Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Bestämning av vaccinimmunogenicitet med hjälp av dendritiska celler härledda från nötkreatur

Published: May 19, 2023 doi: 10.3791/64874
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1, 1, 1
1Animal Production and Health Section, Joint Food and Agriculture Organization (FAO)/International Atomic Energy Agency (IAEA) Centre of Nuclear Techniques in Food and Agriculture, International Atomic Energy Agency, 2Teaching and Research Farm Kremesberg, Clinical Unit for Herd Health Management in Ruminants, Department for Farm Animals and Veterinary Public Health, University of Veterinary Medicine, Vienna

Summary

Metoden beskriver genereringen av dendritiska celler som härrör från bovina monocyter (MoDC) och deras tillämpning för in vitro-utvärdering av antigena kandidater under utvecklingen av potentiella veterinärvacciner hos nötkreatur.

Abstract

Dendritiska celler (DC) är de mest potenta antigenpresenterande cellerna (APC) i immunsystemet. De patrullerar organismen och letar efter patogener och spelar en unik roll inom immunsystemet genom att länka de medfödda och adaptiva immunsvaren. Dessa celler kan fagocytera och sedan presentera fångade antigener till effektorimmunceller, vilket utlöser ett brett spektrum av immunsvar. Denna artikel demonstrerar en standardiserad metod för in vitro-generering av bovint monocyt-härledda dendritiska celler (MoDCs) isolerade från perifera mononukleära celler från nötkreatur (PBMC) och deras tillämpning vid utvärdering av vaccinimmunogenicitet.

Magnetbaserad cellsortering användes för att isolera CD14 + -monocyter från PBMC, och tillskott av komplett odlingsmedium med interleukin (IL) -4 och granulocyt-makrofagkolonistimulerande faktor (GM-CSF) användes för att inducera differentieringen av CD14 + -monocyter till naiva MoDC. Genereringen av omogna MoDCs bekräftades genom detektering av uttrycket av stora histokompatibilitetskomplex II (MHC II), CD86 och CD40 cellytmarkörer. Ett kommersiellt tillgängligt rabiesvaccin användes för att pulsa de omogna MoDC, som därefter samodlades med naiva lymfocyter.

Flödescytometrianalysen av antigenpulsade MoDCs och lymfocytsamodling avslöjade stimulering av T-lymfocytproliferation genom uttryck av Ki-67-, CD25-, CD4- och CD8-markörer. Analysen av mRNA-uttrycket av IFN-γ och Ki-67, med kvantitativ PCR, visade att MoDCs kunde inducera antigenspecifik priming av lymfocyter i detta in vitro-samodlingssystem . Dessutom visade IFN-γ-sekretion bedömd med ELISA en signifikant högre titer (**p < 0,01) i den rabiesvaccinpulsade MoDC-lymfocytsamkulturen än i den icke-antigenpulsade MoDC-lymfocytsamkulturen. Dessa resultat visar validiteten av denna in vitro MoDC-analys för att mäta vaccinimmunogenicitet, vilket innebär att denna analys kan användas för att identifiera potentiella vaccinkandidater för nötkreatur innan man fortsätter med in vivo-studier , liksom i vaccinimmunogenicitetsbedömningar av kommersiella vacciner.

Introduction

Veterinärvaccinering är en viktig aspekt av djurhållning och hälsa, eftersom den bidrar till att förbättra livsmedelstryggheten och djurskyddet genom att ge skydd mot sjukdomar som påverkar djurhållningssektorn globalt1. En effektiv in vitro-metod för att bedöma immunogeniciteten hos möjliga vaccinkandidater skulle bidra till att påskynda processen för utveckling och produktion av vaccin. Det är därför nödvändigt att utöka området immunanalyser med innovativa metoder baserade på in vitro-studier , eftersom detta skulle bidra till att avslöja komplexiteten i immunprocesserna relaterade till immunisering och patogeninfektion. För närvarande används in vivo-immuniserings - och provokationsstudier på djur, som kräver periodisk provtagning (t.ex. blod och mjälte), för att mäta immunogeniciteten hos kandidatvacciner och adjuvanser. Dessa analyser är dyra, tidskrävande och har etiska konsekvenser, eftersom i de flesta fall utförs avlivning av djur i slutet av försöken.

Som ett alternativ till in vivo-analyser har mononukleära celler i perifert blod (PBMC) använts för att utvärdera vaccininducerade immunsvar in vitro2. PBMC är en heterogen population av celler som består av 70% -90% lymfocyter, 10% -20% monocyter och ett begränsat antal dendritiska celler (DCs, 1% -2%)3. PBMCs har antigenpresenterande celler (APC) såsom B-celler, monocyter och DC, som ständigt patrullerar organismen som söker efter tecken på infektion eller vävnadsskada. Lokalt utsöndrade kemokiner underlättar rekrytering och aktivering av APC till dessa platser genom att binda till cellytereceptorer. När det gäller monocyter styr kemokiner sitt öde att antingen differentiera till DC eller makrofager4. Så snart DCs stöter på och fångar en patogen migrerar de till sekundära lymfoida organ, där de kan presentera de bearbetade patogenpeptidantigenerna med användning av MHC (Major Histocompatibility Complex) klass I eller klass II ytproteiner till CD8 + T-celler respektive CD4 + T-celler, vilket utlöser ett immunsvar 5,6.

Den nyckelroll som DCs spelar för att orkestrera ett skyddande immunsvar mot olika patogener gör dem till ett intressant forskningsmål för att förstå intracellulära immunmekanismer, särskilt vid utformning av vacciner och adjuvans mot smittämnen7. Eftersom andelen DCs som kan erhållas från PBMCs är ganska liten (1% -2%), har monocyter istället använts för att generera DCs in vitro 8. Dessa monocyt-härledda DCs (MoDCs) utvecklades initialt som en möjlig behandlingsstrategi vid cancerimmunterapi9. På senare tid har MoDC använts för vaccinforskning 10,11,12, och klassiska monocyter är den dominerande subtypen (89%) för MoDC-produktion 13. Produktionen av MoDCs in vitro har tidigare uppnåtts genom tillägg av granulocyt-makrofagkolonistimulerande faktor (GM-CSF) som ges i kombination med andra cytokiner såsom interleukin-4 (IL-4), tumörnekrosfaktor α (TNF-α) eller IL-1314,15,16.

Framgången för en in vitro MoDC-analys beror på förmågan hos antigenstimulerade mogna MoDCs att modulera omfattningen och typen av immunsvaret specifikt för den typ av antigen som detekteras17. Den typ av patogen som känns igen och presenteras av MoDCs bestämmer differentieringen av CD4 + T-hjälparceller (Th) i antingen Th1-, Th2- eller Th17-effektorceller och kännetecknas av en patogenspecifik sekretorisk cytokinprofil. Ett Th1-svar framkallas mot intracellulära patogener och resulterar i utsöndring av interferon-gamma (IFN-γ) och tumörnekrosfaktor beta (TNF-β), vilket modulerar fagocytberoende skydd. Ett Th2-svar utlöses mot parasitiska organismer och kännetecknas av IL-4, IL-5, IL-10 och IL-13-utsöndring, vilket initierar fagocytoberoende humoralt skydd. Th17 erbjuder neutrofilberoende skydd mot extracellulära bakterie- och svampinfektioner medierade av utsöndringen av IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 och TNF-α 18,19,20,21. Baserat på tidigare studier har det noterats att inte alla patogener faller inom den förväntade cytokinprofilen. Till exempel stimulerar dermala MoDCs, som svar på Leishmania parasitisk infektion, IFN-γ-utsöndring från CD4 + T-celler och CD8 + T-celler, vilket inducerar ett skyddande proinflammatoriskt Th1-svar22.

Det har också visats att i kyckling MoDCs primad med Salmonellalipopolysackarid (LPS), kan inducera ett variabelt svar mot Salmonella typhimurium genom att aktivera både Th1- och Th2-svar, medan Salmonella gallinarum inducerar ett Th2-svar ensamt, vilket kan förklara den högre resistensen hos den senare mot MoDC-clearance23. Aktivering av MoDCs mot Brucella canis (B. canis) har också rapporterats i både hund och humana MoDCs, vilket innebär att detta kan representera en zoonotisk infektionsmekanism24. Humana MoDCs grundade med B. canis inducerar ett starkt Th1-svar som ger resistens mot allvarlig infektion, medan hundens MoDCs inducerar ett dominerande Th17-svar med ett reducerat Th1-svar, vilket leder till etablering av kronisk infektion25. Bovint MoDC uppvisar en ökad affinitet för mul- och klövsjukevirus (FMDV) konjugerat med immunglobulin G (IgG) jämfört med icke-konjugerat FMDV ensamt, eftersom MoDC bildar ett virus-antikroppskomplex som svar på de tidigare10. Sammantaget visar dessa studier hur MoDCs har använts för att analysera komplexiteten hos immunsvar under patogeninfektion. Det adaptiva immunsvaret kan utvärderas genom kvantifiering av specifika markörer associerade med lymfocytproliferation. Ki-67, ett intracellulärt protein som endast detekteras i delande celler, betraktas som en tillförlitlig markör för proliferationsstudier26, och på samma sätt motsvarar CD25 uttryckt på ytan av T-celler under den sena aktiveringsfasen lymfocytproliferation27,28.

Denna studie visar en standardiserad metod för in vitro-generering av MoDCs hos nötkreatur följt av deras tillämpning i en in vitro-immunanalys som används för att testa immunogeniciteten hos vacciner. Ett kommersiellt tillgängligt rabiesvaccin (RV) användes för att validera effekten av denna analys. T-lymfocytaktivering och proliferation mättes med flödescytometri, kvantitativ polymeraskedjereaktion i realtid (qPCR) och enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA) genom analys av väletablerade cellaktiveringsmarkörer såsom Ki-67 och CD25 och utsöndringen av IFN-γ 28,29,30,31. Inga djur- eller humanförsök utförs under MoDC-analysen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Blodinsamling utförs av en certifierad veterinärtjänst i enlighet med de etiska riktlinjerna från den österrikiska myndigheten för hälsa och livsmedelssäkerhet (AGES) och i enlighet med de godkända djurskyddsnormerna32. Studien fick etiskt godkännande från det österrikiska jordbruksministeriet. Den experimentella designen för MoDCs generering och dess efterföljande tillämpning illustreras i figur 1.

1. Produktion av naiva MoDC

OBS: Helblodprover erhölls från en enda patogenfri kalv genom halsvenpunktion med hepariniserade vakutainer (åtta 9 ml blodrör användes för denna studie). Transportera blodet i en islåda. Förvara proverna vid 2–4 °C för senare användning eller bearbeta dem omedelbart. Håll blodet roterande för att undvika blodkoagulering. Sterilisera vacutainers med 70% etanol. Alla följande experiment utfördes med ett biologiskt prov och sex tekniska replikat.

  1. Densitetsgradientcentrifugering för att isolera PBMC från det hepariniserade blodet
    1. Blanda blodet väl genom att invertera det 10x.
    2. Använd en 10 ml pipett, överför 20 ml hepariniserat blod till ett sterilt 50 ml rör och späd det med 10 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
    3. Pipettera 15 ml lymfocytisoleringsmedium till ett sterilt 50 ml rör.
      OBS: Låt det lymfocytisolerande mediet uppnå rumstemperatur före pipettering.
    4. Luta 50 ml röret som innehåller lymfocytisoleringsmediet till 45° läge. Rikta spetsen på en 25 ml pipett vinkelrätt och skikta försiktigt 30 ml blod-PBS ovanpå lymfocytisoleringsmediet utan att blanda de två. Mycket långsamt, sätt tillbaka 50 ml röret till vertikalt läge.
    5. Centrifugera vid 800 × g i 35 minuter vid 20 °C med maximal acceleration och utan bromsning (retardationsfunktionen avstängd).
    6. Använd en Pasteur-pipett för att samla PBMC-skiktet (det tunna vita lagret direkt efter det första plasmaskiktet) och överför det till ett nytt 50 ml rör.
      OBS: Densitetsgradientcentrifugering separerar helblod i olika lager. Som ett resultat sätter erytrocyterna sig i botten som en pellet, de mononukleära cellerna (PBMC) sätter sig vid gränssnittsskiktet och plasman bildar toppskiktet. Granulocyter finns mellan pelleten och PBMC-skiktet.
    7. Tvätta de skördade PBMC 2x genom att tillsätta PBS upp till en volym på 40 ml och blanda noggrant genom pipettering upp och ner. Centrifugera därefter vid 500 × g vid 4 °C i 7 minuter med maximal acceleration och maximal retardation.
    8. Kassera supernatanten genom dekantering, suspendera pelleten igen i 15 ml 1x ammoniumklorid-kalium (ACK) buffert och inkubera vid rumstemperatur i 10-15 minuter.
      OBS: Inkubera inte mer än 15 minuter. Kommersiellt tillgänglig ACK-buffert används för att säkerställa lysering av de kvarvarande röda blodkropparna (RBC) som finns i PBMC-fraktionen.
    9. Tillsätt PBS upp till en volym på 40 ml och centrifugera sedan vid 500 × g och 4 °C i 7 minuter med maximal acceleration och retardation.
    10. Kassera supernatanten genom dekantering och upprepa steg 1.1.9.
    11. Kassera supernatanten och suspendera pelleten igen i 10 ml komplett odlingsmedium (vid rumstemperatur).
      OBS: Det kompletta odlingsmediet består av RPMI 1640 cellodlingsmedium kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin-streptomycin.
  2. Magnetisk separation av CD14+/− -cellerna från PBMC-populationen med hjälp av CD14-konjugerade magnetiska pärlor
    1. Räkna cellerna med en ren hemocytometercellräknare med 10 μL cellsuspension blandad med 10 μL trypanblå (0,4%) lösning.
      OBS: Trypan blått färgämne är en giftig kemikalie och potentiellt cancerframkallande. Det ska hanteras med personlig skyddsutrustning (PPE) för att undvika kontakt, och avfall ska kasseras i en lufttät specialiserad giftig avfallsbehållare. Döda celler kommer att visas blå, medan levande celler kommer att visas klart under mikroskopet.
    2. Centrifugera i 7 min vid 500 × g.
    3. Kassera supernatanten med pipett och suspendera pelleten på nytt i fluorescensaktiverad cellsorteringsbuffert (FACS) med en volym på 40 μl för varje 1 × 107 celler. Blanda noggrant med en pipett.
      OBS: FACS-buffert består av 2% FBS och 2 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA) upplöst i PBS.
    4. Tillsätt 5 μL CD14 mikropärlbuffert per 1 × 107 celler och blanda noggrant med en pipett.
    5. Inkubera i 30 minuter vid 4–8 °C för positivt urval av CD14+ -monocyterhos nötkreatur 33. Vortex var 15: e minut under inkubationsperioden.
    6. Valfritt steg (för flödescytometrianalys): Tillsätt 10 μL CD14-FITC-färgningsantikropp (fluoresceinisotiocyanat) med efterföljande inkubation i 15 minuter vid 4-8 °C. Se flödescytometrianalysen i steg 5 för mer information.
    7. Tillsätt 1 ml FACS-buffert och centrifugera i 7 minuter vid 500 × g.
    8. Kassera supernatanten och suspendera pelleten igen i 500 μL FACS-buffert per 1 × 108 celler.
    9. Sätt in den immunmagnetiska cellseparationskolonnen i separatorn (magnetisk kolonnhållare) och placera ett 15 ml uppsamlingsrör under kolonnutloppet för uppsamling av genomströmningen.
    10. Tvätta kolonnen med 1 ml avgasad FACS-buffert. Efter sköljning, byt ut det använda 15 ml röret med ett nytt.
    11. Låt cellsuspensionen (från steg 1.2.8) passera genom kolonnen genom att pipettera 1 ×10 8 celler i 500 μl buffert åt gången.
      OBS: Var uppmärksam på att inte generera luftbubblor medan du blandar cellerna innan du släpper dem genom kolonnen.
    12. Skölj kolonnen 3x med 3 ml avgasad FACS-buffert varje gång.
    13. Samla in genomflödet och märk denna första eluerade fraktion som CD14− cellfraktionen (PBMC minus CD14+ -monocyter); Detta kallas också den naiva lymfocytfraktionen.
      OBS: CD14− -cellerna hålls i komplett odlingsmedium tills antigenpulsade MoDC produceras.
    14. Ta bort kolumnen från avgränsaren.
    15. Placera ett nytt sterilt 15 ml rör under kolonnen för uppsamling av avloppsvattnet.
    16. Pipettera in 5 ml FACS-buffert i kolonnen och tryck omedelbart igenom den med en kolv.
    17. Samla in genomströmningen och märk denna andra eluerade fraktion som CD14 + cellfraktion; Detta kallas också den naiva monocytfraktionen.
    18. Lägg till komplett odlingsmedium till de skördade CD14 + -monocyterna för att uppnå 1 × 106 celler / ml.
      OBS: Räkna de levande cellerna i den eluerade CD14 + cellfraktionen för att uppskatta volymen av komplett odlingsmedium som krävs för att uppnå önskat cellantal.
    19. Ta en steril platta med 24 brunnar och tillsätt 1 ml cellsuspension (1 × 106 celler/ml) till varje brunn.
  3. Differentiering av CD14 + naiva monocyter till naiva MoDCs genom tillsats av 3% w / v cytokincocktail (GM-CSF + IL-4) med totalt 5 dagars inkubation
    1. Komplettera varje brunn som innehåller CD14 + -monocyter med 40 μL (3% w / v) av cytokincocktailen som tillhandahålls i satsen.
    2. Inkubera plattan i en fuktad inkubator med 5 %CO2 och vid 37 °C i 48 timmar.
    3. På dag 2, överför hälften av innehållet i varje brunn (500 μl) med pipett till enskilda 1,5 ml rör och centrifugera vid 500 × g vid 4 °C i 7 minuter.
    4. Kassera supernatanten och suspendera pelleten igen i 500 μl färskt komplett odlingsmedium.
    5. Överför 500 μl av denna cellsuspension från steg 1.3.4 tillbaka till varje avsedd brunn så att den slutliga volymen är 1 ml.
    6. Berika varje brunn med 20 μL cytokincocktail.
    7. Inkubera kulturen i 72 timmar i en fuktad inkubator med 5 %CO2 och vid 37 °C.
    8. Efter inkubationen på dag 5, ta bort plattan från inkubatorn.
      OBS: Varje brunn kommer att innehålla 1 ml av en cellsuspension av naiva MoDCs. Antalet MoDCs kommer att vara en procentandel (~ 20%) av de ursprungliga monocyterna pläterade (1 × 106 / ml).

2. MoDC endocytisk aktivitetsanalys

OBS: Antigenupptagsanalysen eller endocytisk aktivitetsanalys mäter förmågan hos naiva MoDC att internalisera främmande material. Utför analysen med hjälp av naiva MoDCs odlade med 3% w/v cytokincocktail och med 5 dagars inkubation, som tidigare beskrivits34.

  1. Skörda den naiva MoDC-cellsuspensionen från 24-brunnsplattan och överför den till ett 15 ml rör; samla också eventuella kvarvarande celler genom att skölja brunnarna med PBS.
  2. Centrifugera i 500 × g i 7 min. Kassera supernatanten och suspendera pelleten igen i 1 ml odlingsmedium kompletterat med 1% FBS.
  3. Räkna de levande MoDC-cellerna för att uppskatta volymen medium som krävs för att uppnå önskat cellantal (2 × 105 celler / ml).
  4. Odla de naiva MoDCs i 100 μL komplett odlingsmedium i en 24-brunnsplatta med en slutlig cellkoncentration på 2 × 105 celler/ml.
  5. Komplettera varje brunn med 1 mg/ml FITC-konjugerat dextran (fluorescerande sond som används som endocytosspårare).
    FITC-dextran fungerar som en fluorescerande sond och används som spårämne för endocytos.
  6. Täck plattan och inkubera i mörker vid 5 % CO2 och 37 °C i 60 minuter.
    OBS: För bakgrundskontrollen, inkubera de ytterligare MoDC-cellerna (2 × 105 celler/ml) med 1 mg/ml FITC-dextran på is, eftersom denna typ av inkubation förhindrar att spårämnesmolekylen (FITC-dextran) kommer in i cellerna.
  7. Efter inkubation, överför omedelbart 24-brunnsplattan på is för att stoppa endocytosen av FITC-dextran.
  8. Tvätta cellerna med iskall FACS-buffert.
  9. Skörda, centrifugera och återsuspendera pelleten i 500 μL FACS-buffert.
  10. Analysera fluorescensintensiteten hos FITC-dextran i cellerna med hjälp av flödescytometri. Se flödescytometrianalysen i steg 5.2 för mer information.

