Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

קביעת אימונוגניות החיסון באמצעות תאים דנדריטיים שמקורם במונוציטים של בקר

Published: May 19, 2023 doi: 10.3791/64874
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1, 1, 1
1Animal Production and Health Section, Joint Food and Agriculture Organization (FAO)/International Atomic Energy Agency (IAEA) Centre of Nuclear Techniques in Food and Agriculture, International Atomic Energy Agency, 2Teaching and Research Farm Kremesberg, Clinical Unit for Herd Health Management in Ruminants, Department for Farm Animals and Veterinary Public Health, University of Veterinary Medicine, Vienna

Summary

המתודולוגיה מתארת את הייצור של תאים דנדריטיים שמקורם במונוציטים של בקר (MoDCs) ואת יישומם להערכה חוץ גופית של מועמדים אנטיגניים במהלך הפיתוח של חיסונים וטרינריים פוטנציאליים בבקר.

Abstract

תאים דנדריטיים (DCs) הם התאים מציגי האנטיגן (APC) החזקים ביותר במערכת החיסון. הם מסיירים באורגניזם בחיפוש אחר פתוגנים וממלאים תפקיד ייחודי במערכת החיסון על ידי קישור בין תגובות החיסון המולדות והנרכשות. תאים אלה יכולים לבצע פגוציטים ולאחר מכן להציג אנטיגנים שנלכדו לתאי מערכת החיסון המשפיעים, מה שמעורר מגוון רחב של תגובות חיסוניות. מאמר זה מדגים שיטה סטנדרטית לייצור במבחנה של תאים דנדריטיים שמקורם במונוציטים של בקר (MoDCs) שבודדו מתאי דם חד-גרעיניים היקפיים של בקר (PBMCs) ויישומם בהערכת אימונוגניות חיסונים.

מיון תאים מבוסס מגנטית שימש לבידוד מונוציטים CD14+ מ- PBMCs, ותוספת של מדיום תרבית שלם עם אינטרלוקין (IL)-4 וגורם מגרה מושבת גרנולוציטים-מקרופאגים (GM-CSF) שימשה כדי לגרום להתמיינות של מונוציטים CD14+ ל- MoDCs נאיביים. הדור של MoDCs לא בשלים אושר על ידי זיהוי הביטוי של קומפלקס היסטותאימות גדול II (MHC II), CD86 ו- CD40 פני השטח של התא. חיסון כלבת זמין מסחרית שימש כדי לפעום את MoDCs לא בשלים, אשר לאחר מכן תורבתו יחד עם לימפוציטים נאיביים.

ניתוח ציטומטריית הזרימה של MoDCs פועמים אנטיגן ותרבית לימפוציטים משותפת חשף את הגירוי של התפשטות לימפוציטים מסוג T באמצעות ביטוי של סמני Ki-67, CD25, CD4 ו- CD8. ניתוח ביטוי ה-mRNA של IFN-γ ו-Ki-67, תוך שימוש ב-PCR כמותי, הראה כי ה-MoDCs יכולים לגרום לפרימה ספציפית לאנטיגן של לימפוציטים במערכת זו של תרבית משותפת במבחנה . יתר על כן, הפרשת IFN-γ שהוערכה באמצעות ELISA הראתה טיטר גבוה משמעותית (**p < 0.01) בתרבית הלימפוציטים MoDC-לימפוציטים פועמת חיסון כלבת מאשר בתרבית לימפוציטים MoDC-לימפוציטים ללא אנטיגן. תוצאות אלה מראות את התוקף של בדיקת MoDC במבחנה זו למדידת אימונוגניות חיסונים, כלומר ניתן להשתמש בבדיקה זו כדי לזהות מועמדים פוטנציאליים לחיסון בקר לפני שתמשיך בניסויי in vivo , כמו גם בהערכות אימונוגניות חיסונים של חיסונים מסחריים.

Introduction

חיסון וטרינרי מייצג היבט מכריע של גידול בעלי חיים ובריאותם, שכן הוא תורם לשיפור הביטחון התזונתי ורווחת בעלי החיים על ידי הענקת הגנה מפני מחלות המשפיעות על משק החי ברחבי העולם1. שיטה יעילה במבחנה להערכת האימונוגניות של מועמדים אפשריים לחיסון תסייע להאיץ את תהליך הפיתוח והייצור של חיסונים. לכן, יש צורך להרחיב את תחום בדיקות החיסון עם מתודולוגיות חדשניות המבוססות על מחקרי מבחנה , שכן זה יעזור לחשוף את המורכבות של תהליכים חיסוניים הקשורים חיסון זיהום פתוגן. כיום, מחקרי חיסון ואתגר של בעלי חיים in vivo , הדורשים דגימה תקופתית (למשל, דם וטחול), משמשים למדידת האימונוגניות של חיסונים ואדג'ובנטים מועמדים. בדיקות אלה יקרות, גוזלות זמן ויש להן השלכות אתיות, מכיוון שברוב המקרים, המתת חסד של בעלי חיים מתבצעת עד סוף הניסויים.

כחלופה למבחני in vivo, תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) שימשו להערכת תגובות חיסוניות המושרות על ידי חיסונים במבחנה2. PBMCs הם אוכלוסייה הטרוגנית של תאים המורכבת מ 70%-90% לימפוציטים, 10%-20% מונוציטים, ומספר מוגבל של תאים דנדריטיים (DCs, 1%-2%)3. PBMCs מכילים תאים מציגי אנטיגן (APC) כגון תאי B, מונוציטים ו-DC, אשר מסיירים ללא הרף באורגניזם בחיפוש אחר סימני זיהום או נזק לרקמות. כימוקינים המופרשים באופן מקומי מאפשרים גיוס והפעלה של נגמ"שים לאתרים אלה על ידי קשירה לקולטני פני השטח של התא. במקרה של מונוציטים, כימוקינים מכוונים את גורלם להתמיין ל-DCs או למקרופאגים4. ברגע ש-DCs נתקלים בפתוגן ולוכדים אותו, הם נודדים לאיברי לימפה משניים, שם הם יכולים להציג את האנטיגנים הפפטידיים המעובדים של הפתוגן באמצעות חלבוני שטח מסוג I או Class II של קומפלקס היסטותאימות עיקריים (MHC) לתאי CD8+ T או CD4+ T, בהתאמה, ובכך לעורר תגובה חיסונית 5,6.

תפקיד המפתח שממלאים DCs בתיאום תגובה חיסונית מגנה מפני פתוגנים שונים הופך אותם ליעד מחקרי מעניין להבנת מנגנוני חיסון תוך-תאיים, במיוחד בעת תכנון חיסונים ואדג'ובנטים נגד גורמים זיהומיים7. מכיוון שחלק ה- DCs שניתן להשיג מ- PBMCs הוא קטן למדי (1%-2%), מונוציטים שימשו במקום זאת ליצירת DCs במבחנה8. DCs אלה שמקורם במונוציטים (MoDCs) פותחו בתחילה כאסטרטגיית טיפול אפשרית באימונותרפיה לסרטן9. לאחרונה, MoDCs שימשו למחקר חיסונים 10,11,12, ומונוציטים קלאסיים הם תת-הסוג הדומיננטי (89%) לייצור MoDC 13. הייצור של MoDCs במבחנה הושג בעבר באמצעות תוספת של גורם מגרה מושבת גרנולוציטים-מקרופאגים (GM-CSF) שניתן בשילוב עם ציטוקינים אחרים כגון אינטרלוקין-4 (IL-4), גורם נמק הגידול α (TNF-α), או IL-1314,15,16.

ההצלחה של בדיקת MoDC במבחנה מסתמכת על היכולת של MoDCs בוגרים מעוררי אנטיגן לווסת את ההיקף והסוג של התגובה החיסונית הספציפית לסוג האנטיגן שזוהה17. סוג הפתוגן המוכר ומוצג על ידי MoDCs קובע את ההתמיינות של תאי CD4+ T עוזר (Th) לתאי השפעה Th1, Th2 או Th17 ומאופיין בפרופיל ציטוקין מפריש ספציפי לפתוגן. תגובת Th1 מופעלת נגד פתוגנים תוך-תאיים וגורמת להפרשת אינטרפרון-גמא (IFN-γ) וגורם נמק הגידול בטא (TNF-β), המווסת הגנה תלוית פגוציטים. תגובת Th2 מופעלת נגד אורגניזמים טפיליים ומאופיינת בהפרשת IL-4, IL-5, IL-10 ו-IL-13, היוזמת הגנה הומורלית בלתי תלויה בפאגוציטים. Th17 מציע הגנה תלוית נויטרופילים מפני זיהומים חיידקיים ופטריות חוץ-תאיים בתיווך הפרשת IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 ו-TNF-α 18,19,20,21. בהתבסס על מחקרים קודמים, צוין כי לא כל הפתוגנים נופלים בפרופיל הציטוקינים הצפוי. לדוגמה, MoDCs עוריים, בתגובה לזיהום טפילי לישמניה, מעוררים הפרשת IFN-γ מתאי T CD4+ ותאי T CD8+, ובכך גורמים לתגובת Th1 פרו-דלקתית מגנה22.

כמו כן, הוכח כי בעופות MoDCs עם סלמונלה ליפופוליסכריד (LPS), יכול לגרום לתגובה משתנה נגד סלמונלה טיפימוריום על ידי הפעלת תגובות Th1 ו- Th2, בעוד סלמונלה גלינרום גורם לתגובת Th2 בלבד, מה שיכול להסביר את ההתנגדות הגבוהה יותר של האחרון לקראת אישור MoDC23. ההפעלה של MoDCs נגד Brucella canis (B. canis) דווחה גם בכלבים ובבני אדם, כלומר זה יכול לייצג מנגנון זיהום זואונוטי24. MoDCs אנושיים עם B. canis גורמים לתגובת Th1 חזקה המקנה עמידות לזיהום חמור, בעוד ש-MoDCs לכלבים גורמים לתגובת Th17 דומיננטית עם תגובת Th1 מופחתת, מה שמוביל לאחר מכן לביסוס זיהום כרוני25. MoDCs של בקר מראים זיקה מוגברת לווירוס מחלת הפה והטלפיים (FMDV) מצומד לאימונוגלובולין G (IgG) בהשוואה ל- FMDV לא מצומד בלבד, שכן MoDCs יוצרים קומפלקס נוגדנים נגיפי בתגובה ל-10 הראשונים. יחד, מחקרים אלה מראים כיצד נעשה שימוש ב-MoDCs כדי לנתח את המורכבות של תגובות חיסוניות במהלך זיהום פתוגן. ניתן להעריך את התגובה החיסונית הנרכשת על ידי כימות של סמנים ספציפיים הקשורים לשגשוג לימפוציטים. Ki-67, חלבון תוך-תאי המזוהה רק בתאים מתחלקים, נחשב לסמן אמין למחקרי התפשטות26, ובאופן דומה, CD25 המתבטא על פני השטח של תאי T בשלב המאוחר של ההפעלה מתאים להתרבות לימפוציטים27,28.

מחקר זה מדגים שיטה מתוקננת לייצור במבחנה של MoDCs בקר, ולאחר מכן יישומם בבדיקת חיסון חוץ גופית המשמשת לבדיקת האימונוגניות של חיסונים. חיסון כלבת זמין מסחרית (RV) שימש כדי לאמת את היעילות של בדיקה זו. הפעלה והתפשטות של לימפוציטים מסוג T נמדדו על ידי ציטומטריית זרימה, תגובת שרשרת כמותית בזמן אמת של פולימראז (qPCR) ובדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזימים (ELISA) באמצעות ניתוח של סמני הפעלת תאים מבוססים היטב כגון Ki-67 ו- CD25 והפרשת IFN-γ 28,29,30,31. במהלך הניסוי של משרד ההגנה לא נערכו ניסויים בבעלי חיים או בבני אדם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

איסוף הדם מתבצע על ידי שירות וטרינר מוסמך בהתאם להנחיות האתיות של הסוכנות האוסטרית לבריאות ובטיחות מזון (AGES) ובהתאם לתקנים המקובלים לרווחת בעלי חיים32. המחקר קיבל אישור אתי ממשרד החקלאות האוסטרי. התכנון הניסיוני ליצירת MoDCs ויישומו לאחר מכן מומחש באיור 1.

