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Immunology and Infection

Bestimmung der Immunogenität von Impfstoffen anhand von dendritischen Zellen aus Rindermonozyten

Published: May 19, 2023 doi: 10.3791/64874
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1, 1, 1
1Animal Production and Health Section, Joint Food and Agriculture Organization (FAO)/International Atomic Energy Agency (IAEA) Centre of Nuclear Techniques in Food and Agriculture, International Atomic Energy Agency, 2Teaching and Research Farm Kremesberg, Clinical Unit for Herd Health Management in Ruminants, Department for Farm Animals and Veterinary Public Health, University of Veterinary Medicine, Vienna

Summary

Die Methodik beschreibt die Generierung von bovinen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen (MoDCs) und deren Anwendung für die In-vitro-Evaluierung von Antigenkandidaten während der Entwicklung potenzieller veterinärmedizinischer Impfstoffe bei Rindern.

Abstract

Dendritische Zellen (DCs) sind die potentesten antigenpräsentierenden Zellen (APCs) innerhalb des Immunsystems. Sie patrouillieren den Organismus auf der Suche nach Krankheitserregern und spielen eine einzigartige Rolle innerhalb des Immunsystems, indem sie die angeborene und die adaptive Immunantwort miteinander verbinden. Diese Zellen können phagozytieren und dann eingefangene Antigene den Effektor-Immunzellen präsentieren, was eine Vielzahl von Immunreaktionen auslöst. Diese Arbeit demonstriert eine standardisierte Methode zur In-vitro-Generierung von bovinen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen (MoDCs), die aus mononukleären Zellen (PBMCs) des peripheren Blutes von Rindern isoliert wurden, und ihre Anwendung bei der Bewertung der Immunogenität von Impfstoffen.

Die magnetische Zellsortierung wurde verwendet, um CD14+-Monozyten aus PBMCs zu isolieren, und die Supplementierung des kompletten Nährmediums mit Interleukin (IL)-4 und Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor (GM-CSF) wurde verwendet, um die Differenzierung von CD14+-Monozyten in naive MoDCs zu induzieren. Die Generierung unreifer MoDCs wurde durch den Nachweis der Expression von Major Histocompatibility Complex II (MHC II), CD86 und CD40 Zelloberflächenmarkern bestätigt. Ein kommerziell erhältlicher Tollwutimpfstoff wurde verwendet, um die unreifen MoDCs zu pulsieren, die anschließend mit naiven Lymphozyten kokultiviert wurden.

Die durchflusszytometrische Analyse der antigengepulsten MoDCs und der Lymphozyten-Cokultur ergab die Stimulation der T-Lymphozytenproliferation durch die Expression von Ki-67-, CD25-, CD4- und CD8-Markern. Die Analyse der mRNA-Expression von IFN-γ und Ki-67 mittels quantitativer PCR zeigte, dass die MoDCs das antigenspezifische Priming von Lymphozyten in diesem in vitro Co-Kultursystem induzieren können. Darüber hinaus zeigte die mittels ELISA untersuchte IFN-γ-Sekretion einen signifikant höheren Titer (**p < 0,01) in der Tollwut-Impfstoff-gepulsten MoDC-Lymphozyten-Kokultur als in der nicht-antigengepulsten MoDC-Lymphozyten-Kokultur. Diese Ergebnisse zeigen die Validität dieses In-vitro-MoDC-Assays zur Messung der Immunogenität von Impfstoffen, was bedeutet, dass dieser Assay verwendet werden kann, um potenzielle Impfstoffkandidaten für Rinder zu identifizieren, bevor mit In-vivo-Studien fortgefahren wird, sowie bei der Bewertung der Immunogenität von Impfstoffen kommerzieller Impfstoffe.

Introduction

Tierärztliche Impfungen stellen einen entscheidenden Aspekt der Tierhaltung und -gesundheit dar, da sie zur Verbesserung der Ernährungssicherheit und des Tierwohls beitragen, indem sie Schutz vor Krankheiten bieten, die den Viehzuchtsektor weltweit betreffen1. Eine wirksame In-vitro-Methode zur Beurteilung der Immunogenität möglicher Impfstoffkandidaten würde dazu beitragen, den Prozess der Impfstoffentwicklung und -produktion zu beschleunigen. Es ist daher notwendig, das Feld der Immuntests mit innovativen Methoden auf der Grundlage von In-vitro-Studien zu erweitern, da dies dazu beitragen würde, die Komplexität der Immunprozesse im Zusammenhang mit Immunisierung und Erregerinfektion aufzudecken. Derzeit werden In-vivo-Immunisierungs- und Provokationsstudien an Tieren, die regelmäßige Probenahmen (z. B. Blut und Milz) erfordern, verwendet, um die Immunogenität von Impfstoffkandidaten und Adjuvantien zu messen. Diese Tests sind teuer, zeitaufwändig und haben ethische Implikationen, da in den meisten Fällen die Euthanasie der Tiere am Ende der Studien durchgeführt wird.

Als Alternative zu In-vivo-Assays wurden periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) verwendet, um impfstoffinduzierte Immunantworten in vitrozu untersuchen 2. PBMCs sind eine heterogene Zellpopulation, die sich zu 70 % bis 90 % aus Lymphozyten, zu 10 % aus Monozyten und einer begrenzten Anzahl von dendritischen Zellen (DCs, 1 % bis 2 %) zusammensetzt3. PBMCs beherbergen antigenpräsentierende Zellen (APCs) wie B-Zellen, Monozyten und DCs, die den Organismus ständig auf der Suche nach Anzeichen von Infektionen oder Gewebeschäden patrouillieren. Lokal sezernierte Chemokine erleichtern die Rekrutierung und Aktivierung von APCs an diesen Stellen, indem sie an Rezeptoren auf der Zelloberfläche binden. Im Falle von Monozyten lenken Chemokine ihr Schicksal darauf, sich entweder in DCs oder Makrophagen zu differenzieren4. Sobald DCs auf einen Erreger treffen und ihn einfangen, wandern sie zu sekundären lymphatischen Organen, wo sie die prozessierten Pathogenpeptidantigene mit Hilfe von MHC-Oberflächenproteinen der Klasse I oder II CD8+ T-Zellen bzw. CD4+ T-Zellen präsentieren und so eine Immunantwort auslösenkönnen 5,6.

Die Schlüsselrolle, die DCs bei der Orchestrierung einer schützenden Immunantwort gegen verschiedene Krankheitserreger spielen, macht sie zu einem interessanten Forschungsziel für das Verständnis intrazellulärer Immunmechanismen, insbesondere bei der Entwicklung von Impfstoffen und Adjuvantien gegen Infektionserreger7. Da der Anteil der DCs, die aus PBMCs gewonnen werden können, eher gering ist (1%-2%), wurden stattdessen Monozyten verwendet, um DCs in vitro zu erzeugen 8. Diese von Monozyten abgeleiteten DCs (MoDCs) wurden zunächst als mögliche Behandlungsstrategie in der Krebsimmuntherapie entwickelt9. In jüngerer Zeit wurden MoDCs für die Impfstoffforschung verwendet 10,11,12, und klassische Monozyten sind der vorherrschende Subtyp (89 %) für die MoDC-Produktion 13. Die Herstellung von MoDCs in vitro wurde zuvor durch die Zugabe von Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor (GM-CSF) in Kombination mit anderen Zytokinen wie Interleukin-4 (IL-4), Tumornekrosefaktor α (TNF-α) oder IL-13erreicht 14,15,16.

Der Erfolg eines In-vitro-MoDC-Assays hängt von der Fähigkeit antigenstimulierter reifer MoDCs ab, das Ausmaß und die Art der Immunantwort spezifisch für die Art des nachgewiesenen Antigens zu modulieren17. Die Art des Erregers, der von MoDCs erkannt und präsentiert wird, bestimmt die Differenzierung von CD4+ T-Helferzellen (Th) in Th1-, Th2- oder Th17-Effektorzellen und ist durch ein pathogenspezifisches sekretorisches Zytokinprofil gekennzeichnet. Eine Th1-Antwort wird gegen intrazelluläre Pathogene hervorgerufen und führt zur Sekretion von Interferon-gamma (IFN-γ) und Tumornekrosefaktor beta (TNF-β), was den phagozytischen Schutz moduliert. Eine Th2-Antwort wird gegen parasitäre Organismen ausgelöst und ist durch die Sekretion von IL-4, IL-5, IL-10 und IL-13 gekennzeichnet, die einen phagozytisch-unabhängigen humoralen Schutz initiiert. Th17 bietet einen neutrophilenabhängigen Schutz vor extrazellulären Bakterien- und Pilzinfektionen, die durch die Sekretion von IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 und TNF-α 18,19,20,21 vermittelt werden. Aufgrund früherer Studien wurde festgestellt, dass nicht alle Erreger innerhalb des erwarteten Zytokinprofils liegen. Zum Beispiel stimulieren dermale MoDCs als Reaktion auf eine parasitäre Leishmanieninfektion die IFN-γ Sekretion von CD4+ T-Zellen und CD8+ T-Zellen und induzieren so eine proinflammatorische Th1-Antwort22.

Es wurde auch gezeigt, dass MoDCs von Hühnern, die mit Salmonella-Lipopolysaccharid (LPS) geprimt wurden, eine variable Antwort gegen Salmonella typhimurium induzieren können, indem sie sowohl Th1- als auch Th2-Antworten aktivieren, während Salmonella gallinarum allein eine Th2-Antwort induziert, was die höhere Resistenz des letzteren gegenüber der MoDC-Clearanceerklären könnte 23. Die Aktivierung von MoDCs gegen Brucella canis (B. canis) wurde sowohl bei Hunden als auch bei menschlichen MoDCs berichtet, was bedeutet, dass dies einen zoonotischen Infektionsmechanismus darstellen könnte24. Humane MoDCs, die mit B. canis geprimt sind, induzieren eine starke Th1-Antwort, die eine Resistenz gegen schwere Infektionen verleiht, während canine MoDCs eine dominante Th17-Antwort mit einer reduzierten Th1-Antwort induzieren, was in der Folge zur Etablierung einer chronischen Infektion führt25. Bovine MoDCs zeigen eine erhöhte Affinität für das Maul- und Klauenseuchevirus (FMDV), das mit Immunglobulin G (IgG) konjugiert ist, im Vergleich zu nicht-konjugierten FMDV allein, da die MoDCs als Antwort auf die erstgenannten einen Virus-Antikörper-Komplex bilden10. Zusammenfassend zeigen diese Studien, wie MoDCs verwendet wurden, um die Komplexität von Immunantworten während der Infektion mit Krankheitserregern zu analysieren. Die adaptiven Immunantworten können durch die Quantifizierung spezifischer Marker bewertet werden, die mit der Proliferation von Lymphozyten assoziiert sind. Ki-67, ein intrazelluläres Protein, das nur in sich teilenden Zellen nachgewiesen wird, gilt als zuverlässiger Marker für Proliferationsstudien26, und in ähnlicher Weise entspricht CD25, das während der späten Phase der Aktivierung auf der Oberfläche von T-Zellen exprimiert wird, der Proliferation von Lymphozyten27,28.

Diese Studie demonstriert eine standardisierte Methode zur In-vitro-Generierung von Rinder-MoDCs und deren Anwendung in einem In-vitro-Immunassay, der zur Prüfung der Immunogenität von Impfstoffen verwendet wird. Ein kommerziell erhältlicher Tollwutimpfstoff (RV) wurde verwendet, um die Wirksamkeit dieses Tests zu validieren. Die Aktivierung und Proliferation von T-Lymphozyten wurde mittels Durchflusszytometrie, quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) und ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) durch die Analyse etablierter Zellaktivierungsmarker wie Ki-67 und CD25 und der Sekretion von IFN-γ 28,29,30,31 gemessen. Während des MoDC-Assays werden keine Tier- oder Humanversuche durchgeführt.

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Protocol

Die Blutentnahme erfolgt durch einen zertifizierten Veterinärdienst nach den ethischen Richtlinien der Österreichischen Agentur für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit (AGES) und unter Einhaltung der anerkannten Tierschutzstandards32. Die Studie wurde vom österreichischen Landwirtschaftsministerium ethisch genehmigt. Das Versuchsdesign für die Generierung von MoDCs und deren anschließende Anwendung ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Produktion naiver MoDCs

HINWEIS: Vollblutproben wurden von einem einzelnen pathogenfreien Kalb durch Jugularvenenpunktion mit heparinisierten Vacutainern gewonnen (für diese Studie wurden acht 9-ml-Blutröhrchen verwendet). Transportieren Sie das Blut in einer Kühlbox. Lagern Sie die Proben für die spätere Verwendung bei 2-4 °C oder verarbeiten Sie sie sofort. Halte das Blut in Rotation, um eine Blutgerinnung zu vermeiden. Sterilisieren Sie die Vakuumtainer mit 70% Ethanol. Alle folgenden Experimente wurden mit einer biologischen Probe und sechs technischen Replikaten durchgeführt.

  1. Dichtegradientenzentrifugation zur Isolierung von PBMCs aus dem heparinisierten Blut
    1. Mischen Sie das Blut gut, indem Sie es 10x invertieren.
    2. Übertragen Sie mit einer 10-ml-Pipette 20 ml heparinisiertes Blut in ein steriles 50-ml-Röhrchen und verdünnen Sie es mit 10 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
    3. Pipettieren Sie 15 ml Lymphozyten-Isolationsmedium in ein steriles 50-ml-Röhrchen.
      Anmerkungen: Lassen Sie das Lymphozyten-isolierende Medium vor dem Pipettieren Raumtemperatur erreichen.
    4. Kippen Sie das 50-ml-Röhrchen mit dem Lymphozyten-Isolationsmedium in eine 45°-Position. Richten Sie die Spitze einer 25-ml-Pipette senkrecht aus und schichten Sie die 30 ml Blut-PBS vorsichtig auf das Lymphozyten-Isolationsmedium, ohne die beiden zu vermischen. Bringen Sie das 50-ml-Röhrchen sehr langsam wieder in eine vertikale Position.
    5. Bei 800 × g für 35 min bei 20 °C mit maximaler Beschleunigung und ohne Bremsen zentrifugieren (Verzögerungsfunktion ausgeschaltet).
    6. Verwenden Sie eine Pasteurpipette, um die PBMC-Schicht (die dünne weiße Schicht direkt nach der ersten Plasmaschicht) zu sammeln und in ein neues 50-ml-Röhrchen zu überführen.
      Anmerkungen: Bei der Dichtegradientenzentrifugation wird Vollblut in verschiedene Schichten getrennt. Dadurch siedeln sich die Erythrozyten unten als Pellet an, die mononukleären Zellen (PBMCs) siedeln sich an der Grenzschicht an und das Plasma bildet die oberste Schicht. Granulozyten befinden sich zwischen dem Pellet und der PBMC-Schicht.
    7. Waschen Sie die geernteten PBMCs 2x, indem Sie PBS bis zu einem Volumen von 40 ml hinzufügen und gründlich mischen, indem Sie auf und ab pipettieren. Anschließend bei 500 × g bei 4 °C für 7 min mit maximaler Beschleunigung und maximaler Verzögerung zentrifugieren.
    8. Den Überstand durch Dekantieren verwerfen, das Pellet in 15 ml 1x Ammoniumchlorid-Kalium (ACK)-Puffer resuspendieren und bei Raumtemperatur 10-15 min inkubieren.
      Anmerkungen: Nicht länger als 15 Minuten inkubieren. Handelsüblicher ACK-Puffer wird verwendet, um die Lyse der in der PBMC-Fraktion vorhandenen roten Blutkörperchen (RBCs) zu gewährleisten.
    9. PBS bis zu einem Volumen von 40 ml zugeben und dann bei 500 × g und 4 °C für 7 min mit maximaler Beschleunigung und Verzögerung zentrifugieren.
    10. Verwerfen Sie den Überstand durch Umfüllen und wiederholen Sie Schritt 1.1.9.
    11. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 10 ml vollständigem Nährmedium (bei Raumtemperatur).
      HINWEIS: Das komplette Nährmedium besteht aus RPMI 1640 Zellkulturmedium, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin.
  2. Magnetische Trennung der CD14+/− -Zellen aus der PBMC-Population mittels CD14-konjugierter magnetischer Beads
    1. Zählen Sie die Zellen mit einem sauberen Hämozytometer-Zellzähler unter Verwendung von 10 μl Zellsuspension, gemischt mit 10 μl Trypanblaulösung (0,4 %).
      Anmerkungen: Trypanblauer Farbstoff ist eine giftige Chemikalie und potenziell krebserregend. Es sollte mit persönlicher Schutzausrüstung (PSA) gehandhabt werden, um Kontakt zu vermeiden, und Abfälle sollten in einem luftdichten Spezialbehälter für giftige Abfälle entsorgt werden. Tote Zellen erscheinen blau, während lebende Zellen unter dem Mikroskop klar erscheinen.
    2. 7 min bei 500 × g zentrifugieren.
    3. Verwerfen Sie den Überstand mit einer Pipette und resuspendieren Sie das Pellet in einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierpuffer (FACS) mit einem Volumen von 40 μl pro 1 × 107 Zellen . Mit einer Pipette gründlich mischen.
      HINWEIS: Der FACS-Puffer besteht aus 2 % FBS und 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), die in PBS gelöst sind.
    4. Fügen Sie 5 μl CD14-Mikrokügelchenpuffer pro 1 × 107 Zellen hinzu und mischen Sie gründlich mit einer Pipette.
    5. Inkubation für 30 min bei 4-8 °C für die positive Selektion von bovinen CD14+ Monozyten33. Vortex alle 15 Minuten während der Inkubationszeit.
    6. Optionaler Schritt (für die durchflusszytometrische Analyse): Zugabe von 10 μl CD14-FITC-Färbeantikörper (Fluorescein-Isothiocyanat) mit anschließender Inkubation für 15 min bei 4-8 °C. Weitere Informationen finden Sie in der Durchflusszytometrie-Analyse in Schritt 5.
    7. Fügen Sie 1 ml FACS-Puffer hinzu und zentrifugieren Sie 7 Minuten lang bei 500 × g.
    8. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 500 μl FACS-Puffer pro 1 × 108 Zellen .
    9. Setzen Sie die immunomagnetische Zelltrennungssäule in den Separator (Magnetsäulenhalter) ein und platzieren Sie ein 15-ml-Sammelröhrchen unter dem Säulenauslass, um den Durchfluss aufzufangen.
    10. Waschen Sie die Säule mit 1 ml entgastem FACS-Puffer. Ersetzen Sie nach dem Spülen das gebrauchte 15-ml-Röhrchen durch ein neues.
    11. Die Zellsuspension (aus Schritt 1.2.8) wird durch die Säule geführt, indem jeweils 1 ×10 8 Zellen in 500 μl Puffer pipettiert werden.
      Anmerkungen: Achten Sie darauf, beim Mischen der Zellen keine Luftblasen zu erzeugen, bevor Sie sie durch die Säule lassen.
    12. Spülen Sie die Säule 3x mit jeweils 3 ml entgastem FACS-Puffer.
    13. Sammeln Sie den Durchfluss und markieren Sie diese erste eluierte Fraktion als CD14− -Zellfraktion (PBMCs minus CD14+ -Monozyten); Dies wird auch als naive Lymphozytenfraktion bezeichnet.
      HINWEIS: Die CD14− -Zellen werden in einem vollständigen Nährmedium aufbewahrt, bis antigengepulste MoDCs hergestellt werden.
    14. Entfernen Sie die Spalte aus dem Trennzeichen.
    15. Legen Sie ein neues steriles 15-ml-Röhrchen unter die Säule, um das Abwasser aufzufangen.
    16. Pipettieren Sie 5 ml FACS-Puffer in die Säule und drücken Sie ihn sofort mit einem Kolben durch.
    17. Sammeln Sie den Durchfluss und markieren Sie diese zweite eluierte Fraktion als CD14+ -Zellfraktion. Dies wird auch als naive Monozytenfraktion bezeichnet.
    18. Fügen Sie den geernteten CD14+ -Monozyten ein komplettes Nährmedium hinzu, um 1 × 106 Zellen/ml zu erhalten.
      Anmerkungen: Zählen Sie die lebenden Zellen in der eluierten CD14+ -Zellfraktion, um das Volumen des vollständigen Nährmediums abzuschätzen, das erforderlich ist, um die gewünschte Zellzahl zu erreichen.
    19. Nehmen Sie eine sterile 24-Well-Platte und geben Sie 1 ml der Zellsuspension (1 × 106 Zellen/ml) in jede Well.
  3. Differenzierung der CD14+ naiven Monozyten in naive MoDCs durch Zugabe von 3% w/v Zytokincocktail (GM-CSF + IL-4) mit insgesamt 5 Tagen Inkubation
    1. Ergänzen Sie jede Vertiefung, die CD14+ -Monozyten enthält, mit 40 μl (3 % w/v) des im Kit enthaltenen Zytokincocktails.
    2. Inkubieren Sie die Platte in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO2 und bei 37 °C für 48 h.
    3. An Tag 2 wird die Hälfte des Inhalts jeder Vertiefung (500 μl) mit einer Pipette in einzelne 1,5-ml-Röhrchen übertragen und 7 Minuten lang bei 500 × g bei 4 °C zentrifugiert.
    4. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 500 μl frischem Nährmedium.
    5. 500 μl dieser Zellsuspension aus Schritt 1.3.4 werden in jede dafür vorgesehene Vertiefung zurückübertragen, so dass das Endvolumen 1 ml beträgt.
    6. Reichern Sie jede Vertiefung mit 20 μl Zytokincocktail an.
    7. Die Kultur wird 72 h in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO2 und bei 37 °C inkubiert.
    8. Nach der Inkubation am 5. Tag nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator.
      HINWEIS: Jede Vertiefung enthält 1 ml einer Zellsuspension aus naiven MoDCs. Die Anzahl der MoDCs beträgt einen Prozentsatz (~20%) der ursprünglich plattierten Monozyten (1 × 106/ml).

2. MoDC-Assay zur endozytären Aktivität

HINWEIS: Der Antigen-Aufnahme-Assay oder der endozytäre Aktivitäts-Assay misst die Fähigkeit naiver MoDCs, Fremdmaterial zu internalisieren. Der Assay wird mit naiven MoDCs durchgeführt, die mit einem 3%igen w/v-Zytokincocktail und einer Inkubationszeit von 5 Tagen kultiviert wurden, wie zuvor beschrieben34.

  1. Ernten Sie die naive MoDC-Zellsuspension von der 24-Well-Platte und übertragen Sie sie in ein 15-ml-Röhrchen. Sammeln Sie auch alle verbleibenden Zellen, indem Sie die Vertiefungen mit PBS spülen.
  2. 500 × g 7 Min. zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml Nährmedium, das mit 1 % FBS angereichert ist.
  3. Zählen Sie die lebenden MoDC-Zellen, um das Volumen des Mediums abzuschätzen, das erforderlich ist, um die gewünschte Zellzahl zu erreichen (2 × 105 Zellen/ml).
  4. Die naiven MoDCs werden in 100 μl komplettem Nährmedium in einer 24-Well-Platte mit einer Endzellkonzentration von 2 × 105 Zellen/ml kultiviert.
  5. Ergänzen Sie jede Vertiefung mit 1 mg/ml FITC-konjugiertem Dextran (Fluoreszenzsonde, die als Endozytose-Tracer verwendet wird).
    HINWEIS: Das FITC-Dextran fungiert als Fluoreszenzsonde und wird als Endozytose-Tracer verwendet.
  6. Decken Sie die Platte ab und inkubieren Sie sie 60 Minuten lang im Dunkeln bei 5 % CO2 und 37 °C.
    HINWEIS: Für die Hintergrundkontrolle werden die zusätzlichen MoDC-Zellen (2 × 105 Zellen/ml) mit 1 mg/ml FITC-Dextran auf Eis inkubiert, da diese Art der Inkubation das Eindringen des Tracermoleküls (FITC-dextran) in die Zellen verhindert.
  7. Nach der Inkubation wird die 24-Well-Platte sofort auf Eis übertragen, um die Endozytose von FITC-Dextran zu stoppen.
  8. Waschen Sie die Zellen mit eiskaltem FACS-Puffer.
  9. Ernte, zentrifugieren und resuspendieren Sie das Pellet in 500 μl FACS-Puffer.
  10. Analysieren Sie die Fluoreszenzintensität des FITC-Dextrans in den Zellen mittels Durchflusszytometrie. Weitere Informationen finden Sie in der Durchflusszytometrie-Analyse in Schritt 5.2.

3. Generierung von antigengepulsten MoDCs

HINWEIS: Ein kommerziell erhältlicher und klinisch zugelassener Impfstoff gegen das Tollwutvirus (RV) kann die Differenzierung von naiven MoDCs zu reifen antigenpräsentierenden MoDCs induzieren. Verwenden Sie 0,1 % (~1 μl) einer einzelnen RV-Impfdosis, um antigengepulste MoDCs zu erzeugen. Weiterhin ist es bevorzugt, RV-gepulste MoDCs in der gleichen Kulturplatte herzustellen, die (in Schritt 1.3.8) zur Erzeugung naiver MoDCs verwendet wird, da die Übertragung der naiven MoDCs auf eine neue 24-Well-Platte diese negativ beeinflusst.

  1. Ab Schritt 1.3.8) 1 μl/ml RV-Suspension zu 1 ml naiver MoDC-Kultur in der 24-Well-Platte zugeben und 48 h bei 5 % CO2 und 37 °C inkubieren.
    HINWEIS: Naive MoDCs, die ohne RV-Stimulation kultiviert wurden, werden als Hintergrundkontrolle (und als unspezifische Stimulation für die Co-Kultur mit Lymphozyten in den nächsten Schritten) verwendet.
  2. Nach der Inkubation, an Tag 7, wird die 24-Well-Platte mit den antigengepulsten MoDCs 10 Minuten lang auf Eis gelegt.
  3. Fügen Sie 1 ml eiskaltes PBS pro Vertiefung hinzu. Mischen Sie jede Vertiefung gründlich durch Pipettieren und übertragen Sie die Suspension in ein 15-ml-Röhrchen.
  4. Waschen Sie die Vertiefungen mit 2 ml eiskaltem PBS, um die verbleibenden Zellen in jeder Vertiefung zu sammeln.
  5. Füllen Sie den Inhalt in die entsprechenden Röhrchen und zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 500 × g für 7 Minuten.
  6. Verwerfen Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Zellpellet (antigengepulste MoDCs) in vollständigem Nährmedium und stellen Sie das Volumen auf eine endgültige Zellkonzentration von 1 × 105 Zellen/ml ein.
    Anmerkungen: Zählen Sie die lebenden Zellen, um das Volumen des Mediums abzuschätzen, das erforderlich ist, um die gewünschte Zellzahl zu erreichen. Verwenden Sie RV-gepulste MoDCs ab Tag 7 für das MoDC-Lymphozyten-Kokultursystem.

4. MoDC-Lymphozyten-Kokultur

HINWEIS: Das In-vitro-MoDC-Lymphozyten-Kokultursystem bestimmt die Fähigkeit von MoDCs, antigenspezifische Lymphozyten zu primen. Die verschiedenen Behandlungsgruppen von Zellen nach 16 Tagen Co-Kultur umfassen spezifische, unspezifische und Kontrollzellen. Die spezifische Gruppe ist definiert als Lymphozyten, die mit RV-gepulsten MoDCs kokultiviert werden; die unspezifische Gruppe ist definiert als Lymphozyten, die mit nicht-antigengepulsten MoDCs kokultiviert werden; und die Kontrollgruppe ist definiert als Lymphozyten, die ohne MoDCs kultiviert wurden.

  1. Der eluierten naiven Lymphozytenfraktion (CD14− Zellen) wird ein komplettes Nährmedium zugegeben, um eine Zellkonzentration von 2 × 106 Zellen/ml zu erreichen.
    HINWEIS: Zählen Sie die lebenden Zellen in der CD14− -Zellkultur, die seit ihrer Entnahme in einem vollständigen Nährmedium in einer 24-Well-Platte gehalten wurden, um das Volumen des Mediums abzuschätzen, das erforderlich ist, um die gewünschte Zellzahl zu erreichen.
  2. Nehmen Sie an Tag 7 eine sterile 24-Well-Platte und besetzen Sie die Wells mit 1 ml naiver Lymphozytenzellsuspension (2 × 106 Zellen /ml) plus 1 ml antigengepulster oder nicht-antigengepulster MoDC-Suspension (1 × 105 Zellen/ml).
    HINWEIS: Das Gesamtvolumen in jeder Vertiefung beträgt 2 ml mit einem Verhältnis von 1:20 MoDCs zu Lymphozyten pro Vertiefung.
  3. Die Platte wird 48 h bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert.
  4. Kulturanreicherung und Restimulation mit antigengepulsten MoDCs
    1. Nach der Inkubation der antigengepulsten MoDC-Lymphozyten-Co-Kultur wird an Tag 9 jede Vertiefung mit 20 ng/ml rekombinantem IL-2 ergänzt und für weitere 120 h (5 Tage Inkubation) inkubiert.
    2. Übertragen Sie am 14. Tag 1 ml der Co-Kultur in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie 7 Minuten lang bei 500 × g .
    3. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet mit 1 ml antigengepulsten oder nicht gepulsten MoDCs (1 × 105 Zellen/ml). Mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren und übertragen Sie die Zellsuspensionen zurück in die dafür vorgesehenen Vertiefungen.
      Anmerkungen: In diesem Schritt beträgt das Gesamtvolumen in jeder Vertiefung 2 ml.
    4. Mit der Inkubation bei 5 % CO2 und 37 °C für 48 h fortfahren. Nach der Inkubation am 16. Tag ist die Co-Kultur bereit für die Analyse mittels Durchflusszytometrie, qPCR und ELISA.
      HINWEIS: Für jede 2 ml in jeder Vertiefung der MoDC-Lymphozyten-Kokultur wird 1 ml resuspendierte Zellen für die Durchflusszytometrie gefärbt, 1 ml wird für die RNA-Extraktion verwendet und die Überstände aus beiden werden für ELISA verwendet.

5. Durchflusszytometrische Analyse

Anmerkungen: Färben Sie die Zellen mit geeigneten Markern/mAb, bevor Sie die Proben auf einem Durchflusszytometer laufen lassen. In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu den Reagenzien (Färbe-mAb- und Isotypkontrollen), dem Kit, dem Gerät und der Software, die für die Durchflusszytometrie-Analyse verwendet werden.

  1. Färbeprotokoll für Durchflusszytometer
    HINWEIS: Führen Sie eine Zelloberflächenfärbung für die PBMCs und naiven Lymphozyten und Monozyten mit anti-CD14 mAb durch (Schritt 1.2.6). Für die Zelloberflächenfärbung von naiven MoDCs verwenden Sie anti-CD86-spezifisches, anti-CD40-spezifisches und anti-MHC II-spezifisches mAb. Für die Zelloberflächenfärbung von Zellen ab Tag 16 Co-Kulturen verwenden Sie anti-CD4, anti-CD8, anti-CD25 mAbs; Verwenden Sie für die intrazelluläre Färbung Anti-Ki-67 mAb. Des Weiteren werden die Zellen entweder mit negativer Isotypkontrolle mAb oder ohne mAb (FMO: fluoreszierend minus eins) gefärbt. Der Hauptunterschied bei der Färbung von Oberflächen- und intrazellulären Markern besteht darin, dass bei Zelloberflächenmarkern die Zellen vor der Lebend-/Totfärbung (L/D) oder anderen Prozessen mit spezifischem Oberflächen-mAb gefärbt werden müssen. Die intrazelluläre Färbung wird jedoch nach der L/D-Färbung durchgeführt und erfordert einen Fixations- und Permeabilisierungsschritt, um eine intrazelluläre Penetration zu ermöglichen.
    1. 1 ml Zellsuspension mit einer Pipette in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen überführen und 10 Minuten bei 500 × g zentrifugieren.
      HINWEIS: Bewahren Sie nach der Zentrifugation bei der Verarbeitung der Zellen aus der MoDC-Lymphozyten-Kokultur den Überstand für die ELISA-Analyse auf.
    2. Resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml PBS und füllen Sie es in ein 15-ml-Röhrchen. Sammeln Sie die verbleibenden Zellen mit 1 ml PBS und kombinieren Sie diese mit dem resuspendierten Pellet.
    3. Geben Sie 10 ml PBS in das 15-ml-Röhrchen mit den Zellen, mischen Sie es durch Pipettieren und zentrifugieren Sie es 7 Minuten lang bei 850 x g.
    4. Verwerfen Sie den Überstand und wiederholen Sie Schritt 5.1.3.
    5. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig mit der Restsuspension (ca. 180 μl), die nach dem Dekantieren des Überstands übrig bleibt.
    6. Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine 96-Well-Platte mit V-Boden und versiegeln Sie die Wells, um ein Verschütten zu vermeiden.
    7. Zentrifugieren Sie die Platte bei 1.400 × g für 5 Minuten. Schnippen Sie nach dem Zentrifugieren mit der Platte über einen Abfallbehälter, um die Vertiefungen der Flüssigkeit zu entleeren, und klopfen Sie die Platte auf saugfähiges Papier, um sicherzustellen, dass überschüssige Flüssigkeit entfernt wird.
    8. Fügen Sie 25 μl Oberflächenfärbe-Mastermix pro Vertiefung hinzu und mischen Sie vorsichtig mit einer Pipette, gefolgt von einer Inkubation bei 4 °C für 30 Minuten.
      Anmerkungen: Um eine Mastermischung für die Oberflächenfärbung für eine einzelne Vertiefung herzustellen, fügen Sie 2,5 μl Oberflächen-mAb zu 20 μl FACS-Puffer hinzu.
    9. Fügen Sie 200 μl FACS-Puffer pro Well hinzu und zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 1.400 × g . Entleeren Sie nach dem Zentrifugieren die Vertiefungen der Flüssigkeit durch Umfüllen und klopfen Sie die Platte auf saugfähiges Papier, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
    10. Fügen Sie 100 μl L/D-Färbelösung pro Vertiefung hinzu. Mit einer Pipette gründlich mischen, anschließend bei 4 °C für 15 min im Dunkeln inkubieren.
      Anmerkungen: Lösen Sie für eine einzelne Vertiefung 0,25 μl L/D-Farbstoff in 100 μl FACS-Puffer auf. Der L/D-Farbstoff hilft bei der Unterscheidung zwischen lebenden und toten Zellen.
    11. Fügen Sie 100 μl FACS-Puffer hinzu. Decken Sie die Vertiefungen mit dem Deckel ab und zentrifugieren Sie die Platte 5 Minuten lang für 1.400 × g . Entsorgen Sie den Überstand durch Umfüllen und klopfen Sie die Platte auf saugfähiges Papier.
    12. Wiederholen Sie Schritt 5.1.11.
    13. Fügen Sie 50 μl Fixierungslösung pro Vertiefung hinzu (im Lieferumfang enthalten) und mischen Sie sie mit einer Pipette, bevor Sie die Platte 10 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
    14. Fügen Sie 150 μl des 1x Permeabilisations-Waschpuffers (PW) hinzu, der mit dem Kit geliefert wurde, und decken Sie die Vertiefungen mit dem Deckel ab.
      Anmerkungen: Um 10 ml 1x PW-Puffer herzustellen, verdünnen Sie 1 ml 10x Dauerwellenpuffer in 10 ml dH2O.
    15. Zentrifugieren Sie die Platte bei 1.400 × g für 5 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand durch Umfüllen und klopfen Sie die Platte auf saugfähiges Papier.
    16. Fügen Sie 200 μl 1x PW hinzu, gefolgt von einer Zentrifugation bei 1.400 × g für 5 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand durch Umfüllen und klopfen Sie die Platte auf saugfähiges Papier.
    17. Für die intrazelluläre Färbung werden 25 μl intrazellulärer Färbemastermix (anti-humanes Ki-67 mAb) pro Well hinzugefügt. Gut mischen und die Platte 30 Minuten bei 4 °C oder auf Eis im Dunkeln inkubieren.
      Anmerkungen: Um eine intrazelluläre Färbemastermischung für eine einzelne Vertiefung herzustellen, fügen Sie 1 μl Ki-67 mAb zu 24 μl 1x PW hinzu. Der intrazelluläre Färbemarker wird nur bei der Verarbeitung von Zellen ab Tag 16 Co-Kultur verwendet. Die intrazelluläre Färbung erfolgt nicht während der Verarbeitung von PBMCs, naiven Lymphozyten, Monozyten und naiven MoDCs.
    18. Nach der Inkubation werden 200 μl 1x PW in jede Vertiefung gegeben. Mit einer Pipette mischen und 1.400 × g 5 Minuten lang zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand durch Umfüllen und klopfen Sie die Platte auf saugfähiges Papier.
    19. Fügen Sie 200 μl FACS-Puffer hinzu und zentrifugieren Sie anschließend 5 Minuten lang bei 1.400 × g . Entsorgen Sie den Überstand durch Umfüllen und klopfen Sie die Platte auf saugfähiges Papier.
    20. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 200 μl FACS-Puffer und übertragen Sie den Inhalt jeder Vertiefung in separate sterile Durchflusszytometerröhrchen. Verwenden Sie 300 μl FACS-Puffer pro Well, um die verbleibenden Zellen zu sammeln. Die Zellen sind nun bereit für die durchflusszytometrische Analyse.
  2. Ausführen der Probe auf einem Durchflusszytometer
    HINWEIS: Die Proben wurden auf einem Durchflusszytometer (mit 488 nm, 638 nm und 405 nm Lasern) gemäß dem Handbuch des Herstellers durchgeführt35. Weitere Informationen, Fehlerbehebung und Anpassung des Protokolls finden Sie im Handbuch.
    1. Führen Sie routinemäßige Reinigungsverfahren vor und nach dem Lesen der Proben durch.
      Anmerkungen: Überspringen Sie keine Position, während Sie die Röhrchen in das Gerät einlegen.
      1. Verwenden Sie für den Reinigungszyklus insgesamt vier Röhrchen, wobei das erste Röhrchen Fließreinigungsreagenz und die restlichen drei RöhrchendH2Oenthalten. Jedes Röhrchen enthält 3 ml. Erfassen Sie während des Reinigungslaufs ca. 1 Minute lang Daten mit einer mittleren Durchflussrate, indem Sie 100.000 Ereignisse pro Röhre unter 330 V für Vorwärtsstreuung (FSC) gegenüber 265 V für Seitenstreuung (SSC) erfassen.
        Anmerkungen: Während der Reinigung sollten keine Ablagerungen oder zellulären Ereignisse gemeldet werden. Führen Sie in diesem Fall den Reinigungsschritt erneut durch. Stellen Sie beim Ausführen der Proben sicher, dass sich alle Proben vor der Erfassung der Daten in einer homogenen Suspension befinden, da dies eine genaue Messung gewährleistet.
    2. Um das Zytometer anzuschließen und einzuschalten, klicken Sie auf die Anwendungsschaltfläche in der linken Ecke der Titelleiste. Wählen Sie im Dropdown-Menü der Anwendung die Option Zytometrie und klicken Sie auf die Option Einschalten.
      HINWEIS: Im Dropdown-Menü der Anwendung können Benutzer mit der Option " Öffnen" die vorprogrammierten Assays durchsuchen, während mit der Option "Neues Protokoll " neue Protokolle erstellt werden können.
    3. Legen Sie zunächst die Negativkontrollprobe in den Mehrfachröhrchenhalter. Wählen Sie Neues Protokoll und beobachten Sie den Arbeitsvorrat auf der linken Seite des Arbeitsbereichs/Bildschirms.
    4. Definieren Sie im Arbeitsvorrat die Position der Probe im Mehrfachröhrchenhalter und geben Sie der Probe einen Namen und ein Protokoll zur Identifizierung.
    5. Passen Sie im Hardware-Bedienfeld auf der linken Seite des Arbeitsbereichs mehrere Parameter an und wählen Sie sie aus, z. B. die Detektoren (FSC, SSC und 10 Fluoreszenzbereiche), die Spannungen (V) und Verstärkungen der Photomultiplier sowie die Fläche, Höhe und Breite (AHW) des Signals.
      HINWEIS: Die folgenden Einstellungen für die Detektoren wurden je nach verwendetem Experiment und Instrument ausgewählt: FSC-AHW: AHW, V: 270, G: 5; SSC-AHW: A, V: 350, G: 10; FL1 (CD8/FITC Dextran)-AHW: A, V: 400, G: 1; FL2 (CD25/PE)-AHW: A, V: 500, G: 1; FL6 (CD4/Alexa Fluor 647)-AHW: A, V: 700, G: 1; FL7 (Ki-67/Alexa Fluor 700)-AHW: A, V: 625, G: 1; FL9 (L/D)-AHW: A, V: 425, G: 1.
    6. Passen Sie über das Bedienfeld zur Instrumentenerfassung unter der Titelleiste die Optionen für Durchflussrate (mittel), Zeit (5 min) und Ereignisse (siehe Schritt 5.2.8) an, die erkannt werden sollen. Klicken Sie auf die Option Single erfassen, damit das Gerät das Sample zeichnen/ausführen kann und die Echtzeitvorschau der erkannten Ereignisse angezeigt wird.
    7. Passen Sie in der Echtzeitvorschau den Schwellenwert für die Fluoreszenz (Spannung und Verstärkung) und die Zellgröße an, um schließlich Gates um die gewünschte Zellpopulation zu zeichnen und gleichzeitig zelluläre Trümmer auszuschließen.
      HINWEIS: FSC hilft bei der Unterscheidung von Zellen anhand ihrer Größe und ermöglicht so die Unterscheidung zwischen Zellen des Immunsystems wie Monozyten und Lymphozyten. Monozyten sind größer und weisen im Vergleich zu Lymphozyten eine höhere FSC-Intensität auf.
    8. Erfassen Sie insgesamt etwa 5.000 lebende MoDC-, 50.000 lebende Lymphozyten- und 50.000 lebende Monozytenereignisse.
    9. Sobald alle Parameter in Bezug auf die Negativkontrollprobe eingestellt sind, klicken Sie auf Stopp und speichern Sie das Protokoll.
    10. Laden Sie nun alle Proben auf den Mehrrohrlader. Definieren Sie jede Probe im Arbeitsvorrat und wenden Sie die in Bezug auf die Negativkontrolle angepassten Parameter auf alle Proben innerhalb des Experiments an. Klicken Sie auf die Option Erfassen , damit alle Stichproben im Experiment nacheinander ausgeführt werden können.
    11. Sobald die Daten aus allen Proben erfasst sind, speichern Sie sie und wandeln Sie sie mit einer geeigneten Datenanalysesoftware, die die Erstellung sequenzieller biparametrischer und monoparametrischer Histogramme ermöglicht, in lesbare Daten um.

6. Analyse der Expression von Boten-RNA (mRNA)

  1. RNA-Extraktion
    HINWEIS: Extraktion der Gesamt-RNA aus der antigengepulsten MoDC-Lymphozyten-Kokultur (spezifisch), der nicht-antigengepulsten MoDC-Lymphozyten-Kokultur (unspezifisch), der Lymphozytenkultur ohne MoDCs (Kontrolle) und aus naiven Lymphozyten (CD14− -Zellen, die vor der Co-Kultivierung isoliert wurden). Für die RNA-Extraktion wird Ethanol mit RNase-freiem Wasser hergestellt. Weitere Informationen zum Extraktionskit und zu den Reagenzien finden Sie in der Materialtabelle .
    1. 1 ml Zellsuspension von der MoDC-Lymphozyten-Cokulturplatte (~1 × 106 Zellen/ml) mit einer Pipette in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen übertragen und 10 Minuten lang bei 500 × g zentrifugieren.
    2. Speichern Sie den Überstand für ELISA. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml PBS und überführen Sie es in ein 15-ml-Röhrchen. Sammeln Sie alle verbleibenden Zellen mit 1 ml PBS.
    3. 10 min bei 500 × g zentrifugieren.
      Anmerkungen: Alle Proben sollten behutsam wie lebende Zellen behandelt werden, bis die Zelllyse mit dem im Kit enthaltenen Lysepuffer durchgeführt wird. Durch den Zelltod werden RNasen freigesetzt, die die für die nachgeschaltete Quantifizierung benötigten RNA-Templates schnell hydrolysieren. RLT-Puffer lysiert Zellen in einer Lösung, die RNasen hemmt.
    4. Geben Sie 350 μl Lysepuffer in jede leere Vertiefung und inkubieren Sie sie 2-3 Minuten lang, um die adhärenten Zellen zu lysieren, die in den vorherigen Schritten nicht geerntet wurden.
    5. Sobald die Zentrifugation in Schritt 6.1.3 abgeschlossen ist, ist der Überstand zu verwerfen und das Zellpellet mit den 350 μl Lysepuffer zu vermischen, die in Schritt 6.1.4 hinzugefügt wurden.
      HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt ist es möglich, die Röhrchen bei −80 °C zu lagern oder mit der RNA-Extraktion fortzufahren (folgende Schritte).
    6. In Schritt 6.1.5 werden 350 μl 70%iges Ethanol in das Lysat pipetiert. Das Endvolumen pro Probe beträgt 700 μl.
    7. Setzen Sie die Extraktionssäule in ein 2-ml-Sammelröhrchen ein (im Lieferumfang enthalten).
    8. Übertragen Sie die 700 μl Probe pro Extraktionssäule und zentrifugieren Sie 15 s lang bei 10.000 × g . Entsorgen Sie den Durchfluss im Auffangrohr und setzen Sie ihn wieder in die Schleudersäule ein.
    9. Geben Sie in der Extraktionskolonne 350 μl strengen Waschpuffer (im Kit enthalten) hinzu und zentrifugieren Sie 15 s lang bei mehr als 10.000 × g . Verwerfen Sie den Durchfluss.
    10. Geben Sie 80 μl DNase I-Inkubationsmischung pro Probe auf die Membran der Extraktionskolonne und lassen Sie sie 15 Minuten bei 20-30 °C aushärten.
      Anmerkungen: Um eine DNase I-Inkubationsmischung pro Probe herzustellen, fügen Sie 10 μl DNase I-Stammlösung zu 70 μl DNase-Puffer hinzu, um ein Endvolumen von 80 μl zu erhalten. Mischen Sie gründlich, indem Sie das Röhrchen mehrmals umdrehen und anschließend kurz in der Zentrifuge schleudern.
    11. Waschen Sie die Extraktionssäule mit 350 μl strengem Waschpuffer und zentrifugieren Sie anschließend 15 Minuten lang bei 10.000 × g . Entsorgen Sie den Durchfluss nach dem Zentrifugieren im Sammelröhrchen.
    12. Waschen Sie die Extraktionssäule 2x mit jeweils 500 μl Feinwaschpuffer und zentrifugieren Sie bei 10.000 × g für 15 s und ein zweites Mal für 2 min. Verwerfen Sie den Durchfluss nach jeder Zentrifugation.
    13. Zentrifugieren Sie die Säule 1 Minute lang bei maximaler Geschwindigkeit, um die Membran zu trocknen, und entsorgen Sie das Sammelröhrchen.
    14. Setzen Sie die Extraktionssäule in ein neues 1,5-ml-Sammelröhrchen ein.
    15. Pipettieren Sie 50 μl RNase-freies Wasser auf die Säulenmembran und inkubieren Sie es 3-5 Minuten lang bei Raumtemperatur.
      HINWEIS: Bei RNA-Konzentrationen unter 100 ng ist das Elutionsvolumen auf 30 μl zu reduzieren und die Extraktionssäulenmembran mit dem Produkt aus der ersten Elution erneut zu eluieren, um das Endprodukt zu konzentrieren.
    16. Zentrifugieren Sie 1 Minute lang bei 10.000 × g , um die RNA zu eluieren.
    17. Messen Sie die RNA-Konzentration, indem Sie die Absorption bei 260 nm mit 0,5-2 μl Probe nachweisen. Stellen Sie die endgültige RNA-Konzentration mit RNase-freiem Wasser auf 0,1-1 μg/μl ein.
    18. Lagern Sie die RNA-Aliquots für die spätere Verwendung bei −80 °C.
  2. Synthese komplementärer DNA
    1. Synthetisieren Sie komplementäre DNA (cDNA) aus extrahierter Template-RNA gemäß dem Protokoll des Herstellers, das mit dem Kit geliefert wird (Einzelheiten finden Sie in der Materialtabelle ).
      HINWEIS: Eine Zusammenfassung der Reagenzien und der verwendeten Volumina ist in Tabelle 1 und Tabelle 2 dargestellt. Ein vollständiges Protokoll ist in der Zusatzdatei 1 aufgeführt.
  3. Quantitative Polymerase-Kettenreaktion in Echtzeit
    1. Für die qPCR werden die cDNA-Proben in dreifacher Ausführung durchgeführt. Quantifizierung der bovinen mRNA-Transkriptspiegel für Ki-67 und IFN-γ unter Verwendung spezifischer Primer-Sets in Bezug auf das GAPDH-Gen , wie in Tabelle 3 dargestellt.
      HINWEIS: Ein vollständiges Protokoll finden Sie in der Zusatzdatei 1.

7. Enzyme-linked immunosorbent assay

  1. Die gesammelten Kulturüberstände, die reich an sekretorischen Proteinen sind, werden für die Quantifizierung von IFN-γ mittels ELISA aufbereitet.
    Anmerkungen: Einzelheiten zur Verwendung des Kits finden Sie in der Materialtabelle . Ein vollständiges Protokoll ist in der Zusatzdatei 1 aufgeführt.

8. Statistische Analyse

  1. Analysieren Sie die Daten und erstellen Sie grafische Illustrationen der Versuchsplanung mit kommerzieller Software. Verwenden Sie für die vergleichende Analyse einen ungepaarten nichtparametrischen Test. Betrachten Sie P-Werte < 0,05 als statistisch signifikant.

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Representative Results

Diese Methodik beschreibt die In-vitro-Generierung von Rinder-MoDCs für die Evaluierung von Impfkandidatenantigenen vor der Durchführung von In-vivo-Studien. Abbildung 1 veranschaulicht das experimentelle Schema der bovinen MoDC-Generierung und die Anwendung der MoDCs für den In-vitro-Assay. Mit Hilfe der magnetischen Zellsortiertechnik war es möglich, etwa 26 Millionen CD14+-Myozyten aus den geernteten PBMCs zu gewinnen, die zuvor aus 50 ml Rinderblut isoliert wurden. Die eluierte Zellfraktion frei von CD14+ Monozyten war reich an Lymphozyten und wurde als Quelle für naive CD4+ und CD8+ T-Zellen (CD14− Lymphozytenzellfraktion) verwendet.

Die naive Monozytenfraktion bestand zu 98 % aus CD14+ Monozytenzellen, wie nach CD14-Zellfärbung und Durchflusszytometrie beobachtet wurde (Abbildung 2A,B). Die gereinigten naiven Monozytenzellen differenzierten sich bei einer Kultivierung in Gegenwart des 3%igen Zytokincocktails (GM-CSF und IL-4) mit anschließender Inkubation von 5 Tagen zu einem DC-ähnlichen Phänotyp. Aus einer Ausgangskultur von 26 Millionen CD14+ Monozyten konnten nach 5 Tagen Inkubation insgesamt ca. 12 Millionen MoDCs gewonnen werden. Die naiven MoDCs waren funktionell in der Lage, Antigene aufzunehmen, wie bei der durchflusszytometrischen Analyse von FITC-Dextran beobachtet wurde (Abbildung 3). Darüber hinaus wurden die naiven MoDCs phänotypisch charakterisiert, indem die Expression von MHC-Klasse-II- und co-stimulatorischen CD86- und CD40-Zelloberflächenmarkern untersucht wurde, was den DC-ähnlichen Phänotyp validierte (Abbildung 4).

Die antigengepulste Stimulation naiver MoDCs wurde erreicht, indem diese 2 Tage lang in Gegenwart von inaktiviertem RV kultiviert wurden. Die Aktivierung naiver Lymphozyten (der CD14− -Zellfraktion) erfolgte durch antigengepulste MoDC-Lymphozyten-Co-Kultivierung mit anschließender Supplementierung von IL-2. Während der MoDC-Lymphozyten-Kokultur an Tag 9 wurde eine morphologische Veränderung in den RV-gepulsten MoDCs beobachtet, da sie eine Dendritenausdehnung zeigten, was ein Merkmal der MoDC-Reifung ist (Abbildung 5). An Tag 14 wurde die Aktivierung der Lymphozyten durch die Restimulation der Kokultur durch die Zugabe von neu produzierten RV-gepulsten MoDCs desselben Tieres verstärkt.

Im Vergleich zur nicht-gepulsten MoDC-Lymphozyten-Kokultur konnte eine signifikante Zunahme (p < 0,01) der Lymphozytenproliferation durch die Hochregulation der Ki-67- und CD25-Aktivierungsmarker sowohl auf den CD4+- als auch auf den CD8+-T-Zellen an Tag 16 in der gepulsten MoDC-Lymphozyten-Kokultur nachgewiesen werden (Abbildung 6). Die CD8+ T-Zellen aus den reifen RV-gepulsten MoDC-Kokulturen zeigten eine achtfache Hochregulation (p < 0,01) von Ki-67 im Vergleich zur unspezifischen Gruppe (Abbildung 7A). Die CD4+ T-Zellen in der gleichen Co-Kultur zeigten einen siebenfachen Anstieg (p < 0,01) in Ki-67 im Vergleich zu Kontrollen (Abbildung 7B). Dies demonstriert die Fähigkeit von RV-geprimten MoDCs, das RV-Antigen erfolgreich naiven Lymphozyten zu präsentieren und sie anschließend in einem In-vitro-Zustand zu aktivieren, ähnlich wie es in einem lebenden Tier der Fall ist. Neben der Analyse der Zellen mittels Durchflusszytometrie wurden die Kokulturen auch einer qPCR und einem ELISA unterzogen, um die RV-spezifische Lymphozytenaktivierung mittels RNA-Transkription (Ki-67 und IFN-γ) bzw. extrazellulärer Sekretion (IFN-γ) zu quantifizieren (Abbildung 8). Diese zusätzlichen Nachweismethoden können auch als Bestätigungstests verwendet werden, um die Ergebnisse der Durchflusszytometrie weiter zu validieren. Die mittels qPCR nachgewiesene RNA-Expression für Ki-67 und IFN-γ und die mittels ELISA nachgewiesenen IFN-γ-Spiegel zeigten ähnliche Anstiegsmuster, was auf eine Lymphozytenproliferation hinweist, in der antigenspezifischen Kokultur im Vergleich zur unspezifischen Behandlungsgruppe. Daher korrelierten die qPCR- und ELISA-Ergebnisse mit den Ergebnissen der Durchflusszytometrie. Die qPCR zeigte einen Anstieg der IFN-γ-Expression um >30 % und einen Anstieg der Ki-67-Expression um >5 % in allen Kokulturen, die GAPDH als Kalibrator verwendeten (Abbildung 8A,B). Eine signifikant höhere Konzentration an sezerniertem IFN-γ (**p > 0,01) wurde mittels ELISA unter Verwendung von Kulturüberständen aus der RV-gepulsten MoDC-Lymphozyten-Kokultur gemessen als in der unspezifischen Behandlungsgruppe (Abbildung 8C).

Figure 1
Abbildung 1: Experimentelles Design des bovinen MoDC-basierten In-vitro-Assays. (A) Ernte und Zellsortierung der CD14+-Monozyten- und CD14−-Lymphozytenzellfraktionen aus bovinen PBMCs. Rinderblut wird durch Dichtegradientenzentrifugation zur Gewinnung von PBMCs verarbeitet, gefolgt von einer magnetischen Zellsortierung mit Hilfe von immunmagnetischen Zelltrennsäulen und der anschließenden Kultivierung der geernteten CD14+-naiven Monozytenzellfraktion in supplementiertem RPMI 1640-Medium. (B) Die Herstellung von MoDCs unter Verwendung eines 3%igen Zytokincocktails (GM-CSF + IL-4) mit 5 Tagen Inkubation und MoDC-Lymphozyten-Kokultur. An Tag 0 werden die Monozyten in Gegenwart des Zytokincocktails kultiviert und 48 h inkubiert, um die Differenzierung zu induzieren. An Tag 2 wird die Kultur mit dem gleichen Zytokincocktail restimuliert, gefolgt von einer Inkubation für 72 h, was zur Produktion naiver MoDCs führt. An Tag 5 wird das Impfantigen (Tollwutimpfstoff) in die naive MoDC-Zellkultur gegeben, gefolgt von einer 48-stündigen Inkubation. An Tag 7 erfolgt die Co-Kultivierung von antigengepulsten MoDCs mit naiven Lymphozyten (die CD14−-Zellfraktion), gefolgt von der Inkubation. An Tag 9 wird IL-2 der Co-Kultur hinzugefügt. An Tag 14 erfolgt die Anreicherung/Restimulation der aktivierten/geprimten Lymphozyten durch Zugabe von antigengepulsten MoDCs, gefolgt von einer Inkubation für 48 h. Schließlich werden an Tag 16 die Zellen und der Kulturüberstand für den Lymphozytenproliferationstest entnommen. Abkürzungen: MODCs = bovine Monozyten-abgeleitete dendritische Zellen; PBMCs = mononukleäre Zellen des peripheren Blutes; GM-CSF = Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Morphologie und Reinheit von bovinen CD14+ -Monozyten, die aus PBMCs mit anti-CD14-konjugierten Mikrokügelchen gewonnen wurden. (A) Morphologie von bovinen Monozyten, die 4 h bei 37 °C in einem kompletten Nährmedium zur Entfernung von Mikrokügelchen inkubiert, auf polylysinbeschichteten Objektträgern fixiert und mit modifizierter Giemsa-Färbung gefärbt wurden. Maßstabsbalken = 50 μm. (B) Durchflusszytometrisches Histogramm mit der eluierten CD14+ -Zellfraktion mit einem Reinheitsgrad von 98,6 %, beobachtet unter Verwendung eines Anti-CD14-Antikörpers (rot) und eines FITC-konjugierten IgG1-Isotyp-Kontrollantikörpers der Maus (grün). Abkürzungen: PBMCs = periphere mononukleäre Blutzellen; FITC cont = Fluorescein-Isothiocyanat-Kontrolle. Diese Abbildung wurde von Kangethe et al., 201811 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Endozytäre Aktivität von bovinen MoDCs, die in vitro generiert wurden. Durchflusszytometrisches Histogramm, das die Aufnahme des Tracermoleküls (FITC-dextran) nach Tag 5 naiver MoDCs zeigt. MoDCs inkubierten bei 37 °C für 60 min mit dem Tracermolekül (blau) und MoDCs inkubierten auf Eis mit dem Tracermolekül (grau) als Hintergrundkontrolle. Abkürzungen: MODCs = bovine Monozyten-abgeleitete dendritische Zellen; FITC = Fluorescein-Isothiocyanat. Diese Abbildung wurde von Kangethe et al., 201811 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Phänotypisierung von in vitro generierten bovinen MoDC-spezifischen Zelloberflächenmarkern. Durchflusszytometrische Histogramme für (A) Gating-Strategien von MoDCs und für (B) Tag 5 naive MoDCs, die mit drei verschiedenen DC-spezifischen mAbs (blau) gefärbt wurden, einschließlich der folgenden: Anti-Schaf-MHC II mAb, Anti-bovines CD86 mAb und Anti-bovines CD40 mAb. Alle verglichen mit den entsprechenden Isotyp-Kontrollen (rot). Abkürzungen: DC = dendritische Zellen; MODCs = von Rindermonozyten abgeleitete DCs; MHC II = Haupthistokompatibilitätskomplex II. Diese Abbildung wurde von Kangethe et al., 201811 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Zeichen der Reifung von in vitro produzierten MoDCs während der MoDC-Lymphozyten-Kokultur. Beobachtung der charakteristischen erweiterten dendritischen Struktur durch antigengepulste MoDCs mit inverser Mikroskopie an Tag 9 der MoDC-Lymphozyten-Kokultur. (A) Reife MoDCs innerhalb eines hochgradig konfluierenden Bereichs von kokultivierten Lymphozyten. (B) Reife MoDCs sind in einem Gebiet mit weniger Lymphozyten in Kokultur leicht zu unterscheiden. Maßstabsbalken = 50 μm. Abkürzung: MODCs = bovine moncyte-derived dendritic cells. Diese Abbildung wurde von Kangethe et al., 201811 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 6
Abbildung 6: Sequentielle Gating-Strategie für Punktdiagramme gegen die Expression von Ki-67 und CD25 durch Lymphozyten in der Kokultur von MoDC-Lymphozyten. (A) Die vollständige Gating-Strategie für Zellen, die ab Tag 16 MoDC-Lymphozyten-Kokultur geerntet wurden. (B) Die Ki-67-Expression von CD4+-gesteuerten Lymphozyten und (C) von CD8+-Lymphozyten im Vergleich zur FMO-Kontrolle (ohne mAb) und zur IgG1-k-Isotyp-Kontroll-mAb der FMO-Kontrolle (ohne mAb). Die CD25-Expression auf gated (D) CD8+ und (E) CD4+ Lymphozyten im Vergleich zu Maus IgG1 Isotyp-Kontroll-mAb. Die Behandlungsgruppe repräsentiert spezifisch Lymphozyten, die mit RV-gepulsten MoDCs kokultiviert wurden, während die Kontrollgruppe Lymphozyten repräsentiert, die in Abwesenheit von MoDCs kultiviert wurden. Abkürzungen: MODCs = bovine Monozyten-abgeleitete dendritische Zellen; FMO = fluoreszierend minus eins; RV = Tollwutimpfstoff. Diese Abbildung wurde von Kangethe et al., 201811 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 7
Abbildung 7: Durchflusszytometrische Datenanalyse der Ki-67- und CD25-Expression durch CD4+- und CD8+-Lymphozyten nach Priming mit dem Antigen. Ki-67- und CD25-Expression ab Tag 16 Co-Kultur. Die Behandlungsgruppe (spezifisch) ist definiert als Lymphozyten, die mit RV-gepulsten MoDCs kultiviert wurden; die unspezifische Gruppe entspricht Lymphozyten, die mit nicht-antigengepulsten MoDCs kultiviert wurden; die Kontrollgruppe entspricht Lymphozyten, die ohne MoDCs kultiviert wurden. Die horizontalen Balken stellen den Mittelwert von sechs technischen Repliken dar. (A) Intrazelluläre Expression des Ki-67-Markers durch CD8 T-Zellen und (B) durch CD4 T-Zellen. (C) Zelloberflächenexpression des CD25-Markers durch CD8 T-Zellen und (D) durch CD4 T-Zellen. Abkürzungen: MODCs = bovine Monozyten-abgeleitete dendritische Zellen; RV = Tollwutimpfstoff. Diese Abbildung wurde von Kangethe et al., 201811 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 8
Abbildung 8: Aktivierung des Th1-Markers (IFN-γ und Ki-67) durch MoDCs, die mit dem Tollwutvirus-Antigen geprimt wurden, nachgewiesen durch qPCR und ELISA. Daten von einem Tier mit sechs technischen Replikaten. Die horizontalen Balken stellen den Mittelwert dar. Drei PCR-Replikate zeigten Faltungsveränderungen im Vergleich zu naiven Lymphozyten nach Normalisierung mit einem GAPDH-Referenzgen . (A) IFN-γ-Ausdruck , (B) Ki-67-Ausdruck . (C) Vergleich der IFN-γ Sekretion im Kulturüberstand zwischen drei Behandlungsgruppen, wie sie mittels ELISA nachgewiesen wurden. Die spezifische Gruppe ist definiert als Lymphozyten, die mit RV-gepulsten MoDCs kultiviert wurden; die unspezifische Gruppe entspricht Lymphozyten, die mit nicht-antigengepulsten MoDCs kultiviert wurden; die Kontrollgruppe entspricht Lymphozyten, die ohne MoDCs kultiviert wurden. Abkürzungen: MODCs = bovine Monozyten-abgeleitete dendritische Zellen; RV = Tollwutimpfstoff. Diese Abbildung wurde von Kangethe et al., 201811 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Reagenzien Endkonzentration Volumen pro Reaktion
dNTPs-Mix (10 mM) 1.000 μM 1 μL
Random Hexamer Primer (50 ng/μl) 25 μM 1 μL
RNA-Vorlage 0,1 – 1 μg/μl χ μL (nach Bedarf)
RNAse-freies Wasser - χ μL (nach Bedarf)
Endgültiges Reaktionsvolumen - 10 μL

Tabelle 1: Zusammensetzung des Mastermixes (RNA-Primer-Mix).

Reagenzien Endkonzentration Volumen pro Reaktion
RT-Puffer 10x 1x 2 μL
MgCl2 25 mM 5 mM 4 μL
DVB-T 0,1 M 10 mM 2 μL
RNASE-Inhibitor 40 U/μL 2 HE 1 μL

Tabelle 2: Der 2x PCR-Reaktionsmix. Abkürzungen: RT = reverse transkriptase; DTT = Dithiothreitol.

Zytokin Spezies Zugangsnummer Reihenfolge Länge Tm
IFN-γ Bos taurus FJ263670 F- GTGGGCCTCTCTTCTCAGAA 234 80.5
R- GATCATCCACCGGAATTTGA
Ki-67 Bos taurus XM_015460791.2 F-AAGATTCCAGCGCCCATTCA 148 86.5
R-TGAGGAACGAACACGACTGG
GAPDH Bos taurus Sassu et al., 2020 F-CCTGGAGAAACCTGCCAAGT 214 85.5
R-GCCAAATTCATTGTCGTACCA

Tabelle 3: Primer-Sets für die Amplifikation50.

Reagenzien Endkonzentration Volumen pro Reaktion
Supermix 1x 5 μL
Vorwärts-Primer (5 μM) 250/ 125 nM 1 μL
Reverse Primer (5 μM) 250/ 125 nM 1 μL
cDNA 1:10 verdünnt 1,25 ng 2 μL
Nuklease-freies Wasser - 1 μL
Endgültiges Reaktionsvolumen - 10 μL

Tabelle 4: qPCR-Mastermix

Tube Nr. Konzentration von Standard Serielle Verdünnung
1 50 ng/ml 50 μL Standard + 350 μL Waschpuffer
2 12,5 ng/ml 150 μL aus Röhrchen 1 + 450 μL Waschpuffer
3 6,25 ng/ml 250 μL aus Röhrchen 2 + 250 μL Waschpuffer
4 3,13 ng/ml 250 μL aus Röhrchen 3 + 250 μL Waschpuffer
5 1,56 ng/ml 250 μL aus Röhrchen 4 + 250 μL Waschpuffer
6 0,78 ng/ml 250 μL aus Röhrchen 5 + 250 μL Waschpuffer
7 0,2 ng/ml 150 μL aus Röhrchen 6 + 450 μL Waschpuffer
8 0,1 ng/ml 250 μL aus Röhrchen 7 + 250 μL Waschpuffer
9 0,025 ng/ml 100 μL aus Röhrchen 8 + 300 μL Waschpuffer

Tabelle 5: IFN-γ Standard-Verdünnungsreihe

Ergänzendes Dossier 1: Protokolle für die Synthese komplementärer DNA, quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) in Echtzeit und ELISA-Assay (Enzyme-linked Immunosorbent Assay). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S1: Die Antigenaufnahmefähigkeit von MoDCs mit unterschiedlichen Konzentrationen des Zytokincocktails und mit 3 oder 5 Tagen Kultur. Unterschiedliche Konzentrationen (5 % w/v und 3 % w/v) des Zytokincocktails, der GM-CSF und IL-4 enthält, wurden entweder mit 3 oder 5 Tagen Kultur getestet, um die beste Kombination zur Erzeugung von Hochleistungs-Antigenaufnahme-MoDCs (unter Verwendung des Tracermoleküls FITC-dextran) zu ermitteln. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S2: CD4- und CD8-Priming mit Diptherie-Toxoid (DT) und Blauzungenvirus-Serotyp 4 (BTV). Die Expression von Ki-67 durch CD8-Zellen nach Pulsieren mit (A) DT und (C) BTV und die Expression von Ki-67 durch CD4-Zellen nach Pulsieren mit (B) DT und (D) BVT an Tag 16. Es wurden Vergleiche mit Kulturen durchgeführt, die mit DT und BVT (spezifisch), (C,D) mit CD40L gepulst wurden, sowie mit unspezifischen Priming- und Kontrollbehandlungen. Die horizontalen Balken geben den Mittelwert an. *p < 0,05, **p < 0,01 nach einem Mann-Whitney-Test. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Diese Studie demonstriert eine standardisierte In-vitro-Methode zur Generierung und Phänotypisierung von bovinen MoDCs und deren anschließende Verwendung zur Messung der Immunogenität eines kommerziellen Impfstoffs (z. B. RV). Rinder-MoDCs können als Werkzeug für das Screening potenzieller Impfantigene gegen Rinderkrankheiten und die Vorhersage ihrer potenziellen klinischen Auswirkungen auf der Grundlage von Immunreaktionen verwendet werden, bevor mit In-vivo-Tierversuchen fortgefahren wird. Die generierten MoDCs wurden anhand ihrer morphologischen, phänotypischen und funktionellen Eigenschaften identifiziert. Wir konnten zeigen, dass die MoDCs, die von CD14+ -Monozyten beim Rind stammen, Merkmale aufwiesen, die in DCs zu finden sind, wie z.B. ausgedehnte Dendriten, die Expression von Zelloberflächenmarkern für die Antigenpräsentation wie MHC II, die Expression von co-stimulatorischen Molekülen auf MoDCs wie CD40 und CD86, endozytäre Aktivität und die Fähigkeit, naive Lymphozyten zu aktivieren.

Die in diesem Experiment verwendeten Zellkulturmedien (DMEM und RPMI) werden häufig für die Zelldifferenzierung und -kultivierung verwendet, wobei RPMI häufiger für die Monozytendifferenzierung eingesetzt wird36. Die RPMI-Supplementierung mit FBS oder HS (Pferdeserum) hat keinen Einfluss auf die Monozytendifferenzierung37. Die rekombinante Supplementierung mit GM-CSF und IL-4 führt zu einer entzündlichen Erkrankung, die die Differenzierung von Monozyten auslöst und routinemäßig für die Produktion von funktionell lebensfähigen MoDCs verwendet wird, die in der Lage sind, Antigene aufzunehmen und Immunzellen zu präsentieren38,39. In dieser Studie induzierte RPMI 1640 Medium ergänzt mit 10 % FBS (Komplettkulturmedium), 1 % Penicillin-Streptomycin und der Zugabe eines kommerziell erhältlichen Zytokincocktails (GM-CSF plus IL-4) die Differenzierung von Rindermonozyten, was zur Produktion lebensfähiger MoDCs führte. Wenn die generierten MoDCs mit RV inkubiert wurden, bevor sie mit naiven Lymphozyten kokultiviert wurden, induzierten sie eine T-Zell-abhängige Immunantwort, die spezifisch gegen RV ist, was beweist, dass reife MoDCs RV-Antigene adäquat an Lymphozyten präsentieren können, die noch nie mit RV in Berührung gekommen sind. Dies ist ein entscheidendes Merkmal der adaptiven Immunität, das wir nun im Labor nachbilden können.

Wir beobachteten, dass eine höhere Konzentration des Zytokincocktails (5%) in Verbindung mit einer längeren Inkubationszeit (5 Tage) MoDCs mit geringerer endozytärer Fähigkeit zur Antigenaufnahme produzierte als diejenigen, die mit einer niedrigeren Konzentration von Zytokincocktail (3%) bei gleicher Inkubationszeit (5 Tage) behandelt wurden, wie in der ergänzenden Abbildung S1 dargestellt. Daraus schließen wir, dass eine niedrigere Konzentration des Zytokincocktails (z.B. 3%) mit 5 Tagen Inkubation optimal ist, um funktionell potente MoDCs zu produzieren. Zelloberflächenmarker wie MHC II, CD40 und CD86 sind auf APCs vorhanden, und ihre Hochregulation deutet auf eine funktionelle Zellaktivierung hin40,41,4 2. Wir zeigten eine erhöhte Expression von MHC II, CD40 und CD86 nach Monozytendifferenzierung in naive MoDCs mit Hilfe des Zytokincocktails (Abbildung 4).

Die Optimierung des Verhältnisses von naiven Lymphozyten und MoDCs in einem Kultursystem ist ein Schlüsselfaktor, der das Ergebnis des MoDC-Assays beeinflusst, wobei unterschiedliche MoDC-zu-Lymphozyten-Verhältnisse unterschiedliche Lymphozytenantworten induzieren43. Nachdem wir jedoch ein Verhältnis von MoDC zu Lymphozyten von 1:10-1:40 ausgewertet hatten, stellten wir fest, dass eine Erhöhung der Konzentration von MoDCs die Lymphozytenaktivierung nicht erhöhte, und wir einigten uns schließlich auf ein optimales Verhältnis von 1:20, das den zuvor berichteten Studienähnelt 44,45. Es ist zu beachten, dass die eluierte naive Lymphozytenfraktion unspezifisch aktivierte T-Zellen enthalten kann; Daher ist es zwingend erforderlich, eine Kontrollgruppe zu haben, die nur einer naiven Lymphozytenkultur entspricht.

Aktivierte CD4+ und CD8+ T-Zellen exprimieren spezifische Marker und sezernieren eine Vielzahl von Zytokinen, deren Quantifizierung auf eine Immunaktivierung hinweist. Die intrazelluläre Expression von Ki-67, einem gut charakterisierten Immunaktivierungsmarker, war in dieser MoDC-Lymphozyten-Kokultur hochreguliert29,46. In ähnlicher Weise deutete in dieser Studie die verstärkte IFN-γ-Sekretion durch Lymphozyten auf eine Th1-Antwort gegen das RV-Antigen hin30,31,47. Die IL-2-Expression durch CD4+ T-Zellen ist ebenfalls ein guter Marker für die Visualisierung der T-Zell-Aktivierung. Seine Inkorporation an Tag 9 der MoDC-Lymphozyten-Kokultur machte es jedoch zu einem ungeeigneten Ziel für die Messung der Lymphozytenproliferation für diese Studie48. Die Hochregulation von CD25 in Gegenwart von IL-2 konnte bereits gezeigt werden, dass sie das Priming sowohl von CD4+ als auch von CD8+ T-Zellen bestimmt und wurde in dieser Studie verwendet, um das Priming naiver Lymphozyten durch RV-gepulste MoDCs zu messen28.

Zytotoxische CD8-T-Zellen sind wichtige Effektorzellen gegen intrazelluläre Impfantigene oder virale Krankheitserreger49. Durch die Messung von Lymphozytenaktivierungsmarkern (Ki-67 und CD25) und der Zytokinexpression (IFN-γ) fanden wir heraus, dass die antigenbeladenen MoDCs eine signifikante (p < 0,01) Aktivierung sowohl der CD8- als auch der CD4-T-Zellantworten aufwiesen, wobei die CD8-Antwort und die Th1-Polarisation gegen das RV-Antigen häufiger waren. Ein wichtiger Faktor, der bei der Entwicklung eines MoDC-Assays für adjuvante konjugierte Impfstoffe berücksichtigt werden muss, sind adjuvant-induzierte Lymphozytenantworten. Wir empfehlen die Verwendung einer Kontrollgruppe (Adjuvans-Kontrolle), die nur aus Adjuvans besteht, um Hintergrundsignale zu eliminieren. Dieser Aufbau kann auch verwendet werden, um die Wirkung verschiedener Adjuvantien zu messen, die die Lymphozytenantwort auf ein niedrigimmunogenes Antigen verstärken können, was für den Schutz während In-vivo-Studien entscheidend ist.

Es gibt einige Einschränkungen in dieser Studie, die wir hervorheben möchten. Die experimentellen Daten für jeden Assay wurden von einem einzelnen Tier mit sechs technischen Replikaten abgeleitet. Eine größere Anzahl biologischer Replikate wäre von Vorteil, um Fehler zu minimieren und eine verbesserte statistische Zuverlässigkeit und Ergebnisse mit höherer Genauigkeit zu erzielen. Nichtsdestotrotz wurde dieser Assay in einer früheren Veröffentlichung11 auch mit einem Diptherie-Toxoid (ergänzende Abbildung S2A,B) und einem kommerziellen Impfstoff gegen das Blauzungenvirus-Serotyp 4 (ergänzende Abbildung S2C,D) mit drei bzw. zwei biologischen Tieren getestet und validiert. Darüber hinaus würde der Vergleich der Ergebnisse aus dieser In-vitro-Studie mit einer In-vivo-Studie dazu beitragen, die Authentizität dieses Immuntests zusätzlich zu validieren, was wiederum den Prozess der Implementierung dieses In-vitro-MoDC-Tests als Routinetest in der Impfstoffproduktion und Qualitätskontrolle beschleunigen würde. Schließlich wurde die Expression von CD14 in MoDCs nicht untersucht, da die Literatur in Bezug auf diesen Aspekt inkonsistent ist, insbesondere beim Vergleich von MoDCs verschiedener Tierarten.

Zusammenfassend berichten wir über einen in vitro bovinen MoDC-Assay, der zur Messung der impfstoffinduzierten Immunogenität verwendet werden kann. Dieser MoDC-Assay kann auch mit verschiedenen Methoden ausgewertet werden, darunter Durchflusszytometrie, ELISA und qPCR. Mehrere Methoden zur Bewertung von Aktivierungsmarkern sind in Bereichen mit begrenzten Ressourcen, in denen ein Durchflusszytometer möglicherweise nicht ohne weiteres verfügbar ist, von entscheidender Bedeutung. Dieser Test kann von nationalen Veterinärlabors, die große Chargen von Rinderimpfstoffen herstellen, als Qualitätskontrollschritt einbezogen werden. Darüber hinaus kann es verwendet werden, um potenzielle Impfantigene bei der Entwicklung neuer Rinderimpfstoffe zu identifizieren und sogar auszuwählen, welches Adjuvans vor einem Tierversuch verwendet werden soll. All diese Faktoren werden zu einem ethischeren und erschwinglicheren Ansatz für die Entwicklung und Verwendung von Rinderimpfstoffen beitragen.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Acknowledgments

Wir danken Dr. Eveline Wodak und Dr. Angelika Loistch (AGES) für ihre Unterstützung bei der Bestimmung des Gesundheitszustands der Tiere und für die Bereitstellung von BTV, Dr. Bernhard Reinelt für die Bereitstellung von Rinderblut und Dr. Bharani Settypalli und Dr. William Dundon von der IAEO für nützliche Ratschläge zu den Real-Time-PCR-Experimenten bzw. zur Sprachbearbeitung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACK Lysing Buffer Gibco, Thermo Fisher A1049201 Ammonium-Chloride-Potassium buffer for lysis of residual RBCs in harvested PBMC Fraction
BD Vacutainer Heparin Tubes Becton, Dickinson (BD) and Company 366480 10 mL, additive sodium heparin 158 USP units, glass tube, 16 x 100 mm size
Bovine Dendritic Cell Growth Kit Bio-Rad, UK PBP015KZZ Cytokine cocktail composed of recombinant bovine IL-4 and GM-CSF
Bovine IFN-γ ELISA Kit Bio-Rad MCA5638KZZ Kit use for measuring IFN-γ expression in culture supernatant
CD14 Antibody Bio-Rad MCA2678F Mouse anti-bovine CD14 monoclonal antibody, clone CC-G33, isotype IgG1
CD25 Antibody Bio-Rad MCA2430PE Mouse anti bovine CD25 monoclonal antibody, clone IL-A11, isotype IgG1
CD4 Antibody Bio-Rad MCA1653A647 Mouse anti bovine CD4 monoclonal antibody, clone CC8, isotype IgG2a
CD40 Antibody Bio-Rad MCA2431F Mouse anti-bovine CD40 monoclonal antibody, clone IL-A156, isotype IgG1
CD8 Antibody Bio-Rad MCA837F Mouse anti bovine CD8 monoclonal antibody, clone CC63, isotype IgG2a
CD86 Antibody Bio-Rad MCA2437PE Mouse anti-bovine CD86 monoclonal antibody, clone IL-A190, isotype IgG1
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System Bio-Rad - Thermal cycler PCR machine
Corning Centrifuge Tube Falcon Corning  352096 & 352070 15 mL and 50 mL, high-clarity poypropylene conical bottom, graduated, sterial, seal screw cap, falcon tube
Cytofix/Cytoperm Plus BD Bio Sciences 555028 Fixation/permeabilization kit with BD golgiPlug, use for flow cytometer cell staining
Ethanol Sigma Aldrich 1009832500 Absolute for analysis EMSURE ACS,ISO, Reag. Ph Eur
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco, Thermo Fisher 10500064 Qualified, heat inactivated
Ficoll Plaque PLUS GE Health care Life Sciences, USA 341691 Lymphocyte-isolation medium
FlowClean Cleaning Agent Beckman Coulter, Life Sciences A64669 500 mL
FlowJo FlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, USA - Flow cytometer Histogram software
FlowTubes/ FACS  (Fluorescence-activated single-cell sorting) Tube Falcon Corning  352235 5 mL, sterial, round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap, use in flow cytometry analysis
Fluoresceinisothiocynat-Dextran Sigma Aldrich, Germany 60842-46-8 FITC-dextran MW
Gallios Flow Cytometer Beckman Coulter - Flow cytometer machine
Hard-Shell 96-Well PCR Plates Bio-Rad HSP9601 96 well, low profile, thin wall, skirted, white/clear
Human CD14 MicroBeads Miltenyi Bioteck, Germany 130-050-201 2 mL microbeads conjugated to monoclonal anti-human CD14 antibody isotype IgG2a, used for selection of bovine monocytes from PBMCs
Kaluza Beckman Coulter, Germany - Flow cytometer multicolor data analysis software
MACS Column Miltenyi Bioteck, Germany 130-042-401 Magnetic activated cell sorting or immune magentic cell separation colum for separation of various CD14 cell population based on cell surface antigens
MHC Class II DQ DR Polymorphic Antibody Bio-Rad MCA2228F Mouse anti-sheep MHC Class II DQ DR Polymorphic:FITC, clone 49.1, isotype IgG2a, cross reactive with bovine
Microcentrifuge Tube Sigma Aldrich HS4325 1.5 mL, conical bottom, graduated, sterial tube
Microsoft Power Point Microsoft - The graphical illustrations of experimental design
Mouse IgG1 Negative Control:FITC for CD14, CD40 Antibody Bio-Rad MCA928F Isotype control CD14 and CD40 monoclonal antibody 
Mouse IgG1 Negative Control:PE for CD86 Antibody Bio-Rad MCA928PE Isotype control CD86 monoclonal antibody 
Mouse IgG1 Negative Control:RPE for CD25 Antibody Bio-Rad MCA928PE Isotype control CD25 monoclonal antibody 
Mouse IgG2a Negative Control:FITC for MHC Class II Antibody Bio-Rad MCA929F Isotype control for MHC class II monoclonal antibody 
Nobivac Rabies MSD Animal Health, UK - 1 µL/mL of cell cultured inactivated vaccine containing > 2 I.U./mL Rabies virus strain
Optical seals Bi0-Rad TCS0803 0.2 mL flat PCR tube 8-cap strips, optical, ultraclear, compatible for qPCR machine
Penicillin-Streptomycin Gibco, Thermo Fisher 15140122 100 mL
Phosphate Buffer Saline (PBS) Gibco, Thermo Fisher 10010023 pH 7.4, 1x concentration
Prism - GraphPad 5 Software  Dotmatics - Statistical software
Purified Anti-human Ki-67 antibody Biolegend, USA 350501 Monoclonal antibody, cross reactive with cow, clone ki-67
Purified Mouse IgG1 k Isotype Ctrl Antibody Biolegend 400101 Isotype control for Ki-67 monoclonal antibody
READIDROP Propidium Iodide BD Bio Sciences 1351101 Live/dead cell marker used for flow cytometry, amine reactive dye
Recombinant Human IL-2 Protein R&D System, USA 202-IL-010/CF Interleukin-2, 20 ng/ml
RNeasy Mini Kit Qiagen 74106 Kit use for extraction of total RNA; RLT buffer = lysis buffer; RW1 buffer = stringent guanidine-containing washing buffer; RDD buffer = DNase buffer; RPE buffer = mild wash buffer; RNaseOUT = RNase inhibitor.
RPMI 1640 Medium Sigma Aldrich R8758 Cell culture media with L-glutamine and sodium bicarbonate
SMART-servier medical art  Les Laboratories Servier - Licensed under a creative commons attribution 3.0 unported license
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 172-5270 2x qPCR mix conatins dNTPs, Ss07d fusion polymerase, MgCl2, SYBR Green I supermix = supermix, ROX normalization dyes.
SuperScript III First-Strand Synthesis System Invitrogen, Thermo Fisher 18080051 Kit for cDNA synthsis
Tissue Culture Test plate 24 TPP, Switzerland 92024 24 well plate, sterilized by radiation , growth enhanced treated, volume 3.18 mL
Trypan Blue Solution Gibco, Thermo Fisher 15250061 0.4%, 100 mL, dye to assess cell viability
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Invitrogen, Thermo Fisher 10977023 0.1 µm membrane filtered distilled water
VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes Thermo Fisher Scientific 15206067 VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes have a green top and contain spray-dried lithium, sodium or ammonium heparin on the inner walls and are usedin clinical chemistry, immunology and serology. The anticoagulant heparin activates antithrombin, which blocks the clotting cascade and thus produces a whole blood/plasma sample.
Water Sigma Aldrich W3500-1L Sterile-filtered, bioReagent suitable for cell culture

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Leerer Wert Heft 195
Bestimmung der Immunogenität von Impfstoffen anhand von dendritischen Zellen aus Rindermonozyten
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Liaqat, F., Kangethe, R. T.,… More

Liaqat, F., Kangethe, R. T., Pichler, R., Liu, B., Huber, J., Wijewardana, V., Cattoli, G., Porfiri, L. Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (195), e64874, doi:10.3791/64874 (2023).

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