Summary
该方法描述了牛单核细胞来源的树突状细胞（MoDC）的产生及其在牛潜在兽用疫苗开发过程中抗原候选物体 外评估中的 应用。
Abstract
树突状细胞（DC）是免疫系统中最有效的抗原呈递细胞（APC）。它们在生物体中巡逻寻找病原体，并通过连接先天性和适应性免疫反应在免疫系统中发挥独特的作用。这些细胞可以吞噬细胞，然后将捕获的抗原呈递给效应免疫细胞，从而引发多种免疫反应。本文展示了从牛外周血单核细胞（PBMCs）中分离的牛单核细胞来源的树突状细胞（MoD）的体 外 生成标准化方法及其在疫苗免疫原性评估中的应用。
采用磁性细胞分选从PBMC中分离CD14+单核细胞，并用白细胞介素（IL）-4和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）补充完全培养基诱导CD14+单核细胞分化为幼稚MoDC。通过检测主要组织相容性复合物II（MHC II），CD86和CD40细胞表面标志物的表达来确认未成熟MoDC的产生。市售狂犬病疫苗用于冲击未成熟的MoDC，随后与幼稚淋巴细胞共培养。
抗原脉冲MoDC和淋巴细胞共培养的流式细胞术分析揭示了通过Ki-67，CD25，CD4和CD8标志物的表达刺激T淋巴细胞增殖。使用定量PCR分析 IFN-γ 和 Ki-67的mRNA表达表明，MoDCs可以在该 体外 共培养系统中诱导淋巴细胞的抗原特异性启动。此外，使用 ELISA 评估的 IFN-γ 分泌显示，狂犬病疫苗脉冲 MoDC 淋巴细胞共培养的滴度 （**p < 0.01） 显著高于非抗原脉冲 MoDC 淋巴细胞共培养。这些结果表明，这种 体外 MoDC测定法测量疫苗免疫原性的有效性，这意味着该测定可用于在进行 体内 试验之前确定牛的潜在候选疫苗，以及商业疫苗的疫苗免疫原性评估。
Introduction
兽医疫苗接种是畜牧业和健康的一个重要方面，因为它通过提供保护，防止影响全球畜牧业的疾病，有助于改善粮食安全和动物福利1。评估可能候选疫苗的免疫原性的有效体 外 方法将有助于加速疫苗的开发和生产过程。因此，有必要通过基于 体外 研究的创新方法来扩展免疫测定领域，因为这将有助于揭示与免疫和病原体感染相关的免疫过程的复杂性。目前，需要定期取样（例如血液和脾脏）的 体内 动物免疫和激发研究用于测量候选疫苗和佐剂的免疫原性。这些检测昂贵、耗时且具有伦理意义，因为在大多数情况下，动物安乐死是在试验结束时进行的。
作为体内测定的替代方法，外周血单核细胞（PBMC）已被用于评估疫苗诱导的体外免疫反应2。PBMC是由70%-90%的淋巴细胞，10%-20%的单核细胞和有限数量的树突状细胞（DC，1%-2%）组成的异质细胞群3。PBMC含有抗原呈递细胞（APC），例如B细胞，单核细胞和DC，它们不断巡逻生物体，寻找感染或组织损伤的迹象。局部分泌的趋化因子通过与细胞表面受体结合，促进APCs在这些位点的募集和激活。在单核细胞的情况下，趋化因子引导它们的命运分化成DC或巨噬细胞4。一旦DC遇到并捕获病原体，它们就会迁移到次级淋巴器官，在那里它们可以分别使用主要组织相容性复合体（MHC）I类或II类表面蛋白将加工过的病原体肽抗原呈递到CD8 + T细胞或CD4 + T细胞，从而触发免疫反应5，6。
DC在协调针对各种病原体的保护性免疫应答中发挥的关键作用使其成为了解细胞内免疫机制的有趣研究目标，特别是在设计针对感染因子的疫苗和佐剂时7。由于可以从PBMC获得的DC比例相当小（1%-2%），因此单核细胞已被用于体外产生DC。这些单核细胞衍生的DC（MoDC）最初是作为癌症免疫治疗中可能的治疗策略开发的9。最近，MoDC已被用于疫苗研究10，11，12，经典单核细胞是MoDC生产的主要亚型（89%）13。MoDCs的体外生产以前是通过添加粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）与其他细胞因子（如白细胞介素-4（IL-4）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）或IL-1314，15，16）联合给药来实现的。
体外MoDC测定的成功依赖于抗原刺激的成熟MoDC调节特定于检测到的抗原类型的免疫反应的程度和类型的能力17。MoDCs识别和呈递的病原体类型决定了CD4+ T辅助（Th）细胞分化为Th1，Th2或Th17效应细胞，并且以病原体特异性分泌细胞因子谱为特征。针对细胞内病原体引发Th1反应，并导致干扰素-γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子β（TNF-β）的分泌，后者调节吞噬细胞依赖性保护。针对寄生生物触发 Th2 反应，其特征在于 IL-4、IL-5、IL-10 和 IL-13 分泌，从而启动吞噬细胞非依赖性体液保护。Th17 提供中性粒细胞依赖性保护，防止由分泌 IL-17、IL-17F、IL-6、IL-22 和 TNF-α18、19、20、21 介导的细胞外细菌和真菌感染。根据以前的研究，已经注意到并非所有病原体都属于预期的细胞因子谱。例如，皮肤MoDCs响应利什曼原虫寄生虫感染，刺激CD4 + T细胞和CD8 + T细胞分泌IFN-γ，从而诱导保护性促炎Th1反应22。
研究还表明，在用沙门氏菌脂多糖（LPS）引发的鸡MoDC中，可以通过激活Th1和Th2反应来诱导对鼠伤寒沙门氏菌的可变反应，而加里纳鲁沙门氏菌单独诱导Th2反应，这可以解释后者对MoDC清除率的更高抵抗力23。在犬和人类MoDC中也报道了针对犬布鲁氏菌（B. canis）的MoDCs的激活，这意味着这可能代表人畜共患感染机制24。用犬双歧杆菌引发的人类MoDC诱导强烈的Th1反应，赋予对严重感染的抵抗力，而犬MoDC诱导显性Th17反应，Th1反应降低，随后导致慢性感染的建立25。与单独使用非结合的口蹄疫病毒相比，牛 MoDC 对与免疫球蛋白 G （IgG） 偶联的口蹄疫病毒 （FMDV） 的亲和力增强，因为 MoDC 形成病毒抗体复合物以响应前10 种病毒抗体复合物。综上所述，这些研究显示了MoDC如何用于分析病原体感染期间免疫反应的复杂性。适应性免疫应答可以通过量化与淋巴细胞增殖相关的特定标志物来评估。Ki-67是一种仅在分裂细胞中检测到的细胞内蛋白，被认为是增殖研究的可靠标志物26，同样，在活化后期在T细胞表面表达的CD25对应于淋巴细胞增殖27，28。
本研究展示了一种用于体外产生牛MoDC的标准化方法，然后将其应用于用于测试疫苗免疫原性的体外免疫测定中。市售狂犬病疫苗（RV）用于验证该测定的有效性。通过流式细胞术、实时定量聚合酶链反应（qPCR）和酶联免疫吸附测定法（ELISA）测定T淋巴细胞活化和增殖，分析成熟的细胞活化标志物（如Ki-67和CD25）以及IFN-γ28，29，30，31的分泌。在MoDC测定期间不进行动物或人体实验试验。
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Protocol
采血由经过认证的兽医服务机构根据奥地利卫生和食品安全局（AGES）的道德准则进行，并符合公认的动物福利标准32。该研究获得了奥地利农业部的伦理批准。 MoDCs生成的实验设计及其后续应用如图1所示。
1. 生产幼稚的MoDC
注意：全血样本是通过颈静脉穿刺和肝素化真空管从单个无病原体的小牛获得的（本研究使用了八个 9 mL 血管）。将血液装在保温箱中运输。将样品储存在2-4°C以备后用，或立即处理。保持血液旋转以避免血液凝固。用70%乙醇对真空容器进行消毒。以下所有实验均使用一个生物样品和六个技术重复进行。
- 密度梯度离心，从肝素化血液中分离PBMC
- 通过将血液倒置 10 倍来充分混合血液。
- 使用 10 mL 移液器将 20 mL 肝素化血液转移到无菌 50 mL 管中，并用 10 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 稀释。
- 将 15 mL 淋巴细胞分离培养基移液到无菌 50 mL 管中。
注意：在移液前让淋巴细胞分离培养基达到室温。 - 将含有淋巴细胞分离培养基的 50 mL 管倾斜至 45° 位置。将 25 mL 移液器的尖端垂直点准，并小心地将 30 mL 的 blood-PBS 层叠在淋巴细胞分离培养基上，不要将两者混合。非常缓慢地将 50 mL 管放回垂直位置。
- 在20°C下以800× g 离心35分钟，最大加速度且不制动（减速功能关闭）。
- 使用巴斯德移液器收集PBMC层（紧接第一层血浆之后的白色薄层）并将其转移到新的50 mL管中。
注意：密度梯度离心将全血分离成不同的层。结果，红细胞以沉淀的形式沉淀在底部，单核细胞（PBMC）沉淀在界面层，血浆形成顶层。粒细胞位于沉淀和PBMC层之间。 - 通过添加最大体积为 40 mL 的 PBS 并上下移液彻底混合来清洗收获的 PBMC 2 倍。然后，在4°C下以500× g 离心7分钟，最大加速度和最大减速。
- 通过倾析弃去上清液，将沉淀重悬于15mL的1x氯化铵钾（ACK）缓冲液中，并在室温下孵育10-15分钟。
注意：孵育时间不要超过15分钟。市售的ACK缓冲液用于确保PBMC级分中残留红细胞（RBC）的裂解。 - 加入PBS至40mL体积，然后在500× g 和4°C下以最大加速和减速离心7分钟。
- 倾析弃去上清液，重复步骤1.1.9。
- 弃去上清液，并将沉淀重悬于10mL完全培养基中（室温下）。
注意：完整的培养基由补充有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素链霉素的RPMI 1640细胞培养基组成。
- 使用 CD14 偶联磁珠从 PBMC 群体中磁分离 CD14+/− 细胞
- 使用干净的血细胞计数器计数细胞，使用 10 μL 细胞悬液与 10 μL 台盼蓝 （0.4%） 溶液混合。
注意：台盼蓝染料是一种有毒化学物质和潜在的致癌物质。应在佩戴个人防护装备（PPE）时进行处理，以避免接触，废物应丢弃在密封的专用有毒废物容器中。死细胞会呈现蓝色，而活细胞在显微镜下会显得清晰。 - 以500 ×g离心7分钟。
- 使用移液管弃去上清液，并将沉淀重悬于荧光激活细胞分选缓冲液（FACS）中，每1×107 个细胞使用40μL的体积。用移液管充分混合。
注意：FACS缓冲液由溶解在PBS中的2%FBS和2mM乙二胺四乙酸（EDTA）组成。 - 每 1 × 107 个细胞加入 5 μL CD14 微珠缓冲液，并使用移液器充分混合。
- 在4-8°C孵育30分钟，以阳性选择牛CD14 + 单核细胞33。在孵育期间每15分钟涡旋一次。
- 可选步骤（用于流式细胞术分析）：加入10μLCD14-FITC（异硫氰酸荧光素）染色抗体，随后在4-8°C孵育15分钟。 有关详细信息，请参阅步骤 5 中的流式细胞术分析。
- 加入 1 mL FACS 缓冲液，并以 500 × g 离心 7 分钟。
- 弃去上清液，并将沉淀重悬于每 1 × 108 个细胞的 500 μL FACS 缓冲液中。
- 将免疫磁性细胞分离柱插入分离器（磁性柱支架），并在色谱柱出口下方放置15 mL收集管以收集流出物。
- 用 1 mL 脱气的 FACS 缓冲液洗涤色谱柱。冲洗后，用新的管更换用过的 15 mL 管。
- 通过一次在500μL缓冲液中移取1×108 个细胞，使细胞悬液（来自步骤1.2.8）通过色谱柱。
注意：在允许细胞通过色谱柱之前，请注意在混合细胞时不要产生气泡。 - 每次用 3 mL 脱气的 FACS 缓冲液冲洗色谱柱 3 倍。
- 收集流出物，并将第一个洗脱部分标记为CD14− 细胞级分（PBMC减去CD14 + 单核细胞）;这也被称为幼稚淋巴细胞部分。
注意：CD14− 细胞维持在完整的培养基中，直到产生抗原脉冲MoDC。 - 从分隔符中删除列。
- 在色谱柱下方放置一个新的无菌 15 mL 管以收集流出物。
- 将 5 mL FACS 缓冲液移入色谱柱中，并立即使用柱塞将其推入。
- 收集流出物，并将第二个洗脱部分标记为CD14 + 细胞级分;这也称为幼稚单核细胞分数。
- 将完全培养基添加到收获的CD14 + 单核细胞中，以获得1×106 个细胞/ mL。
注意：计数洗脱的CD14 + 细胞级分中的活细胞，以估计获得所需细胞计数所需的完整培养基的体积。 - 取无菌 24 孔板，向每个孔中加入 1 mL 细胞悬液 （1 × 106 个细胞/mL）。
- 使用干净的血细胞计数器计数细胞，使用 10 μL 细胞悬液与 10 μL 台盼蓝 （0.4%） 溶液混合。
- 通过添加 3% w/v 细胞因子混合物 （GM-CSF + IL-4） 将 CD14+ 幼稚单核细胞分化为幼稚 MoDC，总共孵育 5 天
- 用试剂盒中提供的 40 μL （3% w/v） 细胞因子混合物补充每个含有 CD14+ 单核细胞的孔。
- 将板在含有5%CO2 的加湿培养箱中孵育，并在37°C下孵育48小时。
- 在第 2 天，使用移液器将每个孔内容物的一半 （500 μL） 转移到单独的 1.5 mL 管中，并在 4 °C 下以 500 × g 离心 7 分钟。
- 弃去上清液，并将沉淀重悬于500μL新鲜完全培养基中。
- 将步骤 1.3.4 中的 500 μL 该细胞悬液转移回每个指定孔中，使最终体积为 1 mL。
- 用 20 μL 细胞因子混合物富集每个孔。
- 将培养物在含有5%CO2 的加湿培养箱中并在37°C下孵育72小时。
- 在第5天孵育后，从培养箱中取出板。
注意：每个孔将包含 1 mL 的朴素 MoDC 细胞悬液。MoDC 的数量将是接种的原始单核细胞的百分比 （~20%） （1 ×10 6/mL）。
2. MoDC内吞活性测定
注意：抗原摄取测定或内吞活性测定测量幼稚MoDC内化异物的能力。使用用 3% w/v 细胞因子混合物培养并孵育 5 天的幼稚 MoDC 进行测定，如前所述34。
- 从 24 孔板中收获朴素的 MoDC 细胞悬液，并将其转移到 15 mL 管中;还通过用PBS冲洗孔来收集任何残留细胞。
- 离心500× g7 分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于补充有1%FBS的1mL培养基中。
- 对活 MoDC 细胞进行计数，以估计获得所需细胞计数所需的培养基体积（2 × 105 个细胞/mL）。
- 在 24 孔板中的 100 μL 完全培养基中培养幼稚的 MoDC，最终细胞浓度为 2 ×10 5 个细胞/mL。
- 用 1 mg/mL FITC偶联葡聚糖（用作内吞示踪剂的荧光探针）补充每个孔。
注意：FITC-葡聚糖用作荧光探针，并用作内吞示踪剂。 - 盖上板，并在5%CO2 和37°C的黑暗中孵育60分钟。
注意：对于背景对照，将额外的MoDC细胞（2×105 个细胞/mL）与1 mg/mL FITC-葡聚糖在冰上孵育，因为这种类型的孵育可防止示踪分子（FITC-葡聚糖）进入细胞。 - 孵育后，立即将24孔板转移到冰上以停止FITC-葡聚糖的内吞作用。
- 用冰冷的FACS缓冲液洗涤细胞。
- 收获、离心并将沉淀重悬于 500 μL FACS 缓冲液中。
- 使用流式细胞术分析细胞内FITC-葡聚糖的荧光强度。有关详细信息，请参阅步骤5.2中的流式细胞术分析。
3. 抗原脉冲MoDC的产生
注意：市售且临床批准的狂犬病病毒 （RV） 疫苗可诱导幼稚 MoDC 分化为成熟的抗原呈递 MoDC。使用单次 RV 疫苗接种剂量的 0.1% （~1 μL） 来生成抗原脉冲 MoDC。此外，优选在用于（在步骤1.3.8中）的相同培养板中生产RV脉冲MoDC，以产生朴素MoDC，因为将朴素MoDC转移到新的24孔板会对它们产生负面影响。
- 从步骤1.3.8）将1μL / mL的RV悬浮液加入24孔板中的1mL朴素MoDC培养物中，并在5%CO2 和37°C下孵育48小时。
注意：在没有RV刺激的情况下培养的幼稚MoDC用作背景对照（并在后续步骤中用作与淋巴细胞共培养的非特异性刺激）。 - 孵育后，在第7天，将含有抗原脉冲MoDC的24孔板在冰上保持10分钟。
- 每孔加入 1 mL 冰冷的 PBS。通过移液彻底混合每个孔，并将悬浮液转移到 15 mL 管中。
- 用 2 mL 冰冷的 PBS 洗涤孔，以收集每个孔内残留的细胞。
- 将内容物转移到各自的管中，并以500× g 离心细胞悬液7分钟。
- 弃去上清液，将细胞沉淀（抗原脉冲MoDC）重悬于完全培养基中，并将体积调节至最终细胞浓度为1×105 个细胞/ mL。
注意：对活细胞进行计数以估计达到所需细胞计数所需的培养基体积。从第 7 天开始将右心室脉冲 MoDC 用于 MoDC 淋巴细胞共培养系统。
4. MoDC-淋巴细胞共培养
注意： 体外 MoDC 淋巴细胞共培养系统决定了 MoDC 引发抗原特异性淋巴细胞的能力。共培养16天后细胞的不同处理组包括特异性，非特异性和对照组。特定组定义为与右心室脉冲 MoDC 共培养的淋巴细胞;非特异性组定义为与非抗原脉冲 MoDC 共培养的淋巴细胞;对照组定义为无MoDC培养的淋巴细胞。
- 将完全培养基加入洗脱的幼稚淋巴细胞组分（CD14− 细胞）中，以达到2×106 细胞/ mL的细胞浓度。
注意：计数CD14− 细胞培养物中的活细胞，这些活细胞自收集以来一直保持在24孔板的完整培养基中，以估计获得所需细胞计数所需的培养基体积。 - 在第 7 天，取无菌 24 孔板，并用 1 mL 幼稚淋巴细胞悬液（2 × 106 细胞/mL）加上 1 mL 抗原脉冲或非抗原脉冲 MoDC 悬浮液（1 × 105 细胞/mL）。
注意：每个孔中的总体积将为 2 mL，每孔与淋巴细胞的比例为 1：20 MoDC。 - 将板在37°C和5%CO2下孵育48小时。
- 使用抗原脉冲 MoDC 进行培养富集和再刺激
- 在抗原脉冲MoDC-淋巴细胞共培养物孵育后，在第9天，用20ng / mL重组IL-2补充每个孔，并继续孵育另外120小时（孵育5天）。
- 在第 14 天，将 1 mL 共培养物转移到无菌 1.5 mL 管中，并以 500 × g 离心 7 分钟。
- 弃去上清液，并用 1 mL 抗原脉冲或非脉冲 MoDC（1 × 105 细胞/mL）重悬细胞沉淀。通过移液轻轻混合，然后将细胞悬浮液转移回其指定的孔中。
注意：在此步骤中，每个孔中的总体积为2 mL。 - 继续在5%CO2 和37°C下孵育48小时。在第16天孵育后，共培养物准备好使用流式细胞术，qPCR和ELISA进行分析。
注意：对于MoDC-淋巴细胞共培养的每个孔中每2 mL，将1 mL重悬细胞染色用于流式细胞术，1 mL用于RNA提取，并且两者的上清液用于ELISA。
5. 流式细胞术分析
注意：在流式细胞仪上运行样品之前，用适当的标记物/mAb对细胞进行染色。有关用于流式细胞术分析的试剂（染色mAb和同种型对照）、试剂盒、仪器和软件的详细信息，请参阅 材料表 。
- 流式细胞仪染色方案
注意：使用抗CD14 mAb对PBMC和幼稚淋巴细胞和单核细胞进行细胞表面染色（步骤1.2.6）。对于幼稚MoDC的细胞表面染色，请使用抗CD86特异性，抗CD40特异性和抗MHC II特异性mAb。对于第16天共培养的细胞表面染色，使用抗CD4，抗CD8，抗CD25 mAb;对于细胞内染色，使用抗Ki-67 mAb。此外，用阴性同种型对照mAb或不含mAb（FMO：荧光减一）染色细胞。对表面和细胞内标志物进行染色时的主要区别在于，对于细胞表面标志物，必须在活/死（L/D）染色或任何其他过程之前用特定的表面mAb对细胞进行染色。然而，细胞内染色是在L/D染色后进行的，需要固定加透化步骤以允许细胞内渗透。- 使用移液器将 1 mL 细胞悬液转移到无菌 1.5 mL 管中，并以 500 × g 离心 10 分钟。
注意：离心后，当处理来自MoDC-淋巴细胞共培养物的细胞时，保存上清液用于ELISA分析。 - 将沉淀重悬于 1 mL PBS 中，并将其转移到 15 mL 管中。使用 1 mL PBS 收集残留细胞，并将其与重悬沉淀相结合。
- 将 10 mL PBS 加入包含细胞的 15 mL 管中，通过移液混合，并以 850 x g 离心 7 分钟。
- 弃去上清液，重复步骤5.1.3。
- 弃去上清液，并小心地用倾析上清液后剩余的残留悬浮液（约180μL）重悬细胞沉淀。
- 将细胞悬液转移到V底96孔板中，并密封孔以避免溢出。
- 将板以1，400× g 离心5分钟。离心后，将板轻弹到废物容器上以清空液体孔，然后将板敲击在吸收纸上以确保去除多余的液体。
- 每孔加入 25 μL 表面染色预混液，并使用移液管轻轻混合，然后在 4 °C 下孵育 30 分钟。
注意：要为单个孔制备表面染色预混液，请将 2.5 μL 表面 mAb 添加到 20 μL FACS 缓冲液中。 - 每孔加入 200 μL FACS 缓冲液，并以 1，400 × g 离心 5 分钟。离心后，通过倾析清空液体孔，并在吸收纸上敲击板以除去多余的液体。
- 每孔加入 100 μL L/D 染色溶液。使用移液管充分混合，然后在4°C下在黑暗中孵育15分钟。
注意：对于单个孔，将 0.25 μL L/D 染料溶解在 100 μL FACS 缓冲液中。L/D染料有助于区分活细胞和死细胞。 - 加入 100 μL FACS 缓冲液。盖上盖子盖住孔，将板离心1，400 × g5 分钟。通过倾析丢弃上清液，并在吸水纸上敲击板。
- 重复步骤 5.1.11。
- 每孔加入 50 μL 固定溶液（随试剂盒提供），并与移液管混合，然后将板在室温下在黑暗中孵育 10 分钟。
- 加入试剂盒随附的 150 μL 1x 透化洗涤缓冲液 （PW），并盖上盖子覆盖孔。
注意：要制备 10 mL 的 1x PW 缓冲液，请将 1 mL 的 10x 烫发缓冲液稀释在 10 mLdH 2O 中。 - 将板在4°C下以1，400× g 离心5分钟。通过倾析丢弃上清液，并在吸水纸上敲击板。
- 加入 200 μL 的 1x PW，然后在 4 °C 下以 1，400 × g 离心 5 分钟。通过倾析丢弃上清液，并在吸水纸上敲击板。
- 对于细胞内染色，每孔加入 25 μL 细胞内染色预混液（抗人 Ki-67 mAb）。充分混合，并将板在4°C或在黑暗中的冰上孵育30分钟。
注意：要为单个孔制备细胞内染色预混液，请将 1 μL Ki-67 mAb 加入 24 μL 1x PW 中。细胞内染色标记仅在处理来自第16天共培养的细胞时使用。在处理 PBMC、幼稚淋巴细胞、单核细胞和幼稚 MoDC 时不进行细胞内染色。 - 孵育后，向每个孔中加入 200 μL 1x PW。用移液管混合，离心1，400 × g 5分钟。通过倾析丢弃上清液，并在吸水纸上敲击板。
- 加入 200 μL FACS 缓冲液，然后以 1，400 × g 离心 5 分钟。倾析弃去上清液，并在吸收纸上敲击平板。
- 将细胞沉淀重悬于 200 μL FACS 缓冲液中，并将每个孔的内容物转移到单独的无菌流式细胞仪管中。每孔使用 300 μL FACS 缓冲液收集残留细胞。细胞现在已准备好进行流式细胞术分析。
- 使用移液器将 1 mL 细胞悬液转移到无菌 1.5 mL 管中，并以 500 × g 离心 10 分钟。
- 在流式细胞仪上运行样品
注意：根据制造商手册，样品在流式细胞仪（使用488 nm，638 nm和405 nm激光器）上运行35.有关协议的详细信息、故障排除和自定义，请参阅手册。- 在读取样品之前和之后执行常规清洁程序。
注意： 在仪器中装入试管时不要跳过位置。- 对于清洁周期，总共使用四个管，第一个管子装有流动清洁剂，其余三个管子含有dH2O;每个试管将有 3 mL。在清洁运行期间，通过捕获每个管子在 330 V 下用于前向散射 （FSC） 和 265 V 用于侧向散射 （SSC） 的每个管捕获 100，000 个事件，以中等流速采集数据约 1 分钟。
注意：清洁过程中不应报告碎屑或蜂窝事件;如果发生这种情况，请再次执行清洁步骤。对于运行样品，请确保在获取数据之前所有样品都处于均匀悬浮液中，因为这可确保准确的读数。
- 对于清洁周期，总共使用四个管，第一个管子装有流动清洁剂，其余三个管子含有dH2O;每个试管将有 3 mL。在清洁运行期间，通过捕获每个管子在 330 V 下用于前向散射 （FSC） 和 265 V 用于侧向散射 （SSC） 的每个管捕获 100，000 个事件，以中等流速采集数据约 1 分钟。
- 要连接并打开细胞仪电源，请单击标题栏左上角的应用程序 按钮 。从 应用程序 下拉菜单中，选择选项 细胞术，然后单击选项开 机。
注意：从 应用程序 下拉菜单中， 选项打开 允许用户浏览预编程的检测，而 选项新协议 允许用户创建新方案。 - 最初将 阴性对照 样品装入多管支架中。选择 “新建协议”，然后观察工作区/屏幕左侧的工作 列表 。
- 在工作清单上，定义样品在多管支架中的位置，并为样品命名和方案以进行识别。
- 从位于工作区左侧的硬件面板中，调整并选择多个参数，例如检测器（FSC、SSC 和 10 个荧光范围）、光电倍增管的电压 （V） 和增益以及信号的面积-高度-宽度 （AHW）。
注意：根据所使用的实验和仪器选择以下检测器设置： FSC-AHW：AHW，V：270，G：5; SSC-AHW： A， V： 350， G： 10; FL1 （CD8/FITC 葡聚糖）-AHW： a， v： 400， G： 1; FL2 （CD25/PE）-AHW： A， V： 500， G： 1; FL6 （CD4/Alexa Fluor 647）-AHW： A， V： 700， G： 1; FL7 （Ki-67/Alexa Fluor 700）-AHW： A， V： 625， G： 1; FL9 （长/深）-AHW： A， V： 425， G： 1. - 从位于标题栏下方的仪器采集控制面板中，调整要检测的流速（中）、时间（5 分钟）和事件（参见步骤 5.2.8）选项。单击“采集单个”选项，允许仪器绘制/运行样品并显示检测到的事件的实时预览。
- 从实时预览中，调整 荧光阈值 （电压 和 增益）和细胞大小，以最终在所需细胞群周围绘制门，同时排除任何 细胞 碎片。
注意：FSC有助于根据大小区分细胞，从而允许用户区分免疫系统的细胞，例如单核细胞和淋巴细胞;与淋巴细胞相比，单核细胞更大，FSC强度更高。 - 总共获取大约 5，000 个活 MoDC、50，000 个活淋巴细胞和 50，000 个活单核细胞事件。
- 参考阴性对照样品调整所有参数后，单击 “停止”，然后保存方案。
- 现在将所有样品装载到多管装载器上。定义工作清单上的每个样品，并将参考阴性对照调整的参数应用于实验中的所有样品。单击“ 获取” 选项以允许连续运行实验中的所有样品。
- 从所有样品中获取数据后，使用适当的数据分析软件保存并转换为可读数据，该软件允许生成顺序双参数和单参数直方图。
- 在读取样品之前和之后执行常规清洁程序。
6. 信使核糖核酸（mRNA）表达分析
- 核糖核酸提取
注意：从抗原脉冲 MoDC 淋巴细胞共培养物（特异性）、非抗原脉冲 MoDC 淋巴细胞共培养物（非特异性）、不含 MoDC 的淋巴细胞培养物（对照）和幼稚淋巴细胞（共培养前分离的 CD14− 细胞）中提取总 RNA。对于RNA提取，使用不含RNA酶的水制备乙醇。有关提取试剂盒和试剂的详细信息，请参阅 材料表 。- 使用移液管将 1 mL 细胞悬液从 MoDC-淋巴细胞共培养板（~1 × 106 个细胞/mL）转移到无菌的 1.5 mL 无菌管中，并以 500 × g 离心 10 分钟。
- 保存酶联免疫吸附形式的上清液。将细胞沉淀重悬于 1 mL PBS 中，并将其转移到 15 mL 管中。使用 1 mL PBS 收集任何残留细胞。
- 以500 ×g离心10分钟。
注意：所有样品应作为活细胞精心处理，直到使用试剂盒中提供的裂解缓冲液进行细胞裂解。细胞死亡释放的RNA酶可快速水解下游定量所需的RNA模板。RLT缓冲液在抑制RNA酶的溶液中裂解细胞。 - 向每个空孔中加入 350 μL 裂解缓冲液，孵育 2-3 分钟以裂解在前面步骤中未收获的贴壁细胞。
- 步骤6.1.3中的离心完成后，弃去上清液，并将细胞沉淀与步骤6.1.4中加入的350μL裂解缓冲液合并。
注意：此时，可以将试管储存在-80°C或继续进行RNA提取（以下步骤）。 - 在步骤6.1.5中将350μL的70%乙醇移液到裂解物中。每个样品的最终体积为 700 μL。
- 将提取柱插入 2 mL 收集管（随试剂盒提供）中。
- 每根萃取柱转移 700 μL 样品，并以 10，000 × g 离心 15 秒。丢弃收集管中的流出物，然后将其放回离心柱中。
- 在提取柱中，加入 350 μL 严格的洗涤缓冲液（试剂盒中提供），并以超过 10，000 × g 离心 15 秒。丢弃流出物。
- 将每个样品的80μLDNase I孵育混合物添加到提取柱的膜上，并在20-30°C下凝固15分钟。
注意：要为每个样品制备 DNase I 孵育混合物，请将 10 μL DNase I 储备溶液添加到 70 μL DNase 缓冲液中，最终体积为 80 μL。 通过将试管倒置几次，然后在离心机中短时间旋转来彻底混合。 - 用 350 μL 严格的洗涤缓冲液洗涤萃取柱，然后以 10，000 × g 离心 15 分钟。离心后丢弃收集管中的流出物。
- 每次用 500 μL 温和洗涤缓冲液洗涤提取柱 2 倍，并以 10，000 × g 离心 15 秒，第二次离心 2 分钟。每次离心后丢弃流出物。
- 以最大速度离心柱1分钟以干燥膜，并丢弃收集管。
- 将提取柱放入新的 1.5 mL 收集管中。
- 将 50 μL 无 RNase 的水移液到柱膜上，并在室温下孵育 3-5 分钟。
注意：对于低于 100 ng 的 RNA 浓度，将洗脱体积减少至 30 μL，并使用第一次洗脱中的产物重新洗脱提取柱膜以浓缩最终产物。 - 以 10，000 × g 离心 1 分钟以洗脱 RNA。
- 通过使用 0.5-2 μL 样品检测 260 nm 处的吸光度来测量 RNA 的浓度。使用不含RNA酶的水将最终RNA浓度调节至0.1-1μg/μL。
- 将RNA等分试样储存在-80°C以备后用。
- 互补DNA的合成
- 根据试剂盒随附的制造商方案从提取的模板 RNA 中合成互补 DNA （cDNA）（有关详细信息，请参阅 材料表 ）。
注意：所用试剂和体积的摘要如表 1 和 表2所示。 补充文件 1 中详细介绍了完整的协议。
- 根据试剂盒随附的制造商方案从提取的模板 RNA 中合成互补 DNA （cDNA）（有关详细信息，请参阅 材料表 ）。
- 实时定量聚合酶链反应
- 对于qPCR，一式三份运行cDNA样品。参考 GAPDH 基因，使用特定的引物集量化 Ki-67 和 IFN-γ 的牛 mRNA 转录物水平，如 表 3 所示。
注意： 补充文件 1 中详细介绍了完整的协议。
- 对于qPCR，一式三份运行cDNA样品。参考 GAPDH 基因，使用特定的引物集量化 Ki-67 和 IFN-γ 的牛 mRNA 转录物水平，如 表 3 所示。
7. 酶联免疫吸附测定
- 处理收集的富含分泌蛋白的培养上清液，以通过ELISA定量IFN-γ。
注意：有关套件使用的详细信息，请参阅 材料表 。 补充文件 1 中详细介绍了完整的协议。
8. 统计分析
- 分析数据，并使用商业软件制作实验设计的图形说明。使用未配对非参数检验进行比较分析。考虑 P 值< 0.05 具有统计显著性。
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Representative Results
该方法描述了牛MoDC的体外生成，用于在进行体内研究之前评估候选疫苗抗原。图1说明了牛MoDC生成的实验方案以及MoDC在体外测定中的应用。使用基于磁性的细胞分选技术，可以从收获的PBMC中收集约2600万个CD14 +肌细胞，这些PBMC以前是从50 mL牛血中分离出来的。不含CD14+单核细胞的洗脱细胞组分富含淋巴细胞，可用作幼稚CD4+和CD8+ T细胞（CD14−淋巴细胞组分）的来源。
如CD14细胞染色和流式细胞术后观察到的那样，朴素单核细胞部分由98%CD14 + 单核细胞组成（图2A，B）。纯化的幼稚单核细胞在3%细胞因子混合物（GM-CSF和IL-4）存在下进行培养并随后孵育5天时，分化成DC样表型。从2600万个CD14+ 单核细胞的起始培养物中，孵育5天后总共可以获得约1200万个MoDC。如使用FITC-葡聚糖的流式细胞术分析观察到的那样，幼稚的MoDC在功能上能够摄取抗原（图3）。此外，通过评估MHC II类和共刺激性CD86和CD40细胞表面标志物的表达，对幼稚MoDC进行表型表征，从而验证了DC样表型（图4）。
通过在灭活的RV存在下培养2天来实现朴素MoDC的抗原脉冲刺激。幼稚淋巴细胞（CD14− 细胞部分）的活化是通过抗原脉冲MoDC淋巴细胞共培养并随后补充IL-2来实现的。在第9天的MoDC淋巴细胞共培养过程中，在RV脉冲MoDC中观察到形态变化，因为它们显示出树突延伸，这是MoDC成熟的特征（图5）。在第14天，通过添加来自同一动物的新产生的RV脉冲MoD来重新刺激共培养，从而增强了淋巴细胞的活化。
与非脉冲MoDC淋巴细胞共培养相比，在脉冲MoDC淋巴细胞共培养的第16天，CD4+和CD8 + T细胞上的Ki-67和CD25活化标志物上调，证明了淋巴细胞增殖的显着增加（p < 0.01）（图6）。与非特异性组相比，来自成熟 RV 脉冲 MoDC 共培养物的 CD8+ T 细胞表现出 Ki-67 的 8 倍上调 （p < 0.01）（图 7A）。与对照组相比，同一共培养物中的CD4 + T细胞在Ki-67中增加了7倍（p < 0.01）（图7B）。这证明了RV引发的MoDCs能够成功地将RV抗原呈递给幼稚淋巴细胞，并随后在体外条件下激活它们，类似于活体动物中发生的情况。除了使用流式细胞术分析细胞外，还对共培养物进行qPCR和ELISA，以分别使用RNA转录（Ki-67和IFN-γ）和细胞外分泌（IFN-γ）定量RV特异性淋巴细胞活化（图8）。这些额外的检测方法也可以用作验证性测试，以进一步验证流式细胞术的结果。与非特异性治疗组相比，qPCR 显示的 Ki-67 和 IFN-γ 的 RNA 表达与 ELISA 显示的 IFN-γ 水平在抗原特异性共培养中显示出相似的增加模式，表明淋巴细胞增殖。因此，qPCR和ELISA结果与流式细胞术结果相关。qPCR显示，在使用GAPDH作为校准品的所有共培养物中，IFN-γ表达增加>30%，Ki-67表达增加>5%（图8A，B）。与非特异性治疗组相比，使用来自RV脉冲MoDC淋巴细胞共培养的培养上清液使用ELISA测量分泌的IFN-γ浓度显着更高（**p > 0.01）（图8C）。
图 1：基于 MoDC 的牛体 外 测定的实验设计。 （A）从牛PBMC中收获和细胞分选CD14 + 单核细胞和CD14− 淋巴细胞组分。 牛血通过密度梯度离心处理以收集PBMC，然后使用免疫磁性细胞分离柱进行基于磁性的细胞分选，随后在补充的RPMI 1640培养基中培养收获的CD14 + 幼稚单核细胞级分。（B）使用3%细胞因子混合物（GM-CSF + IL-4）生产MoDC，孵育5天，MoDC-淋巴细胞共培养。在第0天，将单核细胞在细胞因子混合物存在下培养并孵育48小时以诱导分化。在第2天，用相同的细胞因子混合物重新刺激培养物，然后孵育72小时，这导致幼稚MoDC的产生。在第5天，将疫苗抗原（狂犬病疫苗）加入到朴素的MoDC细胞培养物中，然后孵育48小时。在第7天，进行抗原脉冲MoDC与幼稚淋巴细胞（CD14− 细胞部分）的共同培养，然后孵育。在第9天，将IL-2添加到共培养物中。在第14天，通过加入抗原脉冲MoDC进行活化/引发的淋巴细胞的富集/再刺激，然后孵育48小时。最后，在第16天，收获细胞和培养物上清液用于淋巴细胞增殖测定。缩写：MODCs=牛单核细胞来源的树突状细胞;PBMC=外周血单核细胞;GM-CSF = 粒细胞-巨噬细胞-集落刺激因子。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：使用抗 CD14 偶联微珠从 PBMC 收获的牛 CD14+ 单核细胞的形态和纯度。 （A）牛单核细胞的形态在37°C下在完全培养基中孵育4小时以除去微珠，固定在聚赖氨酸包被的载玻片上，并用修饰的吉姆萨染色剂染色。比例尺 = 50 μm。 （B） 流式细胞术直方图显示使用抗 CD14 抗体（红色）和 FITC偶联小鼠 IgG1 同种型对照抗体（绿色）观察到的洗脱的 CD14+ 细胞级分，纯度为 98.6%。缩写：PBMC=外周血单核细胞;FITC持续=异硫氰酸荧光素控制。该数字已修改自Kangethe等人，201811。请点击此处查看此图的大图。
图3： 体外产生的牛MoDC的内吞活性。 流式细胞术直方图显示示踪分子（FITC-葡聚糖）在第 5 天幼稚 MoDC 的摄取。MoDC在37°C下孵育60分钟，示踪分子（蓝色）和MoDC在冰上孵育，示踪分子（灰色）用作背景对照。缩写：MODCs=牛单核细胞来源的树突状细胞;FITC = 异硫氰酸荧光素。该数字已修改自Kangethe等人，201811。请点击此处查看此图的大图。
图 4： 体外生成的牛 MoDC 特异性细胞表面标志物的表型。 流式细胞术直方图，用于 （A） MoDC 的设门策略和 （B） 用三种不同的 DC 特异性单克隆抗体（蓝色）染色的第 5 天幼稚 MoDC，包括以下内容：抗绵羊 MHC II mAb、抗牛 CD86 mAb 和抗牛 CD40 mAb。所有这些都与其相应的同种型对照（红色）进行了比较。缩写：DC = 树突状细胞;MODC = 牛单核细胞衍生的 DC;MHC II = 主要组织相容性复合体 II。该数字已修改自Kangethe等人，201811。请点击此处查看此图的大图。
图 5：MoDC 淋巴细胞共培养过程中体外产生的 MoDC 成熟迹象。 在 MoDC-淋巴细胞共培养的第 9 天，用倒置显微镜观察抗原脉冲 MoDC 的特征性扩展树突结构。（A）在共培养淋巴细胞高度融合区域内的成熟MoDC。（B）成熟的MoDC在共培养中淋巴细胞较少的区域很容易区分。比例尺 = 50 μm。缩写：MODC=牛单核细胞来源的树突状细胞。该数字已修改自Kangethe等人，201811。请点击此处查看此图的大图。
图 6：在 MoDC 淋巴细胞共培养中淋巴细胞针对 Ki-67 和 CD25 表达的点图采用顺序门控策略。 （A）从MoDC淋巴细胞共培养的第16天收获的细胞的完整门控策略。（B）来自CD4 +门控淋巴细胞的Ki-67表达和（C）来自CD8 +淋巴细胞与FMO对照（无mAb）和小鼠IgG1-k同种型对照mAb的比较。门控 （D） CD8+ 和 （E） CD4+ 淋巴细胞上的 CD25 表达与小鼠 IgG1 同种型对照 mAb 的比较。治疗组特异性代表与右心室脉冲MoDC共培养的淋巴细胞，而对照组代表在没有MoDC的情况下培养的淋巴细胞。缩写：MODCs=牛单核细胞来源的树突状细胞;FMO = 荧光减一;RV = 狂犬病疫苗。该数字已修改自Kangethe等人，201811。请点击此处查看此图的大图。
图 7：用抗原引发后 CD4+ 和 CD8+ 淋巴细胞对 Ki-67 和 CD25 表达的流式细胞术数据分析。 Ki-67 和 CD25 表达从第 16 天开始共培养。治疗组（特异性）定义为用右心室脉冲 MoDC 培养的淋巴细胞;非特异性组对应于用非抗原脉冲MoDC培养的淋巴细胞;对照组对应于没有MoDC培养的淋巴细胞。水平条表示六个技术重复的平均值。（A）CD8 T细胞对Ki-67标记物的细胞内表达和（B）CD4 T细胞的细胞内表达。（C）CD8 T细胞和（D）CD4 T细胞对CD25标志物的细胞表面表达。缩写：MODCs=牛单核细胞来源的树突状细胞;RV = 狂犬病疫苗。该数字已修改自Kangethe等人，201811。请点击此处查看此图的大图。
图 8：通过 qPCR 和 ELISA 检测的用狂犬病病毒抗原引发的 MoDC 激活 Th1 标记物（IFN-γ 和 Ki-67）。 数据取自一只动物，有六个技术重复。水平条表示平均值。三个PCR重复显示与使用 GAPDH 参考基因标准化后的幼稚淋巴细胞相比的倍数变化。（A） IFN-γ 表达，（B）Ki-67 表达。（C）通过ELISA检测的三个处理组之间培养上清液中IFN-γ分泌的比较。特定组定义为用右心室脉冲 MoDC 培养的淋巴细胞;非特异性组对应于用非抗原脉冲MoDC培养的淋巴细胞;对照组对应于没有MoDC培养的淋巴细胞。缩写：MODCs=牛单核细胞来源的树突状细胞;RV = 狂犬病疫苗。该数字已修改自Kangethe等人，201811。请点击此处查看此图的大图。
| 试剂 | 最终浓度 | 体积 每个反应 |
| dNTPs混合物（10 mM） | 1，000 微米 | 1 微升 |
| 随机六层推物 （50 ng/μL） | 25微米 | 1 微升 |
| 核糖核酸模板 | 0.1 – 1 微克/微升 | χ μL （根据需要） |
| 核糖核酸酶游离水 | - | χ μL （根据需要） |
| 最终反应体积 | - | 10 微升 |
表1：预混液组成（RNA引物混合物）。
| 试剂 | 最终浓度 | 体积 每个反应 |
| 室温缓冲器 10x | 1 倍 | 2 微升 |
| 氯化镁2 25 毫米M | 5 毫米米 | 4 微升 |
| DTT 0.1 M | 10 毫米 | 2 微升 |
| 核糖核酸酶抑制剂 40 U/μL | 2 U | 1 微升 |
表2：2x PCR反应混合物。 缩写：RT = 逆转录酶;DTT = 二硫苏糖醇。
| 细胞因子 | 物种 | 入藏号 | 序列 | 长度 | Tm | |||
| IFN-γ | 博斯金牛座 | FJ263670 | F- GTGGGCCTCTCTTCTCAGAA | 234 | 80.5 | |||
| R- GATCATCCACCGGAATTTGA | ||||||||
| 基-67 | 博斯金牛座 | XM_015460791.2 | F-AAGATTCCAGCGCCCATTCA | 148 | 86.5 | |||
| R-TGAGGAACGAACACGACTGG | ||||||||
| 加普德 | 博斯金牛座 | 萨苏等人，2020 | F-CCTGGAGAAACCTGCCAAGT | 214 | 85.5 | |||
| R-GCCAAATTCATTGTCGTACCA | ||||||||
表3：用于扩增的引物组50。
| 试剂 | 最终浓度 | 体积 每个反应 |
| 超级混合 | 1 倍 | 5 微升 |
| 正向底漆 （5 μM） | 250/ 125 纳米 | 1 微升 |
| 反向引物 （5 μM） | 250/ 125 纳米 | 1 微升 |
| cDNA 1：10 稀释 | 1.25 纳克 | 2 微升 |
| 无核酸酶水 | - | 1 微升 |
| 最终反应体积 | - | 10 微升 |
表 4：qPCR 预混液
| 管号 | 标准浓度 | 连续稀释 | |||||
| 1 | 50 纳克/毫升 | 50 μL 标准品 + 350 μL 洗涤缓冲液 | |||||
| 2 | 12.5 纳克/毫升 | 150 μL 试管 1 + 450 μL 洗涤缓冲液 | |||||
| 3 | 6.25 纳克/毫升 | 2 管 2 中的 250 μL + 250 μL 洗涤缓冲液 | |||||
| 4 | 3.13 纳克/毫升 | 来自试管 3 的 250 μL + 250 μL 洗涤缓冲液 | |||||
| 5 | 1.56 纳克/毫升 | 250 μL 来自试管 4 + 250 μL 洗涤缓冲液 | |||||
| 6 | 0.78 纳克/毫升 | 250 μL 来自试管 5 + 250 μL 洗涤缓冲液 | |||||
| 7 | 0.2 纳克/毫升 | 来自试管 6 的 150 μL + 450 μL 洗涤缓冲液 | |||||
| 8 | 0.1 纳克/毫升 | 250 μL 来自试管 7 + 250 μL 洗涤缓冲液 | |||||
| 9 | 0.025纳克/毫升 | 100 μL 来自试管 8 + 300 μL 洗涤缓冲液 | |||||
表5：IFN-γ标准稀释系列
补充文件1：互补DNA合成方案，实时定量聚合酶链反应（qPCR）和酶联免疫吸附测定（ELISA）。请点击此处下载此文件。
补充图S1：具有不同浓度的细胞因子混合物和3天或5天培养的MoDC的抗原摄取能力。 用3天或5天的培养物测试含有GM-CSF和IL-4的不同浓度（5%w / v和3% w / v）的细胞因子混合物，以评估产生高性能抗原摄取MoDC的最佳组合（使用示踪分子FITC-葡聚糖）。 请点击此处下载此文件。
补充图S2：CD4和CD8引发白喉类毒素（DT）和蓝舌病毒血清4型（BTV）。CD8细胞在用（A）DT和（C）BTV脉冲后表达Ki-67，CD4细胞在第16天用（B）DT和（D）BVT脉冲后表达Ki-67。与DT和BVT（特异性），（C，D）CD40L以及非特异性启动和对照处理的培养物进行比较。水平条表示平均值。*p < 0.05，**p < 0.01，根据曼-惠特尼测试。请点击此处下载此文件。
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Discussion
本研究展示了一种用于生成和分型牛 MoDC 的标准化体 外 方法，以及随后用于测量商业疫苗（例如 RV）的疫苗免疫原性。牛MoDC可用作筛选针对牛病的潜在疫苗抗原的工具，并在进行 体内 动物试验之前根据免疫反应预测其潜在的临床影响。生成的MoDC是根据其形态，表型和功能特征来鉴定的。我们发现，源自牛CD14 + 单核细胞的MoDC表现出DC中可见的特征，例如延伸的树突，用于抗原呈递的细胞表面标志物的表达（例如MHC II），MoDC上共刺激分子的表达（例如CD40和CD86），内吞活性以及激活幼稚淋巴细胞的能力。
本实验中使用的细胞培养基（DMEM和RPMI）广泛用于细胞分化和培养，RPMI更常用于单核细胞分化36。补充FBS或HS（马血清）的RPMI不影响单核细胞分化37。重组 GM-CSF 和 IL-4 补充剂提供了一种触发单核细胞分化的炎症性疾病，通常用于生产能够摄取抗原并呈递给免疫细胞的功能上可行的 MoDC38，39。在这项研究中，补充有10%FBS（完全培养基）、1%青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基，并添加市售细胞因子混合物（GM-CSF加IL-4）诱导牛单核细胞分化，从而产生活的MoDC。当生成的MoDC在与幼稚淋巴细胞共培养之前与RV一起孵育时，它们诱导了针对RV的T细胞依赖性免疫应答，证明成熟的MoDC可以充分地将RV抗原呈递给从未遇到过RV的淋巴细胞。这是适应性免疫的一个关键特征，我们现在可以在实验室中复制。
我们观察到，较高浓度的细胞因子混合物（5%）加上较长的孵育时间（5天）产生的MoDC具有较低的抗原摄取内吞能力，与使用较低浓度的细胞因子混合物（3%）处理的MoDC相比，具有相同的孵育时间（5天），如补充图S1所示。因此，我们得出结论，较低浓度的细胞因子混合物（例如，3%）和5天的孵育是产生功能有效的MoDC的最佳选择。APC 上存在细胞表面标志物，例如 MHC II、CD40 和 CD86，它们的上调表明功能性细胞活化40，41，42。我们证明了使用细胞因子混合物将单核细胞分化为幼稚MoDC后MHC II，CD40和CD86的表达增强（图4）。
优化培养系统中幼稚淋巴细胞和MoDC的比例是影响MoDC测定结果的关键因素，不同的MoDC与淋巴细胞比率诱导不同的淋巴细胞反应43。然而，在评估MoDC与淋巴细胞的比例为1：10-1：40后，我们观察到增加MoDC的浓度并没有增加淋巴细胞活化，我们最终确定了1：20的最佳比例，这与之前报道的研究相似44，45。应该注意的是，洗脱的幼稚淋巴细胞部分可能含有非特异性活化的T细胞;因此，必须有一个仅对应于幼稚淋巴细胞培养的对照组。
活化的CD4+ 和CD8+ T细胞表达特异性标志物并分泌多种细胞因子，它们的定量表明免疫活化。Ki-67（一种表征良好的免疫激活标志物）的细胞内表达在该MoDC淋巴细胞共培养物29，46中上调。同样，在这项研究中，淋巴细胞分泌增强的IFN-γ表明针对RV抗原30，31，47引发的Th1反应。CD4+ T细胞的IL-2表达也是可视化T细胞活化的良好标志物;然而，它在MoDC-淋巴细胞共培养的第9天被掺入，使其成为本研究测量淋巴细胞增殖的合适靶标48。先前已证明在存在IL-2的情况下CD25的上调可以确定CD4 + 和CD8 + T细胞的启动，并且在本研究中用于测量RV脉冲MoDCs对幼稚淋巴细胞的启动28。
细胞毒性CD8 T细胞是对抗细胞内疫苗抗原或病毒病原体的主要效应细胞49。通过测量淋巴细胞活化标志物（Ki-67和CD25）和细胞因子表达（IFN-γ），我们发现抗原负载的MoDCs对CD8和CD4 T细胞反应均具有显着的（p < 0.01）激活，其中CD8反应和Th1极化对RV抗原更为普遍。在为佐剂结合疫苗设计MoDC检测时需要考虑的一个重要因素是佐剂诱导的淋巴细胞反应。我们建议使用仅由佐剂组成的对照组（佐剂对照）来消除任何背景信号。该装置还可用于测量不同佐剂的作用，这些佐剂可以放大淋巴细胞对低免疫原性抗原的反应，这对于 体内 研究期间的保护至关重要。
我们想强调这项研究有一些局限性。每种测定的实验数据来自具有六个技术重复的单个动物。拥有更多的生物学重复将有利于最大限度地减少错误，并提供增强的统计可靠性和具有更高准确性的结果。尽管如此，在之前的出版物11中，该测定也分别使用白喉类毒素（补充图S2A，B）和针对蓝舌病毒血清型4的商业疫苗（补充图S2C，D）对三只和两只生物动物进行了测试和验证。此外，将从该体外研究中获得的结果与体内研究进行比较将有助于进一步验证该免疫测定的真实性，这反过来又将加速该体外MoDC测定的实施过程作为疫苗生产和质量控制中的常规测试。最后，没有研究CD14在MoDC中的表达，因为这方面的文献不一致，特别是在比较来自不同动物物种的MoDC时。
总之，我们报告了一种可用于测量疫苗诱导的免疫原性的 体外 牛MoDC测定。该MoDC测定也可以使用各种方法进行评估，包括流式细胞术，ELISA和qPCR。在资源有限且流式细胞仪可能不容易获得的地区，拥有多种方法来评估活化标志物至关重要。该测定可由生产大批量牛疫苗的国家兽医实验室作为质量控制步骤。此外，它还可用于在开发新牛疫苗期间识别潜在的疫苗抗原，甚至可以在动物试验前选择使用哪种佐剂。所有这些因素将有助于采用更合乎道德和更实惠的方法来开发和使用牛疫苗。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
我们感谢Eveline Wodak博士和Angelika Loistch博士（AGES）在确定动物健康状况和提供BTV方面的支持，感谢Bernhard Reinelt博士提供牛血，感谢原子能机构的Bharani Settypalli博士和William Dudon博士分别就实时聚合酶链反应实验和语言编辑提供有用的建议。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACK Lysing Buffer | Gibco, Thermo Fisher | A1049201 | Ammonium-Chloride-Potassium buffer for lysis of residual RBCs in harvested PBMC Fraction |
| BD Vacutainer Heparin Tubes | Becton, Dickinson (BD) and Company | 366480 | 10 mL, additive sodium heparin 158 USP units, glass tube, 16 x 100 mm size |
| Bovine Dendritic Cell Growth Kit | Bio-Rad, UK | PBP015KZZ | Cytokine cocktail composed of recombinant bovine IL-4 and GM-CSF |
| Bovine IFN-γ ELISA Kit | Bio-Rad | MCA5638KZZ | Kit use for measuring IFN-γ expression in culture supernatant |
| CD14 Antibody | Bio-Rad | MCA2678F | Mouse anti-bovine CD14 monoclonal antibody, clone CC-G33, isotype IgG1 |
| CD25 Antibody | Bio-Rad | MCA2430PE | Mouse anti bovine CD25 monoclonal antibody, clone IL-A11, isotype IgG1 |
| CD4 Antibody | Bio-Rad | MCA1653A647 | Mouse anti bovine CD4 monoclonal antibody, clone CC8, isotype IgG2a |
| CD40 Antibody | Bio-Rad | MCA2431F | Mouse anti-bovine CD40 monoclonal antibody, clone IL-A156, isotype IgG1 |
| CD8 Antibody | Bio-Rad | MCA837F | Mouse anti bovine CD8 monoclonal antibody, clone CC63, isotype IgG2a |
| CD86 Antibody | Bio-Rad | MCA2437PE | Mouse anti-bovine CD86 monoclonal antibody, clone IL-A190, isotype IgG1 |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | - | Thermal cycler PCR machine |
| Corning Centrifuge Tube | Falcon Corning | 352096 & 352070 | 15 mL and 50 mL, high-clarity poypropylene conical bottom, graduated, sterial, seal screw cap, falcon tube |
| Cytofix/Cytoperm Plus | BD Bio Sciences | 555028 | Fixation/permeabilization kit with BD golgiPlug, use for flow cytometer cell staining |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 1009832500 | Absolute for analysis EMSURE ACS,ISO, Reag. Ph Eur |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco, Thermo Fisher | 10500064 | Qualified, heat inactivated |
| Ficoll Plaque PLUS | GE Health care Life Sciences, USA | 341691 | Lymphocyte-isolation medium |
| FlowClean Cleaning Agent | Beckman Coulter, Life Sciences | A64669 | 500 mL |
| FlowJo | FlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, USA | - | Flow cytometer Histogram software |
| FlowTubes/ FACS (Fluorescence-activated single-cell sorting) Tube | Falcon Corning | 352235 | 5 mL, sterial, round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap, use in flow cytometry analysis |
| Fluoresceinisothiocynat-Dextran | Sigma Aldrich, Germany | 60842-46-8 | FITC-dextran MW |
| Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter | - | Flow cytometer machine |
| Hard-Shell 96-Well PCR Plates | Bio-Rad | HSP9601 | 96 well, low profile, thin wall, skirted, white/clear |
| Human CD14 MicroBeads | Miltenyi Bioteck, Germany | 130-050-201 | 2 mL microbeads conjugated to monoclonal anti-human CD14 antibody isotype IgG2a, used for selection of bovine monocytes from PBMCs |
| Kaluza | Beckman Coulter, Germany | - | Flow cytometer multicolor data analysis software |
| MACS Column | Miltenyi Bioteck, Germany | 130-042-401 | Magnetic activated cell sorting or immune magentic cell separation colum for separation of various CD14 cell population based on cell surface antigens |
| MHC Class II DQ DR Polymorphic Antibody | Bio-Rad | MCA2228F | Mouse anti-sheep MHC Class II DQ DR Polymorphic:FITC, clone 49.1, isotype IgG2a, cross reactive with bovine |
| Microcentrifuge Tube | Sigma Aldrich | HS4325 | 1.5 mL, conical bottom, graduated, sterial tube |
| Microsoft Power Point | Microsoft | - | The graphical illustrations of experimental design |
| Mouse IgG1 Negative Control:FITC for CD14, CD40 Antibody | Bio-Rad | MCA928F | Isotype control CD14 and CD40 monoclonal antibody |
| Mouse IgG1 Negative Control:PE for CD86 Antibody | Bio-Rad | MCA928PE | Isotype control CD86 monoclonal antibody |
| Mouse IgG1 Negative Control:RPE for CD25 Antibody | Bio-Rad | MCA928PE | Isotype control CD25 monoclonal antibody |
| Mouse IgG2a Negative Control:FITC for MHC Class II Antibody | Bio-Rad | MCA929F | Isotype control for MHC class II monoclonal antibody |
| Nobivac Rabies | MSD Animal Health, UK | - | 1 µL/mL of cell cultured inactivated vaccine containing > 2 I.U./mL Rabies virus strain |
| Optical seals | Bi0-Rad | TCS0803 | 0.2 mL flat PCR tube 8-cap strips, optical, ultraclear, compatible for qPCR machine |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco, Thermo Fisher | 15140122 | 100 mL |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco, Thermo Fisher | 10010023 | pH 7.4, 1x concentration |
| Prism - GraphPad 5 Software | Dotmatics | - | Statistical software |
| Purified Anti-human Ki-67 antibody | Biolegend, USA | 350501 | Monoclonal antibody, cross reactive with cow, clone ki-67 |
| Purified Mouse IgG1 k Isotype Ctrl Antibody | Biolegend | 400101 | Isotype control for Ki-67 monoclonal antibody |
| READIDROP Propidium Iodide | BD Bio Sciences | 1351101 | Live/dead cell marker used for flow cytometry, amine reactive dye |
| Recombinant Human IL-2 Protein | R&D System, USA | 202-IL-010/CF | Interleukin-2, 20 ng/ml |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | Kit use for extraction of total RNA; RLT buffer = lysis buffer; RW1 buffer = stringent guanidine-containing washing buffer; RDD buffer = DNase buffer; RPE buffer = mild wash buffer; RNaseOUT = RNase inhibitor. |
| RPMI 1640 Medium | Sigma Aldrich | R8758 | Cell culture media with L-glutamine and sodium bicarbonate |
| SMART-servier medical art | Les Laboratories Servier | - | Licensed under a creative commons attribution 3.0 unported license |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5270 | 2x qPCR mix conatins dNTPs, Ss07d fusion polymerase, MgCl2, SYBR Green I supermix = supermix, ROX normalization dyes. |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen, Thermo Fisher | 18080051 | Kit for cDNA synthsis |
| Tissue Culture Test plate 24 | TPP, Switzerland | 92024 | 24 well plate, sterilized by radiation , growth enhanced treated, volume 3.18 mL |
| Trypan Blue Solution | Gibco, Thermo Fisher | 15250061 | 0.4%, 100 mL, dye to assess cell viability |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Invitrogen, Thermo Fisher | 10977023 | 0.1 µm membrane filtered distilled water |
| VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes | Thermo Fisher Scientific | 15206067 | VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes have a green top and contain spray-dried lithium, sodium or ammonium heparin on the inner walls and are usedin clinical chemistry, immunology and serology. The anticoagulant heparin activates antithrombin, which blocks the clotting cascade and thus produces a whole blood/plasma sample. |
| Water | Sigma Aldrich | W3500-1L | Sterile-filtered, bioReagent suitable for cell culture |
References
- Roth, J. A., Sandbulte, M. R. The role of veterinary vaccines in livestock production, animal health, and public health. In Veterinary Vaccines: Principles and Applications. Metwally, S., El Idrissi, A., Viljoen, G. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 1-10 (2021).
- Roberts, N. J., Douglas, R. G., Simons, R. M., Diamond, M. E. Virus-induced interferon production by human macrophages. The Journal of Immunology. 123 (1), 365-369 (1979).
- Kleiveland, C. R. Peripheral blood mononuclear cells. The Impact of Food Bioactives on Health: In Vitro and Ex Vivo Models. Verhoeckx, K., Cotter, P., López-Expósito, I., Kleiveland, C., Lea, T., Mackie, A., Requena, T., Swiatecka, D., Wichers, H. , Springer. Cham, Switzerland. 161-167 (2015).
- Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 762-774 (2011).
- Domínguez, P. M., Ardavín, C. Differentiation and function of mouse monocyte-derived dendritic cells in steady state and inflammation. Immunological Reviews. 234 (1), 90-104 (2010).
- Steinman, R. M. Linking innate to adaptive immunity through dendritic cells. Novartis Foundation Symposium. 279, 101-109 (2006).
- Vandebriel, R. J., Hoefnagel, M. H. N. Dendritic cell-based in vitro assays for vaccine immunogenicity. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 8 (9), 1323-1325 (2012).
- Hopewell, E. L., Cox, C. Manufacturing dendritic cells for immunotherapy: Monocyte enrichment. Molecular Therapy. Methods and Clinical Development. 16, 155-160 (2020).
- Morse, M. A., Zhou, L. -J., Tedder, T. F., Lyerly, H. K., Smith, C. Generation of dendritic cells in vitro from peripheral blood mononuclear cells with granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor, interleukin-4, and tumor necrosis factor-alpha for use in cancer immunotherapy. Annals of Surgery. 226 (1), 6-16 (1997).
- Robinson, L., et al. Foot-and-mouth disease virus exhibits an altered tropism in the presence of specific immunoglobulins, enabling productive infection and killing of dendritic cells. Journal of Virology. 85 (5), 2212-2223 (2011).
- Kangethe, R. T., Pichler, R., Chuma, F. N. J., Cattoli, G., Wijewardana, V. Bovine monocyte derived dendritic cell based assay for measuring vaccine immunogenicity in vitro. Veterinary Immunology and Immunopathology. 197, 39-48 (2018).
- Harwood, L. J., Gerber, H., Sobrino, F., Summerfield, A., McCullough, K. C. Dendritic cell internalization of foot-and-mouth disease virus: Influence of heparan sulfate binding on virus uptake and induction of the immune response. Journal of Virology. 82 (13), 6379-6394 (2008).
- Hussen, J., et al. Phenotypic and functional heterogeneity of bovine blood monocytes. PLoS One. 8 (8), 71502 (2013).
- Shi, Y., et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and T-cell responses: What we do and don't know. Cell Research. 16 (2), 126-133 (2006).
- Zhou, L. -J., Tedder, T. F. CD14+ blood monocytes can differentiate into functionally mature CD83+ dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (6), 2588-2592 (1996).
- Bautista, E. M., Nfon, C., Ferman, G. S., Golde, W. T. IL-13 replaces IL-4 in development of monocyte derived dendritic cells (MoDC) of swine. Veterinary Immunology and Immunopathology. 115 (1-2), 56-67 (2007).
- León, B., Ardavín, C. Monocyte-derived dendritic cells in innate and adaptive immunity. Immunology and Cell Biology. 86 (4), 320-324 (2008).
- Berger, A. Th1 and Th2 responses: What are they. British Medical Journal. 321 (7258), 424 (2000).
- Romagnani, S.
- Kaiko, G. E., Horvat, J. C., Beagley, K. W., Hansbro, P. M. Immunological decision-making: How does the immune system decide to mount a helper T-cell response. Immunology. 123 (3), 326-338 (2008).
- Duckworth, B. C., Groom, J. R. Conversations that count: Cellular interactions that drive T cell fate. Immunological Reviews. 300 (1), 203-219 (2021).
- León, B., López-Bravo, M., Ardavín, C. Monocyte-derived dendritic cells formed at the infection site control the induction of protective T helper 1 responses against Leishmania. Immunity. 26 (4), 519-531 (2007).
- Singh, D., et al. Differential responses of chicken monocyte-derived dendritic cells infected with Salmonella gallinarum and Salmonella typhimurium. Scientific Reports. 11, 17214 (2021).
- Pujol, M., et al. Variability in the response of canine and human dendritic cells stimulated with Brucella canis. Veterinary Research. 48, 72 (2017).
- Pujol, M., Borie, C., Montoya, M., Ferreira, A., Vernal, R. Brucella canis induces canine CD4+ T cells multi-cytokine Th1/Th17 production via dendritic cell activation. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 62, 68-75 (2019).
- Lašťovička, J., Rataj, M., Bartůňková, J. Assessment of lymphocyte proliferation for diagnostic purpose: Comparison of CFSE staining, Ki-67 expression and 3H-thymidine incorporation. Human Immunology. 77 (12), 1215-1222 (2016).
- Reddy, M., Eirikis, E., Davis, C., Davis, H. M., Prabhakar, U. Comparative analysis of lymphocyte activation marker expression and cytokine secretion profile in stimulated human peripheral blood mononuclear cell cultures: An in vitro model to monitor cellular immune function. Journal of Immunological Methods. 293 (1-2), 127-142 (2004).
- Shatrova, A. N., et al. Time-dependent regulation of IL-2R α-chain (CD25) expression by TCR signal strength and IL-2-induced STAT5 signaling in activated human blood T lymphocytes. PLoS One. 11 (12), 0167215 (2016).
- Shedlock, D. J., et al. Ki-67 staining for determination of rhesus macaque T cell proliferative responses ex vivo. Cytometry, Part A. 77 (3), 275-284 (2010).
- Yen, H. -R., et al. Tc17 CD8 T cells: Functional plasticity and subset diversity. Journal of Immunology. 183 (11), 7161-7168 (2009).
- Kawamura, I., et al. IFN-gamma-producing ability as a possible marker for the protective T cells against Mycobacterium bovis BCG in mice. Journal of Immunology. 148 (9), 2887-2893 (1992).
- Federal Ministry Republic of Austria. Agriculture, Forestry, Regions and Water Management. The Federal Act on Animal Welfare (Tierschutzgesetz - TSchG). Federal Law Gazette I 2004/118. , Available from: https://info.bml.gv.at/en/topics/agriculture/agriculture-in-austria/animal-production-in-austria/animal-welfare-act.html (2005).
- Corripio-Miyar, Y., et al. Phenotypic and functional analysis of monocyte populations in cattle peripheral blood identifies a subset with high endocytic and allogeneic T-cell stimulatory capacity. Veterinary Research. 46, 112 (2015).
- Wijewardana, V., et al. Generation of canine dendritic cells from peripheral blood monocytes without using purified cytokines. Veterinary Immunology and Immunopathology. 114 (1-2), 37-48 (2006).
- Gallios Flow Cytometer with Kaluza for Gallios Software. Instructions for Use. Beckman Coulter. , Available from: http://www.cytometrie-imagerie-saint-antoine.org/media/3924/Kaluza.Gallos.pdf (2014).
- Švajger, U., Jeras, M. Optimal dendritic cell differentiation in rpmi media requires the absence of HEPES buffer. Immunological Investigations. 40 (4), 413-426 (2011).
- Chometon, T. Q., et al. A protocol for rapid monocyte isolation and generation of singular human monocyte-derived dendritic cells. PLoS One. 15 (4), 0231132 (2020).
- Blanco, F. C., et al. Semi-stable production of bovine IL-4 and GM-CSF in the mammalian episomal expression system. Journal of Veterinary Research. 65 (3), 315-321 (2021).
- Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. Journal of Experimental Medicine. 179 (4), 1109-1118 (1994).
- Cho, K. -J., Roche, P. A. Regulation of MHC class II-peptide complex expression by ubiquitination. Frontiers in Immunology. 4, 369 (2013).
- Sansom, D. M., Manzotti, C. N., Zheng, Y. What's the difference between CD80 and CD86. Trends in Immunology. 24 (6), 313-318 (2003).
- Han Lee, G., et al. The role of CD40 expression in dendritic cells in cancer biology; a systematic review. Current Cancer Drug Targets. 14 (7), 610-620 (2014).
- Tanaka, H., Demeure, C. E., Rubio, M., Delespesse, G., Sarfati, M. Human monocyte-derived dendritic cells induce naive T cell differentiation into T helper cell type 2 (Th2) or Th1/Th2 effectors: Role of stimulator/responder ratio. Journal of Experimental Medicine. 192 (3), 405-412 (2000).
- Klechevsky, E., et al. Cross-priming CD8+ T cells by targeting antigens to human dendritic cells through DCIR. Blood. 116 (10), 1685-1697 (2010).
- Schlienger, K., Craighead, N., Lee, K. P., Levine, B. L., June, C. H. Efficient priming of protein antigen-specific human CD4+ T cells by monocyte-derived dendritic cells. Blood. 96 (10), 3490-3498 (2000).
- Soares, A., et al. Novel application of Ki67 to quantify antigen-specific in vitro lymphoproliferation. Journal of Immunological Methods. 362 (1-2), 43-50 (2010).
- Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations. Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2009).
- Bachmann, M. F., Oxenius, A. Interleukin 2: From immunostimulation to immunoregulation and back again. EMBO Reports. 8 (12), 1142-1148 (2007).
- Koup, R. A., Douek, D. C. Vaccine design for CD8 T lymphocyte responses. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 1 (1), 007252 (2011).
- Sassu, E. L., et al. Development and evaluation of a real-time PCR panel for the detection of 20 immune markers in cattle and sheep. Veterinary Immunology and Immunopathology. 227, 110092 (2020).