1. ייצור משרדי ממשלה נאיביים

הערה: דגימות דם שלמות נלקחו מעגל יחיד ללא פתוגן על ידי ניקוב ורידים ג'וגולרי עם vacutainers heparinized (שמונה צינורות דם 9 מ"ל שימשו במחקר זה). העבירו את הדם בקופסת קרח. אחסנו את הדגימות בטמפרטורה של 2-4 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר, או עבדו אותן מיד. שמור על הדם מסתובב כדי למנוע קרישת דם. לעקר את vacutainers עם 70% אתנול. כל הניסויים הבאים בוצעו עם דגימה ביולוגית אחת ושישה שכפולים טכניים.

  1. צנטריפוגה הדרגתית צפיפות לבידוד PBMCs מהדם הפריניזציה
    1. מערבבים היטב את הדם על ידי הפיכתו פי 10.
    2. באמצעות פיפטה 10 מ"ל, להעביר 20 מ"ל של דם heparinized לצינור סטרילי 50 מ"ל, ולדלל אותו עם 10 מ"ל של מלוחים חוצץ פוספט (PBS).
    3. פיפטה 15 מ"ל של בידוד לימפוציטים בינוני לצינור סטרילי 50 מ"ל.
      הערה: יש לאפשר למדיום המבודד לימפוציטים להגיע לטמפרטורת החדר לפני הפיפטה.
    4. הטה את צינור 50 מ"ל המכיל את מדיום בידוד הלימפוציטים למצב של 45°. הצבע על קצה פיפטה 25 מ"ל בניצב, ושכב בזהירות את 30 מ"ל הדם PBS על גבי מדיום בידוד הלימפוציטים, מבלי לערבב את השניים. לאט מאוד, להחזיר את הצינור 50 מ"ל למצב אנכי.
    5. צנטריפוגה ב-800 × גרם למשך 35 דקות ב-20°C עם האצה מרבית וללא בלימה (פונקציית ההאטה כבויה).
    6. השתמש פיפטה פסטר לאסוף את שכבת PBMC (השכבה הלבנה הדקה מיד אחרי השכבה הראשונה של פלזמה) ולהעביר אותו לתוך צינור חדש 50 מ"ל.
      הערה: צנטריפוגת שיפוע צפיפות מפרידה דם שלם לשכבות שונות. כתוצאה מכך, אריתרוציטים להתיישב בתחתית כמו גלולה, תאים mononuclear (PBMCs) להתיישב בשכבת הממשק, ואת פלזמה יוצר את השכבה העליונה. גרנולוציטים נמצאים בין הגלולה לבין שכבת PBMC.
    7. שטפו את מרכזיות הקטיף פי 2 על ידי הוספת PBS עד לנפח של 40 מ"ל וערבוב יסודי על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 500 × גרם ב 4 ° C במשך 7 דקות עם תאוצה מקסימלית האטה מקסימלית.
    8. יש להשליך את הסופרנאטנט על ידי הקנטה, להשהות מחדש את הגלולה ב-15 מ"ל של מאגר אמוניום-כלוריד-אשלגן (ACK) אחד, ולדגור בטמפרטורת החדר למשך 10-15 דקות.
      הערה: אין לדגור במשך יותר מ-15 דקות. מאגר ACK זמין מסחרית משמש כדי להבטיח את הליזה של תאי הדם האדומים שיורית (RBCs) נוכח בחלק PBMC.
    9. הוסף PBS לנפח של 40 מ"ל, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 500 × גרם ו 4 ° C במשך 7 דקות עם האצה והאטה מרביות.
    10. השליכו את הסופרנאטנט על ידי דקאנט, וחזרו על שלב 1.1.9.
    11. השליכו את הסופרנטנט, והשהו מחדש את הגלולה ב-10 מ"ל של מדיום תרבית שלם (בטמפרטורת החדר).
      הערה: מדיום התרבית המלא מורכב ממדיום תרבית תאים RPMI 1640 בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין.
  2. הפרדה מגנטית של תאי CD14+/− מאוכלוסיית PBMC באמצעות חרוזים מגנטיים מצומדים CD14
    1. ספור את התאים עם מונה תאי המוציטומטר נקי באמצעות 10 μL של תרחיף תאים מעורבב עם 10 μL של תמיסת טריפאן כחול (0.4%).
      הערה: צבע כחול טריפאן הוא כימיקל רעיל ומסרטן פוטנציאלי. יש לטפל בו בעת לבישת ציוד מגן אישי (PPE) כדי למנוע מגע, ויש להשליך את הפסולת במיכל אטום מיוחד לפסולת רעילה. תאים מתים ייראו כחולים, ואילו תאים חיים ייראו צלולים מתחת למיקרוסקופ.
    2. צנטריפוגה למשך 7 דקות ב 500 × גרם.
    3. השליכו את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה, והשהו מחדש את הגלולה במאגר מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS) באמצעות נפח של 40 μL לכל 1 × 107 תאים. מערבבים היטב בעזרת פיפטה.
      הערה: מאגר FACS מורכב מ-2% FBS ו-2 mM חומצה אתילאנדיאמין-טטראצטית (EDTA) המומסת ב-PBS.
    4. הוסף 5 μL של CD14 microbead buffer לכל 1 × 107 תאים, וערבב היטב באמצעות פיפטה.
    5. יש לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורה של 4-8 מעלות צלזיוס לבחירה חיובית של מונוציטים CD14+ בקר33. מערבולת כל 15 דקות במהלך תקופת הדגירה.
    6. שלב אופציונלי (לניתוח ציטומטריית זרימה): הוסף 10 μL של נוגדן מכתים CD14-FITC (fluorescein isothiocyanate) עם דגירה עוקבת למשך 15 דקות ב 4-8 ° C. עיין בניתוח ציטומטריית זרימה בשלב 5 לקבלת פרטים.
    7. הוסף 1 מ"ל של מאגר FACS, וצנטריפוגה למשך 7 דקות ב 500 × גרם.
    8. השליכו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של חיץ FACS לכל 1 × 108 תאים.
    9. הכנס את עמודת הפרדת התאים האימונומגנטית למפריד (מחזיק הטור המגנטי), ומקם צינור איסוף של 15 מ"ל מתחת לשקע העמוד לאיסוף הזרימה.
    10. שטפו את העמוד עם 1 מ"ל של מאגר FACS נטול גזים. לאחר השטיפה, החלף את הצינור המשומש של 15 מ"ל בחדש.
    11. אפשר לתרחיף התא (משלב 1.2.8) לעבור דרך העמודה על-ידי צנרת 1 × 108 תאים במאגר של 500 מיקרוליטר בכל פעם.
      הערה: שימו לב לא ליצור בועות אוויר בעת ערבוב התאים לפני שתאפשרו להם לעבור דרך העמודה.
    12. שטפו את העמוד 3x עם 3 מ"ל של מאגר FACS נטול גז בכל פעם.
    13. אסוף את הזרימה, ותייג את החלק המדולל הראשון הזה כשבר תא CD14 (PBMCs פחות מונוציטים CD14+ ); זה נקרא גם מקטע הלימפוציטים הנאיביים.
      הערה: תאי CD14− נשמרים בתווך תרבית שלם עד לייצור MoDCs עם פעימות אנטיגן.
    14. הסר את העמודה מהמפריד.
    15. מניחים צינור סטרילי חדש בנפח 15 מ"ל מתחת לעמוד לאיסוף הקולחים.
    16. פיפטה 5 מ"ל של חיץ FACS לתוך העמודה, ומיד לדחוף אותו באמצעות בוכנה.
    17. אסוף את הזרימה, ותייג את החלק המדולל השני הזה כשבר התא CD14+ ; זה נקרא גם שבר מונוציטים נאיבי.
    18. הוסף מדיום תרבית שלם למונוציטים CD14+ שנקטפו כדי להשיג 1 × 106 תאים / מ"ל.
      הערה: ספור את התאים החיים במקטע התא המדולל CD14+ כדי להעריך את נפח מדיום התרבית המלא הדרוש להשגת ספירת התאים הרצויה.
    19. קח צלחת סטרילית של 24 בארות, והוסף 1 מ"ל של תרחיף התא (1 × 106 תאים / מ"ל) לכל באר.
  3. בידול של מונוציטים נאיביים CD14+ ל-MoDCs נאיביים על ידי תוספת של קוקטייל ציטוקינים 3% w/v (GM-CSF + IL-4) עם סך של 5 ימי דגירה
    1. יש להוסיף לכל באר המכילה מונוציטים מסוג CD14+ 40 μL (3% w/v) של קוקטייל הציטוקינים המסופק בערכה.
    2. לדגור את הצלחת באינקובטור לח עם 5% CO2 וב 37 ° C במשך 48 שעות.
    3. ביום השני, העבירו מחצית מתכולת כל באר (500 מיקרוליטר) באמצעות פיפטה לצינורות בודדים של 1.5 מ"ל, וצנטריפוגה בטמפרטורה של 500 × גרם ב-4°C למשך 7 דקות.
    4. השליכו את הסופרנטנט, ותלו מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של מדיום תרבית שלם ורענן.
    5. העבר 500 μL של תרחיף תא זה משלב 1.3.4 בחזרה לכל באר ייעודית, כך שהנפח הסופי הוא 1 מ"ל.
    6. העשירו כל באר ב-20 מיקרוליטר קוקטייל ציטוקינים.
    7. לדגור על התרבית במשך 72 שעות באינקובטור לח עם 5% CO2 וב 37 ° C.
    8. לאחר הדגירה ביום 5, מוציאים את הצלחת מהאינקובטור.
      הערה: כל באר תכיל 1 מ"ל של תרחיף תאים של MoDCs נאיביים. מספר MoDCs יהיה אחוז (~ 20%) מהמונוציטים המקוריים המצופים (1 × 106/מ"ל).

2. בדיקת פעילות אנדוציטית של MoDC

הערה: בדיקת ספיגת האנטיגן או בדיקת הפעילות האנדוציטית מודדת את יכולתם של משרדי משרד תמימים להפנים חומר זר. בצע את הבדיקה באמצעות MoDCs נאיביים בתרבית עם קוקטייל ציטוקינים 3% w / v ועם 5 ימי דגירה, כפי שתואר קודם34.

  1. קצרו את מתלה תאי MoDC התמימים מצלחת 24 הקידוחים, והעבירו אותו לצינור של 15 מ"ל; כמו כן לאסוף את כל התאים שיורית על ידי שטיפת הבארות עם PBS.
  2. צנטריפוגה ל-500 × גרם למשך 7 דקות. להשליך את supernatant, ולהשעות מחדש את הגלולה ב 1 מ"ל של מדיום תרבית בתוספת 1% FBS.
  3. ספור את תאי MoDC החיים כדי להעריך את נפח התווך הדרוש להשגת ספירת התאים הרצויה (2 × 10,5 תאים/מ"ל).
  4. תרבית את ה-MoDCs התמימים ב-100 מיקרוליטר של מדיום תרבית שלם בצלחת של 24 בארות עם ריכוז תאים סופי של 2 × 105 תאים/מ"ל.
  5. יש להוסיף לכל באר דקסטרן מצומד במינון 1 מ"ג/מ"ל FITC (בדיקה פלואורסצנטית המשמשת כעוקב אנדוציטוזה).
    הערה: FITC-dextran פועל כבדיקה פלואורסצנטית ומשמש כעוקב אנדוציטוזה.
  6. מכסים את הצלחת ודורים בחושך בטמפרטורה של 5% CO2 ו-37°C למשך 60 דקות.
    הערה: עבור בקרת הרקע, דגרו על תאי MoDC נוספים (2 × 105 תאים/מ"ל) עם 1 מ"ג/מ"ל FITC-דקסטרן על קרח, מכיוון שסוג זה של דגירה מונע את כניסתה של מולקולת הנותב (FITC-dextran) לתוך התאים.
  7. לאחר הדגירה, מיד להעביר את צלחת 24 באר על קרח כדי לעצור את אנדוציטוזה של FITC-dextran.
  8. שטפו את התאים עם מאגר FACS קר כקרח.
  9. קציר, צנטריפוגה והשעיה מחדש של הגלולה ב-500 מיקרוליטר של חיץ FACS.
  10. נתח את עוצמת הפלואורסצנטיות של FITC-דקסטרן בתוך התאים באמצעות ציטומטריית זרימה. עיין בניתוח ציטומטריית זרימה בשלב 5.2 לקבלת פרטים.