3. Generering av antigenpulsade MoDC

OBS: Ett kommersiellt tillgängligt och kliniskt godkänt vaccin mot rabiesvirus (RV) kan inducera differentiering av naiva MoDCs till mogna antigenpresenterande MoDCs. Använd 0,1 % (~1 μL) av en enda RV-vaccinationsdos för att generera antigenpulsade MoDCs. Dessutom är det att föredra att producera RV-pulsade MoDCs i samma odlingsplatta som används (i steg 1.3.8) för att generera naiva MoDCseftersom överföring av de naiva MoDCs till en ny 24-brunnsplatta kommer att påverka dem negativt.

  1. Från steg 1.3.8) Tillsätt 1 μl/ml RV-suspension till 1 ml naiv MoDC-kultur i plattan med 24 brunnar och inkubera i 48 timmar vid 5 % CO2 och 37 °C.
    Naiva MoDCs odlade utan RV-stimulering används som bakgrundskontroll (och som icke-specifik stimulering för samodling med lymfocyter i nästa steg).
  2. Efter inkubation, på dag 7, håll 24-brunnsplattan med antigenpulsade MoDCs på is i 10 minuter.
  3. Tillsätt 1 ml iskall PBS per brunn. Blanda var och en väl genom pipettering och överför suspensionen till ett 15 ml rör.
  4. Tvätta brunnarna med 2 ml iskall PBS för att samla kvarvarande celler kvar i varje brunn.
  5. Överför innehållet till respektive rör och centrifugera cellsuspensionen vid 500 × g i 7 minuter.
  6. Kassera supernatanten, suspendera cellpelleten (antigenpulsade MoDCs) i hela odlingsmediet och justera volymen till en slutlig cellkoncentration på 1 × 105 celler/ml.
    OBS: Räkna de levande cellerna för att uppskatta volymen medium som krävs för att uppnå önskat cellantal. Använd RV-pulsade MoDCs från dag 7 för MoDC-lymfocyt-samodlingssystemet.

4. Samodling av MoDC-lymfocyter

OBS: Samodlingssystemet för MoDC-lymfocyter in vitro bestämmer MoDCs förmåga att prima antigenspecifika lymfocyter. De olika behandlingsgrupperna av celler efter 16 dagars samodling inkluderar specifik, icke-specifik och kontroll. Den specifika gruppen definieras som lymfocyter samodlade med RV-pulsade MoDCs; Den icke-specifika gruppen definieras som lymfocyter som samodlats med icke-antigenpulsade MoDC. och kontrollgruppen definieras som lymfocyter odlade utan MoDC.

  1. Tillsätt komplett odlingsmedium till den eluerade naiva lymfocytfraktionen (CD14− celler) för att uppnå en cellkoncentration på 2 × 106 celler/ml.
    OBS: Räkna de levande cellerna i CD14− -cellkulturen som har bibehållits i komplett odlingsmedium i en 24-brunnsplatta sedan deras insamling för att uppskatta volymen medium som krävs för att uppnå önskat cellantal.
  2. På dag 7, ta en steril platta med 24 brunnar och frö brunnarna med 1 ml naiv lymfocytcellssuspension (2 × 106 celler/ml) plus 1 ml antigenpulsad eller icke-antigenpulsad MoDC-suspension (1 × 105 cell/ml).
    OBS: Den totala volymen i varje brunn kommer att vara 2 ml med ett förhållande av 1:20 MoDCs till lymfocyter per brunn.
  3. Inkubera plattan i 48 timmar vid 37 °C och 5 %CO2.
  4. Odlingsanrikning och restimulering med antigenpulsade MoDCs
    1. Efter inkubationen av den antigenpulserade MoDC-lymfocytsamkulturen, på dag 9, komplettera varje brunn med 20 ng / ml rekombinant IL-2 och fortsätt att inkubera i ytterligare 120 timmar (5 dagars inkubation).
    2. På dag 14, överför 1 ml av samkulturen till ett sterilt 1,5 ml rör och centrifugera vid 500 × g i 7 minuter.
    3. Kassera supernatanten och suspendera cellpelleten igen med 1 ml antigenpulsade eller icke-pulsade MoDCs (1 × 105 cell/ml). Blanda försiktigt genom pipettering och överför cellsuspensionerna tillbaka till sina utsedda brunnar.
      OBS: Vid detta steg är den totala volymen i varje brunn 2 ml.
    4. Fortsätt med inkubationen vid 5 % CO2 och 37 °C i 48 timmar. Efter inkubation på dag 16 är samkulturen klar för analys med flödescytometri, qPCR och ELISA.
      OBS: För varje 2 ml i varje brunn i MoDC-lymfocytsamkulturen färgas 1 ml resuspenderade celler för flödescytometri, 1 ml används för RNA-extraktion och supernatanterna från båda används för ELISA.

5. Flödescytometrisk analys

OBS: Färga cellerna med lämpliga markörer/mAb innan proverna körs på en flödescytometer. Se materialtabellen för detaljer om reagenserna (färgning av mAb och isotypkontroller), kit, instrument och programvara som används för flödescytometrianalysen.

  1. Färgningsprotokoll för flödescytometer
    OBS: Utför färgning av cellytan för PBMC och naiva lymfocyter och monocyter med anti-CD14 mAb (steg 1.2.6). För färgning av cellytan av naiva MoDCs, använd anti-CD86-specifik, anti-CD40-specifik och anti-MHC II-specifik mAb. För färgning av celler från dag 16 samkulturer, använd anti-CD4, anti-CD8, anti-CD25 mAbs; för intracellulär färgning, använd anti-Ki-67 mAb. Färga dessutom cellerna antingen med negativ isotypkontroll mAb eller utan mAb (FMO: fluorescerande minus en). Huvudskillnaden vid färgning för yt- och intracellulära markörer är att för cellytmarkörer måste cellerna färgas med specifik yt-mAb före levande / död (L / D) färgning eller andra processer. Intracellulär färgning utförs emellertid efter L / D-färgning och kräver ett fixerings- plus permeabiliseringssteg för att möjliggöra intracellulär penetration.
    1. Överför 1 ml cellsuspension till ett sterilt 1,5 ml rör med pipett och centrifugera i 10 minuter vid 500 × g.
      OBS: Efter centrifugering, vid bearbetning av cellerna från samkulturen med MoDC-lymfocyter, spara supernatanten för ELISA-analys.
    2. Återsuspendera pelleten i 1 ml PBS och överför den till ett 15 ml rör. Samla upp de kvarvarande cellerna med 1 ml PBS och kombinera detta med den återsuspenderade pelleten.
    3. Tillsätt 10 ml PBS till 15 ml röret som innehåller cellerna, blanda genom pipettering och centrifugera i 7 minuter vid 850 x g.
    4. Kassera supernatanten och upprepa steg 5.1.3.
    5. Kassera supernatanten och suspendera försiktigt cellpelleten med den kvarvarande suspensionen (ca 180 μl) kvar efter dekantering av supernatanten.
    6. Överför cellsuspensionen till en v-botten 96-brunnsplatta och täta brunnarna för att undvika spill.
    7. Centrifugera plattan vid 1 400 × g i 5 minuter. Efter centrifugering, vrid plattan över en avfallsbehållare för att tömma brunnarna på vätska och knacka plattan på absorberande papper för att säkerställa avlägsnande av överskottsvätska.
    8. Tillsätt 25 μl ytfärgningsmasterblandning per brunn och blanda försiktigt med pipett, följt av inkubation vid 4 °C i 30 minuter.
      OBS: För att förbereda ytfärgningsmasterblandning för en enda brunn, tillsätt 2,5 μL yta mAb till 20 μL FACS-buffert.
    9. Tillsätt 200 μL FACS-buffert per brunn och centrifugera vid 1 400 × g i 5 minuter. Efter centrifugering, töm brunnarna på vätska genom dekantering och knacka plattan på absorberande papper för att avlägsna överflödig vätska.
    10. Tillsätt 100 μL L/D-färgningslösning per brunn. Blanda noggrant med pipett, följt av inkubation vid 4 °C i 15 min i mörkret.
      Anmärkning: För en enda brunn, lös 0,25 μL L/D-färgämne i 100 μL FACS-buffert. L / D-färgämnet hjälper till att skilja mellan levande och döda celler.
    11. Tillsätt 100 μL FACS-buffert. Täck brunnarna med locket och centrifugera plattan i 1 400 × g i 5 minuter. Kassera supernatanten genom att dekantera och knacka plattan på absorberande papper.
    12. Upprepa steg 5.1.11.
    13. Tillsätt 50 μl fixeringslösning per brunn (medföljer satsen) och blanda med en pipett innan plattan inkuberas vid rumstemperatur i mörker i 10 minuter.
    14. Tillsätt 150 μL av den 1x permeabiliseringstvättbuffert (PW) som medföljer satsen och täck brunnarna med locket.
      OBS: För att förbereda 10 ml 1x PW-buffert, späd 1 ml 10x permbuffert i 10 ml dH2O.
    15. Centrifugera plattan vid 1 400 × g i 5 min vid 4 °C. Kassera supernatanten genom att dekantera och knacka plattan på absorberande papper.
    16. Tillsätt 200 μl 1x PW, följt av centrifugering vid 1 400 × g i 5 min vid 4 °C. Kassera supernatanten genom att dekantera och knacka plattan på absorberande papper.
    17. För intracellulär färgning, tillsätt 25 μL intracellulär färgning mastermix (anti-human Ki-67 mAb) per brunn. Blanda väl och inkubera plattan i 30 minuter vid 4 °C eller på is i mörker.
      OBS: För att förbereda intracellulär färgningsmasterblandning för en enda brunn, tillsätt 1 μL Ki-67 mAb till 24 μL 1x PW. Den intracellulära färgningsmarkören används endast vid bearbetning av celler från dag 16 samodling. Intracellulär färgning görs inte vid bearbetning av PBMC, naiva lymfocyter, monocyter och naiva MoDC.
    18. Efter inkubation, tillsätt 200 μL 1x PW till varje brunn. Blanda med en pipett och centrifugera i 1 400 × g i 5 minuter. Kassera supernatanten genom att dekantera och knacka plattan på absorberande papper.
    19. Tillsätt 200 μl FACS-buffert, följt av centrifugering vid 1 400 × g i 5 minuter. Kassera supernatanten genom att dekantera och knacka plattan på absorberande papper.
    20. Resuspendera cellpelleten i 200 μL FACS-buffert och överför innehållet i varje brunn till separata cytometerrör med sterilt flöde. Använd 300 μL FACS-buffert per brunn för att samla upp kvarvarande celler. Cellerna är nu redo för flödescytometrianalys.
  2. Kör provet på en flödescytometer
    OBS: Proverna kördes på en flödescytometer (med 488 nm, 638 nm och 405 nm lasrar) enligt tillverkarens manual35. Se handboken för detaljer, felsökning och anpassning av protokollet.
    1. Utför rutinmässiga rengöringsprocedurer före och efter läsning av proverna.
      OBS: Hoppa inte över en position när du laddar rören i instrumentet.
      1. För rengöringscykeln, använd totalt fyra rör, med det första röret som innehåller flödesrengöringsreagens och de återstående tre rören som innehåller dH2O; varje rör kommer att ha 3 ml. Under rengöringskörningen ska du samla in data med en medelflödeshastighet i cirka 1 minut genom att registrera 100 000 händelser per rör under 330 V för framåtspridning (FSC) mot 265 V för sidospridning (SSC).
        OBS: Inget skräp eller cellulära händelser ska rapporteras under rengöringen; Om detta händer utför du rengöringssteget igen. För att köra proverna, se till att alla prover är i en homogen suspension innan du hämtar data eftersom detta säkerställer en korrekt avläsning.
    2. För att ansluta och slå på cytometern, klicka på applikationsknappen i det vänstra hörnet av titelfältet. Från rullgardinsmenyn för applikationer väljer du alternativet Cytometri och klickar på alternativet Slå på.
      OBS: Från programmets rullgardinsmeny tillåter alternativet Öppna användare att bläddra igenom de förprogrammerade analyserna, medan alternativet Nytt protokoll tillåter användare att skapa nya protokoll .
    3. Fyll först på det negativa kontrollprovet i hållaren för flera rör. Välj Nytt protokoll och observera arbetslistan till vänster på arbetsytan /skärmen.
    4. På arbetslistan definierar du provets position i flerrörshållaren och ger provet och protokollet ett namn för identifiering.
    5. Från maskinvarupanelen på vänster sida av arbetsytan justerar och väljer du flera parametrar som detektorerna (FSC, SSC och 10 fluorescensområden), spänningarna (V) och förstärkningarna för fotomultiplikatorerna och signalens area-höjd-bredd (AHW).
      OBS: Följande inställningar för detektorerna valdes baserat på experimentet och instrumentet som användes: FSC-AHW: AHW, V: 270, G: 5; SSC-AHW: A, V: 350, G: 10; FL1 (CD8/FITC Dextran)-AHW: A, V: 400, G: 1; FL2 (CD25/PE)-AHW: A, V: 500, G: 1; FL6 (CD4 / Alexa Fluor 647)-AHW: A, V: 700, G: 1; FL7 (Ki-67 / Alexa Fluor 700)-AHW: A, V: 625, G: 1; FL9 (L/D)-AHW: A, V: 425, G: 1.
    6. Från kontrollpanelen för instrumentförvärv under namnlisten justerar du alternativen för flödeshastighet (medium), tid (5 min) och händelser (se steg 5.2.8) som ska detekteras. Klicka på alternativet Skaffa singel för att låta instrumentet rita/köra provet och visa förhandsgranskningen i realtid av de upptäckta händelserna.
    7. Från förhandsgranskningen i realtid justerar du tröskelvärdet för fluorescens (spänning och förstärkning) och cellstorlek för att så småningom rita grindar runt den önskade cellpopulationen samtidigt som eventuella cellulära skräp utesluts.
      OBS: FSC hjälper till att skilja celler på grundval av storlek, vilket gör det möjligt för användare att skilja mellan celler i immunsystemet, såsom monocyter och lymfocyter; monocyter är större och visar en högre FSC-intensitet jämfört med lymfocyter.
    8. Förvärva totalt 5 000 levande MoDC, 50 000 levande lymfocyter och 50 000 levande monocythändelser.
    9. När alla parametrar har justerats med hänvisning till det negativa kontrollprovet klickar du på Stopp och sparar protokollet.
    10. Ladda nu alla prover på flerrörslastaren. Definiera varje prov i arbetslistan och tillämpa parametrarna justerade med hänvisning till den negativa kontrollen på alla prover i experimentet. Klicka på alternativet Hämta för att tillåta att alla prover i experimentet körs i följd.
    11. När data från alla prover har förvärvats, spara och omvandla till läsbara data med hjälp av en lämplig dataanalysprogramvara som möjliggör generering av sekventiella bi-parametriska och monoparametriska histogram.

6. Messenger RNA (mRNA) uttrycksanalys

  1. RNA-extraktion
    OBS: Extrahera totalt RNA från den antigenpulserade MoDC-lymfocytsamkulturen (specifik), den icke-antigenpulserade MoDC-lymfocytsamkulturen (icke-specifik), lymfocytkulturen utan MoDC (kontroll) och från naiva lymfocyter (CD14− -celler isolerade före samodling). För RNA-extraktion, förbered etanol med RNasfritt vatten. Se materialtabellen för detaljer om extraktionssatsen och reagenserna.
    1. Överför 1 ml cellsuspension från samodlingsplattan med MoDC-lymfocyter (~1 × 106 celler/ml) till ett sterilt 1,5 ml sterilt rör med pipett och centrifugera i 10 minuter vid 500 × g.
    2. Spara supernatanten för ELISA. Resuspendera cellpelleten i 1 ml PBS och överför den till ett 15 ml rör. Samla eventuella kvarvarande celler med 1 ml PBS.
    3. Centrifugera i 10 min vid 500 × g.
      OBS: Alla prover ska hanteras försiktigt som levande celler tills celllys utförs med hjälp av lysbufferten som finns i satsen. Celldöd frigör RNaser som snabbt hydrolyserar de RNA-mallar som behövs för kvantifiering nedströms. RLT-buffert lyserar celler i en lösning som hämmar RNaser.
    4. Tillsätt 350 μL lysbuffert till varje tom brunn och inkubera i 2-3 minuter för att lysera de vidhäftande cellerna som inte skördades i föregående steg.
    5. När centrifugeringen i steg 6.1.3 är avslutad, kassera supernatanten och kombinera cellpelleten med den 350 μl lysbuffert som tillsattes i steg 6.1.4.
      OBS: Vid denna tidpunkt är det möjligt att lagra rören vid -80 ° C eller fortsätta med RNA-extraktion (följande steg).
    6. Pipettera 350 μL 70 % etanol till lysatet i steg 6.1.5. Den slutliga volymen per prov är 700 μl.
    7. Sätt in extraktionskolonnen i ett 2 ml uppsamlingsrör (medföljer satsen).
    8. Överför 700 μl prov per extraktionskolonn och centrifugera vid 10 000 × g i 15 s. Kasta genomströmningen i uppsamlingsröret och sätt tillbaka den i rotationskolonnen.
    9. Tillsätt 350 μL sträng tvättbuffert (medföljer i satsen) i extraktionskolonnen och centrifugera vid mer än 10 000 × g i 15 sekunder. Ignorera genomflödet.
    10. Tillsätt 80 μl DNas I-inkubationsblandning per prov på extraktionskolonnens membran och låt det stelna i 15 minuter vid 20–30 °C.
      Anmärkning: För att bereda DNas I-inkubationsblandning per prov, tillsätt 10 μL DNas I-stamlösning till 70 μL DNas-buffert för en slutlig volym på 80 μl. Blanda noggrant genom att vända röret flera gånger, följt av en kort centrifugering.
    11. Tvätta extraktionskolonnen med 350 μL strikt tvättbuffert, följt av centrifugering vid 10 000 × g i 15 minuter. Kassera genomströmningen i uppsamlingsröret efter centrifugering.
    12. Tvätta extraktionskolonnen 2x med 500 μL mild tvättbuffert varje gång och centrifugering vid 10 000 × g i 15 s och en andra gång i 2 minuter. Kassera genomströmningen efter varje centrifugering.
    13. Centrifugera kolonnen med maximal hastighet i 1 minut för att torka membranet och kassera uppsamlingsröret.
    14. Placera extraktionskolonnen i ett nytt 1,5 ml uppsamlingsrör.
    15. Pipettera 50 μL RNasfritt vatten på kolonnmembranet och inkubera i 3-5 minuter vid rumstemperatur.
      OBS: För RNA-koncentrationer under 100 ng, minska elueringsvolymen till 30 μl och återeluera extraktionskolonnmembranet med produkten från den första elueringen för att koncentrera slutprodukten.
    16. Centrifugera vid 10 000 × g i 1 minut för att eluera RNA.
    17. Mät koncentrationen av RNA genom att detektera absorbansen vid 260 nm med 0,5-2 μL prov. Justera den slutliga RNA-koncentrationen till 0,1-1 μg/μl med RNasfritt vatten.
    18. Förvara RNA-alikvoterna vid −80 °C för senare användning.
  2. Syntes av komplementärt DNA
    1. Syntetisera komplementärt DNA (cDNA) från extraherat mall-RNA enligt tillverkarens protokoll som medföljer satsen (se materialtabellen för detaljer).
      Anmärkning: En sammanfattning av reagenserna och de volymer som använts visas i tabell 1 och tabell 2. Ett fullständigt protokoll beskrivs i tilläggsfil 1.
  3. Kvantitativ polymeraskedjereaktion i realtid
    1. För qPCR kör du cDNA-proverna i tre exemplar. Kvantifiera bovint mRNA-transkriptnivåer för Ki-67 och IFN-γ med hjälp av specifika primeruppsättningar med hänvisning till GAPDH-genen , såsom visas i tabell 3.
      OBS: Ett fullständigt protokoll beskrivs i tilläggsfil 1.

7. Enzymkopplad immunadsorberande analys

  1. Bearbeta de insamlade odlingssupernatanterna som är rika på sekretoriska proteiner för kvantifiering av IFN-γ genom ELISA.
    OBS: Se materialtabellen för detaljer om kitanvändning. Ett fullständigt protokoll beskrivs i tilläggsfil 1.

8. Statistisk analys

  1. Analysera data och göra grafiska illustrationer av experimentell design med hjälp av kommersiell programvara. Använd ett oparat icke-parametriskt test för den jämförande analysen. Betrakta P-värden < 0,05 som statistiskt signifikanta.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denna metod beskriver in vitro-generering av MoDC för nötkreatur för utvärdering av vaccinkandidatantigener innan in vivo-studier utförs. Figur 1 illustrerar försöksschemat för generering av MoDC från nötkreatur och tillämpningen av MoDC för in vitro-testet. Med hjälp av den magnetbaserade cellsorteringstekniken var det möjligt att samla in cirka 26 miljoner CD14 + myocyter från de skördade PBMC: erna, som tidigare isolerades från 50 ml nötkreaturblod. Den eluerade cellfraktionen fri från CD14 + -monocyter var rik på lymfocyter och användes som en källa till naiva CD4 + och CD8 + T-celler (CD14 − lymfocytcellfraktion).

Den naiva monocytfraktionen bestod av 98% CD14 + monocytceller, som observerades efter CD14-cellfärgning och flödescytometri (figur 2A, B). De renade naiva monocytcellerna, när de utsätts för odling i närvaro av 3% cytokincocktail (GM-CSF och IL-4) med en efterföljande inkubation av 5 dagar, differentierad till en DC-liknande fenotyp. Från en startkultur av 26 miljoner CD14 + monocyter kunde totalt cirka 12 miljoner MoDCs erhållas efter 5 dagars inkubation. De naiva MoDCs var funktionellt kapabla till antigenupptag, vilket observerades med hjälp av flödescytometrianalysen av FITC-dextran (figur 3). Vidare karakteriserades de naiva MoDCs fenotypiskt genom att bedöma uttrycket av MHC klass II och co-stimulerande CD86- och CD40-cellytemarkörer, vilket validerade den DC-liknande fenotypen (figur 4).

Den antigenpulserade stimuleringen av naiva MoDCs uppnåddes genom att odla dem i närvaro av inaktiverad RV i 2 dagar. Aktiveringen av naiva lymfocyter (CD14− -cellfraktionen) uppnåddes genom antigenpulsad MoDC-lymfocytsamodling med efterföljande tillskott av IL-2. Under samkulturen med MoDC-lymfocyter på dag 9 observerades en morfologisk förändring i de RV-pulsade MoDC, eftersom de visade dendritförlängning, vilket är ett kännetecken för MoDC-mognad (figur 5). På dag 14 förstärktes lymfocytaktiveringen genom att restimulera samkulturen genom tillsats av nyproducerade RV-pulsade MoDCs från samma djur.

Jämfört med den icke-pulsade MoDC-lymfocytsamkulturen visades en signifikant ökning (p < 0,01) i lymfocytproliferation genom uppreglering av Ki-67- och CD25-aktiveringsmarkörerna på både CD4 + och CD8 + T-cellerna på dag 16 i den pulsade MoDC-lymfocytsamkulturen (figur 6). CD8 + T-cellerna från de mogna RV-pulserade MoDC-samkulturerna uppvisade en åttafaldig uppreglering (p < 0,01) av Ki-67 jämfört med den icke-specifika gruppen (figur 7A). CD4 + T-cellerna i samma samkultur visade en sjufaldig ökning (p < 0,01) i Ki-67 jämfört med kontroller (figur 7B). Detta visar förmågan hos RV-grundade MoDCs att framgångsrikt presentera RV-antigenet för naiva lymfocyter och därefter aktivera dem i ett in vitro-tillstånd, liknande vad som händer i ett levande djur. Förutom att analysera cellerna med flödescytometri utsattes samkulturerna också för qPCR och ELISA för att kvantifiera RV-specifik lymfocytaktivering med RNA-transkription (Ki-67 och IFN-γ) respektive extracellulär utsöndring (IFN-γ) (figur 8). Dessa ytterligare detektionsmetoder kan också användas som bekräftande tester för att ytterligare validera resultaten av flödescytometri. RNA-uttrycket för Ki-67 och IFN-γ demonstrerat av qPCR och IFN-γ-nivåerna som demonstrerats av ELISA visade liknande ökningsmönster, vilket indikerar lymfocytproliferation, i den antigenspecifika samkulturen jämfört med den icke-specifika behandlingsgruppen. Därför korrelerade qPCR- och ELISA-resultaten med flödescytometriresultaten. qPCR visade en >30% ökning av IFN-γ-uttryck och en >5% ökning av Ki-67-uttryck i alla samkulturer som använde GAPDH som kalibrator (figur 8A, B). En signifikant högre koncentration av utsöndrade IFN-γ (**p > 0,01) uppmättes med ELISA med hjälp av odlingssupernatanter från den RV-pulsade MoDC-lymfocytsamkulturen jämfört med den icke-specifika behandlingsgruppen (figur 8C).

Figure 1
Figur 1: Experimentell utformning av det bovina MoDC-baserade in vitro-testet. (A) Skörd och cellsortering av CD14+-monocyt- och CD14−-lymfocytcellfraktioner från PBMC hos nötkreatur. Nötkreatursblod bearbetas genom densitetsgradientcentrifugering för att samla PBMC, följt av magnetbaserad cellsortering med användning av immunomagnetiska cellseparationskolonner och efterföljande odling av den skördade CD14+ naiva monocytcellfraktionen i kompletterat RPMI 1640-medium. (B) Produktion av MoDCs med användning av 3% cytokincocktail (GM-CSF + IL-4) med 5 dagars inkubation och MoDC-lymfocytsamodling. På dag 0 odlas monocyterna i närvaro av cytokincocktail och inkuberas i 48 timmar för att inducera differentiering. På dag 2 restimuleras kulturen med samma cytokincocktail, följt av inkubation i 72 h, vilket leder till produktion av naiva MoDC. På dag 5 tillsätts vaccinantigenet (rabiesvaccin) till den naiva MoDC-cellkulturen, följt av 48 h inkubation. På dag 7 utförs samodling av antigenpulsade MoDCs med naiva lymfocyter (CD14− cellfraktionen), följt av inkubation. På dag 9 läggs IL-2 till samkulturen. På dag 14 utförs anrikning/restimulering av de aktiverade/grundade lymfocyterna genom tillsats av antigenpulsade MoDCs, följt av inkubation i 48 timmar. Slutligen, på dag 16, skördas cellerna och odlingssupernatanten för lymfocytproliferationsanalysen. Förkortningar: MODC = dendritiska celler härledda från nötkreatur från monocyter. PBMC = mononukleära celler i perifert blod; GM-CSF = granulocyt-makrofag-kolonistimulerande faktor. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Morfologi och renhet hos bovina CD14+-monocyter skördade från PBMC med användning av anti-CD14-konjugerade mikrokulor. a) Morfologi hos monocyter från nötkreatur som inkuberats under 4 timmar vid 37 °C i ett komplett odlingsmedium för att avlägsna mikrokulor, fixerats på polylysindragna objektglas och färgats med modifierad Giemsa-fläck. Skalstapel = 50 μm. (B) Histogram för flödescytometri som visar den eluerade CD14+-cellfraktionen med en renhetsgrad på 98,6 % observerad med anti-CD14-antikropp (röd) och FITC-konjugerad mus IgG1-isotypkontrollantikropp (grön). Förkortningar: PBMC = mononukleära celler i perifert blod; FITC cont = fluoresceinisotiocyanatreglering. Denna siffra har modifierats från Kangethe et al., 201811. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Endocytisk aktivitet hos bovina MoDCs genererade in vitro. Histogram för flödescytometri som visar upptaget av spårämnesmolekylen (FITC-dextran) vid dag 5 naiva MoDCs. MoDC inkuberas vid 37 °C i 60 minuter med spårämnesmolekylen (blå) och MoDC inkuberas på is med spårämnesmolekylen (grå) som bakgrundskontroll. Förkortningar: MODC = dendritiska celler härledda från nötkreatur från monocyter. FITC = fluoresceinisotiocyanat. Denna siffra har modifierats från Kangethe et al., 201811. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Fenotypning av in vitro-genererade bovina MoDC-specifika cellytemarkörer. Flödescytometrihistogram för (A) grindstrategier för MoDCs och för (B) dag 5 naiva MoDCs färgade med tre olika DC-specificmAbs (blå), inklusive följande: anti-får MHC II mAb, anti-bovint CD86 mB och anti-bovint CD40 mAb. Alla jämfört med motsvarande isotypkontroller (röd). Förkortningar: DC = dendritiska celler; MODC = DC härledda från nötkreatur från monocyter, MHC II = större histokompatibilitetskomplex II. Denna siffra har modifierats från Kangethe et al., 201811. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Tecken på mognad av in vitro-producerade MoDCs under samodling av MoDC-lymfocyter. Observation av den karakteristiska utvidgade dendritiska strukturen med antigenpulsade MoDCs med inverterad mikroskopi på dag 9 av samkulturen med MoDC-lymfocyter. a) Mogna MoDC inom ett mycket sammanflytande område av samodlade lymfocyter. (B) Mogna MoDC är lätta att urskilja i ett område med färre lymfocyter i samodling. Skalstänger = 50 μm. Förkortning: MODCs = dendritiska celler härledda från nötkreatur. Denna siffra har modifierats från Kangethe et al., 201811. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Sekventiell grindstrategi antagen för punktdiagram mot Ki-67- och CD25-uttryck av lymfocyter i MoDC-lymfocytsamkultur. (A) Denfullständiga grindstrategin för celler som skördats från dag 16 MoDC-lymfocytsamodling. (B) Ki-67-uttrycket från CD4+-styrda lymfocyter och (C) från CD8+-lymfocyter jämfört med FMO-kontrollen (utan mAb) och musens IgG1-k-isotypkontroll mAb. CD25-uttrycket på gated (D) CD8 + och (E) CD4 + lymfocyter jämfört med mus IgG1 isotyp kontroll mAb. Behandlingsgruppen representerar specifikt lymfocyter samodlade med RV-pulsade MoDCs, medan kontrollen representerar lymfocyter odlade i frånvaro av MoDCs. Förkortningar: MODC = dendritiska celler härledda från nötkreatur från monocyter. FMO = fluorescerande minus en; RV = rabiesvaccin. Denna siffra har modifierats från Kangethe et al., 201811. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 7
Figur 7: Flödescytometridataanalys av Ki-67- och CD25-uttryck med CD4 + och CD8 + lymfocyter efter priming med antigenet. Ki-67 och CD25 uttryck från dag 16 samkultur. Behandlingsgruppen (specifik) definieras som lymfocyter odlade med RV-pulsade MoDCs; Den icke-specifika gruppen motsvarar lymfocyter odlade med icke-antigenpulsade MoDCs. kontrollgruppen motsvarar lymfocyter odlade utan MoDC. De horisontella staplarna representerar medelvärdet av sex tekniska replikat. (A) Intracellulärt uttryck av Ki-67-markören av CD8 T-celler och (B) av CD4 T-celler. (C) Cellytuttryck av CD25-markören av CD8 T-celler och (D) av CD4 T-celler. Förkortningar: MODC = dendritiska celler härledda från nötkreatur från monocyter. RV = rabiesvaccin. Denna siffra har modifierats från Kangethe et al., 201811. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 8
Figur 8: Th1-marköraktivering (IFN-γ och Ki-67) av MoDCs grundade med rabiesvirusantigenet, som detekterats genom qPCR och ELISA. Data tagna från ett djur med sex tekniska replikat. De horisontella staplarna representerar medelvärdet. Tre PCR-replikat visas som veckförändringar jämfört med naiva lymfocyter efter normalisering med en GAPDH-referensgen . (A) IFN-γ-uttryck , (B) Ki-67-uttryck . (C) Jämförelse av IFN-γ-sekretion i odlingssupernatanten mellan tre behandlingsgrupper, detekterad av ELISA. Den specifika gruppen definieras som lymfocyter odlade med RV-pulsade MoDCs; Den icke-specifika gruppen motsvarar lymfocyter odlade med icke-antigenpulsade MoDCs. kontrollgruppen motsvarar lymfocyter odlade utan MoDC. Förkortningar: MODC = dendritiska celler härledda från nötkreatur från monocyter. RV = rabiesvaccin. Denna siffra har modifierats från Kangethe et al., 201811. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Reagenser Slutlig koncentration Volym Per reaktion
dNTPs Mix (10 mM) 1 000 μM 1 μL
Slumpmässiga hexamerprimrar (50 ng/μl) 25 μM 1 μL
RNA-mall 0,1 – 1 μg/μL χ μL (efter behov)
RNAse Fritt vatten - χ μL (efter behov)
Slutlig reaktionsvolym - 10 μL

Tabell 1: Masterblandningens sammansättning (RNA-primerblandning).

Reagenser Slutlig koncentration Volym Per reaktion
RT-buffert 10x 1x 2 μL
MgCl2 25 mM 5 mM 4 μL
DTT 0,1 M 10 mM 2 μL
RNAse-hämmare 40 E/μL 2 U 1 μL

Tabell 2: 2x PCR-reaktionsblandningen. Förkortningar: RT = omvänt transkriptas; DTT = ditiotreitol.

Cytokin Art Anslutningsnummer Sekvens Längd Tm
IFN-γ Bos taurus FJ263670 F- GTGGGCCTCTCTTCTCAGAA 234 80.5
R- GATCATCCACCGGAATTTGA
Ki-67 Bos taurus XM_015460791.2 F-AAGATTCCAGCGCCCATTCA 148 86.5
R-TGAGGAACGAACACGACTGG
GAPDH Bos taurus Sassu et al., 2020 F-CCTGGAGAAACCTGCCAAGT 214 85.5
R-GCCAAATTCATTGTCGTACCA

Tabell 3: Grundsatser som används för förstärkning50.

Reagenser Slutlig koncentration Volym Per reaktion
Supermix 1x 5 μL
Främre primer (5 μM) 250/ 125 nM 1 μL
Omvänd primers (5 μM) 250/ 125 nM 1 μL
cDNA 1:10 utspädd 1,25 ng 2 μL
Nukleasfritt vatten - 1 μL
Slutlig reaktionsvolym - 10 μL

Tabell 4: qPCR-mastermix

Rör nr. Koncentration av standard Seriell utspädning
1 50 ng/ml 50 μL standard + 350 μL tvättbuffert
2 12,5 ng/ml 150 μL från rör 1 + 450 μL tvättbuffert
3 6,25 ng/ml 250 μL från rör 2 + 250 μL tvättbuffert
4 3,13 ng/ml 250 μL från rör 3 + 250 μL tvättbuffert
5 1,56 ng/ml 250 μL från rör 4 + 250 μL tvättbuffert
6 0,78 ng/ml 250 μL från rör 5 + 250 μL tvättbuffert
7 0,2 ng/ml 150 μL från rör 6 + 450 μL tvättbuffert
8 0,1 ng/ml 250 μL från rör 7 + 250 μL tvättbuffert
9 0,025 ng/ml 100 μL från tub 8 + 300 μL tvättbuffert

Tabell 5: Standardutspädningsserie enligt IFN-γ

Kompletterande fil 1: Protokoll för syntes av komplementärt DNA, kvantitativ polymeraskedjereaktion i realtid (qPCR) och enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA). Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur S1: Antigenupptagsförmåga MoDCs med olika koncentrationer av cytokincocktail och med 3 dagars eller 5 dagars odling. Olika koncentrationer (5% w/v och 3% w/v) av cytokincocktailen innehållande GM-CSF och IL-4 testades antingen med 3 dagars eller 5 dagars odling för att bedöma den bästa kombinationen för att generera högpresterande antigenupptag MoDCs (med hjälp av spårämnesmolekylen FITC-dextran). Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur S2: CD4- och CD8-priming med difteritoxoid (DT) och blåtungevirus serotyp 4 (BTV). Uttrycket av Ki-67 av CD8-celler efter pulsering med (A) DT och (C) BTV och uttrycket av Ki-67 av CD4-celler efter pulsering med (B) DT och (D) BVT vid dag 16. Jämförelser gjordes med kulturer pulserade med DT och BVT (specifik), (C,D) med CD40L och med icke-specifika priming- och kontrollbehandlingar. De horisontella staplarna anger medelvärdet. *p < 0,05, **p < 0,01 enligt ett Mann-Whitney-test. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denna studie visar en standardiserad in vitro-metod för att generera och fenotypa bovina MoDCs och deras efterföljande användning vid mätning av vaccinimmunogeniciteten hos ett kommersiellt vaccin (t.ex. RV). Bovina MoDCs kan användas som ett verktyg för screening av potentiella vaccinantigener mot nötkreatursjukdomar och förutsäga deras potentiella kliniska inverkan baserat på immunsvar innan man går vidare mot in vivo-djurförsök . De genererade MoDC identifierades baserat på deras morfologiska, fenotypiska och funktionella egenskaper. Vi visade att MoDCs härrörande från nötkreatur CD14 + monocyter uppvisade egenskaper som ses i DCs, såsom utökade dendriter, uttrycket av cellytmarkörer för antigenpresentation såsom MHC II, uttrycket av co-stimulerande molekyler på MoDCs såsom CD40 och CD86, endocytisk aktivitet och förmågan att aktivera naiva lymfocyter.

Cellodlingsmediet som används i detta experiment (DMEM och RPMI) används ofta för celldifferentiering och odling, med RPMI som oftare antas för monocytdifferentiering36. RPMI-tillskott med antingen FBS eller HS (hästserum) påverkar inte monocytdifferentiering37. Rekombinant GM-CSF och IL-4-tillskott ger ett inflammatoriskt tillstånd som utlöser monocytdifferentiering och används rutinmässigt för produktion av funktionellt livskraftiga MoDCs som kan antigenupptag och presentation till immunceller38,39. I denna studie inducerade RPMI 1640-medium kompletterat med 10% FBS (komplett odlingsmedium), 1% penicillin-streptomycin och tillsats av en kommersiellt tillgänglig cytokincocktail (GM-CSF plus IL-4) differentiering av bovint monocyt, vilket resulterade i produktion av livskraftiga MoDC. När de genererade MoDCs inkuberades med RV före samodling med naiva lymfocyter, inducerade de ett T-cellberoende immunsvar specifikt mot RV, vilket bevisar att mogna MoDCs kan presentera RV-antigener på ett adekvat sätt till lymfocyter som aldrig har stött på RV. Detta är en avgörande egenskap hos adaptiv immunitet som vi nu kan replikera i labbet.

Vi observerade att en högre koncentration av cytokincocktail (5%) i kombination med en längre inkubationstid (5 dagar) gav MoDCs med lägre endocytisk förmåga för antigenupptag än de som behandlades med en lägre koncentration av cytokincocktail (3%) med samma inkubationstid (5 dagar), som visas i kompletterande figur S1. Därför drar vi slutsatsen att en lägre koncentration av cytokincocktail (t.ex. 3%) med 5 dagars inkubation är optimal för att producera funktionellt potenta MoDC. Cellytmarkörer som MHC II, CD40 och CD86 finns på APC, och deras uppreglering indikerar funktionell cellaktivering40,41,4 2. Vi visade förbättrat uttryck av MHC II, CD40 och CD86 efter monocytdifferentiering till naiva MoDCs med cytokincocktail (figur 4).

Optimering av förhållandet mellan naiva lymfocyter och MoDCs i ett odlingssystem är en nyckelfaktor som påverkar resultatet av MoDC-analysen, med olika MoDC till lymfocytförhållanden som inducerar olika lymfocytsvar43. Men efter att ha utvärderat MoDC till lymfocytförhållanden på 1: 10-1: 40 observerade vi att ökad koncentration av MoDCs inte ökade lymfocytaktiveringen, och vi bestämde oss så småningom för ett optimalt förhållande på 1:20, vilket liknar tidigare rapporterade studier44,45. Det bör noteras att den eluerade naiva lymfocytfraktionen kan innehålla icke-specifikt aktiverade T-celler; Därför är det absolut nödvändigt att ha en kontrollgrupp som motsvarar endast naiv lymfocytkultur.

Aktiverade CD4 + och CD8 + T-celler uttrycker specifika markörer och utsöndrar en mängd olika cytokiner, och deras kvantifiering indikerar immunaktivering. Det intracellulära uttrycket av Ki-67, en välkarakteriserad immunaktiveringsmarkör, uppreglerades i denna MoDC-lymfocytsamkultur29,46. På liknande sätt i denna studie indikerade den förbättrade IFN-γ-utsöndringen av lymfocyter ett Th1-svar framkallat mot RV-antigenet30,31,47. IL-2-uttryck av CD4 + T-celler är också en bra markör för visualisering av T-cellaktivering; dess införlivande på dag 9 av MoDC-lymfocytsamkulturen gjorde det dock till ett olämpligt mål för mätning av lymfocytproliferation för denna studie48. Uppregleringen av CD25 i närvaro av IL-2 har tidigare visat sig bestämma priming av både CD4 + och CD8 + T-celler och användes i denna studie för att mäta priming av naiva lymfocyter av RV-pulserade MoDCs28.

Cytotoxiska CD8 T-celler är viktiga effektorceller mot intracellulära vaccinantigener eller virala patogener49. Genom att mäta lymfocytaktiveringsmarkörer (Ki-67 och CD25) och cytokinuttryck (IFN-γ) fann vi att de antigenladdade MoDC: erna hade signifikant (p < 0,01) aktivering av både CD8- och CD4 T-cellsvar, med CD8-svaret och Th1-polarisationen vanligare mot RV-antigenet. En viktig faktor som måste beaktas vid utformningen av en MoDC-analys för adjuvanskonjugerade vacciner är adjuvansinducerade lymfocytsvar. Vi rekommenderar att du använder en kontrollgrupp (adjuvanskontroll) bestående av endast adjuvans för att eliminera eventuella bakgrundssignaler. Denna inställning kan också användas för att mäta effekten av olika adjuvans som kan förstärka lymfocytsvar mot ett lågimmunogent antigen, vilket är avgörande för skydd under in vivo-studier .

Det finns vissa begränsningar i denna studie som vi vill belysa. Försöksdata för varje analys härleddes från ett enda djur med sex tekniska replikat. Att ha ett större antal biologiska replikat skulle vara fördelaktigt för att minimera fel och ge förbättrad statistisk tillförlitlighet och resultat med högre noggrannhet. I en tidigare publikation11 testades och validerades dock även denna analys med användning av en difteritoxoid (kompletterande figur S2A,B) och ett kommersiellt vaccin mot blåtungevirus serotyp 4 (kompletterande figur S2C,D) med tre respektive två biologiska djur. Att jämföra resultaten från denna in vitro-studie med en in vivo-studie skulle dessutom bidra till att ytterligare validera äktheten hos denna immunanalys, vilket i sin tur skulle påskynda implementeringsprocessen av denna in vitro MoDC-analys som ett rutintest i vaccinproduktion och kvalitetskontroll. Slutligen undersöktes inte uttrycket av CD14 i MoDC, eftersom litteraturen är inkonsekvent när det gäller denna aspekt, särskilt när man jämför MoDC från olika djurarter.

Sammanfattningsvis rapporterar vi en in vitro bovin MoDC-analys som kan användas för att mäta vaccininducerad immunogenicitet. Denna MoDC-analys kan också utvärderas med olika metoder, inklusive flödescytometri, ELISA och qPCR. Att ha flera metoder för att utvärdera aktiveringsmarkörer är avgörande i områden med begränsade resurser där en flödescytometer kanske inte är lättillgänglig. Denna analys kan ingå som ett kvalitetskontrollsteg av nationella veterinärlaboratorier som producerar stora partier vaccin från nötkreatur. Dessutom kan det användas för att identifiera potentiella vaccinantigener under utvecklingen av nya nötkreaturvacciner och till och med för att välja vilket adjuvans som ska användas före en djurförsök. Alla dessa faktorer kommer att bidra till ett mer etiskt och överkomligt tillvägagångssätt för att utveckla och använda nötkreatursvacciner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Dr. Eveline Wodak och Dr. Angelika Loistch (AGES) för deras stöd för att bestämma djurens hälsotillstånd och för att tillhandahålla BTV, Dr. Bernhard Reinelt för att tillhandahålla bovint blod och Dr. Bharani Settypalli och Dr. William Dundon från IAEA för användbara råd om PCR-experiment i realtid respektive språkredigering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACK Lysing Buffer Gibco, Thermo Fisher A1049201 Ammonium-Chloride-Potassium buffer for lysis of residual RBCs in harvested PBMC Fraction
BD Vacutainer Heparin Tubes Becton, Dickinson (BD) and Company 366480 10 mL, additive sodium heparin 158 USP units, glass tube, 16 x 100 mm size
Bovine Dendritic Cell Growth Kit Bio-Rad, UK PBP015KZZ Cytokine cocktail composed of recombinant bovine IL-4 and GM-CSF
Bovine IFN-γ ELISA Kit Bio-Rad MCA5638KZZ Kit use for measuring IFN-γ expression in culture supernatant
CD14 Antibody Bio-Rad MCA2678F Mouse anti-bovine CD14 monoclonal antibody, clone CC-G33, isotype IgG1
CD25 Antibody Bio-Rad MCA2430PE Mouse anti bovine CD25 monoclonal antibody, clone IL-A11, isotype IgG1
CD4 Antibody Bio-Rad MCA1653A647 Mouse anti bovine CD4 monoclonal antibody, clone CC8, isotype IgG2a
CD40 Antibody Bio-Rad MCA2431F Mouse anti-bovine CD40 monoclonal antibody, clone IL-A156, isotype IgG1
CD8 Antibody Bio-Rad MCA837F Mouse anti bovine CD8 monoclonal antibody, clone CC63, isotype IgG2a
CD86 Antibody Bio-Rad MCA2437PE Mouse anti-bovine CD86 monoclonal antibody, clone IL-A190, isotype IgG1
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System Bio-Rad - Thermal cycler PCR machine
Corning Centrifuge Tube Falcon Corning  352096 & 352070 15 mL and 50 mL, high-clarity poypropylene conical bottom, graduated, sterial, seal screw cap, falcon tube
Cytofix/Cytoperm Plus BD Bio Sciences 555028 Fixation/permeabilization kit with BD golgiPlug, use for flow cytometer cell staining
Ethanol Sigma Aldrich 1009832500 Absolute for analysis EMSURE ACS,ISO, Reag. Ph Eur
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco, Thermo Fisher 10500064 Qualified, heat inactivated
Ficoll Plaque PLUS GE Health care Life Sciences, USA 341691 Lymphocyte-isolation medium
FlowClean Cleaning Agent Beckman Coulter, Life Sciences A64669 500 mL
FlowJo FlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, USA - Flow cytometer Histogram software
FlowTubes/ FACS  (Fluorescence-activated single-cell sorting) Tube Falcon Corning  352235 5 mL, sterial, round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap, use in flow cytometry analysis
Fluoresceinisothiocynat-Dextran Sigma Aldrich, Germany 60842-46-8 FITC-dextran MW
Gallios Flow Cytometer Beckman Coulter - Flow cytometer machine
Hard-Shell 96-Well PCR Plates Bio-Rad HSP9601 96 well, low profile, thin wall, skirted, white/clear
Human CD14 MicroBeads Miltenyi Bioteck, Germany 130-050-201 2 mL microbeads conjugated to monoclonal anti-human CD14 antibody isotype IgG2a, used for selection of bovine monocytes from PBMCs
Kaluza Beckman Coulter, Germany - Flow cytometer multicolor data analysis software
MACS Column Miltenyi Bioteck, Germany 130-042-401 Magnetic activated cell sorting or immune magentic cell separation colum for separation of various CD14 cell population based on cell surface antigens
MHC Class II DQ DR Polymorphic Antibody Bio-Rad MCA2228F Mouse anti-sheep MHC Class II DQ DR Polymorphic:FITC, clone 49.1, isotype IgG2a, cross reactive with bovine
Microcentrifuge Tube Sigma Aldrich HS4325 1.5 mL, conical bottom, graduated, sterial tube
Microsoft Power Point Microsoft - The graphical illustrations of experimental design
Mouse IgG1 Negative Control:FITC for CD14, CD40 Antibody Bio-Rad MCA928F Isotype control CD14 and CD40 monoclonal antibody 
Mouse IgG1 Negative Control:PE for CD86 Antibody Bio-Rad MCA928PE Isotype control CD86 monoclonal antibody 
Mouse IgG1 Negative Control:RPE for CD25 Antibody Bio-Rad MCA928PE Isotype control CD25 monoclonal antibody 
Mouse IgG2a Negative Control:FITC for MHC Class II Antibody Bio-Rad MCA929F Isotype control for MHC class II monoclonal antibody 
Nobivac Rabies MSD Animal Health, UK - 1 µL/mL of cell cultured inactivated vaccine containing > 2 I.U./mL Rabies virus strain
Optical seals Bi0-Rad TCS0803 0.2 mL flat PCR tube 8-cap strips, optical, ultraclear, compatible for qPCR machine
Penicillin-Streptomycin Gibco, Thermo Fisher 15140122 100 mL
Phosphate Buffer Saline (PBS) Gibco, Thermo Fisher 10010023 pH 7.4, 1x concentration
Prism - GraphPad 5 Software  Dotmatics - Statistical software
Purified Anti-human Ki-67 antibody Biolegend, USA 350501 Monoclonal antibody, cross reactive with cow, clone ki-67
Purified Mouse IgG1 k Isotype Ctrl Antibody Biolegend 400101 Isotype control for Ki-67 monoclonal antibody
READIDROP Propidium Iodide BD Bio Sciences 1351101 Live/dead cell marker used for flow cytometry, amine reactive dye
Recombinant Human IL-2 Protein R&D System, USA 202-IL-010/CF Interleukin-2, 20 ng/ml
RNeasy Mini Kit Qiagen 74106 Kit use for extraction of total RNA; RLT buffer = lysis buffer; RW1 buffer = stringent guanidine-containing washing buffer; RDD buffer = DNase buffer; RPE buffer = mild wash buffer; RNaseOUT = RNase inhibitor.
RPMI 1640 Medium Sigma Aldrich R8758 Cell culture media with L-glutamine and sodium bicarbonate
SMART-servier medical art  Les Laboratories Servier - Licensed under a creative commons attribution 3.0 unported license
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 172-5270 2x qPCR mix conatins dNTPs, Ss07d fusion polymerase, MgCl2, SYBR Green I supermix = supermix, ROX normalization dyes.
SuperScript III First-Strand Synthesis System Invitrogen, Thermo Fisher 18080051 Kit for cDNA synthsis
Tissue Culture Test plate 24 TPP, Switzerland 92024 24 well plate, sterilized by radiation , growth enhanced treated, volume 3.18 mL
Trypan Blue Solution Gibco, Thermo Fisher 15250061 0.4%, 100 mL, dye to assess cell viability
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Invitrogen, Thermo Fisher 10977023 0.1 µm membrane filtered distilled water
VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes Thermo Fisher Scientific 15206067 VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes have a green top and contain spray-dried lithium, sodium or ammonium heparin on the inner walls and are usedin clinical chemistry, immunology and serology. The anticoagulant heparin activates antithrombin, which blocks the clotting cascade and thus produces a whole blood/plasma sample.
Water Sigma Aldrich W3500-1L Sterile-filtered, bioReagent suitable for cell culture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roth, J. A., Sandbulte, M. R. The role of veterinary vaccines in livestock production, animal health, and public health. In Veterinary Vaccines: Principles and Applications. Metwally, S., El Idrissi, A., Viljoen, G. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 1-10 (2021).
  2. Roberts, N. J., Douglas, R. G., Simons, R. M., Diamond, M. E. Virus-induced interferon production by human macrophages. The Journal of Immunology. 123 (1), 365-369 (1979).
  3. Kleiveland, C. R. Peripheral blood mononuclear cells. The Impact of Food Bioactives on Health: In Vitro and Ex Vivo Models. Verhoeckx, K., Cotter, P., López-Expósito, I., Kleiveland, C., Lea, T., Mackie, A., Requena, T., Swiatecka, D., Wichers, H. , Springer. Cham, Switzerland. 161-167 (2015).
  4. Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 762-774 (2011).
  5. Domínguez, P. M., Ardavín, C. Differentiation and function of mouse monocyte-derived dendritic cells in steady state and inflammation. Immunological Reviews. 234 (1), 90-104 (2010).
  6. Steinman, R. M. Linking innate to adaptive immunity through dendritic cells. Novartis Foundation Symposium. 279, 101-109 (2006).
  7. Vandebriel, R. J., Hoefnagel, M. H. N. Dendritic cell-based in vitro assays for vaccine immunogenicity. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 8 (9), 1323-1325 (2012).
  8. Hopewell, E. L., Cox, C. Manufacturing dendritic cells for immunotherapy: Monocyte enrichment. Molecular Therapy. Methods and Clinical Development. 16, 155-160 (2020).
  9. Morse, M. A., Zhou, L. -J., Tedder, T. F., Lyerly, H. K., Smith, C. Generation of dendritic cells in vitro from peripheral blood mononuclear cells with granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor, interleukin-4, and tumor necrosis factor-alpha for use in cancer immunotherapy. Annals of Surgery. 226 (1), 6-16 (1997).
  10. Robinson, L., et al. Foot-and-mouth disease virus exhibits an altered tropism in the presence of specific immunoglobulins, enabling productive infection and killing of dendritic cells. Journal of Virology. 85 (5), 2212-2223 (2011).
  11. Kangethe, R. T., Pichler, R., Chuma, F. N. J., Cattoli, G., Wijewardana, V. Bovine monocyte derived dendritic cell based assay for measuring vaccine immunogenicity in vitro. Veterinary Immunology and Immunopathology. 197, 39-48 (2018).
  12. Harwood, L. J., Gerber, H., Sobrino, F., Summerfield, A., McCullough, K. C. Dendritic cell internalization of foot-and-mouth disease virus: Influence of heparan sulfate binding on virus uptake and induction of the immune response. Journal of Virology. 82 (13), 6379-6394 (2008).
  13. Hussen, J., et al. Phenotypic and functional heterogeneity of bovine blood monocytes. PLoS One. 8 (8), 71502 (2013).
  14. Shi, Y., et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and T-cell responses: What we do and don't know. Cell Research. 16 (2), 126-133 (2006).
  15. Zhou, L. -J., Tedder, T. F. CD14+ blood monocytes can differentiate into functionally mature CD83+ dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (6), 2588-2592 (1996).
  16. Bautista, E. M., Nfon, C., Ferman, G. S., Golde, W. T. IL-13 replaces IL-4 in development of monocyte derived dendritic cells (MoDC) of swine. Veterinary Immunology and Immunopathology. 115 (1-2), 56-67 (2007).
  17. León, B., Ardavín, C. Monocyte-derived dendritic cells in innate and adaptive immunity. Immunology and Cell Biology. 86 (4), 320-324 (2008).
  18. Berger, A. Th1 and Th2 responses: What are they. British Medical Journal. 321 (7258), 424 (2000).
  19. Romagnani, S. Th1/th2 cells. Inflammatory Bowel Diseases. 5 (4), 285-294 (1999).
  20. Kaiko, G. E., Horvat, J. C., Beagley, K. W., Hansbro, P. M. Immunological decision-making: How does the immune system decide to mount a helper T-cell response. Immunology. 123 (3), 326-338 (2008).
  21. Duckworth, B. C., Groom, J. R. Conversations that count: Cellular interactions that drive T cell fate. Immunological Reviews. 300 (1), 203-219 (2021).
  22. León, B., López-Bravo, M., Ardavín, C. Monocyte-derived dendritic cells formed at the infection site control the induction of protective T helper 1 responses against Leishmania. Immunity. 26 (4), 519-531 (2007).
  23. Singh, D., et al. Differential responses of chicken monocyte-derived dendritic cells infected with Salmonella gallinarum and Salmonella typhimurium. Scientific Reports. 11, 17214 (2021).
  24. Pujol, M., et al. Variability in the response of canine and human dendritic cells stimulated with Brucella canis. Veterinary Research. 48, 72 (2017).
  25. Pujol, M., Borie, C., Montoya, M., Ferreira, A., Vernal, R. Brucella canis induces canine CD4+ T cells multi-cytokine Th1/Th17 production via dendritic cell activation. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 62, 68-75 (2019).
  26. Lašťovička, J., Rataj, M., Bartůňková, J. Assessment of lymphocyte proliferation for diagnostic purpose: Comparison of CFSE staining, Ki-67 expression and 3H-thymidine incorporation. Human Immunology. 77 (12), 1215-1222 (2016).
  27. Reddy, M., Eirikis, E., Davis, C., Davis, H. M., Prabhakar, U. Comparative analysis of lymphocyte activation marker expression and cytokine secretion profile in stimulated human peripheral blood mononuclear cell cultures: An in vitro model to monitor cellular immune function. Journal of Immunological Methods. 293 (1-2), 127-142 (2004).
  28. Shatrova, A. N., et al. Time-dependent regulation of IL-2R α-chain (CD25) expression by TCR signal strength and IL-2-induced STAT5 signaling in activated human blood T lymphocytes. PLoS One. 11 (12), 0167215 (2016).
  29. Shedlock, D. J., et al. Ki-67 staining for determination of rhesus macaque T cell proliferative responses ex vivo. Cytometry, Part A. 77 (3), 275-284 (2010).
  30. Yen, H. -R., et al. Tc17 CD8 T cells: Functional plasticity and subset diversity. Journal of Immunology. 183 (11), 7161-7168 (2009).
  31. Kawamura, I., et al. IFN-gamma-producing ability as a possible marker for the protective T cells against Mycobacterium bovis BCG in mice. Journal of Immunology. 148 (9), 2887-2893 (1992).
  32. Federal Ministry Republic of Austria. Agriculture, Forestry, Regions and Water Management. The Federal Act on Animal Welfare (Tierschutzgesetz - TSchG). Federal Law Gazette I 2004/118. , Available from: https://info.bml.gv.at/en/topics/agriculture/agriculture-in-austria/animal-production-in-austria/animal-welfare-act.html (2005).
  33. Corripio-Miyar, Y., et al. Phenotypic and functional analysis of monocyte populations in cattle peripheral blood identifies a subset with high endocytic and allogeneic T-cell stimulatory capacity. Veterinary Research. 46, 112 (2015).
  34. Wijewardana, V., et al. Generation of canine dendritic cells from peripheral blood monocytes without using purified cytokines. Veterinary Immunology and Immunopathology. 114 (1-2), 37-48 (2006).
  35. Gallios Flow Cytometer with Kaluza for Gallios Software. Instructions for Use. Beckman Coulter. , Available from: http://www.cytometrie-imagerie-saint-antoine.org/media/3924/Kaluza.Gallos.pdf (2014).
  36. Švajger, U., Jeras, M. Optimal dendritic cell differentiation in rpmi media requires the absence of HEPES buffer. Immunological Investigations. 40 (4), 413-426 (2011).
  37. Chometon, T. Q., et al. A protocol for rapid monocyte isolation and generation of singular human monocyte-derived dendritic cells. PLoS One. 15 (4), 0231132 (2020).
  38. Blanco, F. C., et al. Semi-stable production of bovine IL-4 and GM-CSF in the mammalian episomal expression system. Journal of Veterinary Research. 65 (3), 315-321 (2021).
  39. Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. Journal of Experimental Medicine. 179 (4), 1109-1118 (1994).
  40. Cho, K. -J., Roche, P. A. Regulation of MHC class II-peptide complex expression by ubiquitination. Frontiers in Immunology. 4, 369 (2013).
  41. Sansom, D. M., Manzotti, C. N., Zheng, Y. What's the difference between CD80 and CD86. Trends in Immunology. 24 (6), 313-318 (2003).
  42. Han Lee, G., et al. The role of CD40 expression in dendritic cells in cancer biology; a systematic review. Current Cancer Drug Targets. 14 (7), 610-620 (2014).
  43. Tanaka, H., Demeure, C. E., Rubio, M., Delespesse, G., Sarfati, M. Human monocyte-derived dendritic cells induce naive T cell differentiation into T helper cell type 2 (Th2) or Th1/Th2 effectors: Role of stimulator/responder ratio. Journal of Experimental Medicine. 192 (3), 405-412 (2000).
  44. Klechevsky, E., et al. Cross-priming CD8+ T cells by targeting antigens to human dendritic cells through DCIR. Blood. 116 (10), 1685-1697 (2010).
  45. Schlienger, K., Craighead, N., Lee, K. P., Levine, B. L., June, C. H. Efficient priming of protein antigen-specific human CD4+ T cells by monocyte-derived dendritic cells. Blood. 96 (10), 3490-3498 (2000).
  46. Soares, A., et al. Novel application of Ki67 to quantify antigen-specific in vitro lymphoproliferation. Journal of Immunological Methods. 362 (1-2), 43-50 (2010).
  47. Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations. Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2009).
  48. Bachmann, M. F., Oxenius, A. Interleukin 2: From immunostimulation to immunoregulation and back again. EMBO Reports. 8 (12), 1142-1148 (2007).
  49. Koup, R. A., Douek, D. C. Vaccine design for CD8 T lymphocyte responses. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 1 (1), 007252 (2011).
  50. Sassu, E. L., et al. Development and evaluation of a real-time PCR panel for the detection of 20 immune markers in cattle and sheep. Veterinary Immunology and Immunopathology. 227, 110092 (2020).

Tags

tomt värde utgåva 195
Bestämning av vaccinimmunogenicitet med hjälp av dendritiska celler härledda från nötkreatur
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liaqat, F., Kangethe, R. T.,… More

Liaqat, F., Kangethe, R. T., Pichler, R., Liu, B., Huber, J., Wijewardana, V., Cattoli, G., Porfiri, L. Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (195), e64874, doi:10.3791/64874 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter