary

이 방법론은 소 단핵구 유래 수지상 세포(MoDC)의 생성과 소의 잠재적인 동물용 백신 개발 중 항원 후보의 시험관 내 평가를 위한 적용을 설명합니다.

Abstract

수지상 세포(DC)는 면역 체계 내에서 가장 강력한 항원 제시 세포(APC)입니다. 그들은 병원체를 찾기 위해 유기체를 순찰하고 선천성 면역 반응과 적응 면역 반응을 연결하여 면역 체계 내에서 독특한 역할을 합니다. 이 세포는 식세포화한 다음 포획된 항원을 이펙터 면역 세포에 제시하여 다양한 범위의 면역 반응을 유발할 수 있습니다. 이 논문은 소 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 분리된 소 단핵구 유래 수지상 세포(MoDC)의 시험관 내 생성을 위한 표준화된 방법과 백신 면역원성 평가에 대한 적용을 보여줍니다.

자기 기반 세포 분류를 사용하여 PBMC에서 CD14+ 단핵구를 분리하고, 완전한 배양 배지에 인터루킨(IL)-4를 보충하고 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)를 사용하여 CD14+ 단핵구가 나이브 MoDC로 분화되도록 유도했습니다. 미성숙 MoDC의 생성은 주요 조직적합성 복합체 II(MHC II), CD86 및 CD40 세포 표면 마커의 발현을 검출하여 확인되었습니다. 상업적으로 이용 가능한 광견병 백신을 사용하여 미성숙 MoDC를 펄싱했으며, 이후 나이브 림프구와 공동 배양되었습니다.

항원 펄스 MoDC와 림프구 공동 배양의 유세포 분석은 Ki-67, CD25, CD4 및 CD8 마커의 발현을 통한 T 림프구 증식의 자극을 밝혀냈습니다. 정량적 PCR을 사용하여 IFN-γ 및 Ki-67의 mRNA 발현을 분석한 결과, MoDC가 이 시험관 내 공동 배양 시스템에서 림프구의 항원 특이적 프라이밍을 유도할 수 있음을 보여주었습니다. 또한, ELISA를 사용하여 평가된 IFN-γ 분비는 비항원 펄스 MoDC-림프구 공동 배양보다 광견병 백신 펄스 MoDC-림프구 공동 배양에서 유의하게 더 높은 역가(**p < 0.01)를 보였다. 이러한 결과는 백신 면역원성을 측정하기 위한 이 시험관 내 MoDC 분석의 타당성을 보여주며, 이는 이 분석이 생체 내 시험을 진행하기 전에 소에 대한 잠재적인 백신 후보를 식별하는 데 사용될 수 있을 뿐만 아니라 상용 백신의 백신 면역원성 평가에서도 사용될 수 있음을 의미합니다.

Introduction

수의학 예방 접종은 전 세계적으로 가축 부문에 영향을 미치는 질병에 대한 보호를 제공함으로써 식량 안보와 동물 복지 개선에 기여하기 때문에 축산 및 건강의 중요한 측면을 나타냅니다1. 가능한 백신 후보의 면역원성을 평가하는 효과적인 시험관 내 방법은 백신 개발 및 생산 과정을 가속화하는 데 도움이 될 것입니다. 따라서 시험관 내 연구를 기반으로 한 혁신적인 방법론으로 면역 분석 분야를 확장하는 것이 필요하며, 이는 예방 접종 및 병원체 감염과 관련된 면역 과정의 복잡성을 밝히는 데 도움이 될 것입니다. 현재, 주기적인 샘플링(예: 혈액 및 비장)이 필요한 생체 내 동물 면역화 및 챌린지 연구는 후보 백신 및 보조제의 면역원성을 측정하는 데 사용됩니다. 이러한 분석은 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸리며 윤리적 의미가 있는데, 대부분의 경우 동물 안락사는 시험이 끝날 때까지 수행되기 때문입니다.

생체 내 분석의 대안으로 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 사용하여 시험관 내백신 유도 면역 반응을 평가했습니다 2. PBMC는 70%-90% 림프구, 10%-20% 단핵구 및 제한된 수의 수지상 세포(DC, 1%-2%)로 구성된 이질적인 세포 집단입니다3. PBMC에는 B 세포, 단핵구 및 DC와 같은 항원 제시 세포(APC)가 있어 감염이나 조직 손상의 징후를 찾기 위해 유기체를 지속적으로 순찰합니다. 국소 분비된 케모카인은 세포 표면 수용체에 결합하여 이러한 부위에 대한 APC의 모집 및 활성화를 촉진합니다. 단핵구의 경우, 케모카인은 DC 또는 대식세포로 분화하도록 운명을 지시한다4. DC는 병원체를 만나 포획하자마자 이차 림프 기관으로 이동하여 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 I 또는 클래스 II 표면 단백질을 사용하여 처리된 병원체 펩타이드 항원을 각각 CD8+ T 세포 또는 CD4+ T 세포에 제시하여 면역 반응을 유발할 수 있습니다 5,6.

다양한 병원체에 대한 보호 면역 반응을 조율하는 데 있어 DC가 수행하는 핵심 역할은 특히 감염원에 대한 백신 및 보조제를 설계할 때 세포 내 면역 메커니즘을 이해하기 위한 흥미로운 연구 대상이 됩니다7. PBMC로부터 얻을 수 있는 DC의 비율이 다소 작기 때문에(1%-2%), 대신 단핵구가 시험관 내에서 DC를 생성하는 데 사용되었습니다 8. 이러한 단핵구 유래 DC(MoDC)는 암 면역요법에서 가능한 치료 전략으로 처음 개발되었다9. 최근에는 MoDC가 백신 연구에 사용되었으며(10,11,12), 고전적 단핵구(monocyte)가 MoDC 생산의 주요 아형(89%)이다 13. 시험관 내에서 MoDC의 생산은 이전에 인터루킨-4(IL-4), 종양 괴사 인자 α(TNF-α) 또는 IL-13과 같은 다른 사이토카인과 함께 제공되는 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)의 첨가를 통해 달성되었습니다 14,15,16.

in vitro MoDC 분석의 성공 여부는 항원 자극 성숙 MoDC가 검출된 항원 유형에 특이적인 면역 반응의 범위와 유형을 조절하는 능력에 달려 있다17. MoDC에 의해 인식되고 제시되는 병원체의 유형은 CD4+ T 헬퍼(Th) 세포를 Th1, Th2 또는 Th17 이펙터 세포로 분화하는 것을 결정하며 병원체 특이적 분비 사이토카인 프로파일을 특징으로 합니다. Th1 반응은 세포 내 병원체에 대해 유도되어 식세포 의존성 보호를 조절하는 인터페론-감마(IFN-γ) 및 종양 괴사 인자 베타(TNF-β)의 분비를 초래합니다. Th2 반응은 기생 유기체에 대해 유발되며 IL-4, IL-5, IL-10 및 IL-13 분비를 특징으로 하며, 이는 식세포 독립적인 체액 보호를 시작합니다. Th17은 IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 및 TNF-α 18,19,20,21의 분비에 의해 매개되는 세포외 박테리아 및 진균 감염에 대한 호중구 의존성 보호를 제공한다. 이전 연구에 따르면 모든 병원체가 예상되는 사이토카인 프로필에 속하는 것은 아닙니다. 예를 들어, 리슈만편모충 기생충 감염에 대한 반응으로 피부 MoDC는 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포에서 IFN-γ 분비를 자극하여 보호 전염증 Th1 반응을 유도한다22.

또한 살모넬라 지질다당류(LPS)로 프라이밍된 닭 MoDC에서 Th1 및 Th2 반응을 모두 활성화하여 살모넬라 티피뮤리움에 대한 가변 반응을 유도할 수 있는 반면, 살모넬라 갈리나룸은 Th2 반응만 유도하여 MoDC 클리어런스23에 대한 후자의 더 높은 내성을 설명할 수 있습니다. 브루셀라 캐니스(Brucella canis, B. canis)에 대한 MoDC의 활성화는 개와 인간 MoDC 모두에서 보고되었으며, 이는 이것이 인수공통전염병 감염 메커니즘을 나타낼 수 있음을 의미한다24. B. canis로 프라이밍된 인간 MoDC는 중증 감염에 대한 내성을 부여하는 강력한 Th1 반응을 유도하는 반면, 개 MoDC는 감소된 Th1 반응으로 지배적인 Th17 반응을 유도하여 만성 감염을 확립합니다25. 소 MoDC는 비접합 FMDV 단독에 비해 면역글로불린 G(IgG)와 결합된 구제역 바이러스(FMDV)에 대해 향상된 친화력을 보여주며, 이는 MoDC가 전자에 반응하여 바이러스-항체 복합체를 형성하기 때문입니다10. 종합하면, 이러한 연구는 병원체 감염 중 면역 반응의 복잡성을 분석하기 위해 MoDC가 어떻게 사용되었는지 보여줍니다. 적응 면역 반응은 림프구 증식과 관련된 특정 마커의 정량화에 의해 평가될 수 있다. 분열하는 세포에서만 검출되는 세포내 단백질인 Ki-67은 증식 연구의 신뢰할 수 있는 마커로 간주되며26, 유사하게, 활성화의 후기 단계 동안 T 세포 표면에서 발현되는 CD25는 림프구 증식에 해당합니다27,28.

이 연구는 백신의 면역원성을 테스트하는 데 사용되는 체외 면역 분석에 적용한 후 소 MoDC의 시험관 내 생성을 위한 표준화된 방법을 보여줍니다. 이 분석의 효능을 검증하기 위해 상업적으로 이용 가능한 광견병 백신(RV)을 사용했습니다. T 림프구 활성화 및 증식은 Ki-67 및 CD25와 같은 잘 확립된 세포 활성화 마커의 분석과 IFN-γ 28,29,30,31의 분비를 통해 유세포 분석, 실시간 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR) 및 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)으로 측정되었습니다. MoDC 분석 중에는 동물 또는 인간 실험 시험이 수행되지 않습니다.

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Protocol

채혈은 오스트리아 보건식품안전청(AGES)의 윤리 가이드라인과 동물복지 기준32에 따라 공인된 수의사에 의해 수행됩니다. 이 연구는 오스트리아 농무부로부터 윤리적 승인을 받았습니다. MoDC 생성 및 후속 적용을 위한 실험 설계는 그림 1에 나와 있습니다.

1. 순진한 MoDC의 생산

참고: 전혈 샘플은 헤파린화된 진공제를 사용한 경정맥 천자에 의해 병원체가 없는 단일 송아지에서 얻었습니다(이 연구에는 8개의 9mL 혈액 튜브가 사용됨). 아이스 박스에 혈액을 운반하십시오. 나중에 사용할 수 있도록 샘플을 2-4 °C에서 보관하거나 즉시 처리하십시오. 혈액 응고를 피하기 위해 혈액을 계속 회전시키십시오. 진공 청소기를 70 % 에탄올로 소독하십시오. 다음의 모든 실험은 하나의 생물학적 샘플과 6개의 기술 복제물로 수행되었습니다.

  1. 헤파린화된 혈액에서 PBMC를 분리하기 위한 밀도 구배 원심분리
    1. 혈액을 10 배 뒤집어 잘 섞는다.
    2. 10mL 피펫을 사용하여 헤파린화된 혈액 20mL를 멸균된 50mL 튜브로 옮기고 10mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 희석합니다.
    3. 림프구 분리 배지 15 mL를 멸균된 50 mL 튜브에 피펫팅한다.
      참고: 피펫팅 전에 림프구 분리 배지가 실온에 도달하도록 합니다.
    4. 림프구 분리 배지가 들어 있는 50mL 튜브를 45° 위치로 기울입니다. 25mL 피펫의 끝을 수직으로 가리키고 30mL의 혈액-PBS를 혼합하지 않고 림프구 분리 배지 위에 조심스럽게 겹칩니다. 아주 천천히 50mL 튜브를 수직 위치로 되돌립니다.
    5. 800 × g 에서 35 분 동안 20 ° C에서 최대 가속 및 제동 없음으로 원심 분리합니다 (감속 기능 꺼짐).
    6. 파스퇴르 피펫을 사용하여 PBMC 층(혈장의 첫 번째 층 바로 뒤에 있는 얇은 흰색 층)을 수집하고 새 50mL 튜브로 옮깁니다.
      참고: 밀도 구배 원심분리는 전혈을 다른 층으로 분리합니다. 그 결과, 적혈구는 펠릿으로 바닥에 침전되고, 단핵 세포 (PBMC)는 계면층에 침전되고, 혈장은 최상층을 형성한다. 과립구는 펠릿과 PBMC 층 사이에서 발견됩니다.
    7. PBS를 40mL 부피까지 첨가하고 위아래로 피펫팅하여 완전히 혼합하여 수확된 PBMC를 2배 세척합니다. 그런 다음 4°C에서 500× g 에서 7분 동안 최대 가속 및 최대 감속으로 원심분리합니다.
    8. 경사 분리에 의해 상청액을 버리고, 펠릿을 1x 염화 암모늄 칼륨 (ACK) 완충액 15 mL에 재현탁하고, 실온에서 10-15 분 동안 배양한다.
      참고: 15분 이상 배양하지 마십시오. 시판되는 ACK 완충액은 PBMC 분획에 존재하는 잔류 적혈구(RBC)의 용해를 보장하기 위해 사용됩니다.
    9. PBS를 최대 40mL 부피까지 첨가한 다음 500× g 및 4°C에서 최대 가속 및 감속으로 7분 동안 원심분리합니다.
    10. 디캔팅하여 상층액을 버리고 1.1.9단계를 반복합니다.
    11. 상청액을 버리고 펠렛을 10mL의 완전 배양 배지(실온에서)에 재현탁합니다.
      참고: 전체 배양 배지는 10% 소 태아 혈청(FBS)과 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 RPMI 1640 세포 배양 배지로 구성됩니다.
  2. CD14 결합 마그네틱 비드를 사용하여 PBMC 집단에서 CD14+/- 세포의 자기 분리
    1. 10μL의 트리판 블루(0.4%) 용액과 혼합된 10μL의 세포 현탁액을 사용하여 깨끗한 혈구계 세포 계수기로 세포를 계수합니다.
      알림: 트리판 블루 염료는 독성 화학 물질이며 잠재적인 발암 물질입니다. 접촉을 피하기 위해 개인 보호 장비(PPE)를 착용한 상태에서 취급해야 하며, 폐기물은 밀폐된 특수 유독성 폐기물 용기에 버려야 합니다. 죽은 세포는 파란색으로 보이지만 살아있는 세포는 현미경으로 선명하게 보입니다.
    2. 500 × g에서 7 분 동안 원심 분리기.
    3. 피펫을 사용하여 상청액을 버리고, 1 ×10 7 세포마다 40 μL의 부피를 사용하여 형광 활성화 세포 분류 완충액(FACS)에 펠렛을 재현탁한다. 피펫을 사용하여 철저히 혼합하십시오.
      참고: FACS 버퍼는 PBS에 용해된 2% FBS와 2mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)으로 구성됩니다.
    4. 1 × 107 세포당 5 μL의 CD14 마이크로비드 완충액을 첨가하고, 피펫을 사용하여 완전히 혼합한다.
    5. 소 CD14+ 단핵구의 양성 선택을 위해 4-8°C에서 30분 동안 배양합니다33. 잠복기 동안 15 분마다 소용돌이.
    6. 선택적 단계(유세포 분석용): CD14-FITC(플루오레세인 이소티오시아네이트) 염색 항체 10μL를 추가하고 4-8°C에서 15분 동안 후속 배양합니다. 자세한 내용은 5단계의 유세포 분석을 참조하십시오.
    7. 1mL의 FACS 완충액을 첨가하고 500× g에서 7분 동안 원심분리합니다.
    8. 상청액을 버리고, 펠렛을 1 ×8 세포 당 500 μL의 FACS 완충액에 재현탁시킨다.
    9. 면역자기 세포 분리 컬럼을 분리기(마그네틱 컬럼 홀더)에 삽입하고 플로우 스루를 수집하기 위한 컬럼 출구 아래에 15mL 수집 튜브를 놓습니다.
    10. 1mL의 탈기된 FACS 완충액으로 컬럼을 세척합니다. 헹군 후 사용한 15mL 튜브를 새 것으로 교체하십시오.
    11. 한 번에 500 μL의 완충액에 1 ×10 8 개의 세포를 피펫팅하여 세포 현탁액(단계 1.2.8)이 컬럼을 통과하도록 합니다.
      알림: 셀이 컬럼을 통과하도록 하기 전에 혼합하는 동안 기포가 발생하지 않도록 주의하십시오.
    12. 매번 3mL의 탈기된 FACS 완충액으로 컬럼을 3배 헹굽니다.
    13. 유동을 수집하고 이 첫 번째 용출된 분획을 CD14- 세포 분획(PBMC - CD14+ 단핵구)으로 표시합니다. 이것은 나이브 림프구 분획이라고도 합니다.
      참고: CD14- 세포는 항원 펄스 MoDC가 생성될 때까지 완전한 배양 배지에서 유지됩니다.
    14. 구분 기호에서 열을 제거합니다.
    15. 폐수 수집을 위해 컬럼 아래에 새 멸균 15mL 튜브를 놓습니다.
    16. 5 mL의 FACS 완충액을 컬럼 내로 피펫팅하고, 즉시 플런저를 사용하여 밀어 넣었다.
    17. 플로우 스루를 수집하고 이 두 번째 용출된 분획을 CD14+ 세포 분획으로 라벨링합니다. 이것은 나이브 단핵구 분획이라고도합니다.
    18. 수확된 CD14+ 단핵구에 완전한 배양 배지를 추가하여 1 ×10 6 cells/mL를 얻습니다.
      참고: 용출된 CD14+ 세포 분획에서 살아있는 세포를 계수하여 원하는 세포 수를 얻는 데 필요한 완전한 배양 배지의 부피를 추정합니다.
    19. 멸균된 24웰 플레이트를 취하여 각 웰에 1mL의 세포 현탁액(1 × 106 cells/mL)을 추가합니다.
  3. 총 5일의 배양과 함께 3% w/v 사이토카인 칵테일(GM-CSF + IL-4)을 추가하여 CD14+ 나이브 단핵구를 나이브 MoDC로 분화
    1. CD14+ 단핵구가 포함된 각 웰에 키트에 제공된 사이토카인 칵테일 40μL(3% w/v)를 보충합니다.
    2. 플레이트를 5%CO2 및 37°C에서 48시간 동안 가습된 인큐베이터에서 인큐베이션한다.
    3. 2일째에 피펫을 사용하여 각 웰 함량의 절반(500μL)을 개별 1.5mL 튜브로 옮기고 4°C에서 500× g 에서 7분 동안 원심분리합니다.
    4. 상청액을 버리고 펠렛을 500 μL의 신선하고 완전한 배양 배지에 재현탁합니다.
    5. 이 세포 현탁액 500μL를 단계 1.3.4에서 각 지정된 웰로 다시 옮겨 최종 부피가 1mL가 되도록 합니다.
    6. 각 웰을 20μL의 사이토카인 칵테일로 풍부하게 합니다.
    7. 배양물을 5% CO2 및 37°C의 가습된 인큐베이터에서72 시간 동안 인큐베이션한다.
    8. 5 일째에 배양 한 후 인큐베이터에서 플레이트를 제거합니다.
      참고: 각 웰에는 순진한 MoDC의 세포 현탁액 1mL가 들어 있습니다. MoDC의 수는 도금된 원래 단핵구의 백분율(~20%)이 될 것입니다(1 × 106/mL).

2. MoDC endocytic 활성 분석

참고: 항원 흡수 분석 또는 세포내 활성 분석은 이물질을 내재화하는 순진한 MoDC의 능력을 측정합니다. 앞서 설명한 바와 같이, 3% w/v 사이토카인 칵테일 및 5일간의 배양으로 배양된 나이브 MoDC를 사용하여 분석을 수행한다34.

  1. 24-웰 플레이트로부터 나이브 MoDC 세포 현탁액을 수확하고, 이를 15 mL 튜브로 옮기고; 또한 PBS로 웰을 헹구어 잔류 세포를 수집합니다.
  2. 7분 동안 500 ×g 의 원심분리기. 상층액을 버리고, 1% FBS가 보충된 배양액 1mL에 펠렛을 재현탁한다.
  3. 살아있는 MoDC 세포를 계수하여 원하는 세포 수(2 × 105 cells/mL)를 달성하는 데 필요한 배지의 부피를 추정합니다.
  4. 최종 세포 농도가 2 ×10 5 cells/mL인 24웰 플레이트에서 완전한 배양 배지 100μL에서 나이브 MoDC를 배양합니다.
  5. 각 웰에 1mg/mL FITC 복합 덱스트란(엔도사이토시스 추적자로 사용되는 형광 프로브)을 보충합니다.
    참고: FITC-덱스트란은 형광 프로브 역할을 하며 엔도사이토시스 추적자로 사용됩니다.
  6. 플레이트를 덮고, 5%CO2 및 37°C의 암실에서 60분 동안 인큐베이션한다.
    참고: 백그라운드 제어의 경우 얼음 위에서 1mg/mL FITC-덱스트란과 함께 추가 MoDC 세포(2 × 105 cells/mL)를 배양합니다.
  7. 배양 후 즉시 24웰 플레이트를 얼음 위에 옮겨 FITC-덱스트란의 엔도사이토시스를 중지합니다.
  8. 얼음처럼 차가운 FACS 완충액으로 세포를 세척하십시오.
  9. 펠릿을 수확하고, 원심분리하고, 500 μL의 FACS 완충액에 재현탁시킨다.
  10. 유세포 분석을 사용하여 세포 내 FITC-dextran의 형광 강도를 분석합니다. 자세한 내용은 5.2단계의 유세포 분석 분석을 참조하십시오.

3. 항원 펄스 MoDC의 생성

참고: 광견병 바이러스(RV)에 대한 상업적으로 이용 가능하고 임상적으로 승인된 백신은 순진한 MoDC를 성숙한 항원 제시 MoDC로 분화하도록 유도할 수 있습니다. 단일 RV 백신 접종 용량의 0.1%(~1μL)를 사용하여 항원 펄스 MoDC를 생성합니다. 또한, 나이브 MoDC를 생성하기 위해 사용된 것과 동일한 배양 플레이트(단계 1.3.8에서)에서 RV-펄스 MoDC를 생산하는 것이 바람직한데, 이는 나이브 MoDC를 새로운 24웰 플레이트로 옮기는 것이 그들에게 부정적인 영향을 미치기 때문이다.

  1. 단계 1.3.8)에서 RV 현탁액 1μL/mL를 24웰 플레이트의 나이브 MoDC 배양액 1mL에 넣고 5%CO2 및 37°C에서 48시간 동안 배양합니다.
    참고: RV 자극 없이 배양된 Naive MoDC는 배경 대조군으로 사용됩니다(다음 단계에서 림프구와의 공동 배양을 위한 비특이적 자극).
  2. 인큐베이션 후, 7일째에, 항원-펄스된 MoDC를 함유하는 24-웰 플레이트를 10분 동안 얼음 위에 보관한다.
  3. 웰 당 얼음처럼 차가운 PBS 1mL를 추가합니다. 피펫팅으로 각 웰을 완전히 혼합하고 현탁액을 15mL 튜브로 옮깁니다.
  4. 웰을 2mL의 얼음-차가운 PBS로 세척하여 각 웰 내에 남아 있는 잔류 세포를 수집한다.
  5. 내용물을 각각의 튜브로 옮기고 세포 현탁액을 500 × g 에서 7 분 동안 원심 분리합니다.
  6. 상층액을 버리고 세포 펠릿(항원 펄스 MoDC)을 완전한 배양 배지에 재현탁하고 부피를 1 ×10 5 cells/mL의 최종 세포 농도로 조정합니다.
    알림: 원하는 세포 수를 얻는 데 필요한 배지의 부피를 추정하기 위해 살아있는 세포를 계산합니다. MoDC-림프구 공동 배양 시스템을 위해 7일차부터 RV 펄스 MoDC를 사용합니다.

4. MoDC-림프구 공배양

참고: 시험관 내 MoDC-림프구 공동 배양 시스템은 항원 특이적 림프구를 프라이밍하는 MoDC의 능력을 결정합니다. 16일간의 공동 배양 후 세포의 상이한 처리 그룹에는 특이적, 비특이적 및 대조군이 포함된다. 특정 그룹은 RV-펄스 MoDC와 공동 배양된 림프구로 정의됩니다. 비특이적 그룹은 비항원 펄스 MoDC와 공동 배양된 림프구로 정의됩니다. 대조군은 MoDC 없이 배양된 림프구로 정의됩니다.

  1. 용출된 나이브 림프구 분획(CD14- 세포)에 완전한 배양 배지를 추가하여 2 ×10 6 cells/mL의 세포 농도를 달성합니다.
    참고: 원하는 세포 수를 달성하는 데 필요한 배지의 부피를 추정하기 위해 수집 이후 24웰 플레이트의 완전한 배양 배지에서 유지된 CD14- 세포 배양액의 살아있는 세포를 계산합니다.
  2. 7일째에 멸균된 24웰 플레이트를 채취하여 1mL의 나이브 림프구 세포 현탁액(2 × 106 cell/mL)과 1mL의 항원 펄스 또는 비항원 펄스 MoDC 현탁액(1 × 105 cell/mL)으로 웰에 시딩합니다.
    참고: 각 웰의 총 부피는 웰당 림프구에 대한 1:20 MoDC의 비율로 2mL입니다.
  3. 플레이트를 37°C 및 5%CO2에서 48시간 동안 인큐베이션한다.
  4. 항원 펄스 MoDC를 사용한 배양 강화 및 재자극
    1. 항원 펄스 MoDC-림프구 공동 배양 후 9일째에 각 웰에 20ng/mL 재조합 IL-2를 보충하고 추가 120시간(5일 배양) 동안 계속 배양합니다.
    2. 14일째에, 공배양물 1 mL를 멸균된 1.5 mL 튜브로 옮기고, 500 × g 에서 7분 동안 원심분리한다.
    3. 상층액을 버리고 1mL의 항원 펄스 또는 비펄스 MoDC(1 ×10 5 cell/mL)로 세포 펠릿을 재현탁합니다. 피펫팅으로 부드럽게 혼합하고 세포 현탁액을 지정된 웰로 다시 옮깁니다.
      참고: 이 단계에서 각 웰의 총 부피는 2mL입니다.
    4. 5%CO2 및 37°C에서 48시간 동안 인큐베이션을 계속한다. 16일째에 배양한 후, 공동-배양은 유세포 분석, qPCR 및 ELISA를 사용하여 분석을 위해 준비된다.
      참고: MoDC-림프구 공동 배양의 각 웰에서 2mL마다 1mL의 재현탁 세포를 유세포 분석을 위해 염색하고, 1mL를 RNA 추출에 사용하고, 두 세포의 상층액을 ELISA에 사용합니다.

5. 유세포 분석

참고: 유세포 분석기에서 샘플을 실행하기 전에 적절한 마커/mAb로 세포를 염색하십시오. 유세포 분석에 사용되는 시약(염색 mAb 및 이소타입 대조군), 키트, 기기 및 소프트웨어에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

  1. 유세포 분석기 염색 프로토콜
    참고: 항-CD14 mAb를 사용하여 PBMC, 나이브 림프구 및 단핵구에 대한 세포 표면 염색을 수행합니다(단계 1.2.6). 나이브 MoDC의 세포 표면 염색을 위해 항-CD86 특이적, 항-CD40-특이적 및 항-MHC II 특이적 mAb를 사용하십시오. 16일째 공동 배양된 세포의 세포 표면 염색을 위해 항-CD4, 항-CD8, 항-CD25 mAb를 사용하십시오. 세포내 염색을 위해 항-Ki-67 mAb를 사용하십시오. 또한, 음성 이소타입 대조군 mAb 또는 mAb 없이 세포를 염색합니다(FMO: 형광 마이너스 1). 표면 및 세포 내 마커에 대한 염색의 주요 차이점은 세포 표면 마커의 경우 L/D(Live/Dead) 염색 또는 기타 공정 전에 특정 표면 mAb로 세포를 염색해야 한다는 것입니다. 그러나 세포 내 염색은 L/D 염색 후에 수행되며 세포 내 침투를 허용하기 위해 고정과 투과화 단계가 필요합니다.
    1. 세포 현탁액 1 mL를 피펫을 사용하여 멸균된 1.5 mL 튜브로 옮기고, 500 × g에서 10분 동안 원심분리하였다.
      참고: 원심분리 후 MoDC-림프구 공동 배양에서 세포를 처리할 때 ELISA 분석을 위해 상청액을 저장합니다.
    2. 펠릿을 PBS 1mL에 재현탁하고 15mL 튜브로 옮깁니다. 1mL의 PBS를 사용하여 잔류 세포를 수집하고 이를 재현탁된 펠릿과 결합합니다.
    3. 세포를 함유하는 15 mL 튜브에 10 mL의 PBS를 첨가하고, 피펫팅에 의해 혼합하고, 850 x g에서 7분 동안 원심분리한다.
    4. 상청액을 버리고 5.1.3 단계를 반복하십시오.
    5. 상층액을 버리고 상층액을 디캔팅한 후 남은 잔류 현탁액(약 180μL)으로 세포 펠릿을 조심스럽게 재현탁합니다.
    6. 세포 현탁액을 v-바닥 96-웰 플레이트로 옮기고, 유출을 피하기 위해 웰을 밀봉한다.
    7. 플레이트를 1,400 × g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 접시를 폐기물 용기 위로 튕겨 액체의 우물을 비우고 흡수지에 접시를 두드려 과도한 액체를 제거합니다.
    8. 웰당 표면 염색 마스터 믹스 25μL를 추가하고 피펫을 사용하여 부드럽게 혼합한 다음 4°C에서 30분 동안 배양합니다.
      참고: 단일 웰에 대한 표면 염색 마스터 믹스를 준비하려면 2.5μL의 표면 mAb를 20μL의 FACS 버퍼에 추가합니다.
    9. 웰 당 200 μL의 FACS 완충액을 첨가하고, 1,400 × g 에서 5 분 동안 원심분리한다. 원심분리 후 디캔팅하여 액체의 웰을 비우고 흡수지에 플레이트를 두드려 과도한 액체를 제거합니다.
    10. 웰당 100 μL의 L/D 염색 용액을 추가합니다. 피펫을 사용하여 완전히 혼합한 다음, 4°C에서 암실에서 15분 동안 인큐베이션하였다.
      참고: 단일 웰의 경우 0.25μL의 L/D 염료를 100μL의 FACS 완충액에 녹입니다. L/D 염료는 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별하는 데 도움이 됩니다.
    11. 100μL의 FACS 버퍼를 추가합니다. 웰을 뚜껑으로 덮고 플레이트를 1,400× g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 디캔팅하여 상층액을 버리고 흡수지에 플레이트를 두드립니다.
    12. 5.1.11단계를 반복합니다.
    13. 웰당 50μL의 고정 용액(키트와 함께 제공됨)을 추가하고 플레이트를 실온에서 암실에서 10분 동안 배양하기 전에 피펫과 혼합합니다.
    14. 키트와 함께 제공된 1x 투과-세척 완충액(PW) 150μL를 추가하고 웰을 뚜껑으로 덮습니다.
      참고: 10mL의 1x PW 완충액을 준비하려면 1mL의 dH2O에 10mL의 10x perm 완충액을 희석합니다.
    15. 플레이트를 1,400 × g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리한다. 디캔팅하여 상층액을 버리고 흡수지에 플레이트를 두드립니다.
    16. 200 μL의 1x PW를 첨가한 후, 4°C에서 5분 동안 1,400 × g 에서 원심분리하였다. 디캔팅하여 상층액을 버리고 흡수지에 플레이트를 두드립니다.
    17. 세포내 염색을 위해 웰당 25μL의 세포내 염색 마스터 믹스(항-인간 Ki-67 mAb)를 추가합니다. 잘 섞고, 플레이트를 4°C에서 또는 어두운 곳에서 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션한다.
      참고: 단일 웰에 대한 세포내 염색 마스터 믹스를 준비하려면 1μL의 Ki-67 mAb를 24μL의 1x PW에 추가합니다. 세포내 염색 마커는 16일째 동시 배양된 세포를 처리할 때만 사용됩니다. PBMC, 나이브 림프구, 단핵구 및 나이브 MoDC를 처리하는 동안에는 세포내 염색이 수행되지 않습니다.
    18. 배양 후 각 웰에 1x PW 200μL를 추가합니다. 피펫으로 혼합하고 5분 동안 1,400× g 의 원심분리기를 만듭니다. 디캔팅하여 상층액을 버리고 흡수지에 플레이트를 두드립니다.
    19. 200μL의 FACS 완충액을 추가한 후 1,400× g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 디캔팅하여 상층액을 버리고 흡수성 종이에 접시를 두드립니다.
    20. 세포 펠릿을 200μL의 FACS 완충액에 재현탁하고 각 웰의 내용물을 별도의 멸균 유세포 분석기 튜브로 옮깁니다. 웰당 300 μL의 FACS 완충액을 사용하여 잔류 세포를 수집한다. 이제 세포는 유세포 분석을 위한 준비가 되었습니다.
  2. 유세포 분석기에서 시료 실행
    참고: 샘플은 제조업체 설명서에 따라 유세포 분석기(488nm, 638nm 및 405nm 레이저 사용)에서 실행되었습니다35. 프로토콜에 대한 자세한 내용, 문제 해결 및 사용자 정의에 대해서는 설명서를 참조하십시오.
    1. 샘플을 읽기 전후에 일상적인 세척 절차를 수행하십시오.
      알림: 기기에 튜브를 장착하는 동안 위치를 건너뛰지 마십시오.
      1. 세척 사이클의 경우 총 4 개의 튜브를 사용하며, 첫 번째 튜브에는 유동 세척 시약이 들어 있고 나머지 3 개의 튜브에는 dH2O가 들어 있습니다. 각 튜브에는 3mL가 있습니다. 세척 실행 중에 측면 산란(SSC)의 경우 265V에 대해 FSC(Forward Scatter)의 경우 330V에서 튜브당 100,000개의 이벤트를 캡처하여 약 1분 동안 중간 유량으로 데이터를 수집합니다.
        알림: 청소하는 동안 파편이나 세포 현상이 보고되어서는 안 됩니다. 이 경우 청소 단계를 다시 수행하십시오. s를 실행하기 위해amples, 모든 s가 있는지 확인하십시오.amp정확한 판독을 보장하기 때문에 데이터를 수집하기 전에 les가 균질한 현탁액에 있습니다.
    2. 유세포분석기를 연결하고 전원을 켜려면 제목 표시줄의 왼쪽 모서리에 있는 응용 프로그램 버튼을 클릭합니다. 응용 프로그램 드롭다운 메뉴에서 Cytometry 옵션을 선택하고 Power On 옵션을 클릭합니다.
      참고: 애플리케이션 드롭다운 메뉴에서 열기 옵션을 사용하면 사전 프로그래밍된 분석을 탐색할 수 있고 새 프로토콜 옵션을 사용하면 새 프로토콜을 생성할 수 있습니다.
    3. 처음에는 음성 대조군 을 로드합니다.amp다중 튜브 홀더에 있습니다. 새 프로토콜을 선택하고 작업 공간/화면 왼쪽에 있는 작업 목록을 관찰합니다.
    4. 작업 목록에서 s의 위치를 정의amp다중 튜브 홀더에서 s와 식별을 위해 le 및 프로토콜에 이름을 지정합니다.
    5. 작업 공간의 왼쪽에 있는 하드웨어 패널에서 검출기(FSC, SSC 및 10개의 형광 범위), 광전자 증배관의 전압(V) 및 이득, 신호의 면적-높이-너비(AHW)와 같은 여러 매개변수를 조정하고 선택합니다.
      알림: 검출기에 대한 다음 설정은 사용된 실험 및 기기에 따라 선택되었습니다: FSC-AHW: AHW, V: 270, G: 5; SSC-AHW: A, V: 350, G: 10; FL1 (CD8/FITC 덱스트란)-AHW: A, V: 400, G: 1; FL2 (CD25/PE)-AHW: A, V: 500, G: 1; FL6 (CD4 / Alexa Fluor 647) -AHW : A, V : 700, G : 1; FL7 (Ki-67 / Alexa Fluor 700) -AHW : A, V : 625, G : 1; FL9 (L/D)-AHW: A, V: 425, G: 1.
    6. 제목 표시줄 아래에 있는 기기 획득 제어판에서 감지하려는 유량(중간), 시간(5분) 및 이벤트(5.2.8단계 참조)에 대한 옵션을 조정합니다. Acquire Single(단일 획득) 옵션을 클릭하면 기기가 샘플을 그리거나 실행하고 감지된 이벤트의 실시간 미리보기를 표시할 수 있습니다.
    7. 실시간 미리보기에서 형광 임계값 (전압 및 게인)과 세포 크기를 조정하여 세포 파편을 배제하면서 원하는 세포 집단 주위에 게이트를 그립니다.
      참고: FSC는 크기를 기준으로 세포를 구별하는 데 도움이 되므로 사용자가 단핵구 및 림프구와 같은 면역 체계의 세포를 구별할 수 있습니다. 단핵구는 림프구에 비해 더 크고 더 높은 FSC 강도를 나타냅니다.
    8. 약 5,000개의 살아있는 MoDC, 50,000개의 살아있는 림프구 및 50,000개의 살아있는 단핵구 이벤트를 획득합니다.
    9. 음성 대조군 샘플을 참조하여 모든 매개변수가 조정되면 Stop(중지)을 클릭하고 프로토콜을 저장합니다.
    10. 이제 모든 샘플을 멀티 튜브 로더에 로드합니다. 작업 목록에서 각 샘플을 정의하고 음성 대조군을 참조하여 조정된 매개 변수를 실험 내의 모든 샘플에 적용합니다. 획득 옵션을 클릭하여 실험의 모든 샘플을 연속적으로 실행할 수 있도록 합니다.
    11. 모든 샘플에서 데이터를 수집한 후에는 순차적 이중 모수 및 단일 모수 히스토그램을 생성할 수 있는 적절한 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 저장 및 판독 가능한 데이터로 변환합니다.

6. 메신저 RNA(mRNA) 발현 분석

  1. RNA 추출
    참고: 항원 펄스 MoDC-림프구 공동 배양(특이적), 비항원 펄스 MoDC-림프구 공동 배양(비특이적), MoDC가 없는 림프구 배양(대조군) 및 나이브 림프구(CD14- 공동 배양 전에 분리된 세포). RNA 추출을 위해 RNase가 없는 물을 사용하여 에탄올을 준비합니다. 추출 키트 및 시약에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
    1. MoDC-림프구 공동 배양 플레이트(~1 ×10 6 cells/mL)에서 세포 현탁액 1mL를 피펫을 사용하여 멸균된 1.5mL 멸균 튜브로 옮기고 500×g에서 10분 동안 원심분리합니다.
    2. ELISA를 위해 상청액을 저장합니다. 세포 펠릿을 PBS 1mL에 재현탁하고 15mL 튜브로 옮깁니다. 1mL의 PBS를 사용하여 잔류 세포를 수집합니다.
    3. 500 × g에서 10 분 동안 원심 분리기.
      알림: 모든 샘플은 키트에 제공된 용해 완충액을 사용하여 세포 용해가 수행될 때까지 살아있는 세포로 섬세하게 다루어야 합니다. 세포 사멸은 다운스트림 정량화에 필요한 RNA 주형을 빠르게 가수분해하는 RNase를 방출합니다. RLT 완충액은 RNase를 억제하는 용액에서 세포를 용해합니다.
    4. 350 μL의 용해 완충액을 각각의 빈 웰에 첨가하고, 2-3분 동안 인큐베이션하여 이전 단계에서 수확되지 않은 부착 세포를 용해시켰다.
    5. 단계 6.1.3에서 원심분리가 완료되면 상층액을 버리고 6.1.4단계에서 첨가된 용해 완충액 350μL와 세포 펠릿을 결합합니다.
      참고: 이 시점에서 튜브를 -80°C에서 보관하거나 RNA 추출을 진행할 수 있습니다(다음 단계).
    6. 단계 6.1.5의 용해물에 350 μL의 70% 에탄올을 피펫팅한다. 샘플당 최종 부피는 700μL입니다.
    7. 추출 컬럼을 2mL 수집 튜브(키트와 함께 제공됨) 내에 삽입합니다.
    8. 추출 컬럼당 700μL의 시료를 옮기고 10,000× g 에서 15초 동안 원심분리합니다. 수집 튜브의 플로우 스루를 버리고 스핀 컬럼에 다시 넣습니다.
    9. 추출 컬럼에 350μL의 엄격한 세척 완충액(키트에 제공됨)을 추가하고 10,000 ×g 이상에서 15초 동안 원심분리합니다. 플로우 스루를 폐기합니다.
    10. 시료당 80 μL의 DNase I 인큐베이션 혼합물을 추출 컬럼의 멤브레인에 첨가하고, 20-30°C에서 15분 동안 경화시킨다.
      참고: 샘플당 DNase I 배양 혼합물을 준비하려면 10μL의 DNase I 저장 용액을 70μL의 DNase 버퍼에 추가하여 최종 부피 80μL를 만듭니다. 튜브를 여러 번 뒤집어 완전히 혼합한 다음 원심분리기에서 짧게 돌립니다.
    11. 추출 컬럼을 350μL의 엄격한 세척 완충액으로 세척한 후 10,000× g 에서 15분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 수집 튜브의 흐름관을 폐기하십시오.
    12. 추출 컬럼을 매번 500μL의 순한 세척 완충액으로 2배 세척하고 10,000× g 에서 15초 동안 원심분리하고 2분 동안 두 번째로 세척합니다. 각 원심분리 후 플로우 스루를 폐기하십시오.
    13. 컬럼을 최대 속도로 1분 동안 원심분리하여 멤브레인을 건조시키고 수집 튜브를 버립니다.
    14. 추출 컬럼을 새 1.5mL 수집 튜브에 넣습니다.
    15. RNase가 없는 물 50μL를 컬럼 멤브레인에 피펫팅하고 실온에서 3-5분 동안 배양합니다.
      참고: RNA 농도가 100ng 미만인 경우 용출량을 30μL로 줄이고 첫 번째 용출 제품을 사용하여 추출 컬럼 멤브레인을 다시 용리하여 최종 제품을 농축합니다.
    16. 10,000 × g 에서 1분 동안 원심분리하여 RNA를 용출시킨다.
    17. 0.5-2 μL의 시료를 사용하여 260 nm에서 흡광도를 검출하여 RNA의 농도를 측정합니다. RNase가 없는 물을 사용하여 최종 RNA 농도를 0.1-1 μg/μL로 조정합니다.
    18. 나중에 사용할 수 있도록 RNA 분취량을 -80°C에 보관합니다.
  2. 상보적 DNA의 합성
    1. 키트와 함께 제공된 제조업체의 프로토콜에 따라 추출된 주형 RNA에서 상보적 DNA(cDNA)를 합성합니다(자세한 내용은 재료 표 참조).
      참고: 사용된 시약과 부피에 대한 요약은 표 1 과 표 2에 나와 있습니다. 전체 프로토콜은 보충 파일 1에 자세히 설명되어 있습니다.
  3. 실시간 정량적 중합효소 연쇄 반응
    1. qPCR의 경우 cDNA 샘플을 세 번 실행합니다. 표 3에 나타낸 바와 같이, GAPDH 유전자를 참조하여 특이적 프라이머 세트를 사용하여 Ki-67 및 IFN-γ에 대한 소 mRNA 전사체 수준을 정량화한다.
      참고: 전체 프로토콜은 보충 파일 1에 자세히 설명되어 있습니다.

7. 효소면역흡착 분석

  1. 분비 단백질이 풍부한 배양 상층액을 채취하여 ELISA를 통해 IFN-γ 정량화합니다.
    알림: 키트 사용에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. 전체 프로토콜은 보충 파일 1에 자세히 설명되어 있습니다.

8. 통계 분석

  1. 데이터를 분석하고 상용 소프트웨어를 사용하여 실험 설계를 그래픽으로 보여줍니다. 비교 분석을 위해 쌍체가 없는 비모수 검정을 사용합니다. 0.05< P 값이 통계적으로 유의하다고 생각하십시오.

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Representative Results

이 방법론은 생체 내 연구를 수행하기 전에 후보 백신 항원을 평가하기 위한 소 MoDC의 시험관 내 생성을 설명합니다. 그림 1은 소 MoDC 생성의 실험 계획과 시험관 내 분석을 위한 MoDC의 적용을 보여줍니다. 자기 기반 세포 분류 기술을 사용하여 이전에 50mL의 소 혈액에서 분리된 수확된 PBMC에서 약 2,600만 개의 CD14+ 근세포를 수집할 수 있었습니다. CD14+ 단핵구가 없는 용출된 세포 분획은 림프구가 풍부했으며 나이브 CD4+ 및 CD8+ T 세포(CD14- 림프구 세포 분획)의 공급원으로 사용되었습니다.

나이브 단핵구 분획은 CD14 세포 염색 및 유세포 분석 후 관찰된 바와 같이 98% CD14+ 단핵구 세포로 구성되었습니다(그림 2A, B). 정제된 나이브 단핵구 세포를, 3% 사이토카인 칵테일(GM-CSF 및 IL-4)의 존재 하에 배양을 실시하고 5일간 후속 배양을 실시하면, DC 유사 표현형으로 분화된다. 2,600만 개의 CD14+ 단핵구의 시작 배양에서 배양 5일 후에 총 약 1,200만 MoDC를 얻을 수 있었습니다. 순진한 MoDC는 FITC-덱스트란의 유세포 분석 분석을 사용하여 관찰된 바와 같이 기능적으로 항원 흡수가 가능했습니다(그림 3). 또한, 나이브 MoDC는 MHC 클래스 II와 공동 자극 CD86 및 CD40 세포 표면 마커의 발현을 평가하여 표현형으로 특성화되었으며, 이는 DC 유사 표현형을 검증했습니다(그림 4).

나이브 MoDC의 항원 펄스 자극은 2일 동안 비활성화된 RV의 존재 하에서 배양함으로써 달성되었습니다. 나이브 림프구(CD14- 세포 분획)의 활성화는 IL-2의 후속 보충과 함께 항원 펄스 MoDC- 림프구 공동 배양에 의해 달성되었습니다. 9일째 MoDC-림프구 동시 배양 동안 RV-펄스 MoDC에서 형태학적 변화가 관찰되었는데, 이는 MoDC 성숙의 특징인 수상돌기 확장을 보였기 때문입니다(그림 5). 14일째에, 동일한 동물로부터 새로 생산된 RV-펄스 MoDC를 첨가하여 공동 배양을 재자극함으로써 림프구 활성화가 향상되었습니다.

비펄스 MoDC-림프구 공동 배양과 비교하여, 펄스 MoDC-림프구 공동 배양에서 16일째에 CD4+ 및 CD8+ T 세포 모두에서 Ki-67 및 CD25 활성화 마커의 상향 조절에 의해 림프구 증식의 상당한 증가(p < 0.01)가 입증되었습니다(그림 6). 성숙한 RV-펄스 MoDC 공동 배양의 CD8+ T 세포는 비특이적 그룹과 비교할 때 Ki-67의 8배 상향 조절(p < 0.01)을 나타냈습니다(그림 7A). 동일한 공동 배양에서 CD4+ T 세포는 대조군에 비해 Ki-67에서 7배 증가(p < 0.01)를 보였습니다(그림 7B). 이것은 RV 프라이밍 MoDC가 RV 항원을 나이브 림프구에 성공적으로 제시한 후 살아있는 동물에서 일어나는 것과 유사한 시험관 내 조건에서 활성화하는 능력을 보여줍니다. 유세포 분석을 사용하여 세포를 분석하는 것 외에도 공동 배양을 수행하여 RNA 전사(Ki-67 및 IFN-γ) 및 세포외 분비(IFN-γ)를 각각 사용하여 RV 특이적 림프구 활성화를 정량화했습니다(그림 8). 이러한 추가 검출 방법은 유세포 분석 결과를 추가로 검증하기 위한 확인 테스트로도 사용할 수 있습니다. qPCR에 의해 입증된 Ki-67 및 IFN-γ에 대한 RNA 발현 및 ELISA에 의해 입증된 IFN-γ 수준은 비특이적 처리군에 비해 항원 특이적 공동 배양에서 림프구 증식을 나타내는 유사한 증가 패턴을 보였다. 따라서 qPCR 및 ELISA 결과는 유세포 분석 결과와 상관관계가 있습니다. qPCR은 GAPDH를 보정기로 사용한 모든 공동 배양에서 IFN-γ 발현이 >30% 증가하고 Ki-67 발현이 >5% 증가한 것으로 나타났습니다(그림 8A, B). 비특이적 처리군에 비해 RV-펄스 MoDC-림프구 공동 배양의 배양 상층액을 사용하여 ELISA로 훨씬 더 높은 농도의 분비된 IFN-γ(**p > 0.01)를 측정했습니다(그림 8C).

Figure 1
그림 1: 소 MoDC 기반 시험관 내 분석의 실험 설계. (A) 소 PBMC에서 CD14+ 단핵구 및 CD14- 림프구 세포 분획의 수확 및 세포 분류. 소의 혈액을 밀도 구배 원심분리로 처리하여 PBMC를 수집한 다음, 면역자기 세포 분리 컬럼을 사용하여 자기 기반 세포 분류를 하고, 보충된 RPMI 1640 배지에서 수확된 CD14+ 나이브 단핵구 세포 분획을 후속 배양합니다. (B) 5일간의 인큐베이션 및 MoDC-림프구 공동 배양과 함께 3% 사이토카인 칵테일(GM-CSF + IL-4)을 사용하여 MoDC를 생산합니다. 0일째에, 단핵구를 사이토카인 칵테일의 존재 하에 배양하고, 분화를 유도하기 위해 48시간 동안 인큐베이션한다. 2일째에 배양물을 동일한 사이토카인 칵테일로 재분석한 후 72시간 동안 배양하여 순진한 MoDC를 생산합니다. 5일째에 백신 항원(광견병 백신)을 나이브 MoDC 세포 배양에 첨가한 후 48시간 배양합니다. 7일째에 항원 펄스 MoDC와 나이브 림프구(CD14- 세포 분획)의 공동 배양을 수행한 후 배양합니다. 9일째에, IL-2가 공배양물에 첨가된다. 14일째에 활성화된/프라이밍된 림프구의 농축/재자극은 항원 펄스 MoDC를 첨가한 후 48시간 동안 배양하여 수행됩니다. 마지막으로, 16일째에, 림프구 증식 분석을 위해 세포 및 배양 상청액을 수확한다. 약어: MODCs = 소 단핵구 유래 수지상 세포; PBMCs = 말초 혈액 단핵 세포; GM-CSF = 과립구-대식세포-집락-자극 인자. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 항-CD14 결합 마이크로비드를 사용하여 PBMC에서 수확한 소 CD14+ 단핵구의 형태 및 순도. (a) 소 단핵구의 형태 마이크로비드를 제거하기 위해 완전 배양 배지에서 37°C에서 4시간 동안 배양하고, 폴리라이신 코팅된 슬라이드에 고정하고, 변형된 김사 염색으로 염색합니다. 눈금 막대 = 50 μm. (B) 항-CD14 항체(빨간색) 및 FITC-접합 마우스 IgG1 이소타입 대조군 항체(녹색)를 사용하여 관찰된 98.6% 순도 수준으로 용리된 CD14+ 세포 분획을 보여주는 유세포 분석 히스토그램. 약어: PBMC = 말초 혈액 단핵 세포; FITC cont = 플루오레세인 이소티오시아네이트 대조군. 이 수치는 Kangethe et al., 201811에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 시험관 내에서 생성된 소 MoDC의 세포내 활성. 5일째 나이브 MoDC까지 추적자 분자(FITC-덱스트란)의 흡수를 보여주는 유세포 분석 히스토그램. 추적자 분자(파란색)와 함께 37°C에서 60분 동안 배양한 MoDC와 배경 대조군으로 사용된 추적자 분자(회색)와 함께 얼음에서 배양한 MoDC를 사용했습니다. 약어: MODCs = 소 단핵구 유래 수지상 세포; FITC = 플루오레세인 이소티오시아네이트. 이 수치는 Kangethe et al., 201811에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: in vitro에서 생성된 소 MoDC 특이적 세포 표면 마커의 표현형 분석. (A) MoDC의 게이팅 전략 및 (B) 항양 MHC II mAb, 항소 CD86 mAb 및 항소 CD40 mAb를 포함하여 3가지 다른 DC 특이적 MoAb(파란색)로 염색된 5일 나이브 MoDC에 대한 유세포 분석 히스토그램. 모두 해당 등형 컨트롤(빨간색)과 비교됩니다. 약어: DC = 수지상 세포; MODCs = 소 단핵구 유래 DC; MHC II = 주요 조직 적합성 복합체 II. 이 수치는 Kangethe et al., 201811에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: MoDC-림프구 동시 배양 동안 시험관 내에서 생산된 MoDC의 성숙 징후. MoDC-림프구 공동 배양 9일째에 도립 현미경으로 항원 펄스 MoDC에 의한 특징적인 확장된 수지상 구조 관찰. (A) 공동 배양된 림프구의 고도로 합류하는 영역 내의 성숙한 MoDC. (B) 성숙한 MoDC는 공동 배양에서 림프구가 적은 영역에서 쉽게 구별할 수 있습니다. 스케일 바 = 50 μm. 약어: MODCs = 소 단핵구 유래 수지상 세포. 이 수치는 Kangethe et al., 201811에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6: MoDC-림프구 공동 배양에서 림프구에 의한 Ki-67 및 CD25 발현에 대한 도트 플롯에 채택된 순차적 게이팅 전략. (A)16일째 MoDC-림프구 공동 배양에서 수확한 세포에 대한 전체 게이팅 전략. (B) FMO 대조군(mAb 없음) 및 마우스 IgG1-k 이소타입 대조군 mAb와 비교한 CD4+-개폐 림프구 및 (C) CD8+ 림프구로부터의 Ki-67 발현. 개폐된 (D) CD8+ 및 (E) CD4+ 림프구에서의 CD25 발현을 마우스 IgG1 이소타입 대조군 mAb와 비교하였다. 처리군은 구체적으로 RV-펄스 MoDC와 함께 배양된 림프구를 나타내는 반면, 대조군은 MoDC가 없는 상태에서 배양된 림프구를 나타냅니다. 약어: MODCs = 소 단핵구 유래 수지상 세포; FMO = 형광 마이너스 1; RV = 광견병 백신. 이 수치는 Kangethe et al., 201811에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 7
그림 7: 항원으로 프라이밍한 후 CD4+ 및 CD8+ 림프구에 의한 Ki-67 및 CD25 발현의 유세포 분석 데이터. Ki-67 및 CD25 발현은 16일째부터 공동배양. 치료 그룹(특이적)은 RV-펄스 MoDC로 배양된 림프구로 정의됩니다. 비특이적 그룹은 비항원 펄스 MoDC로 배양된 림프구에 해당합니다. 대조군은 MoDC 없이 배양된 림프구에 해당합니다. 가로 막대는 6번의 기술 반복실험의 평균을 나타냅니다. (A) CD8 T 세포에 의한 Ki-67 마커의 세포내 발현 및 (B) CD4 T 세포에 의한 발현. (c) CD8 T 세포에 의한 CD25 마커의 세포 표면 발현 및 (D) CD4 T 세포에 의한 세포 표면 발현. 약어: MODCs = 소 단핵구 유래 수지상 세포; RV = 광견병 백신. 이 수치는 Kangethe et al., 201811에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 8
그림 8: qPCR 및 ELISA를 통해 검출된 광견병 바이러스 항원으로 프라이밍된 MoDC에 의한 Th1 마커(IFN-γ 및 Ki-67) 활성화. 6개의 기술 복제를 통해 한 동물에서 가져온 데이터. 가로 막대는 평균을 나타냅니다. GAPDH 참조 유전자로 정상화한 후 나이브 림프구와 비교하여 배수 변화로 나타난 3개의 PCR 복제. (A) IFN-γ 발현, (B) Ki-67 발현. (C) ELISA에 의해 검출된 바와 같이 3개의 처리 그룹 사이의 배양 상청액에서 IFN-γ 분비의 비교. 특정 그룹은 RV-펄스 MoDC로 배양된 림프구로 정의됩니다. 비특이적 그룹은 비항원 펄스 MoDC로 배양된 림프구에 해당합니다. 대조군은 MoDC 없이 배양된 림프구에 해당합니다. 약어: MODCs = 소 단핵구 유래 수지상 세포; RV = 광견병 백신. 이 수치는 Kangethe et al., 201811에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

시약 최종 농도 반응당 부피
dNTP 믹스(10mM) 1,000 마이크로미터 1 μL
무작위 헥사머 프라이머(50ng/μL) 25 마이크로미터 1 μL
RNA 템플릿 0.1 – 1 μg/μL χ μL(필요에 따라)
RNAse 무함유수 - χ μL(필요에 따라)
최종 반응 부피 - 10 μL

표 1: 마스터 믹스 조성(RNA 프라이머 믹스).

시약 최종 농도 반응당 부피
RT 버퍼 10x 1배 2 마이크로리터
MgCl2 25 밀리엠 5 밀리엠 4 μL
DTT 0.1 미터 10 밀리엠 2 마이크로리터
RNAse 억제제 40 U/μL 2 U 1 μL

표 2: 2x PCR 반응 혼합물. 약어: RT = 역전사효소; DTT = 디티오트레이톨.

사이토카인 종 수탁 번호 순서 길이 증권 시세 표시기
IFN-γ 보스 황소 자리 FJ263670 에프- GTGGGCCTCTCTTCTCAGAA 234 80.5
R-갓캣캇챠가아짱가아트가
기-67 보스 황소 자리 XM_015460791.2 F-AAGATTCCAGCGCCCATTCA 148 86.5
R-TGAGGAACGAACACGACTGG
증권 시세 표시기 보스 황소 자리 Sassu 외, 2020 F-CCTGGAGAAACCTGCCAAGT〈블랙〉 214 85.5
R-GCCAAATTCATTGTCGTACCA

표 3: 증폭에 사용되는 프라이머 세트50.

시약 최종 농도 반응당 부피
슈퍼믹스 1배 5 μL
포워드 프라이머(5μM) 250/125 nM 1 μL
역방향 프라이머(5μM) 250/125 nM 1 μL
희석된 cDNA 1:10 1.25 응 2 마이크로리터
뉴클레아제가 없는 물 - 1 μL
최종 반응 부피 - 10 μL

표 4: qPCR 마스터 믹스

튜브 번호 표준물질의 농도 연속 희석
1 50ng/mL 표준물질 50 μL + 세척 완충액 350 μL
2 12.5ng/mL 튜브 1에서 150 μL + 세척 완충액 450 μL
3 6.25ng/mL 튜브 2에서 250 μL + 세척 완충액 250 μL
4 3.13ng/mL 튜브 3에서 250 μL + 세척 완충액 250 μL
5 1.56ng/mL 튜브 4에서 250 μL + 세척 완충액 250 μL
6 0.78ng/mL 튜브 5에서 250 μL + 세척 완충액 250 μL
7 0.2ng/mL 튜브 6에서 150 μL + 세척 완충액 450 μL
8 0.1ng/mL 튜브 7에서 250 μL + 세척 완충액 250 μL
9 0.025ng/mL 튜브 8에서 100 μL + 세척 완충액 300 μL

표 5: IFN-γ 표준 희석 시리즈

보충 파일 1: 상보적 DNA 합성, 실시간 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR) 및 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)을 위한 프로토콜. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 S1: 항원 흡수능 MoDCs와 사이토카인 칵테일의 농도를 상이하게 하고 3일 또는 5일간의 배양 .GM-CSF 및 IL-4를 함유하는 사이토카인 칵테일의 다양한 농도(5% w/v 및 3% w/v)를 3일 또는 5일의 배양으로 테스트하여 고성능 항원 흡수 MoDC를 생성하기 위한 최상의 조합을 평가했습니다(추적자 분자 FITC-덱스트란 사용). 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 S2: 디프테리아 톡소이드(DT) 및 블루텅 바이러스 혈청형 4(BTV)를 사용한 CD4 및 CD8 프라이밍. (A) DT 및 (C) BTV로 펄싱한 후 CD8 세포에 의한 Ki-67의 발현 및 16일째에 (B) DT 및 (D) BVT로 펄싱한 후 CD4 세포에 의한 Ki-67의 발현. DT 및 BVT(특이적), (C,D)와 CD40L, 비특이적 프라이밍 및 대조군 처리로 펄싱된 배양물과 비교했습니다. 가로 막대는 평균을 나타냅니다. *p < 0.05, **p < 0.01(Mann-Whitney 검정 따름). 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

이 연구는 소 MoDC를 생성 및 표현형화하기 위한 표준화된 시험관 내 방법과 상업용 백신(예: RV)의 백신 면역원성을 측정하는 데 사용하는 방법을 보여줍니다. 소 MoDC는 가축 질병에 대한 잠재적인 백신 항원을 스크리닝하고 생체 내 동물 시험을 진행하기 전에 면역 반응을 기반으로 잠재적인 임상 영향을 예측하기 위한 도구로 사용할 수 있습니다. 생성된 MoDC는 형태학적, 표현형적, 기능적 특성에 따라 식별되었습니다. 우리는 소 CD14+ 단핵구에서 유래한 MoDC가 확장된 수상돌기, MHC II와 같은 항원 제시를 위한 세포 표면 마커의 발현, CD40 및 CD86과 같은 MoDC에서 공동 자극 분자의 발현, 내세포 활성 및 나이브 림프구를 활성화하는 능력.

본 실험에 사용된 세포 배양 배지(DMEM 및 RPMI)는 세포 분화 및 배양에 널리 사용되며, RPMI는 단핵구 분화에 더 자주 채택된다36. FBS 또는 HS(말 혈청)를 사용한 RPMI 보충은 단핵구 분화에 영향을 미치지 않는다37. 재조합 GM-CSF 및 IL-4 보충은 단핵구 분화를 유발하는 염증 상태를 제공하며 항원 흡수 및 면역 세포에 대한 제시가 가능한 기능적으로 실행 가능한 MoDC의 생산에 일상적으로 사용됩니다38,39. 이 연구에서 RPMI 1640 배지는 10% FBS(완전 배양 배지), 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 상업적으로 이용 가능한 사이토카인 칵테일(GM-CSF 플러스 IL-4)을 첨가하여 소 단핵구 분화를 유도하여 생존 가능한 MoDC를 생성했습니다. 생성된 MoDC를 나이브 림프구와 공동 배양하기 전에 RV와 함께 배양했을 때, RV에 특이적인 T 세포 의존성 면역 반응을 유도하여 성숙한 MoDC가 RV를 본 적이 없는 림프구에 RV 항원을 적절하게 제시할 수 있음을 증명했습니다. 이것은 우리가 지금 실험실에서 복제할 수 있는 적응 면역의 중요한 특성입니다.

우리는 더 긴 배양 시간(5일)과 결합된 더 높은 농도의 사이토카인 칵테일(5%)이 더 낮은 농도의 사이토카인 칵테일(3%)로 처리된 것보다 항원 흡수에 대한 더 낮은 내세포 능력을 가진 MoDC를 생성하는 것을 관찰했습니다. 따라서 우리는 5일의 배양과 함께 더 낮은 농도의 사이토카인 칵테일(예: 3%)이 기능적으로 강력한 MoDC를 생산하는 데 최적이라고 결론지었습니다. MHC II, CD40 및 CD86과 같은 세포 표면 마커는 APC에 존재하며, 이들의 상향 조절은 기능적 세포 활성화를 나타낸다40,41,4 2. 우리는 사이토카인 칵테일을 사용하여 단핵구가 나이브 MoDC로 분화한 후 MHC II, CD40 및 CD86의 향상된 발현을 입증했습니다(그림 4).

배양 시스템에서 나이브 림프구와 MoDC의 비율을 최적화하는 것은 MoDC 분석의 결과에 영향을 미치는 핵심 요소이며, 다양한 림프구 반응을 유도하는 다른 MoDC 대 림프구 비율이 있습니다43. 그러나 MoDC 대 림프구 비율을 1:10-1:40으로 평가한 후 MoDC의 농도를 증가시켜도 림프구 활성화가 증가하지 않는다는 것을 관찰했으며 결국 이전에 보고된 연구와 유사한 1:20의 최적 비율에 정착했습니다44,45. 용출된 나이브 림프구 분획은 비특이적으로 활성화된 T 세포를 함유할 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 따라서 나이브 림프구 배양에만 해당하는 대조군을 갖는 것이 필수적입니다.

활성화된 CD4+ 및 CD8+ T 세포는 특정 마커를 발현하고 다양한 사이토카인을 분비하며, 이들의 정량화는 면역 활성화를 나타냅니다. 잘 특성화된 면역 활성화 마커인 Ki-67의 세포 내 발현은 이 MoDC-림프구 공동 배양29,46에서 상향 조절되었습니다. 유사하게, 이 연구에서, 림프구에 의한 IFN-γ 분비의 강화는 RV 항원30,31,47에 대해 유도된 Th1 반응을 나타내었다. CD4+ T 세포에 의한 IL-2 발현은 또한 T 세포 활성화를 시각화하기 위한 좋은 마커입니다. 그러나 MoDC-림프구 공동 배양 9일째에 통합되었기 때문에 이 연구에서 림프구 증식을 측정하는 데 적합하지 않은 표적이 되었습니다48. IL-2의 존재 하에서 CD25의 상향 조절은 이전에 CD4+ 및 CD8+ T 세포 모두의 프라이밍을 결정하는 것으로 나타났으며 이 연구에서 RV-펄스 MoDC에 의한 나이브 림프구의 프라이밍을 측정하는 데 사용되었습니다28.

세포독성 CD8 T 세포는 세포내 백신 항원 또는 바이러스 병원체에 대한 주요 이펙터 세포이다49. 림프구 활성화 마커(Ki-67 및 CD25) 및 사이토카인 발현(IFN-γ)을 측정함으로써, 우리는 항원 로딩 MoDC가 CD8 및 CD4 T 세포 반응 모두의 유의한(p < 0.01) 활성화를 가지며, CD8 반응 및 Th1 분극이 RV 항원에 대해 더 널리 퍼져 있음을 발견했습니다. 보조제 결합 백신에 대한 MoDC 분석을 설계할 때 고려해야 할 중요한 요소는 보조제 유도 림프구 반응입니다. 배경 신호를 제거하기 위해 보조제로만 구성된 대조군(보조제 대조군)을 사용하는 것이 좋습니다. 이 설정은 또한 생체 내 연구 중 보호에 중요한 저면역원성 항원에 대한 림프구 반응을 증폭할 수 있는 다양한 보조제의 효과를 측정하는 데 사용할 수 있습니다.

이 연구에는 강조하고 싶은 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 각 분석에 대한 실험 데이터는 6개의 기술 복제가 있는 단일 동물에서 파생되었습니다. 생물학적 반복물 수가 많을수록 오류를 최소화하고 통계적 신뢰성과 결과를 더 높은 정확도로 제공하는 데 도움이 됩니다. 그럼에도 불구하고, 이전 간행물11에서 이 분석은 디프테리아 톡소이드(보충 그림 S2A,B)와 블루텅 바이러스 혈청형 4에 대한 상용 백신(보충 그림 S2C,D)을 각각 3마리 및 2마리의 생물학적 동물과 함께 사용하여 테스트 및 검증되었습니다. 또한, 이 시험관 내 연구에서 얻은 결과를 생체 내 연구와 비교하면 이 면역 분석의 진위를 추가로 검증하는 데 도움이 될 것이며, 이는 백신 생산 및 품질 관리에서 일상적인 테스트로서 이 체외 MoDC 분석의 구현 프로세스를 가속화할 것입니다. 마지막으로, MoDC에서 CD14의 발현은 특히 다른 동물 종의 MoDC를 비교할 때 이 측면에 대해 문헌이 일치하지 않기 때문에 조사되지 않았습니다.

결론적으로, 우리는 백신 유발 면역원성을 측정하는 데 사용할 수 있는 시험관 내 소 MoDC 분석을 보고합니다. 이 MoDC 분석은 유세포 분석, ELISA 및 qPCR을 포함한 다양한 방법을 사용하여 평가할 수도 있습니다. 활성화 마커를 평가하기 위한 여러 가지 방법을 갖는 것은 유세포 분석기를 쉽게 사용할 수 없는 제한된 자원이 있는 영역에서 매우 중요합니다. 이 분석은 소 백신을 대량으로 생산하는 국립 수의학 연구소의 품질 관리 단계로 포함될 수 있습니다. 또한 새로운 소 백신을 개발하는 동안 잠재적인 백신 항원을 식별하고 동물 시험 전에 사용할 보조제를 선택하는 데에도 사용할 수 있습니다. 이러한 모든 요소는 소 백신을 개발하고 사용하는 데 있어 보다 윤리적이고 저렴한 접근 방식에 기여할 것입니다.

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Disclosures

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgments

동물의 건강 상태를 확인하고 BTV를 제공하는 데 도움을 준 Eveline Wodak 박사와 Angelika Loistch 박사(AGES), 소의 혈액을 제공한 Bernhard Reinelt 박사, Real-Time PCR 실험 및 언어 편집에 대한 유용한 조언을 제공한 IAEA의 Bharani Settypalli 박사와 William Dundon 박사에게 각각 감사드립니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACK Lysing Buffer Gibco, Thermo Fisher A1049201 Ammonium-Chloride-Potassium buffer for lysis of residual RBCs in harvested PBMC Fraction
BD Vacutainer Heparin Tubes Becton, Dickinson (BD) and Company 366480 10 mL, additive sodium heparin 158 USP units, glass tube, 16 x 100 mm size
Bovine Dendritic Cell Growth Kit Bio-Rad, UK PBP015KZZ Cytokine cocktail composed of recombinant bovine IL-4 and GM-CSF
Bovine IFN-γ ELISA Kit Bio-Rad MCA5638KZZ Kit use for measuring IFN-γ expression in culture supernatant
CD14 Antibody Bio-Rad MCA2678F Mouse anti-bovine CD14 monoclonal antibody, clone CC-G33, isotype IgG1
CD25 Antibody Bio-Rad MCA2430PE Mouse anti bovine CD25 monoclonal antibody, clone IL-A11, isotype IgG1
CD4 Antibody Bio-Rad MCA1653A647 Mouse anti bovine CD4 monoclonal antibody, clone CC8, isotype IgG2a
CD40 Antibody Bio-Rad MCA2431F Mouse anti-bovine CD40 monoclonal antibody, clone IL-A156, isotype IgG1
CD8 Antibody Bio-Rad MCA837F Mouse anti bovine CD8 monoclonal antibody, clone CC63, isotype IgG2a
CD86 Antibody Bio-Rad MCA2437PE Mouse anti-bovine CD86 monoclonal antibody, clone IL-A190, isotype IgG1
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System Bio-Rad - Thermal cycler PCR machine
Corning Centrifuge Tube Falcon Corning  352096 & 352070 15 mL and 50 mL, high-clarity poypropylene conical bottom, graduated, sterial, seal screw cap, falcon tube
Cytofix/Cytoperm Plus BD Bio Sciences 555028 Fixation/permeabilization kit with BD golgiPlug, use for flow cytometer cell staining
Ethanol Sigma Aldrich 1009832500 Absolute for analysis EMSURE ACS,ISO, Reag. Ph Eur
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco, Thermo Fisher 10500064 Qualified, heat inactivated
Ficoll Plaque PLUS GE Health care Life Sciences, USA 341691 Lymphocyte-isolation medium
FlowClean Cleaning Agent Beckman Coulter, Life Sciences A64669 500 mL
FlowJo FlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, USA - Flow cytometer Histogram software
FlowTubes/ FACS  (Fluorescence-activated single-cell sorting) Tube Falcon Corning  352235 5 mL, sterial, round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap, use in flow cytometry analysis
Fluoresceinisothiocynat-Dextran Sigma Aldrich, Germany 60842-46-8 FITC-dextran MW
Gallios Flow Cytometer Beckman Coulter - Flow cytometer machine
Hard-Shell 96-Well PCR Plates Bio-Rad HSP9601 96 well, low profile, thin wall, skirted, white/clear
Human CD14 MicroBeads Miltenyi Bioteck, Germany 130-050-201 2 mL microbeads conjugated to monoclonal anti-human CD14 antibody isotype IgG2a, used for selection of bovine monocytes from PBMCs
Kaluza Beckman Coulter, Germany - Flow cytometer multicolor data analysis software
MACS Column Miltenyi Bioteck, Germany 130-042-401 Magnetic activated cell sorting or immune magentic cell separation colum for separation of various CD14 cell population based on cell surface antigens
MHC Class II DQ DR Polymorphic Antibody Bio-Rad MCA2228F Mouse anti-sheep MHC Class II DQ DR Polymorphic:FITC, clone 49.1, isotype IgG2a, cross reactive with bovine
Microcentrifuge Tube Sigma Aldrich HS4325 1.5 mL, conical bottom, graduated, sterial tube
Microsoft Power Point Microsoft - The graphical illustrations of experimental design
Mouse IgG1 Negative Control:FITC for CD14, CD40 Antibody Bio-Rad MCA928F Isotype control CD14 and CD40 monoclonal antibody 
Mouse IgG1 Negative Control:PE for CD86 Antibody Bio-Rad MCA928PE Isotype control CD86 monoclonal antibody 
Mouse IgG1 Negative Control:RPE for CD25 Antibody Bio-Rad MCA928PE Isotype control CD25 monoclonal antibody 
Mouse IgG2a Negative Control:FITC for MHC Class II Antibody Bio-Rad MCA929F Isotype control for MHC class II monoclonal antibody 
Nobivac Rabies MSD Animal Health, UK - 1 µL/mL of cell cultured inactivated vaccine containing > 2 I.U./mL Rabies virus strain
Optical seals Bi0-Rad TCS0803 0.2 mL flat PCR tube 8-cap strips, optical, ultraclear, compatible for qPCR machine
Penicillin-Streptomycin Gibco, Thermo Fisher 15140122 100 mL
Phosphate Buffer Saline (PBS) Gibco, Thermo Fisher 10010023 pH 7.4, 1x concentration
Prism - GraphPad 5 Software  Dotmatics - Statistical software
Purified Anti-human Ki-67 antibody Biolegend, USA 350501 Monoclonal antibody, cross reactive with cow, clone ki-67
Purified Mouse IgG1 k Isotype Ctrl Antibody Biolegend 400101 Isotype control for Ki-67 monoclonal antibody
READIDROP Propidium Iodide BD Bio Sciences 1351101 Live/dead cell marker used for flow cytometry, amine reactive dye
Recombinant Human IL-2 Protein R&D System, USA 202-IL-010/CF Interleukin-2, 20 ng/ml
RNeasy Mini Kit Qiagen 74106 Kit use for extraction of total RNA; RLT buffer = lysis buffer; RW1 buffer = stringent guanidine-containing washing buffer; RDD buffer = DNase buffer; RPE buffer = mild wash buffer; RNaseOUT = RNase inhibitor.
RPMI 1640 Medium Sigma Aldrich R8758 Cell culture media with L-glutamine and sodium bicarbonate
SMART-servier medical art  Les Laboratories Servier - Licensed under a creative commons attribution 3.0 unported license
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 172-5270 2x qPCR mix conatins dNTPs, Ss07d fusion polymerase, MgCl2, SYBR Green I supermix = supermix, ROX normalization dyes.
SuperScript III First-Strand Synthesis System Invitrogen, Thermo Fisher 18080051 Kit for cDNA synthsis
Tissue Culture Test plate 24 TPP, Switzerland 92024 24 well plate, sterilized by radiation , growth enhanced treated, volume 3.18 mL
Trypan Blue Solution Gibco, Thermo Fisher 15250061 0.4%, 100 mL, dye to assess cell viability
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Invitrogen, Thermo Fisher 10977023 0.1 µm membrane filtered distilled water
VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes Thermo Fisher Scientific 15206067 VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes have a green top and contain spray-dried lithium, sodium or ammonium heparin on the inner walls and are usedin clinical chemistry, immunology and serology. The anticoagulant heparin activates antithrombin, which blocks the clotting cascade and thus produces a whole blood/plasma sample.
Water Sigma Aldrich W3500-1L Sterile-filtered, bioReagent suitable for cell culture

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References

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Liaqat, F., Kangethe, R. T., Pichler, R., Liu, B., Huber, J., Wijewardana, V., Cattoli, G., Porfiri, L. Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (195), e64874, doi:10.3791/64874 (2023).

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