3. ייצור של MoDC בפולסי אנטיגן

הערה: חיסון זמין מסחרית ומאושר קלינית נגד נגיף הכלבת (RV) יכול לגרום להבחנה של MoDCs נאיביים ל-MoDCs בוגרים מציגי אנטיגן. השתמש ב-0.1% (~1 μL) של מנת חיסון אחת נגד קרוואנים כדי לייצר MoDCs עם פעימות אנטיגן. יתר על כן, עדיף לייצר MoDCs בפולסי RV באותה לוחית תרבית המשמשת (בשלב 1.3.8) ליצירת MoDC נאיביים, מכיוון שהעברת MoDCs נאיביים לצלחת חדשה בת 24 בארות תשפיע עליהם לרעה.

  1. משלב 1.3.8) הוסף 1 μL/mL של מתלה RV ל-1 מ"ל של תרבית MoDC נאיבית בלוח 24 הקידוחים, ודגור במשך 48 שעות ב-5% CO2 ו-37°C.
    הערה: MoDCs נאיביים בתרבית ללא גירוי RV משמשים כבקרת רקע (וכגירוי לא ספציפי לתרבית משותפת עם לימפוציטים בשלבים הבאים).
  2. לאחר הדגירה, ביום השביעי, יש לשמור את הצלחת בת 24 הקידוחים המכילה את פעימות האנטיגן MoDCs על קרח למשך 10 דקות.
  3. הוסף 1 מ"ל של PBS קר כקרח לכל באר. מערבבים היטב כל באר על ידי פיפטינג, ומעבירים את המתלה לצינור 15 מ"ל.
  4. שטפו את הבארות עם 2 מ"ל של PBS קר כקרח כדי לאסוף את התאים השיוריים שנותרו בתוך כל באר.
  5. מעבירים את התכולה לצינורות המתאימים שלהם, וצנטריפוגו את תרחיף התא ב 500 × גרם למשך 7 דקות.
  6. יש להשליך את הסופרנטנט, להשהות מחדש את כדורית התא (MoDCs בפולסי אנטיגן) בתווך תרבית שלם, ולהתאים את עוצמת הקול לריכוז התא הסופי של 1 × 105 תאים/מ"ל.
    הערה: ספור את התאים החיים כדי להעריך את נפח התווך הדרוש להשגת ספירת התאים הרצויה. השתמש ב- MoDCs פועמים של קרוואנים מהיום השביעי עבור מערכת התרבית המשותפת של לימפוציטים MoDC.

4. תרבית משותפת של לימפוציטים MoDC

הערה: מערכת התרבות המשותפת של לימפוציטים MoDC במבחנה קובעת את היכולת של MoDCs לראשוני לימפוציטים ספציפיים לאנטיגן. קבוצות הטיפול השונות של תאים לאחר 16 ימים של תרבית משותפת כוללות ספציפיות, לא ספציפיות וביקורת. הקבוצה הספציפית מוגדרת כלימפוציטים בתרבית משותפת עם MoDCs פועמים של RV; הקבוצה הלא ספציפית מוגדרת כלימפוציטים בתרבית משותפת עם MoDCs שאינם פועמים באנטיגן; וקבוצת הביקורת מוגדרת כלימפוציטים בתרבית ללא MoDCs.

  1. הוסף מדיום תרבית שלם למקטע הלימפוציטים הנאיבי המדולל (תאי CD14- ) כדי להשיג ריכוז תאים של 2 × 106 תאים / מ"ל.
    הערה: ספור את התאים החיים בתרבית התאים CD14 שנשמרו בתווך תרבית שלם בצלחת של 24 בארות מאז איסופם כדי להעריך את נפח התווך הדרוש להשגת ספירת התאים הרצויה.
  2. ביום השביעי, קחו צלחת סטרילית של 24 בארות, וזרעו את הבארות עם 1 מ"ל של תרחיף תאי לימפוציטים נאיבי (2 × 106 תאים/מ"ל) בתוספת 1 מ"ל של תרחיף MoDC בפולס אנטיגן או ללא פעימות אנטיגן (1 × 105 תאים/מ"ל).
    הערה: הנפח הכולל בכל באר יהיה 2 מ"ל עם יחס של 1:20 MoDCs ללימפוציטים לכל באר.
  3. לדגור על הצלחת במשך 48 שעות ב 37 ° C ו 5% CO2.
  4. העשרה ורסטימולציה בתרבית עם MoDCs בפולסי אנטיגן
    1. לאחר הדגירה של תרבית לימפוציטים MoDC-פועמת אנטיגן, ביום 9, להשלים כל באר עם 20 ng/mL רקומביננטי IL-2, ולהמשיך לדגור עוד 120 שעות (5 ימים דגירה).
    2. ביום ה-14, העבירו 1 מ"ל של התרבית המשותפת לצינור סטרילי של 1.5 מ"ל, וצנטריפוגה ב-500 × גרם למשך 7 דקות.
    3. השליכו את הסופרנטנט, והשהו מחדש את כדורית התא עם 1 מ"ל של MoDCs דופקי אנטיגן או לא פועמים (1 × 105 תאים/מ"ל). מערבבים בעדינות על ידי פיפטינג, ומעבירים את מתלי התאים בחזרה לבארות המיועדות להם.
      הערה: בשלב זה, הנפח הכולל בכל באר הוא 2 מ"ל.
    4. המשך עם הדגירה ב 5% CO2 ו 37 ° C במשך 48 שעות. לאחר הדגירה ביום ה -16, התרבות המשותפת מוכנה לניתוח באמצעות ציטומטריית זרימה, qPCR ו- ELISA.
      הערה: עבור כל 2 מ"ל בכל באר של תרבית לימפוציטים MoDC, 1 מ"ל של תאים מרחפים מוכתמים עבור ציטומטריית זרימה, 1 מ"ל משמש למיצוי RNA, והסופרנאטנטים משניהם משמשים עבור ELISA.

5. ניתוח ציטומטרי זרימה

הערה: צבעו את התאים בסמנים מתאימים/mAb לפני הפעלת הדגימות על ציטומטר זרימה. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על ריאגנטים (צביעת mAb ופקדי איזוטיפ), ערכה, מכשיר ותוכנה המשמשים לניתוח ציטומטריית זרימה.

  1. פרוטוקול צביעת ציטומטר זרימה
    הערה: בצע צביעה של פני השטח של התא עבור PBMCs ולימפוציטים ומונוציטים נאיביים באמצעות anti-CD14 mAb (שלב 1.2.6). לצביעת פני התא של MoDCs נאיביים, השתמש ב- mAb ספציפי ל- CD86, ספציפי ל- CD40 וספציפי ל- MRC II. עבור צביעת פני התא של תאים מהיום 16 תרביות משותפות, להשתמש אנטי CD4, אנטי CD8, אנטי CD25 mAbs; עבור צביעה תוך תאית, להשתמש אנטי Ki-67 mAb. יתר על כן, להכתים את התאים עם בקרת איזוטיפ שלילי mAb או ללא mAb (FMO: פלורסנט מינוס אחד). ההבדל העיקרי בעת צביעה עבור פני השטח וסמנים תוך תאיים הוא כי עבור סמנים פני התא, התאים חייבים להיות מוכתמים עם mAb משטח ספציפי לפני צביעה חיה / מת (L / D) או כל תהליך אחר. עם זאת, צביעה תוך תאית מבוצעת לאחר צביעת L/D ודורשת קיבוע בתוספת שלב חדירה כדי לאפשר חדירה תוך תאית.
    1. מעבירים 1 מ"ל של תרחיף תאים לצינור סטרילי של 1.5 מ"ל באמצעות פיפטה, וצנטריפוגה למשך 10 דקות ב 500 × גרם.
      הערה: לאחר צנטריפוגה, בעת עיבוד התאים מתרבית משותפת של לימפוציטים MoDC, שמור את הסופרנאטנט לניתוח ELISA.
    2. להשעות את הגלולה ב 1 מ"ל של PBS, ולהעביר אותו צינור 15 מ"ל. לאסוף את התאים שיורית באמצעות 1 מ"ל של PBS, ולשלב את זה עם גלולה resuspended.
    3. הוסף 10 מ"ל PBS לצינור 15 מ"ל המכיל את התאים, ערבב על ידי פיפטינג וצנטריפוגה במשך 7 דקות ב 850 x גרם.
    4. השליכו את הסופר-נטנט וחזרו על שלב 5.1.3.
    5. השליכו את הסופרנטנט, והשעו בזהירות את כדורית התא עם המתלה השיורי (כ-180 מיקרוליטר) שנותר לאחר פירוק הסופרנטנט.
    6. מעבירים את מתלה התא לצלחת V בעלת 96 בארות, ואטמו את הבארות כדי למנוע שפיכה.
    7. צנטריפוגה את הצלחת ב 1,400 × גרם במשך 5 דקות. לאחר הצנטריפוגה, העבירו את הצלחת מעל מיכל פסולת כדי לרוקן את בארות הנוזלים, והקישו על הצלחת על נייר סופג כדי להבטיח סילוק נוזלים עודפים.
    8. יש להוסיף 25 μL של תערובת מאסטר לצביעת פני השטח לכל באר, ולערבב בעדינות באמצעות פיפטה, ולאחר מכן לדגור בחום של 4°C למשך 30 דקות.
      הערה: כדי להכין תערובת מאסטר לצביעת משטח עבור באר אחת, הוסף 2.5 μL של mAb משטח ל- 20 μL של מאגר FACS.
    9. הוסף 200 μL של חיץ FACS לכל באר, וצנטריפוגה ב 1,400 × גרם למשך 5 דקות. לאחר הצנטריפוגה, רוקנו את הבארות מנוזלים על ידי ניקוז, והקישו על הצלחת על נייר סופג כדי להסיר נוזלים עודפים.
    10. הוסף 100 μL של תמיסת צביעה L/D לכל באר. מערבבים היטב באמצעות פיפטה, ולאחר מכן דגירה ב 4 ° C במשך 15 דקות בחושך.
      הערה: עבור באר יחידה, יש להמיס 0.25 μL של צבע L/D ב-100 μL של חיץ FACS. צבע L/D מסייע להבחין בין תאים חיים ומתים.
    11. הוסף 100 μL של מאגר FACS. מכסים את הבארות במכסה, וצנטריפוגות את הצלחת למשך 1,400 × גרם למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנאטנט על ידי דקאנט, והקישו על הצלחת על נייר סופג.
    12. חזור על שלב 5.1.11.
    13. מוסיפים 50 מיקרוליטר של תמיסת קיבוע לכל באר (מסופקת עם הערכה), ומערבבים עם פיפטה לפני הדגירה על הצלחת בטמפרטורת החדר בחושך למשך 10 דקות.
    14. הוסף 150 μL של 1x permebilization-wash buffer (PW) שסופק עם הערכה, ולכסות את הבארות עם המכסה.
      הערה: כדי להכין 10 מ"ל של 1x PW buffer, לדלל 1 מ"ל של 10x perm buffer ב 10 מ"ל של dH2O.
    15. צנטריפוגה את הצלחת ב 1,400 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנאטנט על ידי דקאנט, והקישו על הצלחת על נייר סופג.
    16. הוסף 200 μL של 1x PW, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 1,400 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנאטנט על ידי דקאנט, והקישו על הצלחת על נייר סופג.
    17. עבור צביעה תוך תאית, להוסיף 25 μL של צביעה תאית תערובת אב צביעה (Ki-67 mAb אנטי אנושי) לכל באר. מערבבים היטב, ודגרים על הצלחת במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס או על קרח בחושך.
      הערה: כדי להכין תערובת אב צביעה תוך תאית לבאר אחת, הוסף 1 μL של Ki-67 mAb ל- 24 μL של 1x PW. סמן הצביעה התוך-תאי משמש רק בעת עיבוד תאים מהיום ה-16 לתרבית משותפת. צביעה תוך תאית אינה נעשית בעת עיבוד PBMCs, לימפוציטים נאיביים, מונוציטים ו- MoDCs נאיביים.
    18. לאחר הדגירה, יש להוסיף 200 μL של 1x PW לכל באר. מערבבים עם פיפטה וצנטריפוגה 1,400 × גרם במשך 5 דקות. השליכו את הסופרנאטנט על ידי דקאנט, והקישו על הצלחת על נייר סופג.
    19. הוסף 200 μL של חיץ FACS, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 1,400 × גרם במשך 5 דקות. השליכו את הסופרנאטנט על ידי דקאנט, והקישו על הצלחת על נייר סופג.
    20. השהה מחדש את גלולת התא ב -200 מיקרוליטר של מאגר FACS, והעבר את התוכן של כל באר לצינורות ציטומטר זרימה סטריליים נפרדים. השתמש 300 μL של חיץ FACS לכל באר כדי לאסוף את התאים שיורית. התאים מוכנים כעת לניתוח ציטומטריית זרימה.
  2. הפעלת הדגימה על ציטומטר זרימה
    הערה: הדגימות הופעלו על ציטומטר זרימה (באמצעות לייזרים של 488 ננומטר, 638 ננומטר ו- 405 ננומטר) על פי מדריך היצרן35. עיין במדריך לקבלת פרטים, פתרון בעיות והתאמה אישית של הפרוטוקול.
    1. בצע הליכי ניקוי שגרתיים לפני ואחרי קריאת הדגימות.
      הערה: אין לדלג על מיקום בעת טעינת הצינורות במכשיר.
      1. עבור מחזור הניקוי, השתמש בסך הכל בארבעה צינורות, כאשר הצינור הראשון מכיל מגיב ניקוי זרימה ושלושת הצינורות הנותרים מכילים dH2O; כל צינור יהיה 3 מ"ל. במהלך ריצת הניקוי, קבל נתונים עם קצב זרימה בינוני למשך כדקה אחת על ידי לכידת 100,000 אירועים לכל צינור מתחת ל- 330 V עבור פיזור קדימה (FSC) לעומת 265 V עבור פיזור צדדי (SSC).
        הערה: אין לדווח על לכלוך או אירועים סלולריים במהלך הניקוי; במקרה כזה, בצעו שוב את שלב הניקוי. להפעלת הדגימות, ודא שכל הדגימות נמצאות בהשעיה הומוגנית לפני קבלת הנתונים מכיוון שהדבר מבטיח קריאה מדויקת.
    2. כדי לחבר ולהפעיל את הציטומטר, לחץ על כפתור היישום הממוקם בפינה השמאלית של פס הכותרת. מהתפריט הנפתח של היישום , בחר באפשרות Cytometry ולחץ על האפשרות Power On.
      הערה: מהתפריט הנפתח של היישום , האפשרות פתח מאפשרת למשתמשים לעיין בבדיקות שתוכנתו מראש, בעוד שהאפשרות פרוטוקול חדש מאפשרת למשתמשים ליצור פרוטוקולים חדשים.
    3. בתחילה לטעון את דגימת הבקרה השלילית במחזיק multi-tube. בחר פרוטוקול חדש והתבונן ברשימת העבודה בצד שמאל של סביבת העבודה /המסך.
    4. ברשימת העבודה, הגדר את מיקום הדגימה במחזיק הרב-צינורות, ותן שם לדגימה ולפרוטוקול לזיהוי.
    5. מלוח החומרה הממוקם בצד שמאל של סביבת העבודה, התאם ובחר פרמטרים מרובים כגון הגלאים (FSC, SSC ו- 10 טווחי פלואורסצנציה), המתחים (V ) והרווחים של מכפילי האור, והשטח-גובה-רוחב (AHW) של האות.
      הערה: ההגדרות הבאות עבור הגלאים נבחרו בהתבסס על הניסוי והמכשיר בו נעשה שימוש: FSC-AHW: AHW, V: 270, G: 5; SSC-AHW: A, V: 350, G: 10; FL1 (CD8/FITC Dextran)-AHW: A, V: 400, G: 1; FL2 (CD25/PE)-AHW: A, V: 500, G: 1; FL6 (CD4/Alexa Fluor 647)-AHW: A, V: 700, G: 1; FL7 (Ki-67/Alexa Fluor 700)-AHW: A, V: 625, G: 1; FL9 (L/D)-AHW: A, V: 425, G: 1.
    6. מלוח הבקרה של רכישת המכשירים הממוקם מתחת לפס הכותרת, התאם את האפשרויות עבור קצב זרימה (בינוני), זמן (5 דקות) ואירועים (ראה שלב 5.2.8) הרצויים לזיהוי. לחץ על האפשרות רכוש יחיד כדי לאפשר למכשיר לצייר / להפעיל את הדגימה ולהציג את התצוגה המקדימה בזמן אמת של האירועים שזוהו.
    7. מהתצוגה המקדימה בזמן אמת, התאם את סף הפלואורסצנטיות (מתח ורווח) ואת גודל התא כדי לצייר בסופו של דבר שערים סביב אוכלוסיית התאים הרצויה תוך אי הכללת פסולת תאית.
      הערה: FSC מסייע להבחין בין תאים על בסיס גודל, ובכך מאפשר למשתמשים להבדיל בין תאים של המערכת החיסונית, כגון מונוציטים ולימפוציטים; מונוציטים גדולים יותר ומראים עוצמת FSC גבוהה יותר בהשוואה ללימפוציטים.
    8. לרכוש סך של כ-5,000 MoDC חיים, 50,000 לימפוציטים חיים ו-50,000 אירועי מונוציטים חיים.
    9. לאחר שכל הפרמטרים מותאמים בהתייחסות למדגם הבקרה השלילית, לחץ על עצור ושמור את הפרוטוקול.
    10. כעת טען את כל הדגימות על המעמיס מרובה הצינורות. הגדר כל דגימה ברשימת העבודה, והחל את הפרמטרים המותאמים ביחס לבקרה השלילית על כל הדגימות בניסוי. לחץ על האפשרות רכוש כדי לאפשר את כל הדגימות בניסוי לרוץ ברציפות.
    11. לאחר רכישת הנתונים מכל הדגימות, שמור והפוך לנתונים קריאים באמצעות תוכנת ניתוח נתונים מתאימה המאפשרת יצירת היסטוגרמות דו-פרמטריות ומונו-פרמטריות רציפות.

6. ניתוח ביטוי רנ"א שליח (mRNA)

  1. מיצוי RNA
    הערה: חלץ את סך כל הרנ"א מהתרבות המשותפת של לימפוציטים MoDC-פועמים באנטיגן (ספציפי), מהתרבות המשותפת של לימפוציטים MoDC ללא פעימות אנטיגן (לא ספציפי), מתרבית הלימפוציטים ללא MoDCs (בקרה), ומלימפוציטים נאיביים (CD14-תאים שבודדו לפני תרבית משותפת). עבור מיצוי RNA, להכין אתנול באמצעות מים ללא RNase. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על ערכת המיצוי והריאגנטים.
    1. העבר 1 מ"ל של תרחיף תאים מצלחת התרבית המשותפת של לימפוציטים MoDC (~ 1 × 106 תאים / מ"ל) לצינור סטרילי 1.5 מ"ל באמצעות פיפטה, וצנטריפוגה למשך 10 דקות ב 500 × גרם.
    2. שמור את supernatant עבור ELISA. להשעות מחדש את גלולת התא ב 1 מ"ל של PBS, ולהעביר אותו צינור 15 מ"ל. אסוף תאים שיוריים באמצעות 1 מ"ל של PBS.
    3. צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 500 × גרם.
      הערה: יש לטפל בכל הדגימות בעדינות כתאים חיים עד לביצוע ליזה התאית באמצעות חיץ הליזיס המסופק בערכה. מוות תאי משחרר RNases שמבצע הידרוליזה מהירה של תבניות הרנ"א הדרושות לכימות במורד הזרם. חיץ RLT ממקם תאים בתמיסה המעכבת RNases.
    4. מוסיפים 350 μL של חיץ ליזה לכל באר ריקה, ודגרים במשך 2-3 דקות כדי ליזה את התאים הדבקים שלא נקטפו בשלבים הקודמים.
    5. לאחר השלמת הצנטריפוגה בשלב 6.1.3, השליכו את הסופרנטנט ושלבו את גלולת התא עם 350 מיקרוליטר של חיץ ליזיס שנוסף בשלב 6.1.4.
      הערה: בשלב זה, ניתן לאחסן את הצינורות ב -80 ° C או להמשיך עם מיצוי RNA (השלבים הבאים).
    6. פיפטה 350 μL של 70% אתנול לליזט בשלב 6.1.5. הנפח הסופי לדגימה הוא 700 μL.
    7. הכנס את עמוד החילוץ בתוך צינור איסוף של 2 מ"ל (מצורף לערכה).
    8. מעבירים את 700 מיקרוליטר הדגימה לכל עמודת חילוץ, וצנטריפוגה ב-10,000 × גרם למשך 15 שניות. השליכו את הזרימה בצינור האיסוף, והחזירו אותה לעמוד הסיבוב.
    9. בעמודת החילוץ, הוסף 350 μL של חיץ כביסה מחמיר (מסופק בערכה), וצנטריפוגה ביותר מ -10,000 × גרם למשך 15 שניות. מחק את הזרימה.
    10. הוסף 80 μL של תערובת דגירה DNase I לכל דגימה על הממברנה של עמודת החילוץ, ולאפשר לו להגדיר במשך 15 דקות ב 20-30 ° C.
      הערה: כדי להכין תערובת דגירה של DNase I לדגימה, הוסף 10 μL של תמיסת מלאי DNase I ל- 70 μL של מאגר DNase לקבלת נפח סופי של 80 μL. ערבב היטב על ידי היפוך הצינור מספר פעמים, ולאחר מכן סיבוב קצר בצנטריפוגה.
    11. שטפו את עמוד השאיבה עם 350 מיקרוליטר של חיץ כביסה מחמיר, ולאחר מכן צנטריפוגה בעוצמה של 10,000 × גרם למשך 15 דקות. יש להשליך את הזרימה בצינור האיסוף לאחר הצנטריפוגה.
    12. יש לשטוף את עמוד החילוץ 2x עם 500 μL של חיץ שטיפה עדין בכל פעם ועם צנטריפוגה ב 10,000 × גרם במשך 15 שניות ופעם שנייה במשך 2 דקות. השליכו את הזרימה לאחר כל צנטריפוגה.
    13. צנטריפוגו את העמוד במהירות מרבית למשך דקה אחת כדי לייבש את הממברנה, והשליכו את צינור האיסוף.
    14. מניחים את עמוד החילוץ בצינור איסוף חדש של 1.5 מ"ל.
    15. פיפטה 50 μL של מים נטולי RNase על קרום העמוד, ולדגור במשך 3-5 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: עבור ריכוזי RNA מתחת ל-100 ננוגרם, יש להפחית את נפח ה-elution ל-30 μL, ולשלול מחדש את קרום עמוד החילוץ באמצעות המוצר מהאלוציה הראשונה כדי לרכז את המוצר הסופי.
    16. צנטריפוגה ב 10,000 × גרם למשך דקה אחת כדי להוציא את הרנ"א.
    17. למדוד את ריכוז RNA על ידי זיהוי ספיגה ב 260 ננומטר באמצעות 0.5-2 μL של דגימה. התאם את ריכוז הרנ"א הסופי ל-0.1-1 מיקרוגרם/μL באמצעות מים נטולי RNase.
    18. אחסן את aliquots RNA ב -80 ° C לשימוש מאוחר יותר.
  2. סינתזה של DNA משלים
    1. סנתז DNA משלים (cDNA) מ-RNA תבנית מופק בהתאם לפרוטוקול היצרן שסופק עם הערכה (עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים).
      הערה: סיכום של הריאגנטים ואמצעי האחסון שבהם נעשה שימוש מוצג בטבלה 1 ובטבלה 2. פרוטוקול מלא מפורט בקובץ משלים 1.
  3. תגובת שרשרת כמותית בזמן אמת של פולימראז
    1. עבור qPCR, הפעל את דגימות cDNA בטריפליקטים. כמת את רמות התמליל של mRNA בקר עבור Ki-67 ו- IFN-γ באמצעות ערכות פריימר ספציפיות בהתייחסות לגן GAPDH , כפי שמוצג בטבלה 3.
      הערה: פרוטוקול מלא מפורט בקובץ משלים 1.

7. בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים

  1. עבד את תרביות העל שנאספו עשירות בחלבוני הפרשה לכימות IFN-γ באמצעות ELISA.
    הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על השימוש בערכה. פרוטוקול מלא מפורט בקובץ משלים 1.

8. ניתוח סטטיסטי

  1. לנתח את הנתונים, ולעשות איורים גרפיים של עיצוב ניסיוני באמצעות תוכנה מסחרית. השתמש במבחן לא פרמטרי לא מזווג לניתוח השוואתי. שקול ערכי P < 0.05 כמובהקים סטטיסטית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מתודולוגיה זו מתארת את הדור במבחנה של MoDCs בקר להערכת אנטיגנים מועמדים לחיסון לפני ביצוע מחקרי in vivo. איור 1 מדגים את התוכנית הניסיונית של יצירת MoDC בקר ואת היישום של MoDCs עבור בדיקות במבחנה. באמצעות טכניקת מיון תאים מבוססת מגנטיות, ניתן היה לאסוף כ -26 מיליון מיוציטים CD14+ מה- PBMCs שנקטפו, אשר בודדו בעבר מ -50 מ"ל של דם בקר. מקטע התא המדולל ללא מונוציטים CD14+ היה עשיר בלימפוציטים ושימש כמקור לתאי T נאיביים CD4+ ו- CD8+ (מקטע תאי לימפוציטים CD14).

מקטע המונוציטים התמים היה מורכב מ-98% תאי מונוציטים CD14+, כפי שנצפה לאחר צביעת תאי CD14 וציטומטריית זרימה (איור 2A,B). תאי המונוציטים הנאיביים המטוהרים, כאשר הם נתונים לתרבית בנוכחות קוקטייל ציטוקינים 3% (GM-CSF ו- IL-4) עם דגירה עוקבת של 5 ימים, התמינו לפנוטיפ דמוי DC. מתרבית התחלתית של 26 מיליון מונוציטים CD14+, ניתן היה להשיג סך של כ -12 מיליון MoDCs לאחר 5 ימי דגירה. ה-MoDCs הנאיביים היו מסוגלים מבחינה תפקודית לקלוט אנטיגן, כפי שנצפה באמצעות ניתוח ציטומטריית זרימה של FITC-dextran (איור 3). יתר על כן, ה-MoDCs הנאיביים אופיינו פנוטיפית על-ידי הערכת הביטוי של MHC class II וסמנים של תאי CD86 ו-CD40 מגרים קו-סטימולטוריים, אשר אימתו את הפנוטיפ דמוי DC (איור 4).

גירוי פעימות האנטיגן של MoDCs נאיביים הושג על ידי גידולם בנוכחות RV מומת במשך יומיים. ההפעלה של לימפוציטים נאיביים (מקטע התא CD14) הושגה על ידי תרבית לימפוציטים MoDC-לימפוציטים בפולסים אנטיגן יחד עם תוספת של IL-2 לאחר מכן. במהלך התרבית המשותפת של לימפוציטים של MoDC ביום ה-9, נצפה שינוי מורפולוגי ב-MoDCs עם פעימות RV, כאשר הם הראו התרחבות דנדריטים, שהיא מאפיין של הבשלת MoDC (איור 5). ביום ה-14, הפעלת הלימפוציטים השתפרה על-ידי שחזור התרבית המשותפת באמצעות תוספת של MoDCs חדשים שיוצרו בפולסי קרוואנים מאותה חיה.

בהשוואה לתרבית המשותפת של לימפוציטים MoDC-לימפוציטים ללא פעימות, הודגמה עלייה משמעותית (p < 0.01) בהתפשטות הלימפוציטים על-ידי הגברת הוויסות של סמני ההפעלה Ki-67 ו-CD25 הן בתאי CD4+ והן בתאי CD8+ T ביום ה-16 בתרבית המשותפת של לימפוציטים MoDC-לימפוציטים פועמים (איור 6). תאי CD8+ T מתרביות MoDC בוגרות עם פעימות RV הציגו ויסות מוגבר פי שמונה (p < 0.01) של Ki-67 בהשוואה לקבוצה הלא ספציפית (איור 7A). תאי CD4+ T באותה תרבית משותפת הראו עלייה של פי שבעה (p < 0.01) ב- Ki-67 בהשוואה לקבוצת ביקורת (איור 7B). זה מדגים את היכולת של MoDCs דרוכים RV להציג בהצלחה את אנטיגן RV ללימפוציטים נאיביים ולאחר מכן להפעיל אותם במצב מבחנה, בדומה למה שקורה בחיה חיה. בנוסף לניתוח התאים באמצעות ציטומטריית זרימה, התרביות המשותפות היו נתונות גם ל-qPCR ול-ELISA כדי לכמת את הפעלת הלימפוציטים הספציפיים ל-RV באמצעות שעתוק RNA (Ki-67 ו-IFN-γ) והפרשת חוץ-תאית(IFN-γ), בהתאמה (איור 8). שיטות זיהוי נוספות אלה יכולות לשמש גם כבדיקות אישור כדי לאמת עוד יותר את התוצאות של ציטומטריית זרימה. ביטוי ה-RNA עבור Ki-67 ו-IFN-γ שהודגם על ידי qPCR ורמות IFN-γ שהודגמו על ידי ELISA הראו דפוסי עלייה דומים, המעידים על התפשטות לימפוציטים, בתרבית המשותפת הספציפית לאנטיגן בהשוואה לקבוצת הטיפול הלא ספציפית. לכן, תוצאות qPCR ו- ELISA היו בקורלציה עם תוצאות ציטומטריית הזרימה. ה-qPCR הראה עלייה של >30% בביטוי IFN-γ ועלייה של >5% בביטוי Ki-67 בכל התרביות המשותפות שהשתמשו ב-GAPDH ככיול (איור 8A,B). ריכוז גבוה משמעותית של IFN-γ מופרש (**p > 0.01) נמדד עם ELISA באמצעות תרביות סופרנאטים מתרבית לימפוציטים MoDC-לימפוציטים בפולסי RV בהשוואה לקבוצת הטיפול הלא ספציפית (איור 8C).

Figure 1
איור 1: תכנון ניסויי של ניסוי בקר מבוסס MoDC במבחנה. (A) קציר ומיון תאים של מונוציטים CD14+ ושברי תאי לימפוציטים CD14-CD14 ממרכזיות בקר. דם בקר מעובד על ידי צנטריפוגת שיפוע צפיפות לאיסוף PBMCs, ולאחר מכן מיון תאים מבוסס מגנט באמצעות עמודות הפרדת תאים אימונומגנטיות ותרבית לאחר מכן של מקטע תאי מונוציטים נאיבי CD14+ שנקצר בתווך RPMI 1640 מוסף. (B) ייצור של MoDCs באמצעות קוקטייל ציטוקינים 3% (GM-CSF + IL-4) עם 5 ימי דגירה ותרבות משותפת של לימפוציטים MoDC. ביום 0, המונוציטים מתורבתים בנוכחות קוקטייל הציטוקינים ומודגרים במשך 48 שעות כדי לגרום להתמיינות. ביום השני, התרבית מגורה מחדש עם אותו קוקטייל ציטוקינים, ואחריו דגירה במשך 72 שעות, מה שמוביל לייצור של MoDC נאיביים. ביום החמישי מוסיפים אנטיגן חיסוני (חיסון נגד כלבת) לתרבית תאי MoDC הנאיבית, ואחריה דגירה של 48 שעות. ביום השביעי מתבצע גידול משותף של MoDCs פועמים באנטיגן עם לימפוציטים נאיביים (מקטע התאים CD14-), ואחריו הדגירה. ביום 9, IL-2 מתווסף לתרבות המשותפת. ביום ה-14 מתבצעת העשרה/רסטימולציה של הלימפוציטים המופעלים/ראשוניים על ידי הוספת MoDCs פועמים באנטיגן, ולאחר מכן דגירה למשך 48 שעות. לבסוף, ביום ה-16, התאים והתרבית נקצרים לבדיקת התפשטות הלימפוציטים. קיצורים: MODCs = תאים דנדריטיים שמקורם במונוציטים בקר; PBMCs = תאי דם חד-גרעיניים היקפיים; GM-CSF = גרנולוציטים-מקרופאגים-מושבה-גורם מגרה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: מורפולוגיה וטוהר של מונוציטים של בקר CD14+ שנקטפו מ-PBMCs באמצעות מיקרו-כדוריות מצומדות נגד CD14. (A) מורפולוגיה של מונוציטים של בקר המודגרים במשך 4 שעות בטמפרטורה של 37°C בתווך תרבית שלם להסרת מיקרו-חרוזים, קבועים על שקופיות מצופות פולי-ליזין ומוכתמים בכתם Giemsa שונה. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (B) היסטוגרמה של ציטומטריית זרימה המציגה את מקטע התא המדולל CD14+ עם רמת טוהר של 98.6% שנצפתה באמצעות נוגדן אנטי-CD14 (אדום) ונוגדן בקרת איזוטיפ IgG1 מצומד לעכבר (ירוק). קיצורים: PBMCs = תאים חד-גרעיניים היקפיים בדם; FITC cont = בקרת איזותיוציאנט פלואורסצאין. נתון זה שונה מ Kangethe et al., 201811. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: פעילות אנדוציטית של MoDCs של בקר הנוצרת במבחנה. היסטוגרמה של ציטומטריית זרימה המראה את ספיגת מולקולת הנותב (FITC-dextran) ביום 5 של MoDCs נאיביים. MoDCs מודגרים בטמפרטורה של 37°C במשך 60 דקות כאשר מולקולת הנותב (כחול) ו-MoDCs מודגרים על קרח כאשר מולקולת הנותב (אפור) משמשת כבקרת רקע. קיצורים: MODCs = תאים דנדריטיים שמקורם במונוציטים בקר; FITC = איזותיוציאנט פלואורסצאין. נתון זה שונה מ Kangethe et al., 201811. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: פנוטיפ של סמנים ספציפיים לתא MoDC שנוצרו במבחנה על ידי בקר.היסטוגרמות ציטומטריית זרימה עבור (A) אסטרטגיות gating של MoDCs ועבור (B) יום 5 MoDCs נאיביים מוכתמים בשלושה DC-specificmAbs שונים (כחול), כולל הבאים: נגד כבשים MHC II mAb, CD86 mAb נגד בקר ו- CD40 mAb נגד בקר. הכל בהשוואה לבקרות האיזוטיפ המקבילות שלהם (אדום). קיצורים: DC = תאים דנדריטיים; MODCs = DCs שמקורם במונוציטים בקר; MHC II = קומפלקס היסטותאימות עיקרי II. נתון זה שונה מ Kangethe et al., 201811. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: סימני הבשלה של MoDCs המיוצרים במבחנה במהלך תרבית משותפת של לימפוציטים MoDC. תצפית על המבנה הדנדריטי המורחב האופייני על ידי MoDCs פועמים באנטיגן עם מיקרוסקופ הפוך ביום 9 של תרבית לימפוציטים MoDC-לימפוציטים. (A) MoDCs בוגרים בתוך אזור מאוד משולב של לימפוציטים בתרבית משותפת. (B) ניתן להבחין בקלות ב-MoDCs בוגרים באזור עם פחות לימפוציטים בתרבית משותפת. פסי קנה מידה = 50 מיקרומטר. קיצור: MODCs = תאים דנדריטיים שמקורם במונוציטים בקר. נתון זה שונה מ Kangethe et al., 201811. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: אסטרטגיית gating רציפה שאומצה עבור תרשימי נקודות כנגד ביטוי Ki-67 ו-CD25 על-ידי לימפוציטים בתרבית משותפת של לימפוציטים MoDC. (A) Tהוא אסטרטגיית gating מלאה עבור תאים שנקצרו מהיום ה-16 לתרבית משותפת של לימפוציטים MoDC. (B) ביטוי Ki-67 מלימפוציטים מגודרים CD4+ ו-(C) מלימפוציטים CD8+ בהשוואה לבקרת FMO (ללא mAb) ובקרת איזוטיפ IgG1-k של עכבר mAb. ביטוי CD25 על לימפוציטים מגודרים (D) CD8+ ו- (E) CD4+ בהשוואה לעכבר IgG1 איזוטיפ בקרת mAb. קבוצת הטיפול מייצגת באופן ספציפי לימפוציטים בתרבית משותפת עם MoDCs עם פעימות RV, ואילו קבוצת הביקורת מייצגת לימפוציטים בתרבית בהיעדר MoDCs. קיצורים: MODCs = תאים דנדריטיים שמקורם במונוציטים בקר; FMO = פלורסנט מינוס אחד; RV = חיסון נגד כלבת. נתון זה שונה מ Kangethe et al., 201811. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: ניתוח נתוני ציטומטריית זרימה של ביטוי Ki-67 ו- CD25 על ידי לימפוציטים CD4+ ו- CD8+ לאחר פרימה עם האנטיגן. ביטוי Ki-67 ו- CD25 מהיום ה -16 תרבות משותפת. קבוצת הטיפול (ספציפית) מוגדרת כלימפוציטים בתרבית עם MoDCs פועמים RV; הקבוצה הלא ספציפית מתאימה ללימפוציטים בתרבית עם MoDCs שאינם פועמים באנטיגן; קבוצת הביקורת מתאימה ללימפוציטים בתרבית ללא MoDCs. הפסים האופקיים מייצגים את הממוצע של שישה עותקים טכניים. (A) ביטוי תוך-תאי של סמן Ki-67 על ידי תאי T CD8 ו-(B) על ידי תאי CD4 T. (C) ביטוי פני השטח של התא של סמן CD25 על ידי תאי T CD8 ו-(D) על ידי תאי CD4 T. קיצורים: MODCs = תאים דנדריטיים שמקורם במונוציטים בקר; RV = חיסון נגד כלבת. נתון זה שונה מ Kangethe et al., 201811. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 8
איור 8: הפעלת סמן Th1 (IFN-γ ו-Ki-67) על-ידי משרד ההגנה האמריקאי עם אנטיגן נגיף הכלבת, כפי שזוהה באמצעות qPCR ו-ELISA. הנתונים נלקחו מחיה אחת עם שישה עותקים משוכפלים טכניים. הפסים האופקיים מייצגים את הממוצע. שלושה שכפול PCR מוצג כשינויי קיפול בהשוואה ללימפוציטים נאיביים לאחר נורמליזציה עם גן ייחוס GAPDH . (A) ביטוי IFN-γ , (B) ביטוי Ki-67 . (C) השוואה של הפרשת IFN-γ בתרבית בין שלוש קבוצות טיפול, כפי שזוהתה על ידי ELISA. הקבוצה הספציפית מוגדרת כלימפוציטים בתרבית עם MoDC פועם RV; הקבוצה הלא ספציפית מתאימה ללימפוציטים בתרבית עם MoDCs שאינם פועמים באנטיגן; קבוצת הביקורת מתאימה ללימפוציטים בתרבית ללא MoDCs. קיצורים: MODCs = תאים דנדריטיים שמקורם במונוציטים בקר; RV = חיסון נגד כלבת. נתון זה שונה מ Kangethe et al., 201811. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

ריאגנטים ריכוז סופי נפח לכל תגובה
תערובת dNTPs (10 mM) 1,000 מיקרומטר 1 μL
פריימרים אקראיים להקסמר (50 ng/μL) 25 מיקרומטר 1 μL
תבנית RNA 0.1 – 1 מיקרוגרם/μL χ μL (לפי הצורך)
מים ללא RNAse - χ μL (לפי הצורך)
נפח תגובה סופי - 10 מיקרוליטר

טבלה 1: הרכב תערובת מאסטר (תערובת פריימר RNA).

ריאגנטים ריכוז סופי נפח לכל תגובה
מאגר RT פי 10 1x 2 μL
MgCl2 25 מ"מ 5 מ"מ 4 μL
DTT 0.1 מטר 10 מ"מ 2 μL
מעכב RNAse 40 U/μL 2 U 1 μL

טבלה 2: תמהיל תגובת PCR 2x. קיצורים: RT = תעתיק הפוך; DTT = dithiothreitol.

ציטוקין מינים מספר הצטרפות רצף אורך Tm
IFN-γ בוס שור FJ263670 F- GTGGGCCTCTCTTCTCAGAA 234 80.5
R- GATCATCCACCGGAATTTGA
קי-67 בוס שור XM_015460791.2 F-AAGATTCCAGCGCCCATTCA 148 86.5
R-TGAGGAACGAACGACTGG
GAPDH בוס שור סאסו ואח', 2020 F-CCTGGAGAAACCTGCCAAGT 214 85.5
R-GCCAAATTCATTGTCGTACCA

טבלה 3: ערכות פריימר המשמשות להגברה50.

ריאגנטים ריכוז סופי נפח לכל תגובה
סופרמיקס 1x 5 מיקרוליטר
פריימר קדמי (5 מיקרומטר) 250/ 125 נאנומטר 1 μL
פריימרים הפוכים (5 מיקרומטר) 250/ 125 נאנומטר 1 μL
cDNA 1:10 מדולל 1.25 ננוגרם 2 μL
מים ללא Nuclease - 1 μL
נפח תגובה סופי - 10 מיקרוליטר

טבלה 4: תערובת הורים qPCR

צינור מס' ריכוז התקן דילול סדרתי
1 50 נ"ג/מ"ל 50 μL של תקן + 350 μL של חיץ כביסה
2 12.5 ננוגרם/מ"ל 150 μL מצינור 1 + 450 μL של חיץ כביסה
3 6.25 נ"ג/מ"ל 250 μL מצינור 2 + 250 μL של חיץ כביסה
4 3.13 נ"ג/מ"ל 250 μL מצינור 3 + 250 μL של חיץ כביסה
5 1.56 ננוגרם/מ"ל 250 μL מצינור 4 + 250 μL של חיץ כביסה
6 0.78 נ"ג/מ"ל 250 μL מצינור 5 + 250 μL של חיץ כביסה
7 0.2 נ"ג/מ"ל 150 μL מצינור 6 + 450 μL של חיץ כביסה
8 0.1 נ"ג/מ"ל 250 μL מצינור 7 + 250 μL של חיץ כביסה
9 0.025 נ"ג/מ"ל 100 μL מצינור 8 + 300 μL של חיץ כביסה

טבלה 5: סדרת דילול סטנדרטי IFN-γ

קובץ משלים 1: פרוטוקולים לסינתזה של DNA משלים, תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (qPCR), ובדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים (ELISA). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

תרשים משלים S1: יכולת ספיגת האנטיגן MoDCs עם ריכוזים שונים של קוקטייל הציטוקינים ועם 3 ימים או 5 ימים של תרבית. ריכוזים שונים (5% w/v ו-3% w/v) של קוקטייל הציטוקינים המכיל GM-CSF ו-IL-4 נבדקו בתרבית של 3 ימים או 5 ימים כדי להעריך את השילוב הטוב ביותר ליצירת MoDCs בעלי ספיגת אנטיגן בעלת ביצועים גבוהים (באמצעות מולקולת הנותב FITC-dextran). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S2: CD4 ו-CD8 מקדימים עם רעלן דיפטריה (DT) וסרוטיפ וירוס Bluetongue 4 (BTV). הביטוי של Ki-67 על ידי תאי CD8 לאחר פעימה עם (A) DT ו- (C) BTV והביטוי של Ki-67 על ידי תאי CD4 לאחר פעימה עם (B) DT ו- (D) BVT ביום 16. השוואות נעשו עם תרביות פועמות עם DT ו- BVT (ספציפי), (C,D) עם CD40L, ועם טיפולי פריימינג ובקרה לא ספציפיים. הפסים האופקיים מציינים את הממוצע. *p < 0.05, **p < 0.01 לפי מבחן מאן-ויטני. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מחקר זה מדגים שיטה מתוקננת במבחנה לייצור ופנוטיפ של MoDC בקר והשימוש בהם לאחר מכן במדידת האימונוגניות של החיסון של חיסון מסחרי (למשל, RV). MoDCs של בקר יכולים לשמש ככלי לסינון אנטיגנים פוטנציאליים של חיסונים נגד מחלות בקר וחיזוי ההשפעה הקלינית הפוטנציאלית שלהם בהתבסס על תגובות חיסוניות לפני שמתקדמים לקראת ניסויים בבעלי חיים in vivo . ה-MoDCs שנוצרו זוהו על סמך המאפיינים המורפולוגיים, הפנוטיפיים והתפקודיים שלהם. הראינו כי מונוציטים של MoDCs שמקורם בבקר CD14+ הציגו תכונות שנצפו ב-DCs, כגון דנדריטים מורחבים, ביטוי של סמנים על פני התא להצגת אנטיגן כגון MHC II, ביטוי של מולקולות קו-סטימולטוריות על MoDCs כגון CD40 ו-CD86, פעילות אנדוציטית והיכולת להפעיל לימפוציטים נאיביים.

אמצעי תרביות התאים המשמשים בניסוי זה (DMEM ו-RPMI) נמצאים בשימוש נרחב עבור התמיינות תאים וטיפוחם, כאשר RPMI מאומץ לעתים קרובות יותר עבור התמיינות מונוציטים36. תוספת RPMI עם FBS או HS (נסיוב סוסים) אינה משפיעה על התמיינות מונוציטים37. תוספי GM-CSF ו- IL-4 רקומביננטיים מספקים מצב דלקתי המעורר התמיינות מונוציטים ומשמש באופן שגרתי לייצור MoDCs ברי קיימא מבחינה תפקודית המסוגלים לקלוט אנטיגן ולהציגו לתאי מערכת החיסון38,39. במחקר זה, RPMI 1640 medium בתוספת 10% FBS (מדיום תרבית מלאה), 1% פניצילין-סטרפטומיצין, ותוספת של קוקטייל ציטוקינים זמין מסחרית (GM-CSF בתוספת IL-4) גרמו להתמיינות מונוציטים בקר, וכתוצאה מכך לייצור MoDCs קיימא. כאשר ה-MoDCs שנוצרו הודגרו עם RV לפני שהתרבו יחד עם לימפוציטים נאיביים, הם גרמו לתגובה חיסונית תלוית תאי T ספציפית נגד RV, והוכיחו כי MoDCs בוגרים יכולים להציג כראוי אנטיגנים RV ללימפוציטים שמעולם לא נתקלו ב-RV. זהו מאפיין מכריע של חסינות נרכשת שאנו יכולים כעת לשכפל במעבדה.

ראינו כי ריכוז גבוה יותר של קוקטייל ציטוקינים (5%) יחד עם זמן דגירה ארוך יותר (5 ימים) יצרו MoDCs עם יכולת אנדוציטית נמוכה יותר לספיגת אנטיגן מאשר אלה שטופלו עם ריכוז נמוך יותר של קוקטייל ציטוקינים (3%) עם אותו זמן דגירה (5 ימים), כפי שניתן לראות באיור משלים S1. לפיכך, אנו מסיקים כי ריכוז נמוך יותר של קוקטייל ציטוקינים (למשל, 3%) עם 5 ימי דגירה הוא אופטימלי לייצור MoDCs חזקים מבחינה תפקודית. סמני פני השטח של התא כגון MHC II, CD40 ו- CD86 נמצאים על APC, והוויסות שלהם מצביע על הפעלת תאים פונקציונלית40,41,4 2. הדגמנו ביטוי משופר של MHC II, CD40 ו-CD86 לאחר התמיינות מונוציטים ל-MoDCs נאיביים באמצעות קוקטייל הציטוקינים (איור 4).

מיטוב היחס בין לימפוציטים נאיביים ל-MoDCs במערכת תרבית הוא גורם מפתח המשפיע על תוצאות בדיקת MoDC, כאשר יחסי MoDC ללימפוציטים שונים גורמים לתגובות לימפוציטים מגוונות43. עם זאת, לאחר הערכת יחסי MoDC ללימפוציטים של 1:10-1:40, ראינו שהגדלת הריכוז של MoDC לא הגבירה את הפעלת הלימפוציטים, ובסופו של דבר הסתפקנו ביחס אופטימלי של 1:20, הדומה למחקרים שדווחו בעבר44,45. יש לציין כי מקטע הלימפוציטים הנאיבי המדולל עשוי להכיל תאי T שאינם מופעלים באופן ספציפי; לכן, הכרחי שתהיה קבוצת ביקורת המתאימה רק לתרבות לימפוציטים נאיבית.

תאי T פעילים מסוג CD4+ ו-CD8+ מבטאים סמנים ספציפיים ומפרישים מגוון ציטוקינים, וכימות שלהם מצביע על הפעלת מערכת החיסון. הביטוי התוך-תאי של Ki-67, סמן הפעלה חיסוני מאופיין היטב, היה מווסת בתרבית משותפת זו של לימפוציטים MoDC29,46. באופן דומה במחקר זה, הפרשת IFN-γ המוגברת על ידי לימפוציטים הצביעה על תגובת Th1 שהתעוררה כנגד אנטיגן RV30,31,47. ביטוי IL-2 על ידי תאי T CD4+ הוא גם סמן טוב להמחשת הפעלת תאי T; עם זאת, שילובו ביום 9 של התרבות המשותפת של לימפוציטים MoDC הפך אותו למטרה לא מתאימה למדידת התפשטות לימפוציטים במחקר זה48. הרגולציה של CD25 בנוכחות IL-2 הוכחה בעבר כקובעת את הפריימינג של תאי T CD4+ ו- CD8+ ושימשה במחקר זה למדידת הפריימינג של לימפוציטים נאיביים על ידי MoDCs28 עם פעימות RV.

תאי T ציטוטוקסיים CD8 הם תאי השפעה עיקריים נגד אנטיגנים חיסונים תוך תאיים או פתוגנים נגיפיים49. על ידי מדידת סמני הפעלת לימפוציטים (Ki-67 ו- CD25) וביטוי ציטוקינים (IFN-γ), מצאנו כי ל- MoDCs טעוני האנטיגן הייתה הפעלה משמעותית (p < 0.01) של תגובות תאי T CD8 ו- CD4, כאשר תגובת CD8 וקיטוב Th1 היו נפוצים יותר כנגד אנטיגן RV. גורם חשוב שיש לקחת בחשבון בעת תכנון בדיקת MoDC עבור חיסונים מצומדים אדג'ובנטיים הוא תגובות לימפוציטים המושרות על ידי אדג'ובנט. אנו ממליצים להשתמש בקבוצת ביקורת (בקרת אדג'ובנט) המורכבת מאדג'ובנט בלבד כדי לסלק אותות רקע כלשהם. מערך זה יכול לשמש גם למדידת ההשפעה של אדג'ובנטים שונים שיכולים להגביר את תגובות הלימפוציטים כלפי אנטיגן אימונוגני נמוך, שהוא חיוני להגנה במהלך מחקרי in vivo .

יש כמה מגבלות במחקר הזה שאנחנו רוצים להדגיש. נתוני הניסוי עבור כל בדיקה נגזרו מחיה אחת עם שישה עותקים טכניים. מספר גדול יותר של עותקים ביולוגיים יועיל למזער טעויות ולספק אמינות סטטיסטית משופרת ותוצאות בדיוק גבוה יותר. אף על פי כן, בפרסום קודם11, בדיקה זו נבדקה ואומתה גם באמצעות רעלן דיפטריה (איור משלים S2A,B) וחיסון מסחרי נגד סרוטיפ 4 של נגיף Bluetongue (איור משלים S2C,D) עם שלוש ושתי חיות ביולוגיות, בהתאמה. יתר על כן, השוואת התוצאות שהתקבלו ממחקר זה במבחנה עם מחקר in vivo תסייע בנוסף לאמת את האותנטיות של בדיקה חיסונית זו, אשר, בתורו, תאיץ את תהליך היישום של בדיקת MoDC במבחנה זו כבדיקה שגרתית בייצור חיסונים ובקרת איכות. לבסוף, הביטוי של CD14 ב- MoDCs לא נחקר, מכיוון שהספרות אינה עקבית לגבי היבט זה, במיוחד כאשר משווים MoDCs ממיני בעלי חיים שונים.

לסיכום, אנו מדווחים על בדיקת MoDC של בקר חוץ גופי שניתן להשתמש בה כדי למדוד אימונוגניות הנגרמת על ידי חיסון. ניתן להעריך בדיקת MoDC זו גם בשיטות שונות, כולל ציטומטריית זרימה, ELISA ו- qPCR. קיום שיטות מרובות להערכת סמני הפעלה הוא חיוני באזורים עם משאבים מוגבלים שבהם ציטומטר זרימה עשוי שלא להיות זמין. בדיקה זו יכולה להיכלל כשלב בקרת איכות על ידי מעבדות וטרינריות לאומיות המייצרות אצוות גדולות של חיסוני בקר. בנוסף, ניתן להשתמש בו כדי לזהות אנטיגנים פוטנציאליים לחיסון במהלך הפיתוח של חיסוני בקר חדשים ואפילו לבחור באיזה אדג'ובנט להשתמש לפני ניסוי בבעלי חיים. כל הגורמים הללו יתרמו לגישה אתית וזולה יותר לפיתוח ושימוש בחיסוני בקר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים לד"ר אוולין וודאק וד"ר אנג'ליקה לויסטש (AGES) על תמיכתם בקביעת מצבם הבריאותי של בעלי החיים ועל אספקת BTV, ד"ר ברנהרד ריינלט על אספקת דם בקר, וד"ר בהראני סטיפלי וד"ר ויליאם דנדון מהסוכנות הבינלאומית לאנרגיה אטומית על עצות מועילות לגבי ניסויי PCR בזמן אמת ועריכת שפה, בהתאמה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACK Lysing Buffer Gibco, Thermo Fisher A1049201 Ammonium-Chloride-Potassium buffer for lysis of residual RBCs in harvested PBMC Fraction
BD Vacutainer Heparin Tubes Becton, Dickinson (BD) and Company 366480 10 mL, additive sodium heparin 158 USP units, glass tube, 16 x 100 mm size
Bovine Dendritic Cell Growth Kit Bio-Rad, UK PBP015KZZ Cytokine cocktail composed of recombinant bovine IL-4 and GM-CSF
Bovine IFN-γ ELISA Kit Bio-Rad MCA5638KZZ Kit use for measuring IFN-γ expression in culture supernatant
CD14 Antibody Bio-Rad MCA2678F Mouse anti-bovine CD14 monoclonal antibody, clone CC-G33, isotype IgG1
CD25 Antibody Bio-Rad MCA2430PE Mouse anti bovine CD25 monoclonal antibody, clone IL-A11, isotype IgG1
CD4 Antibody Bio-Rad MCA1653A647 Mouse anti bovine CD4 monoclonal antibody, clone CC8, isotype IgG2a
CD40 Antibody Bio-Rad MCA2431F Mouse anti-bovine CD40 monoclonal antibody, clone IL-A156, isotype IgG1
CD8 Antibody Bio-Rad MCA837F Mouse anti bovine CD8 monoclonal antibody, clone CC63, isotype IgG2a
CD86 Antibody Bio-Rad MCA2437PE Mouse anti-bovine CD86 monoclonal antibody, clone IL-A190, isotype IgG1
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System Bio-Rad - Thermal cycler PCR machine
Corning Centrifuge Tube Falcon Corning  352096 & 352070 15 mL and 50 mL, high-clarity poypropylene conical bottom, graduated, sterial, seal screw cap, falcon tube
Cytofix/Cytoperm Plus BD Bio Sciences 555028 Fixation/permeabilization kit with BD golgiPlug, use for flow cytometer cell staining
Ethanol Sigma Aldrich 1009832500 Absolute for analysis EMSURE ACS,ISO, Reag. Ph Eur
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco, Thermo Fisher 10500064 Qualified, heat inactivated
Ficoll Plaque PLUS GE Health care Life Sciences, USA 341691 Lymphocyte-isolation medium
FlowClean Cleaning Agent Beckman Coulter, Life Sciences A64669 500 mL
FlowJo FlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, USA - Flow cytometer Histogram software
FlowTubes/ FACS  (Fluorescence-activated single-cell sorting) Tube Falcon Corning  352235 5 mL, sterial, round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap, use in flow cytometry analysis
Fluoresceinisothiocynat-Dextran Sigma Aldrich, Germany 60842-46-8 FITC-dextran MW
Gallios Flow Cytometer Beckman Coulter - Flow cytometer machine
Hard-Shell 96-Well PCR Plates Bio-Rad HSP9601 96 well, low profile, thin wall, skirted, white/clear
Human CD14 MicroBeads Miltenyi Bioteck, Germany 130-050-201 2 mL microbeads conjugated to monoclonal anti-human CD14 antibody isotype IgG2a, used for selection of bovine monocytes from PBMCs
Kaluza Beckman Coulter, Germany - Flow cytometer multicolor data analysis software
MACS Column Miltenyi Bioteck, Germany 130-042-401 Magnetic activated cell sorting or immune magentic cell separation colum for separation of various CD14 cell population based on cell surface antigens
MHC Class II DQ DR Polymorphic Antibody Bio-Rad MCA2228F Mouse anti-sheep MHC Class II DQ DR Polymorphic:FITC, clone 49.1, isotype IgG2a, cross reactive with bovine
Microcentrifuge Tube Sigma Aldrich HS4325 1.5 mL, conical bottom, graduated, sterial tube
Microsoft Power Point Microsoft - The graphical illustrations of experimental design
Mouse IgG1 Negative Control:FITC for CD14, CD40 Antibody Bio-Rad MCA928F Isotype control CD14 and CD40 monoclonal antibody 
Mouse IgG1 Negative Control:PE for CD86 Antibody Bio-Rad MCA928PE Isotype control CD86 monoclonal antibody 
Mouse IgG1 Negative Control:RPE for CD25 Antibody Bio-Rad MCA928PE Isotype control CD25 monoclonal antibody 
Mouse IgG2a Negative Control:FITC for MHC Class II Antibody Bio-Rad MCA929F Isotype control for MHC class II monoclonal antibody 
Nobivac Rabies MSD Animal Health, UK - 1 µL/mL of cell cultured inactivated vaccine containing > 2 I.U./mL Rabies virus strain
Optical seals Bi0-Rad TCS0803 0.2 mL flat PCR tube 8-cap strips, optical, ultraclear, compatible for qPCR machine
Penicillin-Streptomycin Gibco, Thermo Fisher 15140122 100 mL
Phosphate Buffer Saline (PBS) Gibco, Thermo Fisher 10010023 pH 7.4, 1x concentration
Prism - GraphPad 5 Software  Dotmatics - Statistical software
Purified Anti-human Ki-67 antibody Biolegend, USA 350501 Monoclonal antibody, cross reactive with cow, clone ki-67
Purified Mouse IgG1 k Isotype Ctrl Antibody Biolegend 400101 Isotype control for Ki-67 monoclonal antibody
READIDROP Propidium Iodide BD Bio Sciences 1351101 Live/dead cell marker used for flow cytometry, amine reactive dye
Recombinant Human IL-2 Protein R&D System, USA 202-IL-010/CF Interleukin-2, 20 ng/ml
RNeasy Mini Kit Qiagen 74106 Kit use for extraction of total RNA; RLT buffer = lysis buffer; RW1 buffer = stringent guanidine-containing washing buffer; RDD buffer = DNase buffer; RPE buffer = mild wash buffer; RNaseOUT = RNase inhibitor.
RPMI 1640 Medium Sigma Aldrich R8758 Cell culture media with L-glutamine and sodium bicarbonate
SMART-servier medical art  Les Laboratories Servier - Licensed under a creative commons attribution 3.0 unported license
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 172-5270 2x qPCR mix conatins dNTPs, Ss07d fusion polymerase, MgCl2, SYBR Green I supermix = supermix, ROX normalization dyes.
SuperScript III First-Strand Synthesis System Invitrogen, Thermo Fisher 18080051 Kit for cDNA synthsis
Tissue Culture Test plate 24 TPP, Switzerland 92024 24 well plate, sterilized by radiation , growth enhanced treated, volume 3.18 mL
Trypan Blue Solution Gibco, Thermo Fisher 15250061 0.4%, 100 mL, dye to assess cell viability
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Invitrogen, Thermo Fisher 10977023 0.1 µm membrane filtered distilled water
VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes Thermo Fisher Scientific 15206067 VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes have a green top and contain spray-dried lithium, sodium or ammonium heparin on the inner walls and are usedin clinical chemistry, immunology and serology. The anticoagulant heparin activates antithrombin, which blocks the clotting cascade and thus produces a whole blood/plasma sample.
Water Sigma Aldrich W3500-1L Sterile-filtered, bioReagent suitable for cell culture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roth, J. A., Sandbulte, M. R. The role of veterinary vaccines in livestock production, animal health, and public health. In Veterinary Vaccines: Principles and Applications. Metwally, S., El Idrissi, A., Viljoen, G. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 1-10 (2021).
  2. Roberts, N. J., Douglas, R. G., Simons, R. M., Diamond, M. E. Virus-induced interferon production by human macrophages. The Journal of Immunology. 123 (1), 365-369 (1979).
  3. Kleiveland, C. R. Peripheral blood mononuclear cells. The Impact of Food Bioactives on Health: In Vitro and Ex Vivo Models. Verhoeckx, K., Cotter, P., López-Expósito, I., Kleiveland, C., Lea, T., Mackie, A., Requena, T., Swiatecka, D., Wichers, H. , Springer. Cham, Switzerland. 161-167 (2015).
  4. Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 762-774 (2011).
  5. Domínguez, P. M., Ardavín, C. Differentiation and function of mouse monocyte-derived dendritic cells in steady state and inflammation. Immunological Reviews. 234 (1), 90-104 (2010).
  6. Steinman, R. M. Linking innate to adaptive immunity through dendritic cells. Novartis Foundation Symposium. 279, 101-109 (2006).
  7. Vandebriel, R. J., Hoefnagel, M. H. N. Dendritic cell-based in vitro assays for vaccine immunogenicity. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 8 (9), 1323-1325 (2012).
  8. Hopewell, E. L., Cox, C. Manufacturing dendritic cells for immunotherapy: Monocyte enrichment. Molecular Therapy. Methods and Clinical Development. 16, 155-160 (2020).
  9. Morse, M. A., Zhou, L. -J., Tedder, T. F., Lyerly, H. K., Smith, C. Generation of dendritic cells in vitro from peripheral blood mononuclear cells with granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor, interleukin-4, and tumor necrosis factor-alpha for use in cancer immunotherapy. Annals of Surgery. 226 (1), 6-16 (1997).
  10. Robinson, L., et al. Foot-and-mouth disease virus exhibits an altered tropism in the presence of specific immunoglobulins, enabling productive infection and killing of dendritic cells. Journal of Virology. 85 (5), 2212-2223 (2011).
  11. Kangethe, R. T., Pichler, R., Chuma, F. N. J., Cattoli, G., Wijewardana, V. Bovine monocyte derived dendritic cell based assay for measuring vaccine immunogenicity in vitro. Veterinary Immunology and Immunopathology. 197, 39-48 (2018).
  12. Harwood, L. J., Gerber, H., Sobrino, F., Summerfield, A., McCullough, K. C. Dendritic cell internalization of foot-and-mouth disease virus: Influence of heparan sulfate binding on virus uptake and induction of the immune response. Journal of Virology. 82 (13), 6379-6394 (2008).
  13. Hussen, J., et al. Phenotypic and functional heterogeneity of bovine blood monocytes. PLoS One. 8 (8), 71502 (2013).
  14. Shi, Y., et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and T-cell responses: What we do and don't know. Cell Research. 16 (2), 126-133 (2006).
  15. Zhou, L. -J., Tedder, T. F. CD14+ blood monocytes can differentiate into functionally mature CD83+ dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (6), 2588-2592 (1996).
  16. Bautista, E. M., Nfon, C., Ferman, G. S., Golde, W. T. IL-13 replaces IL-4 in development of monocyte derived dendritic cells (MoDC) of swine. Veterinary Immunology and Immunopathology. 115 (1-2), 56-67 (2007).
  17. León, B., Ardavín, C. Monocyte-derived dendritic cells in innate and adaptive immunity. Immunology and Cell Biology. 86 (4), 320-324 (2008).
  18. Berger, A. Th1 and Th2 responses: What are they. British Medical Journal. 321 (7258), 424 (2000).
  19. Romagnani, S. Th1/th2 cells. Inflammatory Bowel Diseases. 5 (4), 285-294 (1999).
  20. Kaiko, G. E., Horvat, J. C., Beagley, K. W., Hansbro, P. M. Immunological decision-making: How does the immune system decide to mount a helper T-cell response. Immunology. 123 (3), 326-338 (2008).
  21. Duckworth, B. C., Groom, J. R. Conversations that count: Cellular interactions that drive T cell fate. Immunological Reviews. 300 (1), 203-219 (2021).
  22. León, B., López-Bravo, M., Ardavín, C. Monocyte-derived dendritic cells formed at the infection site control the induction of protective T helper 1 responses against Leishmania. Immunity. 26 (4), 519-531 (2007).
  23. Singh, D., et al. Differential responses of chicken monocyte-derived dendritic cells infected with Salmonella gallinarum and Salmonella typhimurium. Scientific Reports. 11, 17214 (2021).
  24. Pujol, M., et al. Variability in the response of canine and human dendritic cells stimulated with Brucella canis. Veterinary Research. 48, 72 (2017).
  25. Pujol, M., Borie, C., Montoya, M., Ferreira, A., Vernal, R. Brucella canis induces canine CD4+ T cells multi-cytokine Th1/Th17 production via dendritic cell activation. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 62, 68-75 (2019).
  26. Lašťovička, J., Rataj, M., Bartůňková, J. Assessment of lymphocyte proliferation for diagnostic purpose: Comparison of CFSE staining, Ki-67 expression and 3H-thymidine incorporation. Human Immunology. 77 (12), 1215-1222 (2016).
  27. Reddy, M., Eirikis, E., Davis, C., Davis, H. M., Prabhakar, U. Comparative analysis of lymphocyte activation marker expression and cytokine secretion profile in stimulated human peripheral blood mononuclear cell cultures: An in vitro model to monitor cellular immune function. Journal of Immunological Methods. 293 (1-2), 127-142 (2004).
  28. Shatrova, A. N., et al. Time-dependent regulation of IL-2R α-chain (CD25) expression by TCR signal strength and IL-2-induced STAT5 signaling in activated human blood T lymphocytes. PLoS One. 11 (12), 0167215 (2016).
  29. Shedlock, D. J., et al. Ki-67 staining for determination of rhesus macaque T cell proliferative responses ex vivo. Cytometry, Part A. 77 (3), 275-284 (2010).
  30. Yen, H. -R., et al. Tc17 CD8 T cells: Functional plasticity and subset diversity. Journal of Immunology. 183 (11), 7161-7168 (2009).
  31. Kawamura, I., et al. IFN-gamma-producing ability as a possible marker for the protective T cells against Mycobacterium bovis BCG in mice. Journal of Immunology. 148 (9), 2887-2893 (1992).
  32. Federal Ministry Republic of Austria. Agriculture, Forestry, Regions and Water Management. The Federal Act on Animal Welfare (Tierschutzgesetz - TSchG). Federal Law Gazette I 2004/118. , Available from: https://info.bml.gv.at/en/topics/agriculture/agriculture-in-austria/animal-production-in-austria/animal-welfare-act.html (2005).
  33. Corripio-Miyar, Y., et al. Phenotypic and functional analysis of monocyte populations in cattle peripheral blood identifies a subset with high endocytic and allogeneic T-cell stimulatory capacity. Veterinary Research. 46, 112 (2015).
  34. Wijewardana, V., et al. Generation of canine dendritic cells from peripheral blood monocytes without using purified cytokines. Veterinary Immunology and Immunopathology. 114 (1-2), 37-48 (2006).
  35. Gallios Flow Cytometer with Kaluza for Gallios Software. Instructions for Use. Beckman Coulter. , Available from: http://www.cytometrie-imagerie-saint-antoine.org/media/3924/Kaluza.Gallos.pdf (2014).
  36. Švajger, U., Jeras, M. Optimal dendritic cell differentiation in rpmi media requires the absence of HEPES buffer. Immunological Investigations. 40 (4), 413-426 (2011).
  37. Chometon, T. Q., et al. A protocol for rapid monocyte isolation and generation of singular human monocyte-derived dendritic cells. PLoS One. 15 (4), 0231132 (2020).
  38. Blanco, F. C., et al. Semi-stable production of bovine IL-4 and GM-CSF in the mammalian episomal expression system. Journal of Veterinary Research. 65 (3), 315-321 (2021).
  39. Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. Journal of Experimental Medicine. 179 (4), 1109-1118 (1994).
  40. Cho, K. -J., Roche, P. A. Regulation of MHC class II-peptide complex expression by ubiquitination. Frontiers in Immunology. 4, 369 (2013).
  41. Sansom, D. M., Manzotti, C. N., Zheng, Y. What's the difference between CD80 and CD86. Trends in Immunology. 24 (6), 313-318 (2003).
  42. Han Lee, G., et al. The role of CD40 expression in dendritic cells in cancer biology; a systematic review. Current Cancer Drug Targets. 14 (7), 610-620 (2014).
  43. Tanaka, H., Demeure, C. E., Rubio, M., Delespesse, G., Sarfati, M. Human monocyte-derived dendritic cells induce naive T cell differentiation into T helper cell type 2 (Th2) or Th1/Th2 effectors: Role of stimulator/responder ratio. Journal of Experimental Medicine. 192 (3), 405-412 (2000).
  44. Klechevsky, E., et al. Cross-priming CD8+ T cells by targeting antigens to human dendritic cells through DCIR. Blood. 116 (10), 1685-1697 (2010).
  45. Schlienger, K., Craighead, N., Lee, K. P., Levine, B. L., June, C. H. Efficient priming of protein antigen-specific human CD4+ T cells by monocyte-derived dendritic cells. Blood. 96 (10), 3490-3498 (2000).
  46. Soares, A., et al. Novel application of Ki67 to quantify antigen-specific in vitro lymphoproliferation. Journal of Immunological Methods. 362 (1-2), 43-50 (2010).
  47. Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations. Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2009).
  48. Bachmann, M. F., Oxenius, A. Interleukin 2: From immunostimulation to immunoregulation and back again. EMBO Reports. 8 (12), 1142-1148 (2007).
  49. Koup, R. A., Douek, D. C. Vaccine design for CD8 T lymphocyte responses. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 1 (1), 007252 (2011).
  50. Sassu, E. L., et al. Development and evaluation of a real-time PCR panel for the detection of 20 immune markers in cattle and sheep. Veterinary Immunology and Immunopathology. 227, 110092 (2020).

Tags

ערך ריק גיליון 195
קביעת אימונוגניות החיסון באמצעות תאים דנדריטיים שמקורם במונוציטים של בקר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liaqat, F., Kangethe, R. T.,… More

Liaqat, F., Kangethe, R. T., Pichler, R., Liu, B., Huber, J., Wijewardana, V., Cattoli, G., Porfiri, L. Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (195), e64874, doi:10.3791/64874 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter