Immunology and Infection

Détermination de l’immunogénicité du vaccin à l’aide de cellules dendritiques dérivées de monocytes bovins

Published: May 19, 2023 doi: 10.3791/64874

Fatima Liaqat¹, Richard Thiga Kangethe¹, Rudolf Pichler¹, Bo Liu¹, Johann Huber², Viskam Wijewardana¹, Giovanni Cattoli¹, Luca Porfiri¹

¹Animal Production and Health Section, Joint Food and Agriculture Organization (FAO)/International Atomic Energy Agency (IAEA) Centre of Nuclear Techniques in Food and Agriculture, International Atomic Energy Agency, ²Teaching and Research Farm Kremesberg, Clinical Unit for Herd Health Management in Ruminants, Department for Farm Animals and Veterinary Public Health, University of Veterinary Medicine, Vienna

Summary

La méthodologie décrit la génération de cellules dendritiques dérivées de monocytes bovins (MoDC) et leur application pour l’évaluation in vitro de candidats antigéniques au cours du développement de vaccins vétérinaires potentiels chez les bovins.

Abstract

Les cellules dendritiques (CD) sont les cellules présentatrices d’antigènes (APC) les plus puissantes du système immunitaire. Ils patrouillent l’organisme à la recherche d’agents pathogènes et jouent un rôle unique au sein du système immunitaire en reliant les réponses immunitaires innées et adaptatives. Ces cellules peuvent phagocyter puis présenter des antigènes capturés aux cellules immunitaires effectrices, déclenchant une gamme variée de réponses immunitaires. Cet article démontre une méthode normalisée pour la génération in vitro de cellules dendritiques dérivées de monocytes bovins (MoDC) isolées à partir de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) de bovins et leur application dans l’évaluation de l’immunogénicité du vaccin.

Le tri cellulaire magnétique a été utilisé pour isoler les monocytes CD14+ des PBMC, et la supplémentation d’un milieu de culture complet avec de l’interleukine (IL)-4 et du facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF) a été utilisée pour induire la différenciation des monocytes CD14⁺ en MoDC naïfs. La génération de MoDC immatures a été confirmée par la détection de l’expression des marqueurs de surface cellulaire du complexe majeur d’histocompatibilité II (MHC II), CD86 et CD40. Un vaccin antirabique disponible dans le commerce a été utilisé pour pulser les MoDC immatures, qui ont ensuite été co-cultivés avec des lymphocytes naïfs.

L’analyse par cytométrie en flux des MoDC pulsés d’antigènes et de la co-culture lymphocytaire a révélé la stimulation de la prolifération des lymphocytes T par l’expression de marqueurs Ki-67, CD25, CD4 et CD8. L’analyse de l’expression de l’ARNm de l’IFN-γ et du Ki-67, en utilisant la PCR quantitative, a montré que les MoDC pouvaient induire l’amorçage spécifique de l’antigène des lymphocytes dans ce système de co-culture in vitro . De plus, la sécrétion d’IFN-γ évaluée à l’aide d’ELISA a montré un titre significativement plus élevé (**p < 0,01) dans la co-culture MoDC-lymphocytes pulsée par le vaccin antirabique que dans la co-culture MoDC-lymphocytes non pulsée antigénique. Ces résultats montrent la validité de ce test MoDC in vitro pour mesurer l’immunogénicité du vaccin, ce qui signifie que ce test peut être utilisé pour identifier les candidats vaccins potentiels pour les bovins avant de procéder aux essais in vivo , ainsi que dans les évaluations de l’immunogénicité des vaccins commerciaux.

Introduction

La vaccination vétérinaire représente un aspect crucial de l’élevage et de la santé animale, car elle contribue à améliorer la sécurité alimentaire et le bien-être animal en conférant une protection contre les maladies qui affectent le secteur de l’élevage à l’échelle mondiale¹. Une méthode in vitro efficace pour évaluer l’immunogénicité d’éventuels candidats vaccins contribuerait à accélérer le processus de développement et de production de vaccins. Il est donc nécessaire d’élargir le champ des tests immunitaires avec des méthodologies innovantes basées sur des études in vitro , car cela contribuerait à dévoiler la complexité des processus immunitaires liés à l’immunisation et à l’infection pathogène. À l’heure actuelle, on utilise l’immunisation in vivo des animaux et les études de provocation, qui nécessitent un échantillonnage périodique (p. ex. sang et rate), pour mesurer l’immunogénicité des vaccins et adjuvants candidats. Ces tests sont coûteux, prennent beaucoup de temps et ont des implications éthiques, car dans la plupart des cas, l’euthanasie animale est effectuée à la fin des essais.

Comme alternative aux essais in vivo, les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) ont été utilisées pour évaluer les réponses immunitaires induites par le vaccin in vitro². Les PBMC sont une population hétérogène de cellules composée de 70 % à 90 % de lymphocytes, de 10 à 20 % de monocytes et d’un nombre limité de cellules dendritiques (DC, 1 % à 2 %)³. Les PBMC hébergent des cellules présentatrices d’antigènes (APC) telles que les cellules B, les monocytes et les DC, qui patrouillent constamment l’organisme à la recherche de signes d’infection ou de lésions tissulaires. Les chimiokines sécrétées localement facilitent le recrutement et l’activation des APC sur ces sites en se liant aux récepteurs de surface cellulaire. Dans le cas des monocytes, les chimiokines dirigent leur destin pour se différencier en DC ou en macrophages⁴. Dès que les DC rencontrent et capturent un agent pathogène, ils migrent vers les organes lymphoïdes secondaires, où ils peuvent présenter les antigènes peptidiques pathogènes traités à l’aide de protéines de surface de classe I ou de classe II du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) aux lymphocytes T CD8+ ou aux lymphocytes T CD4⁺, respectivement, déclenchant ainsi une réponse immunitaire ^5,6.

Le rôle clé joué par les CD dans l’orchestration d’une réponse immunitaire protectrice contre divers agents pathogènes en fait une cible de recherche intéressante pour comprendre les mécanismes immunitaires intracellulaires, en particulier lors de la conception de vaccins et d’adjuvants contre les agents infectieux⁷. Étant donné que la fraction de DC pouvant être obtenue à partir des PBMC est plutôt faible (1% -2%), les monocytes ont plutôt été utilisés pour générer des DC in vitro⁸. Ces DC dérivés de monocytes (MoDC) ont été initialement développés comme stratégie de traitement possible en immunothérapie du cancer⁹. Plus récemment, les MoDC ont été utilisés pour la recherche sur les vaccins 10,11,12^, et les monocytes classiques sont le sous-type prédominant (89%) pour la production de MoDC ¹³. La production de MoDCs in vitro a déjà été réalisée par l’ajout de facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF) administré en association avec d’autres cytokines telles que l’interleukine-4 (IL-4), le facteur de nécrose tumorale α (TNF-α) ou l’IL-13^14,15,16.

Le succès d’un essai de DC in vitro repose sur la capacité des MoDC matures stimulés par l’antigène à moduler l’étendue et le type de réponse immunitaire spécifique au type d’antigène détecté¹⁷. Le type d’agent pathogène reconnu et présenté par les DC détermine la différenciation des lymphocytes T auxiliaires (Th) CD4⁺ en cellules effectrices Th1, Th2 ou Th17 et est caractérisé par un profil de cytokines sécrétoires spécifique à l’agent pathogène. Une réponse Th1 est provoquée contre les agents pathogènes intracellulaires et entraîne la sécrétion d’interféron gamma (IFN-γ) et de facteur de nécrose tumorale bêta (TNF-β), qui module la protection phagocytaire-dépendante. Une réponse Th2 est déclenchée contre les organismes parasites et est caractérisée par la sécrétion d’IL-4, IL-5, IL-10 et IL-13, qui initie une protection humorale indépendante des phagocytes . Th17 offre une protection dépendante des neutrophiles contre les infections bactériennes et fongiques extracellulaires médiées par la sécrétion d’IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 et TNF-α 18,19,20,21. Sur la base d’études antérieures, il a été noté que tous les agents pathogènes ne correspondent pas au profil cytokinique attendu. Par exemple, les MoDC dermiques, en réponse à une infection parasitaire à Leishmania, stimulent la sécrétion d’IFN-γ par les lymphocytes T CD4+ et les lymphocytes T CD8⁺, induisant ainsi une réponse pro-inflammatoire protectrice en Th1²².

Il a également été démontré que, chez les poulets, les MoDCs amorcés avec Salmonella lipopolysaccharide (LPS), peuvent induire une réponse variable contre Salmonella typhimurium en activant à la fois les réponses Th1 et Th2, tandis que Salmonella gallinarum induit une réponse Th2 seule, ce qui pourrait expliquer la résistance plus élevée de cette dernière à la clairance MoDC²³. L’activation des DC contre Brucella canis (B. canis) a également été rapportée dans les MoDC canins et humains, ce qui signifie que cela pourrait représenter un mécanisme d’infection zoonotique²⁴. Les MoDC humains amorcés avec B. canis induisent une forte réponse Th1 qui confère une résistance à une infection grave, tandis que les MoDC canins induisent une réponse Th17 dominante avec une réponse Th1 réduite, conduisant par la suite à l’établissement d’une infection chronique²⁵. Les DCD bovins présentent une affinité accrue pour le virus aphteux (FMDV) conjugué à l’immunoglobuline G (IgG) par rapport au virus de la fièvre aphteuse non conjugué seul, car les MoDC forment un complexe viral-anticorps en réponse aux¹⁰ premiers. Prises ensemble, ces études montrent comment les DC ont été utilisés pour analyser la complexité des réponses immunitaires au cours d’une infection pathogène. Les réponses immunitaires adaptatives peuvent être évaluées par la quantification de marqueurs spécifiques associés à la prolifération des lymphocytes. La Ki-67, une protéine intracellulaire détectée uniquement dans les cellules en division, est considérée comme un marqueur fiable pour les études de prolifération²⁶, et de même, CD25 exprimé à la surface des lymphocytes T au cours de la phase tardive d’activation correspond à la prolifération lymphocytaire^27,28.

Cette étude démontre une méthode standardisée pour la génération in vitro de MD bovins suivie de leur application dans un essai immunitaire in vitro utilisé pour tester l’immunogénicité des vaccins. Un vaccin antirabique (RV) disponible dans le commerce a été utilisé pour valider l’efficacité de ce test. L’activation et la prolifération des lymphocytes T ont été mesurées par cytométrie en flux, réaction en chaîne quantitative par polymérase en temps réel (qPCR) et dosage immuno-enzymatique (ELISA) grâce à l’analyse de marqueurs d’activation cellulaire bien établis tels que Ki-67 et CD25 et la sécrétion d’IFN-γ 28,29,30,31. Aucun essai expérimental animal ou humain n’est effectué au cours du test MoDC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

La collecte de sang est effectuée par un service vétérinaire certifié conformément aux directives éthiques de l’Agence autrichienne pour la santé et la sécurité alimentaire (AGES) et conformément aux normes acceptées en matière de bien-être animal³². L’étude a reçu l’approbation éthique du ministère autrichien de l’Agriculture. La conception expérimentale de la génération de DCMO et son application ultérieure sont illustrées à la figure 1.

1. Production de DC naïfs

REMARQUE : Des échantillons de sang total ont été prélevés à partir d’un seul veau exempt d’agents pathogènes par ponction de la veine jugulaire avec des vacutainers héparinisés (huit tubes de sang de 9 mL ont été utilisés pour cette étude). Transportez le sang dans une glacière. Conservez les échantillons à 2-4 °C pour une utilisation ultérieure ou traitez-les immédiatement. Gardez le sang en rotation pour éviter la coagulation du sang. Stériliser les vacutainers avec de l’éthanol à 70%. Toutes les expériences suivantes ont été réalisées avec un échantillon biologique et six réplications techniques.

Centrifugation à gradient de densité pour isoler les PBMC du sang hépariné
1. Mélangez bien le sang en l’inversant 10x.
2. À l’aide d’une pipette de 10 mL, transférer 20 mL de sang hépariné dans un tube stérile de 50 mL et le diluer avec 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
3. Pipeter 15 mL de milieu d’isolement lymphocytaire dans un tube stérile de 50 mL.
  REMARQUE : Laisser le milieu isolant les lymphocytes atteindre la température ambiante avant le pipetage.
4. Incliner le tube de 50 mL contenant le milieu d’isolement lymphocytaire à une position de 45°. Pointez l’extrémité d’une pipette de 25 mL perpendiculairement et déposez soigneusement les 30 mL de PBS sanguin sur le milieu d’isolement des lymphocytes, sans mélanger les deux. Très lentement, ramenez le tube de 50 ml en position verticale.
5. Centrifuger à 800 × g pendant 35 min à 20 °C avec accélération maximale et sans freinage (fonction de décélération désactivée).
6. Utilisez une pipette Pasteur pour recueillir la couche PBMC (la fine couche blanche juste après la première couche de plasma) et transférez-la dans un nouveau tube de 50 mL.
  REMARQUE: La centrifugation par gradient de densité sépare le sang total en différentes couches. En conséquence, les érythrocytes se déposent au fond sous forme de pastille, les cellules mononucléaires (PBMC) se déposent dans la couche d’interface et le plasma forme la couche supérieure. Les granulocytes se trouvent entre la pastille et la couche PBMC.
7. Lavez les PBMC récoltés 2x en ajoutant du PBS jusqu’à un volume de 40 ml et en mélangeant soigneusement en pipetant de haut en bas. Ensuite, centrifuger à 500 × g à 4 °C pendant 7 min avec une accélération maximale et une décélération maximale.
8. Jeter le surnageant par décantation, remettre en suspension la pastille dans 15 mL de 1x tampon de chlorure d’ammonium-potassium (ACK) et incuber à température ambiante pendant 10-15 min.
  NOTE: Ne pas incuber pendant plus de 15 min. Le tampon ACK disponible dans le commerce est utilisé pour assurer la lyse des globules rouges résiduels (GR) présents dans la fraction PBMC.
9. Ajouter du PBS jusqu’à un volume de 40 mL, puis centrifuger à 500 × g et 4 °C pendant 7 min avec une accélération et une décélération maximales.
10. Jeter le surnageant par décantation et répéter l’étape 1.1.9.
11. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 10 mL de milieu de culture complet (à température ambiante).
  NOTE: Le milieu de culture complet est composé du milieu de culture cellulaire RPMI 1640 complété par 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline-streptomycine.
Séparation magnétique des cellules CD14^+/⁻ de la population PBMC à l’aide de billes magnétiques conjuguées CD14
1. Compter les cellules avec un compteur de cellules d’hémocytomètre propre en utilisant 10 μL de suspension cellulaire mélangée à 10 μL de solution de bleu de trypan (0,4%).
  REMARQUE: Le colorant bleu trypan est un produit chimique toxique et potentiellement cancérigène. Il doit être manipulé en portant un équipement de protection individuelle (EPI) pour éviter tout contact, et les déchets doivent être jetés dans un contenant de déchets toxiques spécialisé hermétique. Les cellules mortes apparaîtront en bleu, tandis que les cellules vivantes apparaîtront claires au microscope.
2. Centrifuger pendant 7 min à 500 × g.
3. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette et remettre la pastille en suspension dans un tampon de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) en utilisant un volume de 40 μL pour 1 × 10⁷ cellules. Bien mélanger à l’aide d’une pipette.
  REMARQUE : Le tampon FACS est composé de 2 % de FBS et de 2 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) dissous dans du PBS.
4. Ajouter 5 μL de tampon de microbilles CD14 par 1 × 10 à 7 cellules, et bien mélanger^à l’aide d’une pipette.
5. Incuber pendant 30 min à 4-8 °C pour la sélection positive des monocytes CD14⁺ bovins³³. Vortex toutes les 15 minutes pendant la période d’incubation.
6. Étape facultative (pour l’analyse par cytométrie en flux) : Ajouter 10 μL d’anticorps colorant CD14-FITC (isothiocyanate de fluorescéine) avec incubation ultérieure pendant 15 min à 4-8 °C. Reportez-vous à l’analyse de cytométrie en flux à l’étape 5 pour plus de détails.
7. Ajouter 1 mL de tampon FACS et centrifuger pendant 7 min à 500 × g.
8. Jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 500 μL de tampon FACS par 1 × 10⁸ cellules.
9. Insérez la colonne de séparation des cellules immunomagnétiques dans le séparateur (porte-colonne magnétique) et placez un tube de collecte de 15 mL sous la sortie de la colonne pour recueillir le flux.
10. Laver la colonne avec 1 mL de tampon FACS dégazé. Après le rinçage, remplacez le tube usagé de 15 ml par un nouveau.
11. Laisser passer la suspension cellulaire (à partir de l’étape 1.2.8) à travers la colonne en pipetant 1 × 10⁸ cellules dans 500 μL de tampon à la fois.
  REMARQUE: Faites attention à ne pas générer de bulles d’air lors du mélange des cellules avant de les laisser traverser la colonne.
12. Rincer la colonne 3x avec 3 mL de tampon FACS dégazé à chaque fois.
13. Recueillir l’écoulement continu et étiqueter cette première fraction éluée comme fraction cellulaire CD14⁻ (PBMC moins monocytes CD14⁺ ); C’est ce qu’on appelle aussi la fraction lymphocytaire naïve.
  REMARQUE : Les cellules CD14⁻ sont maintenues dans un milieu de culture complet jusqu’à ce que des MoDC pulsés d’antigène soient produits.
14. Retirez la colonne du séparateur.
15. Placer un nouveau tube stérile de 15 mL sous la colonne pour la collecte de l’effluent.
16. Pipeter 5 mL de tampon FACS dans la colonne et la pousser immédiatement à l’aide d’un piston.
17. Recueillir l’écoulement continu et étiqueter cette deuxième fraction éluée comme fraction de cellule CD14⁺ ; C’est ce qu’on appelle aussi la fraction monocytaire naïve.
18. Ajouter un milieu de culture complet aux monocytes CD14⁺ récoltés pour obtenir 1 × 10⁶ cellules/mL.
  REMARQUE : Compter les cellules vivantes dans la fraction cellulaire CD14⁺ éluée pour estimer le volume de milieu de culture complet nécessaire pour atteindre le nombre de cellules désiré.
19. Prenez une plaque stérile de 24 puits et ajoutez 1 mL de la suspension cellulaire (1 × 10⁶ cellules/mL) à chaque puits.
Différenciation des monocytes naïfs CD14⁺ en MoDC naïfs par addition d’un cocktail de cytokines à 3% p/v (GM-CSF + IL-4) avec un total de 5 jours d’incubation
1. Complétez chaque puits contenant des monocytes CD14⁺ avec 40 μL (3% p/v) du cocktail de cytokines fourni dans la trousse.
2. Incuber la plaque dans un incubateur humidifié avec 5% de CO₂ et à 37 °C pendant 48 h.
3. Le jour 2, transférer la moitié du contenu de chaque puits (500 μL) à l’aide d’une pipette dans des tubes individuels de 1,5 mL et centrifuger à 500 × g à 4 °C pendant 7 min.
4. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 500 μL de milieu de culture complet frais.
5. Transfère 500 μL de cette suspension cellulaire de l’étape 1.3.4 à chaque puits désigné de sorte que le volume final soit de 1 mL.
6. Enrichir chaque puits avec 20 μL de cocktail de cytokines.
7. Incuber la culture pendant 72 h dans un incubateur humidifié à 5% de CO₂ et à 37 °C.
8. Après l’incubation du jour 5, retirez la plaque de l’incubateur.
  REMARQUE : Chaque puits contiendra 1 mL d’une suspension cellulaire de MoDC naïfs. Le nombre de MoDC sera un pourcentage (~20%) des monocytes originaux plaqués (1 × 10⁶/mL).

2. Essai de l’activité endocytaire MoDC

REMARQUE : Le test d’absorption d’antigène ou le test d’activité endocytaire mesure la capacité des DC naïfs à internaliser des matières étrangères. Effectuer le dosage en utilisant des MoDC naïfs cultivés avec un cocktail de cytokines à 3% p/v et avec 5 jours d’incubation, comme décrit précédemment³⁴.

Prélever la suspension cellulaire MoDC naïve de la plaque de 24 puits et la transférer dans un tube de 15 mL; recueillir également les cellules résiduelles en rinçant les puits avec du PBS.
Centrifuger pendant 500 × g pendant 7 min. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 1 mL de milieu de culture additionné de FBS à 1 %.
Compter les cellules MoDC vivantes pour estimer le volume de milieu nécessaire pour atteindre le nombre de cellules souhaité (2 × 10⁵ cellules/mL).
Culture des MoDC naïfs dans 100 μL de milieu de culture complet dans une plaque de 24 puits avec une concentration cellulaire finale de 2 × 10⁵ cellules/mL.
Compléter chaque puits avec 1 mg/mL de dextrane conjugué FITC (sonde fluorescente utilisée comme traceur d’endocytose).
REMARQUE: Le FITC-dextran agit comme une sonde fluorescente et est utilisé comme traceur d’endocytose.
Couvrir la plaque, et incuber à l’obscurité à 5% de CO₂ et 37 °C pendant 60 min.
NOTE: Pour le contrôle de fond, incuber les cellules MoDC supplémentaires (2 × 10⁵ cellules / mL) avec 1 mg / mL FITC-dextran sur de la glace, car ce type d’incubation empêche l’entrée de la molécule traceuse (FITC-dextran) dans les cellules.
Après l’incubation, transférer immédiatement la plaque de 24 puits sur de la glace pour arrêter l’endocytose de FITC-dextran.
Lavez les cellules avec un tampon FACS glacé.
Récolter, centrifuger et remettre en suspension la pastille dans 500 μL de tampon FACS.
Analyser l’intensité de fluorescence du FITC-dextran dans les cellules à l’aide de la cytométrie en flux. Reportez-vous à l’analyse de cytométrie en flux à l’étape 5.2 pour plus de détails.

3. Génération de MoDC pulsés d’antigènes

REMARQUE : Un vaccin disponible dans le commerce et cliniquement approuvé contre le virus de la rage (RV) peut induire la différenciation des DC naïfs en MD présentant un antigène mature. Utiliser 0,1 % (~1 μL) d’une seule dose de vaccin antirotavirus pour générer des MoDC pulsés d’antigène. En outre, il est préférable de produire des MoDC pulsés RV dans la même plaque de culture utilisée (à l’étape 1.3.8) pour générer des MoDC naïfs, car le transfert des MoDC naïfs dans une nouvelle plaque de 24 puits les affectera négativement.

À partir de l’étape 1.3.8), Ajouter 1 μL/mL de suspension de RV à 1 mL de culture de DC naïf dans la plaque de 24 puits, et incuber pendant 48 h à 5 % de CO₂ et 37 °C.
REMARQUE: Les MoDC naïfs cultivés sans stimulation RV sont utilisés comme contrôle de fond (et comme stimulation non spécifique pour la co-culture avec des lymphocytes dans les étapes suivantes).
Après l’incubation, le jour 7, conserver la plaque de 24 puits contenant les MoDC pulsés d’antigène sur la glace pendant 10 minutes.
Ajouter 1 mL de PBS glacé par puits. Bien mélanger chaque puits par pipetage et transférer la suspension dans un tube de 15 mL.
Lavez les puits avec 2 ml de PBS glacé pour recueillir les cellules résiduelles laissées dans chaque puits.
Transférer le contenu dans leurs tubes respectifs et centrifuger la suspension cellulaire à 500 × g pendant 7 min.
Jeter le surnageant, remettre en suspension la pastille cellulaire (MoDC pulsés d’antigène) dans un milieu de culture complet et ajuster le volume à une concentration cellulaire finale de 1 × 10⁵ cellules/mL.
REMARQUE: Comptez les cellules vivantes pour estimer le volume de milieu nécessaire pour atteindre le nombre de cellules souhaité. Utilisez des MoDC pulsés RV à partir du jour 7 pour le système de co-culture MoDC-lymphocyte.

4. Co-culture MoDC-lymphocytes

REMARQUE: Le système de co-culture MoDC-lymphocytes in vitro détermine la capacité des MoDCs à amorcer les lymphocytes spécifiques de l’antigène. Les différents groupes de traitement de cellules après 16 jours de co-culture comprennent des cellules spécifiques, non spécifiques et témoins. Le groupe spécifique est défini comme des lymphocytes co-cultivés avec des MoDC pulsés RV; le groupe non spécifique est défini comme des lymphocytes co-cultivés avec des MoDC non pulsés par antigène; et le groupe témoin est défini comme des lymphocytes cultivés sans MoDC.

Ajouter un milieu de culture complet à la fraction lymphocytaire naïve éluée (cellules CD14⁻ ) pour atteindre une concentration cellulaire de 2 × 10⁶ cellules/mL.
REMARQUE : Compter les cellules vivantes de la culture cellulaire CD14⁻ qui ont été maintenues dans un milieu de culture complet dans une plaque de 24 puits depuis leur collecte afin d’estimer le volume de milieu nécessaire pour atteindre le nombre de cellules souhaité.
Le jour 7, prendre une plaque stérile de 24 puits et ensemencer les puits avec 1 mL de suspension de cellules lymphocytaires naïves (2 × 10⁶ cellules/mL) plus 1 mL de suspension de MoDC pulsée ou non pulsée d’antigène (1 × 10⁵ cellules/mL).
NOTE: Le volume total dans chaque puits sera de 2 mL avec un rapport de 1:20 MoDCs par lymphocytes par puits.
Incuber la plaque pendant 48 h à 37 °C et 5% de CO₂.
Enrichissement et restimulation de la culture avec des MoDC pulsés d’antigènes
1. Après l’incubation de la co-culture MoDC-lymphocytes pulsée antigène, le jour 9, compléter chaque puits avec 20 ng/mL d’IL-2 recombinante et continuer à incuber pendant encore 120 h (5 jours d’incubation).
2. Le jour 14, transférer 1 mL de la coculture dans un tube stérile de 1,5 mL et centrifuger à 500 × g pendant 7 min.
3. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire avec 1 mL de MoDC pulsés ou non pulsés par antigène (1 × 10⁵ cellules/mL). Mélanger doucement par pipetage et transférer les suspensions cellulaires vers leurs puits désignés.
  REMARQUE : À cette étape, le volume total dans chaque puits est de 2 mL.
4. Poursuivre l’incubation à 5 % de CO₂ et 37 °C pendant 48 h. Après l’incubation du jour 16, la co-culture est prête pour l’analyse par cytométrie de flux, qPCR et ELISA.
  REMARQUE: Pour chaque 2 mL dans chaque puits de la co-culture lymphocytaire MoDC, 1 mL de cellules remises en suspension est coloré pour la cytométrie en flux, 1 mL est utilisé pour l’extraction de l’ARN et les surnageants des deux sont utilisés pour ELISA.

5. Analyse cytométrique en flux

REMARQUE : Colorer les cellules avec les marqueurs appropriés/mAb avant d’exécuter les échantillons sur un cytomètre en flux. Reportez-vous au tableau des matériaux pour plus de détails sur les réactifs (témoins de coloration de l’AcM et des isotypes), la trousse, l’instrument et le logiciel utilisés pour l’analyse de cytométrie en flux.

Protocole de coloration du cytomètre en flux
REMARQUE : Effectuer une coloration de la surface cellulaire pour les PBMC et les lymphocytes et monocytes naïfs à l’aide d’anticorps monoclonaux anti-CD14 (étape 1.2.6). Pour la coloration de la surface cellulaire des MoDC naïfs, utilisez un AcM anti-CD86-spécifique, anti-CD40-spécifique et anti-MHC II-spécifique. Pour la coloration de la surface cellulaire des cellules à partir des co-cultures du jour 16, utilisez des mAbs anti-CD4, anti-CD8, anti-CD25; pour la coloration intracellulaire, utilisez un anticorps monoclonal anti-Ki-67. De plus, colorer les cellules soit avec un isotype négatif contrôle mAb, soit sans mAb (FMO: fluorescent moins un). La principale différence lors de la coloration pour les marqueurs de surface et intracellulaires est que pour les marqueurs de surface cellulaire, les cellules doivent être colorées avec un AcM de surface spécifique avant la coloration vivante / morte (L / D) ou tout autre processus. Cependant, la coloration intracellulaire est effectuée après la coloration L / D et nécessite une étape de fixation plus perméabilisation pour permettre la pénétration intracellulaire.
1. Transvaser 1 mL de suspension cellulaire dans un tube stérile de 1,5 mL à l’aide d’une pipette et centrifuger pendant 10 min à 500 × g.
  REMARQUE: Après la centrifugation, lors du traitement des cellules de la co-culture MoDC-lymphocyte, conservez le surnageant pour l’analyse ELISA.
2. Remettez la pastille en suspension dans 1 mL de PBS et transférez-la dans un tube de 15 mL. Recueillir les cellules résiduelles à l’aide de 1 mL de PBS et les combiner avec la pastille remise en suspension.
3. Ajouter 10 mL de PBS dans le tube de 15 mL contenant les cellules, mélanger par pipetage et centrifuger pendant 7 min à 850 x g.
4. Jetez le surnageant et répétez l’étape 5.1.3.
5. Jeter le surnageant et remettre délicatement en suspension la pastille de la cellule avec la suspension résiduelle (environ 180 μL) laissée après la décantation du surnageant.
6. Transférer la suspension cellulaire sur une plaque à fond en V de 96 puits et sceller les puits pour éviter les déversements.
7. Centrifuger la plaque à 1 400 × g pendant 5 min. Après la centrifugation, passez la plaque sur un récipient à déchets pour vider les puits de liquide et tapotez la plaque sur du papier absorbant pour assurer l’élimination de l’excès de liquide.
8. Ajouter 25 μL de mélange principal de coloration de surface par puits et mélanger doucement à l’aide d’une pipette, puis incuber à 4 °C pendant 30 min.
  REMARQUE : Pour préparer le mélange principal de coloration de surface pour un seul puits, ajouter 2,5 μL d’AcM de surface à 20 μL de tampon FACS.
9. Ajouter 200 μL de tampon FACS par puits, et centrifuger à 1 400 × g pendant 5 min. Après la centrifugation, videz les puits de liquide par décantation et tapotez la plaque sur du papier absorbant pour éliminer l’excès de liquide.
10. Ajouter 100 μL de solution de coloration L/D par puits. Bien mélanger à l’aide d’une pipette, puis procéder à une incubation à 4 °C pendant 15 min dans l’obscurité.
  REMARQUE : Pour un seul puits, dissoudre 0,25 μL de colorant L/D dans 100 μL de tampon FACS. Le colorant L/D aide à distinguer les cellules vivantes des cellules mortes.
11. Ajouter 100 μL de tampon FACS. Couvrir les puits avec le couvercle et centrifuger la plaque pendant 1 400 × g pendant 5 min. Jeter le surnageant par décantation et tapoter la plaque sur du papier absorbant.
12. Répétez l’étape 5.1.11.
13. Ajouter 50 μL de solution de fixation par puits (fournie avec le kit), et mélanger à la pipette avant d’incuber la plaque à température ambiante dans l’obscurité pendant 10 min.
14. Ajouter 150 μL du tampon de perméabilisation-lavage (PW) 1x fourni avec le kit et couvrir les puits avec le couvercle.
  REMARQUE : Pour préparer 10 mL de 1x tampon PW, diluer 1 mL de tampon permanent 10x dans 10 mL de_dH2O.
15. Centrifuger la plaque à 1 400 × g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant par décantation et tapoter la plaque sur du papier absorbant.
16. Ajouter 200 μL de 1x PW, puis centrifuger à 1 400 × g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant par décantation et tapoter la plaque sur du papier absorbant.
17. Pour la coloration intracellulaire, ajouter 25 μL de mélange maître de coloration intracellulaire (anticorps monoclonaux Ki-67 anti-humain) par puits. Bien mélanger et incuber l’assiette pendant 30 min à 4 °C ou sur de la glace dans l’obscurité.
  REMARQUE : Pour préparer le mélange principal de coloration intracellulaire pour un seul puits, ajouter 1 μL de Ki-67 mAb à 24 μL de 1x PW. Le marqueur de coloration intracellulaire n’est utilisé que lors du traitement des cellules à partir de la co-culture du jour 16. La coloration intracellulaire n’est pas effectuée lors du traitement des PBMC, des lymphocytes naïfs, des monocytes et des MoDC naïfs.
18. Après l’incubation, ajouter 200 μL de 1x PW à chaque puits. Mélanger à l’aide d’une pipette et centrifuger pendant 1 400 × g pendant 5 min. Jeter le surnageant par décantation et tapoter la plaque sur du papier absorbant.
19. Ajouter 200 μL de tampon FACS, puis centrifuger à 1 400 × g pendant 5 min. Jetez le surnageant par décantation et tapotez-le sur du papier absorbant.
20. Resuspendre la pastille cellulaire dans 200 μL de tampon FACS et transférer le contenu de chaque puits dans des tubes de cytomètre à flux stériles séparés. Utilisez 300 μL de tampon FACS par puits pour recueillir les cellules résiduelles. Les cellules sont maintenant prêtes pour l’analyse par cytométrie en flux.
Exécution de l’échantillon sur un cytomètre en flux
REMARQUE: Les échantillons ont été exécutés sur un cytomètre en flux (à l’aide de lasers de 488 nm, 638 nm et 405 nm) conformément au manuel du fabricant.³⁵. Reportez-vous au manuel pour plus de détails, le dépannage et la personnalisation du protocole.
1. Effectuer des procédures de nettoyage de routine avant et après la lecture des échantillons.
  REMARQUE: Ne sautez pas une position pendant le chargement des tubes dans l’instrument.
  1. Pour le cycle de nettoyage, utiliser un total de quatre tubes, le premier contenant un réactif de nettoyage en flux et les trois autres contenant du dH₂O; chaque tube aura 3 mL. Pendant le cycle de nettoyage, acquérir des données avec un débit moyen pendant environ 1 min en capturant 100 000 événements par tube sous 330 V pour la diffusion vers l’avant (FSC) contre 265 V pour la diffusion latérale (SSC).
    REMARQUE : Aucun débris ou événement cellulaire ne doit être signalé pendant le nettoyage; Si cela se produit, effectuez à nouveau l’étape de nettoyage. Pour exécuter les échantillons, assurez-vous que tous les échantillons sont dans une suspension homogène avant d’acquérir les données, car cela garantit une lecture précise.
2. Pour connecter et allumer le cytomètre, cliquez sur le bouton Application situé dans le coin gauche de la barre de titre. Dans le menu déroulant de l’application, sélectionnez l’option Cytométrie et cliquez sur l’option Allumer.
  REMARQUE: Dans le menu déroulant de l’application, l’option Ouvrir permet aux utilisateurs de parcourir les tests préprogrammés, tandis que l’option Nouveau protocole permet aux utilisateurs de créer de nouveaux protocoles.
3. Chargez d’abord l’échantillon témoin négatif dans le support multitube. Sélectionnez Nouveau protocole et observez la liste de travail sur le côté gauche de l’espace de travail/écran.
4. Sur la liste de travail, définissez la position de l’échantillon dans le support multitube et donnez un nom à l’échantillon et au protocole d’identification.
5. À partir du panneau Matériel situé sur le côté gauche de l’espace de travail, réglez et sélectionnez plusieurs paramètres tels que les détecteurs (FSC, SSC et 10 plages de fluorescence), les tensions (V ) et les gains des photomultiplicateurs, ainsi que la surface-hauteur-largeur (AHW) du signal.
  NOTE: Les réglages suivants pour les détecteurs ont été sélectionnés en fonction de l’expérience et de l’instrument utilisé: FSC-AHW: AHW, V: 270, G: 5; SSC-AHW: A, V: 350, G: 10; FL1 (CD8/FITC Dextran)-AHW: A, V: 400, G: 1; FL2 (CD25/PE)-AHW: A, V: 500, G: 1; FL6 (CD4/Alexa Fluor 647)-AHW: A, V: 700, G: 1; FL7 (Ki-67/Alexa Fluor 700)-AHW: A, V: 625, G: 1; FL9 (L/D)-AHW: A, V: 425, G: 1.
6. À partir du panneau de commande d’acquisition d’instruments situé sous la barre de titre, réglez les options de débit (moyen), de temps (5 min) et d’événements (voir étape 5.2.8) que vous souhaitez détecter. Cliquez sur l’option Acquérir un single pour permettre à l’instrument de dessiner / exécuter l’échantillon et afficher l’aperçu en temps réel des événements détectés.
7. À partir de l’aperçu en temps réel, ajustez le seuil de fluorescence (tension et gain) et la taille de la cellule pour éventuellement tracer des portes autour de la population cellulaire souhaitée tout en excluant tout débris cellulaire.
  REMARQUE: FSC aide à distinguer les cellules sur la base de la taille, permettant ainsi aux utilisateurs de différencier les cellules du système immunitaire, telles que les monocytes et les lymphocytes; Les monocytes sont plus gros et montrent une intensité FSC plus élevée par rapport aux lymphocytes.
8. Acquérir un total de 5 000 MoDC vivants, 50 000 lymphocytes vivants et 50 000 événements monocytaires vivants.
9. Une fois que tous les paramètres sont ajustés en référence à l’échantillon de contrôle négatif, cliquez sur Arrêter et enregistrez le protocole.
10. Maintenant, chargez tous les échantillons sur la chargeuse multitube. Définissez chaque échantillon de la liste de travail et appliquez les paramètres ajustés en référence au contrôle négatif à tous les échantillons de l’expérience. Cliquez sur l’option Acquérir pour permettre à tous les échantillons de l’expérience d’être exécutés consécutivement.
11. Une fois les données de tous les échantillons acquises, sauvegardez et transformez-les en données lisibles à l’aide d’un logiciel d’analyse de données approprié qui permet la génération d’histogrammes biparamétriques et monoparamétriques séquentiels.

6. Analyse de l’expression de l’ARN messager (ARNm)

Extraction d’ARN
REMARQUE : Extraire l’ARN total de la co-culture MoDC-lymphocytes pulsée d’antigène (spécifique), de la co-culture MoDC-lymphocytes non pulsée d’antigène (non spécifique), de la culture lymphocytaire sans MoDC (témoin) et de lymphocytes naïfs (cellules CD14⁻ isolées avant la co-culture). Pour l’extraction de l’ARN, préparez de l’éthanol en utilisant de l’eau sans RNase. Reportez-vous au tableau des matériaux pour plus de détails sur la trousse d’extraction et les réactifs.
1. Transférer 1 mL de suspension cellulaire de la plaque de coculture MoDC-lymphocytes (~1 × 10⁶ cellules/mL) dans un tube stérile stérile de 1,5 mL à l’aide d’une pipette et centrifuger pendant 10 min à 500 × g.
2. Gardez le surnageant pour ELISA. Remettez en suspension la pastille de cellule dans 1 mL de PBS et transférez-la dans un tube de 15 mL. Recueillir toutes les cellules résiduelles en utilisant 1 mL de PBS.
3. Centrifuger pendant 10 min à 500 × g.
  REMARQUE: Tous les échantillons doivent être manipulés délicatement comme des cellules vivantes jusqu’à ce que la lyse cellulaire soit effectuée à l’aide du tampon de lyse fourni dans la trousse. La mort cellulaire libère des RNases qui hydrolysent rapidement les matrices d’ARN nécessaires à la quantification en aval. Le tampon RLT lyse les cellules dans une solution qui inhibe les RNases.
4. Ajouter 350 μL de tampon de lyse à chaque puits vide et incuber pendant 2-3 minutes pour lyser les cellules adhérentes qui n’ont pas été récoltées dans les étapes précédentes.
5. Une fois la centrifugation de l’étape 6.1.3 terminée, jeter le surnageant et combiner la pastille de cellule avec le tampon de lyse de 350 μL ajouté à l’étape 6.1.4.
  REMARQUE: À ce stade, il est possible de stocker les tubes à -80 ° C ou de procéder à l’extraction de l’ARN (étapes suivantes).
6. Pipeter 350 μL d’éthanol à 70% au lysat à l’étape 6.1.5. Le volume final par échantillon est de 700 μL.
7. Insérez la colonne d’extraction dans un tube de collecte de 2 mL (fourni avec la trousse).
8. Transférer les 700 μL d’échantillon par colonne d’extraction et centrifuger à 10 000 × g pendant 15 s. Jetez le flux dans le tube de collecte et replacez-le dans la colonne de rotation.
9. Dans la colonne d’extraction, ajouter 350 μL de tampon de lavage strict (fourni dans le kit) et centrifuger à plus de 10 000 × g pendant 15 s. Ignorez le flux.
10. Ajouter 80 μL de mélange d’incubation DNase I par échantillon sur la membrane de la colonne d’extraction et laisser reposer pendant 15 min à 20-30 °C.
  NOTE: Pour préparer le mélange d’incubation DNase I par échantillon, ajouter 10 μL de solution mère DNase I à 70 μL de tampon DNase pour un volume final de 80 μL. Bien mélanger en retournant le tube plusieurs fois, suivi d’un court spin dans la centrifugeuse.
11. Laver la colonne d’extraction avec 350 μL de tampon de lavage rigoureux, suivi d’une centrifugation à 10 000 × g pendant 15 min. Jeter l’écoulement dans le tube de collecte après la centrifugation.
12. Laver la colonne d’extraction 2x avec 500 μL de tampon de lavage doux à chaque fois et par centrifugation à 10 000 × g pendant 15 s et une seconde fois pendant 2 min. Jetez le flux après chaque centrifugation.
13. Centrifuger la colonne à vitesse maximale pendant 1 min pour sécher la membrane et jeter le tube de collecte.
14. Placer la colonne d’extraction dans un nouveau tube de prélèvement de 1,5 mL.
15. Pipeter 50 μL d’eau exempte de RNase sur la membrane de la colonne et incuber pendant 3 à 5 minutes à température ambiante.
  REMARQUE : Pour les concentrations d’ARN inférieures à 100 ng, réduire le volume d’élution à 30 μL et éluer de nouveau la membrane de la colonne d’extraction à l’aide du produit de la première élution pour concentrer le produit final.
16. Centrifuger à 10 000 × g pendant 1 min pour éluer l’ARN.
17. Mesurer la concentration d’ARN en détectant l’absorbance à 260 nm en utilisant 0,5-2 μL d’échantillon. Ajuster la concentration finale d’ARN à 0,1-1 μg/μL en utilisant de l’eau sans RNase.
18. Conserver les aliquotes d’ARN à −80 °C pour une utilisation ultérieure.
Synthèse d’ADN complémentaire
1. Synthétiser l’ADN complémentaire (ADNc) à partir de l’ARN modèle extrait selon le protocole du fabricant fourni avec la trousse (voir le tableau des matériaux pour plus de détails).
  NOTE : Un résumé des réactifs et des volumes utilisés est présenté dans les tableaux 1 et 2. Un protocole complet est détaillé dans le dossier supplémentaire 1.
Réaction en chaîne de la polymérase quantitative en temps réel
1. Pour la qPCR, exécutez les échantillons d’ADNc en trois exemplaires. Quantifier les niveaux de transcrits d’ARNm bovins pour Ki-67 et IFN-γ à l’aide d’ensembles d’amorces spécifiques en référence au gène GAPDH , comme le montre le tableau 3.
  REMARQUE : Un protocole complet est détaillé dans le dossier supplémentaire 1.

7. Dosage immunoenzymatique

Traiter les surnageants de culture collectés riches en protéines sécrétoires pour la quantification de l’IFN-γ par ELISA.
REMARQUE : Consultez le tableau des matières pour plus de détails sur l’utilisation de la trousse. Un protocole complet est détaillé dans le dossier supplémentaire 1.

8. Analyse statistique

Analyser les données et faire des illustrations graphiques de la conception expérimentale à l’aide de logiciels commerciaux. Utilisez un test non paramétrique non apparié pour l’analyse comparative. Considérez que les valeurs P < 0,05 sont statistiquement significatives.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Cette méthodologie décrit la génération in vitro de MD bovins pour l’évaluation des antigènes vaccinaux candidats avant la réalisation d’études in vivo. La figure 1 illustre le schéma expérimental de la production de DC bovins et l’application des DC pour le test in vitro. En utilisant la technique de tri cellulaire magnétique, il a été possible de prélever environ 26 millions de myocytes CD14⁺ des PBMC récoltés, qui étaient auparavant isolés de 50 ml de sang de bovin. La fraction cellulaire éluée exempte de monocytes CD14+ était riche en lymphocytes et était utilisée comme source de lymphocytes CD4+ et CD8⁺ naïfs (fraction lymphocytaire CD14⁻).

La fraction monocytaire naïve était composée à 98 % de cellules monocytaires CD14⁺, comme observé après coloration des cellules CD14 et cytométrie en flux (Figure 2A,B). Les cellules monocytaires naïves purifiées, lorsqu’elles sont soumises à une culture en présence du cocktail de cytokines à 3% (GM-CSF et IL-4) avec une incubation ultérieure de 5 jours, se sont différenciées en un phénotype de type DC. À partir d’une culture initiale de 26 millions de monocytes CD14⁺, un total d’environ 12 millions de MDC a pu être obtenu après 5 jours d’incubation. Les MoDC naïfs étaient fonctionnellement capables d’absorber l’antigène, comme on l’a observé à l’aide de l’analyse par cytométrie en flux du FITC-dextran (Figure 3). De plus, les MoDC naïfs ont été phénotypiquement caractérisés en évaluant l’expression du CMH de classe II et des marqueurs de surface cellulaire CD86 et CD40 co-stimulateurs, ce qui a validé le phénotype de type DC (Figure 4).

La stimulation pulsée par antigène de MoDC naïfs a été obtenue en les cultivant en présence de RV inactivé pendant 2 jours. L’activation des lymphocytes naïfs (la fraction cellulaire CD14⁻ ) a été obtenue par co-culture de lymphocytes MoDC pulsés d’antigène avec la supplémentation ultérieure d’IL-2. Au cours de la co-culture MoDC-lymphocytes au jour 9, un changement morphologique a été observé dans les MoDC pulsés RV, car ils ont montré une extension dendrite, qui est une caractéristique de la maturation MoDC (Figure 5). Au jour 14, l’activation lymphocytaire a été améliorée en restimulant la co-culture par l’ajout de MoDC pulsés RV nouvellement produits à partir du même animal.

Par rapport à la co-culture MoDC-lymphocytes non pulsés, une augmentation significative (p < 0,01) de la prolifération lymphocytaire a été démontrée par la régulation positive des marqueurs d’activation Ki-67 et CD25 sur les lymphocytes T CD4+ et CD8⁺ au jour 16 dans la co-culture pulsée MoDC-lymphocytes (Figure 6). Les lymphocytes T CD8⁺ des co-cultures MoDC matures pulsées RV présentaient une régulation positive huit fois (p < 0,01) de Ki-67 par rapport au groupe non spécifique (Figure 7A). Les lymphocytes T CD4⁺ d’une même culture ont montré une multiplication par sept (p < 0,01) chez Ki-67 par rapport aux témoins (Figure 7B). Cela démontre la capacité des MoDC amorcés par le RV à présenter avec succès l’antigène du rotavirus aux lymphocytes naïfs et à les activer ensuite dans une condition in vitro, similaire à ce qui se passe chez un animal vivant. En plus d’analyser les cellules à l’aide de la cytométrie en flux, les co-cultures ont également été soumises à la qPCR et à l’ELISA pour quantifier l’activation lymphocytaire spécifique du RV en utilisant la transcription de l’ARN (Ki-67 et IFN-γ) et la sécrétion extracellulaire (IFN-γ), respectivement (Figure 8). Ces méthodes de détection supplémentaires peuvent également être utilisées comme tests de confirmation pour valider davantage les résultats de la cytométrie en flux. L’expression de l’ARN pour Ki-67 et IFN-γ démontrée par qPCR et les niveaux d’IFN-γ démontrés par ELISA ont montré des schémas similaires d’augmentation, indiquant une prolifération lymphocytaire, dans la co-culture spécifique de l’antigène par rapport au groupe de traitement non spécifique. Par conséquent, les résultats qPCR et ELISA étaient corrélés avec les résultats de la cytométrie de flux. La qPCR a montré une augmentation de >30% de l’expression de l’IFN-γ et une augmentation de >5% de l’expression de Ki-67 dans toutes les co-cultures utilisant GAPDH comme calibrateur (Figure 8A,B). Une concentration significativement plus élevée d’IFN-γ sécrétée (**p > 0,01) a été mesurée avec ELISA en utilisant des surnageants de culture provenant de la co-culture MoDC-lymphocytes pulsés RV par rapport au groupe de traitement non spécifique (figure 8C).

Figure 1 : Conception expérimentale du test in vitro bovin basé sur le MoDC. (A) Récolte et tri cellulaire des monocytes CD14+ et des fractions cellulaires lymphocytaires CD14⁻ des PBMC bovins. Le sang des bovins est traité par centrifugation à gradient de densité pour collecter les PBMC, suivie d’un tri cellulaire magnétique à l’aide de colonnes de séparation cellulaire immunomagnétiques et de la culture ultérieure de la fraction cellulaire naïve CD14⁺ récoltée dans un milieu RPMI 1640 supplémenté. (B) La production de MoDCs en utilisant un cocktail de cytokines à 3% (GM-CSF + IL-4) avec 5 jours d’incubation et co-culture MoDC-lymphocyte. Le jour 0, les monocytes sont cultivés en présence du cocktail de cytokines et incubés pendant 48 h pour induire la différenciation. Le jour 2, la culture est restimulée avec le même cocktail de cytokines, suivie d’une incubation pendant 72 h, ce qui conduit à la production de MoDCs naïfs. Le jour 5, l’antigène vaccinal (vaccin antirabique) est ajouté à la culture cellulaire naïve MoDC, suivi d’une incubation de 48 heures. Le jour 7, la co-culture de MoDC pulsés d’antigène avec des lymphocytes naïfs (la fraction cellulaire CD14⁻) est effectuée, suivie d’une incubation. Le jour 9, l’IL-2 est ajoutée à la co-culture. Le jour 14, l’enrichissement/restimulation des lymphocytes activés/amorcés est effectué par l’ajout de MoDC pulsés à l’antigène, suivi d’une incubation pendant 48 h. Enfin, le jour 16, les cellules et le surnageant de culture sont récoltés pour le test de prolifération des lymphocytes. Abréviations : MODC = cellules dendritiques dérivées de monocytes bovins; PBMC = cellules mononucléées du sang périphérique; GM-CSF = facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Morphologie et pureté des monocytes CD14⁺ bovins récoltés dans les PBMC à l’aide de microbilles conjuguées anti-CD14. (A) Morphologie des monocytes bovins incubés pendant 4 h à 37 °C dans un milieu de culture complet pour éliminer les microbilles, fixés sur des lames revêtues de polylysine et colorés avec une coloration Giemsa modifiée. Barre d’échelle = 50 μm. (B) Histogramme de cytométrie en flux montrant la fraction cellulaire CD14⁺ éluée avec un niveau de pureté de 98,6 % observé en utilisant l’anticorps anti-CD14 (rouge) et l’anticorps témoin de l’isotype IgG1 conjugué FITC chez la souris (vert). Abréviations : PBMC = cellules mononucléées du sang périphérique; FITC cont = contrôle de l’isothiocyanate de fluorescéine. Ce chiffre a été modifié à partir de Kangethe et al., 2018¹¹. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Activité endocytaire des DC bovins générés in vitro. Histogramme de cytométrie en flux montrant l’absorption de la molécule traceur (FITC-dextran) par les MoDC naïfs du jour 5. Les DC sont incubés à 37 °C pendant 60 min avec la molécule traceuse (bleu) et les DC incubés sur glace avec la molécule traceur (grise) utilisée comme témoin de fond. Abréviations : MODC = cellules dendritiques dérivées de monocytes bovins; FITC = isothiocyanate de fluorescéine. Ce chiffre a été modifié à partir de Kangethe et al., 2018¹¹. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Phénotypage de marqueurs de surface cellulaire bovins spécifiques au MoDC générés in vitro. Histogrammes de cytométrie de flux pour (A) les stratégies de déclenchement des DC et pour les DC naïfs du 5e jour (B) colorés avec trois AcM spécifiques de DC différents (bleu), y compris les suivants : AcM CMH II anti-ovins, AcM CD86 antibovin et AcM CD40 antibovin. Tous comparés à leurs contrôles d’isotypes correspondants (rouge). Abréviations : DC = cellules dendritiques; MODC = CD dérivés de monocytes bovins; CMH II = complexe majeur d’histocompatibilité II. Ce chiffre a été modifié à partir de Kangethe et al., 2018¹¹. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Signes de maturation des MoDC produits in vitro au cours de la co-culture MoDC-lymphocyte. Observation de la structure dendritique étendue caractéristique par des MoDC pulsés d’antigène avec microscopie inversée au jour 9 de la co-culture MoDC-lymphocyte. (A) MoDCs matures dans une zone hautement confluente de lymphocytes en co-culture. (B) Les MoDC matures sont facilement reconnaissables dans une zone avec moins de lymphocytes en co-culture. Barres d’échelle = 50 μm. Abréviation : MODC = cellules dendritiques dérivées de monocytes bovins. Ce chiffre a été modifié à partir de Kangethe et al., 2018¹¹. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Stratégie de gating séquentiel adoptée pour les diagrammes à points par rapport à l’expression de Ki-67 et CD25 par les lymphocytes dans la co-culture MoDC-lymphocyte. (A) Lastratégie de déclenchement complète pour les cellules prélevées à partir de la co-culture MoDC-lymphocytes du jour 16. (B) L’expression de Ki-67 à partir de lymphocytes CD4+-dépendants et (C) de lymphocytes CD8⁺ par rapport au contrôle FMO (sans mAb) et au contrôle d’isotype IgG1-k de souris mAb. L’expression de CD25 sur les lymphocytes CD8+ et (E) CD4⁺ fermés (D) par rapport à l’isotype IgG1 de souris contrôle mAb. Le groupe de traitement représente spécifiquement les lymphocytes co-cultivés avec des MoDC pulsés RV, tandis que le groupe témoin représente les lymphocytes cultivés en l’absence de MoDC. Abréviations : MODC = cellules dendritiques dérivées de monocytes bovins; FMO = fluorescent moins un; RV = vaccin contre la rage. Ce chiffre a été modifié à partir de Kangethe et al., 2018¹¹. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Analyse des données de cytométrie en flux de l’expression de Ki-67 et CD25 par les lymphocytes CD4+ et CD8⁺ après amorçage avec l’antigène. Expression de Ki-67 et CD25 à partir de la co-culture du jour 16. Le groupe de traitement (spécifique) est défini comme des lymphocytes cultivés avec des MoDC pulsés RV; le groupe non spécifique correspond aux lymphocytes cultivés avec des MoDC non pulsés d’antigènes; le groupe témoin correspond aux lymphocytes cultivés sans MoDCs. Les barres horizontales représentent la moyenne de six répliques techniques. (A) Expression intracellulaire du marqueur Ki-67 par les lymphocytes T CD8 et (B) par les lymphocytes T CD4. (C) Expression de surface cellulaire du marqueur CD25 par les lymphocytes T CD8 et (D) par les lymphocytes T CD4. Abréviations : MODC = cellules dendritiques dérivées de monocytes bovins; RV = vaccin contre la rage. Ce chiffre a été modifié à partir de Kangethe et al., 2018¹¹. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8 : Activation du marqueur Th1 (IFN-γ et Ki-67) par les MoDC amorcés avec l’antigène du virus de la rage, tel que détecté par qPCR et ELISA. Données prélevées sur un animal avec six répliques techniques. Les barres horizontales représentent la moyenne. Trois réplications PCR ont montré des changements de pli par rapport aux lymphocytes naïfs après normalisation avec un gène de référence GAPDH. (A) expression IFN-γ, (B) expression Ki-67. (C) Comparaison de la sécrétion d’IFN-γ dans le surnageant de culture entre trois groupes de traitement, telle que détectée par ELISA. Le groupe spécifique est défini comme des lymphocytes cultivés avec des MoDC pulsés RV; le groupe non spécifique correspond aux lymphocytes cultivés avec des MoDC non pulsés d’antigènes; le groupe témoin correspond aux lymphocytes cultivés sans MoDCs. Abréviations : MODC = cellules dendritiques dérivées de monocytes bovins; RV = vaccin contre la rage. Ce chiffre a été modifié à partir de Kangethe et al., 2018¹¹. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Réactifs	Concentration finale	Volume Par réaction
dNTPs Mix (10 mM)	1 000 μM	1 μL
Amorces hexamères aléatoires (50 ng/μL)	25 μM	1 μL
Modèle d’ARN	0,1 – 1 μg/μL	χ μL (selon les besoins)
ARNase Eau libre	-	χ μL (selon les besoins)
Volume de réaction final	-	10 μL

Tableau 1 : Composition du mélange principal (mélange d’amorces d’ARN).

Réactifs	Concentration finale	Volume Par réaction
Tampon RT 10x	1x	2 μL
MgCl₂25 mM	5 mM	4 μL
TNT 0,1 M	10 mM	2 μL
Inhibiteur de l’ARNase 40 U/μL	2 U	1 μL

Tableau 2 : Le mélange réactionnel 2x PCR. Abréviations : RT = transcriptase inverse; DTT = dithiothreitol.

Cytokine	Espèce	Numéro d’acquisition	Séquence	Longueur	Tm
IFN-γ	Bos taurus	FJ263670	F- GTGGGCCTCTCTTCTCAGAA	234	80.5
			R- GATCATCCACCGGAATTTGA
Ki-67	Bos taurus	XM_015460791.2	F-AAGATTCCAGCGCCCATTCA	148	86.5
			R-TGAGGAACGAACACGACTGG
GAPDH	Bos taurus	Sassu et al., 2020	F-CCTGGAGAAACCTGCCAAGT	214	85.5
			R-GCCAAATTCATTGTCGTACCA

Tableau 3 : Ensembles d’amorces utilisés pour l’amplification⁵⁰.

Réactifs	Concentration finale	Volume Par réaction
Supermix	1x	5 μL
Amorce avant (5 μM)	250/ 125 nM	1 μL
Amorces inversées (5 μM)	250/ 125 nM	1 μL
ADNc 1:10 dilué	1,25 ng	2 μL
Eau sans nucléase	-	1 μL
Volume de réaction final	-	10 μL

Tableau 4 : mélange maître qPCR

N° de tube	Concentration de l’étalon	Dilution en série
1	50 ng/mL	50 μL de standard + 350 μL de tampon de lavage
2	12,5 ng/mL	150 μL du tube 1 + 450 μL de tampon de lavage
3	6,25 ng/mL	250 μL du tube 2 + 250 μL de tampon de lavage
4	3,13 ng/mL	250 μL du tube 3 + 250 μL de tampon de lavage
5	1,56 ng/mL	250 μL du tube 4 + 250 μL de tampon de lavage
6	0,78 ng/mL	250 μL du tube 5 + 250 μL de tampon de lavage
7	0,2 ng/mL	150 μL du tube 6 + 450 μL de tampon de lavage
8	0,1 ng/mL	250 μL du tube 7 + 250 μL de tampon de lavage
9	0,025 ng/mL	100 μL du tube 8 + 300 μL de tampon de lavage

Tableau 5 : Série étalon de dilution IFN-γ

Fichier supplémentaire 1 : Protocoles pour la synthèse de l’ADN complémentaire, la réaction en chaîne quantitative par polymérase en temps réel (qPCR) et le dosage immuno-enzymatique (ELISA). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S1 : Capacité d’absorption de l’antigène par les MoDC avec différentes concentrations du cocktail de cytokines et avec 3 ou 5 jours de culture. Différentes concentrations (5 % p/v et 3 % p/v) du cocktail de cytokines contenant du GM-CSF et de l’IL-4 ont été testées avec 3 jours ou 5 jours de culture pour évaluer la meilleure combinaison pour générer une absorption d’antigènes à haute performance MoDCs (en utilisant la molécule traceuse FITC-dextran). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S2 : Amorçage des CD4 et CD8 avec l’anatoxine diphtérique (DT) et le virus de la fièvre catarrhale ovine de sérotype 4 (BTV). L’expression de Ki-67 par les cellules CD8 après pulsation avec (A) DT et (C) BTV et l’expression de Ki-67 par les cellules CD4 après pulsation avec (B) DT et (D) BVT au jour 16. Des comparaisons ont été faites avec des cultures pulsées avec DT et BVT (spécifique), (C, D) avec CD40L, et avec des traitements d’amorçage et de contrôle non spécifiques. Les barres horizontales indiquent la moyenne. *p < 0,05, **p < 0,01 selon un test de Mann-Whitney. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Cette étude démontre une méthode in vitro normalisée pour la production et le phénotypage des DC bovins et leur utilisation subséquente pour mesurer l’immunogénicité vaccinale d’un vaccin commercial (p. ex. RV). Les DC bovines peuvent être utilisées comme outil pour dépister les antigènes vaccinaux potentiels contre les maladies des bovins et prédire leur impact clinique potentiel en fonction des réponses immunitaires avant de procéder à des essais in vivo sur des animaux. Les DC générés ont été identifiés en fonction de leurs caractéristiques morphologiques, phénotypiques et fonctionnelles. Nous avons montré que les MoDC dérivés de monocytes CD14⁺ bovins présentaient des caractéristiques observées dans les DC, telles que des dendrites étendues, l’expression de marqueurs de surface cellulaire pour la présentation de l’antigène tels que le CMH II, l’expression de molécules co-stimulatrices sur les MoDC telles que CD40 et CD86, l’activité endocytaire et la capacité d’activer les lymphocytes naïfs.

Les milieux de culture cellulaire utilisés dans cette expérience (DMEM et RPMI) sont largement utilisés pour la différenciation cellulaire et la culture, le RPMI étant plus fréquemment adopté pour la différenciation des monocytes³⁶. La supplémentation en RPMI avec FBS ou HS (sérum de cheval) n’affecte pas la différenciation des monocytes³⁷. La supplémentation en GM-CSF et IL-4 recombinants fournit une affection inflammatoire qui déclenche la différenciation des monocytes et est couramment utilisée pour la production de MoDC fonctionnellement viables capables d’absorber l’antigène et de se présenter aux cellules immunitaires^38,39. Dans cette étude, le milieu RPMI 1640 complété par 10% FBS (milieu de culture complet), 1% pénicilline-streptomycine et l’ajout d’un cocktail de cytokines disponibles dans le commerce (GM-CSF plus IL-4) ont induit la différenciation des monocytes bovins, entraînant la production de MoDC viables. Lorsque les MoDC générés ont été incubés avec le RV avant la co-culture avec des lymphocytes naïfs, ils ont induit une réponse immunitaire dépendante des lymphocytes T spécifique contre le RV, prouvant que les MoDC matures peuvent présenter adéquatement les antigènes de RV aux lymphocytes qui n’ont jamais rencontré le RV. Il s’agit d’une caractéristique cruciale de l’immunité adaptative que nous pouvons maintenant reproduire en laboratoire.

Nous avons observé qu’une concentration plus élevée de cocktail de cytokines (5%) associée à un temps d’incubation plus long (5 jours) produisait des DC avec une capacité endocytaire plus faible pour l’absorption de l’antigène que ceux traités avec une concentration plus faible de cocktail de cytokines (3%) avec le même temps d’incubation (5 jours), comme le montre la figure supplémentaire S1. Par conséquent, nous concluons qu’une concentration plus faible de cocktail de cytokines (par exemple, 3%) avec 5 jours d’incubation est optimale pour produire des MoDC fonctionnellement puissants. Des marqueurs de surface cellulaire tels que MHC II, CD40 et CD86 sont présents sur les APC, et leur régulation positive indique une activation cellulaire fonctionnelle^40,41,4 ². Nous avons démontré une expression accrue du CMH II, CD40 et CD86 après différenciation des monocytes en MoDC naïfs à l’aide du cocktail de cytokines (Figure 4).

L’optimisation du rapport entre les lymphocytes naïfs et les MoDC dans un système de culture est un facteur clé qui influence le résultat du test MoDC, avec différents rapports MoDC/lymphocytes induisant des réponses lymphocytaires variées⁴³. Cependant, après avoir évalué les rapports MoDC/lymphocytes de 1:10-1:40, nous avons observé que l’augmentation de la concentration de MoDCs n’augmentait pas l’activation lymphocytaire, et nous avons finalement opté pour un rapport optimal de 1:20, ce qui est similaire aux études précédemment rapportées^44,45. Il convient de noter que la fraction lymphocytaire naïve éluée peut contenir des lymphocytes T non spécifiquement activés; Par conséquent, il est impératif d’avoir un groupe témoin correspondant uniquement à la culture de lymphocytes naïfs.

Les lymphocytes T CD4+ et CD8⁺ activés expriment des marqueurs spécifiques et sécrètent une variété de cytokines, et leur quantification indique une activation immunitaire. L’expression intracellulaire de Ki-67, un marqueur d’activation immunitaire bien caractérisé, a été régulée à la hausse dans cette co-culture lymphocytaire MoDC^29,46. De même, dans cette étude, l’augmentation de la sécrétion d’IFN-γ par les lymphocytes a indiqué une réponse Th1 provoquée contre l’antigène RV^30,31,47. L’expression de l’IL-2 par les lymphocytes T CD4⁺ est également un bon marqueur pour visualiser l’activation des lymphocytes T; cependant, son incorporation au jour 9 de la co-culture MoDC-lymphocytes en a fait une cible inappropriée pour mesurer la prolifération lymphocytaire pour cette étude⁴⁸. Il a déjà été démontré que la régulation positive de CD25 en présence d’IL-2 détermine l’amorçage des lymphocytes T CD4+ et CD8⁺ et a été utilisée dans cette étude pour mesurer l’amorçage des lymphocytes naïfs par des MoDC^{pulsés RV 28}.

Les lymphocytes T CD8 cytotoxiques sont des cellules effectrices majeures contre les antigènes vaccinaux intracellulaires ou les pathogènes viraux⁴⁹. En mesurant les marqueurs d’activation lymphocytaire (Ki-67 et CD25) et l’expression des cytokines (IFN-γ), nous avons constaté que les MoDC chargés d’antigènes avaient une activation significative (p < 0,01) des réponses des lymphocytes T CD8 et CD4, la réponse CD8 et la polarisation Th1 étant plus fréquentes contre l’antigène RV. Un facteur important qui doit être pris en compte lors de la conception d’un test MoDC pour les vaccins conjugués avec adjuvant est la réponse lymphocytaire induite par adjuvant. Nous recommandons d’utiliser un groupe témoin (contrôle adjuvant) composé uniquement d’adjuvant pour éliminer tout signal de fond. Cette configuration peut également être utilisée pour mesurer l’effet de différents adjuvants qui peuvent amplifier les réponses lymphocytaires vers un antigène faiblement immunogène, ce qui est crucial pour la protection lors d’études in vivo .

Il y a certaines limites de cette étude que nous voulons souligner. Les données expérimentales pour chaque essai ont été dérivées d’un seul animal avec six répétitions techniques. Le fait d’avoir un plus grand nombre de répétitions biologiques serait bénéfique pour minimiser les erreurs et fournir une fiabilité statistique accrue et des résultats avec une plus grande précision. Néanmoins, dans une publication précédente¹¹, ce test a également été testé et validé à l’aide d’une anatoxine diphtérique (figure supplémentaire S2A,B) et d’un vaccin commercial contre le sérotype 4 du virus de la fièvre catarrhale du mouton (figure supplémentaire S2C,D) avec trois et deux animaux biologiques, respectivement. En outre, la comparaison des résultats obtenus de cette étude in vitro avec une étude in vivo aiderait à valider l’authenticité de ce test immunitaire, ce qui, à son tour, accélérerait le processus de mise en œuvre de ce test MoDC in vitro en tant que test de routine dans la production de vaccins et le contrôle de la qualité. Enfin, l’expression de CD14 dans les DC n’a pas été étudiée, car la littérature est incohérente quant à cet aspect, en particulier lorsque l’on compare les DC de différentes espèces animales.

En conclusion, nous rapportons un test MoDC bovin in vitro qui peut être utilisé pour mesurer l’immunogénicité induite par le vaccin. Ce test MoDC peut également être évalué à l’aide de diverses méthodes, notamment la cytométrie en flux, ELISA et qPCR. Disposer de plusieurs méthodes pour évaluer les marqueurs d’activation est crucial dans les zones aux ressources limitées où un cytomètre en flux peut ne pas être facilement disponible. Ce test peut être inclus comme étape de contrôle de la qualité par les laboratoires vétérinaires nationaux qui produisent de grands lots de vaccins bovins. En outre, il peut être utilisé pour identifier les antigènes vaccinaux potentiels lors de la mise au point de nouveaux vaccins bovins et même pour sélectionner l’adjuvant à utiliser avant un essai sur les animaux. Tous ces facteurs contribueront à une approche plus éthique et abordable de la mise au point et de l’utilisation des vaccins bovins.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions la Dre Eveline Wodak et la Dre Angelika Loistch (AGES) pour leur soutien dans la détermination de l’état de santé des animaux et pour la fourniture du virus de la fièvre catarrhale ovine, le Dr Bernhard Reinelt pour la fourniture de sang bovin, et le Dr Bharani Settypalli et le Dr William Dundon de l’AIEA pour leurs conseils utiles sur les expériences de PCR en temps réel et l’édition du langage, respectivement.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ACK Lysing Buffer	Gibco, Thermo Fisher	A1049201	Ammonium-Chloride-Potassium buffer for lysis of residual RBCs in harvested PBMC Fraction
BD Vacutainer Heparin Tubes	Becton, Dickinson (BD) and Company	366480	10 mL, additive sodium heparin 158 USP units, glass tube, 16 x 100 mm size
Bovine Dendritic Cell Growth Kit	Bio-Rad, UK	PBP015KZZ	Cytokine cocktail composed of recombinant bovine IL-4 and GM-CSF
Bovine IFN-γ ELISA Kit	Bio-Rad	MCA5638KZZ	Kit use for measuring IFN-γ expression in culture supernatant
CD14 Antibody	Bio-Rad	MCA2678F	Mouse anti-bovine CD14 monoclonal antibody, clone CC-G33, isotype IgG1
CD25 Antibody	Bio-Rad	MCA2430PE	Mouse anti bovine CD25 monoclonal antibody, clone IL-A11, isotype IgG1
CD4 Antibody	Bio-Rad	MCA1653A647	Mouse anti bovine CD4 monoclonal antibody, clone CC8, isotype IgG2a
CD40 Antibody	Bio-Rad	MCA2431F	Mouse anti-bovine CD40 monoclonal antibody, clone IL-A156, isotype IgG1
CD8 Antibody	Bio-Rad	MCA837F	Mouse anti bovine CD8 monoclonal antibody, clone CC63, isotype IgG2a
CD86 Antibody	Bio-Rad	MCA2437PE	Mouse anti-bovine CD86 monoclonal antibody, clone IL-A190, isotype IgG1
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad	-	Thermal cycler PCR machine
Corning Centrifuge Tube	Falcon Corning	352096 & 352070	15 mL and 50 mL, high-clarity poypropylene conical bottom, graduated, sterial, seal screw cap, falcon tube
Cytofix/Cytoperm Plus	BD Bio Sciences	555028	Fixation/permeabilization kit with BD golgiPlug, use for flow cytometer cell staining
Ethanol	Sigma Aldrich	1009832500	Absolute for analysis EMSURE ACS,ISO, Reag. Ph Eur
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco, Thermo Fisher	10500064	Qualified, heat inactivated
Ficoll Plaque PLUS	GE Health care Life Sciences, USA	341691	Lymphocyte-isolation medium
FlowClean Cleaning Agent	Beckman Coulter, Life Sciences	A64669	500 mL
FlowJo	FlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, USA	-	Flow cytometer Histogram software
FlowTubes/ FACS (Fluorescence-activated single-cell sorting) Tube	Falcon Corning	352235	5 mL, sterial, round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap, use in flow cytometry analysis
Fluoresceinisothiocynat-Dextran	Sigma Aldrich, Germany	60842-46-8	FITC-dextran MW
Gallios Flow Cytometer	Beckman Coulter	-	Flow cytometer machine
Hard-Shell 96-Well PCR Plates	Bio-Rad	HSP9601	96 well, low profile, thin wall, skirted, white/clear
Human CD14 MicroBeads	Miltenyi Bioteck, Germany	130-050-201	2 mL microbeads conjugated to monoclonal anti-human CD14 antibody isotype IgG2a, used for selection of bovine monocytes from PBMCs
Kaluza	Beckman Coulter, Germany	-	Flow cytometer multicolor data analysis software
MACS Column	Miltenyi Bioteck, Germany	130-042-401	Magnetic activated cell sorting or immune magentic cell separation colum for separation of various CD14 cell population based on cell surface antigens
MHC Class II DQ DR Polymorphic Antibody	Bio-Rad	MCA2228F	Mouse anti-sheep MHC Class II DQ DR Polymorphic:FITC, clone 49.1, isotype IgG2a, cross reactive with bovine
Microcentrifuge Tube	Sigma Aldrich	HS4325	1.5 mL, conical bottom, graduated, sterial tube
Microsoft Power Point	Microsoft	-	The graphical illustrations of experimental design
Mouse IgG1 Negative Control:FITC for CD14, CD40 Antibody	Bio-Rad	MCA928F	Isotype control CD14 and CD40 monoclonal antibody
Mouse IgG1 Negative Control:PE for CD86 Antibody	Bio-Rad	MCA928PE	Isotype control CD86 monoclonal antibody
Mouse IgG1 Negative Control:RPE for CD25 Antibody	Bio-Rad	MCA928PE	Isotype control CD25 monoclonal antibody
Mouse IgG2a Negative Control:FITC for MHC Class II Antibody	Bio-Rad	MCA929F	Isotype control for MHC class II monoclonal antibody
Nobivac Rabies	MSD Animal Health, UK	-	1 µL/mL of cell cultured inactivated vaccine containing > 2 I.U./mL Rabies virus strain
Optical seals	Bi0-Rad	TCS0803	0.2 mL flat PCR tube 8-cap strips, optical, ultraclear, compatible for qPCR machine
Penicillin-Streptomycin	Gibco, Thermo Fisher	15140122	100 mL
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Gibco, Thermo Fisher	10010023	pH 7.4, 1x concentration
Prism - GraphPad 5 Software	Dotmatics	-	Statistical software
Purified Anti-human Ki-67 antibody	Biolegend, USA	350501	Monoclonal antibody, cross reactive with cow, clone ki-67
Purified Mouse IgG1 k Isotype Ctrl Antibody	Biolegend	400101	Isotype control for Ki-67 monoclonal antibody
READIDROP Propidium Iodide	BD Bio Sciences	1351101	Live/dead cell marker used for flow cytometry, amine reactive dye
Recombinant Human IL-2 Protein	R&D System, USA	202-IL-010/CF	Interleukin-2, 20 ng/ml
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74106	Kit use for extraction of total RNA; RLT buffer = lysis buffer; RW1 buffer = stringent guanidine-containing washing buffer; RDD buffer = DNase buffer; RPE buffer = mild wash buffer; RNaseOUT = RNase inhibitor.
RPMI 1640 Medium	Sigma Aldrich	R8758	Cell culture media with L-glutamine and sodium bicarbonate
SMART-servier medical art	Les Laboratories Servier	-	Licensed under a creative commons attribution 3.0 unported license
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5270	2x qPCR mix conatins dNTPs, Ss07d fusion polymerase, MgCl2, SYBR Green I supermix = supermix, ROX normalization dyes.
SuperScript III First-Strand Synthesis System	Invitrogen, Thermo Fisher	18080051	Kit for cDNA synthsis
Tissue Culture Test plate 24	TPP, Switzerland	92024	24 well plate, sterilized by radiation , growth enhanced treated, volume 3.18 mL
Trypan Blue Solution	Gibco, Thermo Fisher	15250061	0.4%, 100 mL, dye to assess cell viability
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Invitrogen, Thermo Fisher	10977023	0.1 µm membrane filtered distilled water
VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes	Thermo Fisher Scientific	15206067	VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes have a green top and contain spray-dried lithium, sodium or ammonium heparin on the inner walls and are usedin clinical chemistry, immunology and serology. The anticoagulant heparin activates antithrombin, which blocks the clotting cascade and thus produces a whole blood/plasma sample.
Water	Sigma Aldrich	W3500-1L	Sterile-filtered, bioReagent suitable for cell culture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Roth, J. A., Sandbulte, M. R. The role of veterinary vaccines in livestock production, animal health, and public health. In Veterinary Vaccines: Principles and Applications. Metwally, S., El Idrissi, A., Viljoen, G. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 1-10 (2021).
Roberts, N. J., Douglas, R. G., Simons, R. M., Diamond, M. E. Virus-induced interferon production by human macrophages. The Journal of Immunology. 123 (1), 365-369 (1979).
Kleiveland, C. R. Peripheral blood mononuclear cells. The Impact of Food Bioactives on Health: In Vitro and Ex Vivo Models. Verhoeckx, K., Cotter, P., López-Expósito, I., Kleiveland, C., Lea, T., Mackie, A., Requena, T., Swiatecka, D., Wichers, H. , Springer. Cham, Switzerland. 161-167 (2015).
Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 762-774 (2011).
Domínguez, P. M., Ardavín, C. Differentiation and function of mouse monocyte-derived dendritic cells in steady state and inflammation. Immunological Reviews. 234 (1), 90-104 (2010).
Steinman, R. M. Linking innate to adaptive immunity through dendritic cells. Novartis Foundation Symposium. 279, 101-109 (2006).
Vandebriel, R. J., Hoefnagel, M. H. N. Dendritic cell-based in vitro assays for vaccine immunogenicity. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 8 (9), 1323-1325 (2012).
Hopewell, E. L., Cox, C. Manufacturing dendritic cells for immunotherapy: Monocyte enrichment. Molecular Therapy. Methods and Clinical Development. 16, 155-160 (2020).
Morse, M. A., Zhou, L. -J., Tedder, T. F., Lyerly, H. K., Smith, C. Generation of dendritic cells in vitro from peripheral blood mononuclear cells with granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor, interleukin-4, and tumor necrosis factor-alpha for use in cancer immunotherapy. Annals of Surgery. 226 (1), 6-16 (1997).
Robinson, L., et al. Foot-and-mouth disease virus exhibits an altered tropism in the presence of specific immunoglobulins, enabling productive infection and killing of dendritic cells. Journal of Virology. 85 (5), 2212-2223 (2011).
Kangethe, R. T., Pichler, R., Chuma, F. N. J., Cattoli, G., Wijewardana, V. Bovine monocyte derived dendritic cell based assay for measuring vaccine immunogenicity in vitro. Veterinary Immunology and Immunopathology. 197, 39-48 (2018).
Harwood, L. J., Gerber, H., Sobrino, F., Summerfield, A., McCullough, K. C. Dendritic cell internalization of foot-and-mouth disease virus: Influence of heparan sulfate binding on virus uptake and induction of the immune response. Journal of Virology. 82 (13), 6379-6394 (2008).
Hussen, J., et al. Phenotypic and functional heterogeneity of bovine blood monocytes. PLoS One. 8 (8), 71502 (2013).
Shi, Y., et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and T-cell responses: What we do and don't know. Cell Research. 16 (2), 126-133 (2006).
Zhou, L. -J., Tedder, T. F. CD14+ blood monocytes can differentiate into functionally mature CD83+ dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (6), 2588-2592 (1996).
Bautista, E. M., Nfon, C., Ferman, G. S., Golde, W. T. IL-13 replaces IL-4 in development of monocyte derived dendritic cells (MoDC) of swine. Veterinary Immunology and Immunopathology. 115 (1-2), 56-67 (2007).
León, B., Ardavín, C. Monocyte-derived dendritic cells in innate and adaptive immunity. Immunology and Cell Biology. 86 (4), 320-324 (2008).
Berger, A. Th1 and Th2 responses: What are they. British Medical Journal. 321 (7258), 424 (2000).
Romagnani, S. Th1/th2 cells. Inflammatory Bowel Diseases. 5 (4), 285-294 (1999).
Kaiko, G. E., Horvat, J. C., Beagley, K. W., Hansbro, P. M. Immunological decision-making: How does the immune system decide to mount a helper T-cell response. Immunology. 123 (3), 326-338 (2008).
Duckworth, B. C., Groom, J. R. Conversations that count: Cellular interactions that drive T cell fate. Immunological Reviews. 300 (1), 203-219 (2021).
León, B., López-Bravo, M., Ardavín, C. Monocyte-derived dendritic cells formed at the infection site control the induction of protective T helper 1 responses against Leishmania. Immunity. 26 (4), 519-531 (2007).
Singh, D., et al. Differential responses of chicken monocyte-derived dendritic cells infected with Salmonella gallinarum and Salmonella typhimurium. Scientific Reports. 11, 17214 (2021).
Pujol, M., et al. Variability in the response of canine and human dendritic cells stimulated with Brucella canis. Veterinary Research. 48, 72 (2017).
Pujol, M., Borie, C., Montoya, M., Ferreira, A., Vernal, R. Brucella canis induces canine CD4+ T cells multi-cytokine Th1/Th17 production via dendritic cell activation. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 62, 68-75 (2019).
Lašťovička, J., Rataj, M., Bartůňková, J. Assessment of lymphocyte proliferation for diagnostic purpose: Comparison of CFSE staining, Ki-67 expression and 3H-thymidine incorporation. Human Immunology. 77 (12), 1215-1222 (2016).
Reddy, M., Eirikis, E., Davis, C., Davis, H. M., Prabhakar, U. Comparative analysis of lymphocyte activation marker expression and cytokine secretion profile in stimulated human peripheral blood mononuclear cell cultures: An in vitro model to monitor cellular immune function. Journal of Immunological Methods. 293 (1-2), 127-142 (2004).
Shatrova, A. N., et al. Time-dependent regulation of IL-2R α-chain (CD25) expression by TCR signal strength and IL-2-induced STAT5 signaling in activated human blood T lymphocytes. PLoS One. 11 (12), 0167215 (2016).
Shedlock, D. J., et al. Ki-67 staining for determination of rhesus macaque T cell proliferative responses ex vivo. Cytometry, Part A. 77 (3), 275-284 (2010).
Yen, H. -R., et al. Tc17 CD8 T cells: Functional plasticity and subset diversity. Journal of Immunology. 183 (11), 7161-7168 (2009).
Kawamura, I., et al. IFN-gamma-producing ability as a possible marker for the protective T cells against Mycobacterium bovis BCG in mice. Journal of Immunology. 148 (9), 2887-2893 (1992).
Federal Ministry Republic of Austria. Agriculture, Forestry, Regions and Water Management. The Federal Act on Animal Welfare (Tierschutzgesetz - TSchG). Federal Law Gazette I 2004/118. , Available from: https://info.bml.gv.at/en/topics/agriculture/agriculture-in-austria/animal-production-in-austria/animal-welfare-act.html (2005).
Corripio-Miyar, Y., et al. Phenotypic and functional analysis of monocyte populations in cattle peripheral blood identifies a subset with high endocytic and allogeneic T-cell stimulatory capacity. Veterinary Research. 46, 112 (2015).
Wijewardana, V., et al. Generation of canine dendritic cells from peripheral blood monocytes without using purified cytokines. Veterinary Immunology and Immunopathology. 114 (1-2), 37-48 (2006).
Gallios Flow Cytometer with Kaluza for Gallios Software. Instructions for Use. Beckman Coulter. , Available from: http://www.cytometrie-imagerie-saint-antoine.org/media/3924/Kaluza.Gallos.pdf (2014).
Švajger, U., Jeras, M. Optimal dendritic cell differentiation in rpmi media requires the absence of HEPES buffer. Immunological Investigations. 40 (4), 413-426 (2011).
Chometon, T. Q., et al. A protocol for rapid monocyte isolation and generation of singular human monocyte-derived dendritic cells. PLoS One. 15 (4), 0231132 (2020).
Blanco, F. C., et al. Semi-stable production of bovine IL-4 and GM-CSF in the mammalian episomal expression system. Journal of Veterinary Research. 65 (3), 315-321 (2021).
Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. Journal of Experimental Medicine. 179 (4), 1109-1118 (1994).
Cho, K. -J., Roche, P. A. Regulation of MHC class II-peptide complex expression by ubiquitination. Frontiers in Immunology. 4, 369 (2013).
Sansom, D. M., Manzotti, C. N., Zheng, Y. What's the difference between CD80 and CD86. Trends in Immunology. 24 (6), 313-318 (2003).
Han Lee, G., et al. The role of CD40 expression in dendritic cells in cancer biology; a systematic review. Current Cancer Drug Targets. 14 (7), 610-620 (2014).
Tanaka, H., Demeure, C. E., Rubio, M., Delespesse, G., Sarfati, M. Human monocyte-derived dendritic cells induce naive T cell differentiation into T helper cell type 2 (Th2) or Th1/Th2 effectors: Role of stimulator/responder ratio. Journal of Experimental Medicine. 192 (3), 405-412 (2000).
Klechevsky, E., et al. Cross-priming CD8+ T cells by targeting antigens to human dendritic cells through DCIR. Blood. 116 (10), 1685-1697 (2010).
Schlienger, K., Craighead, N., Lee, K. P., Levine, B. L., June, C. H. Efficient priming of protein antigen-specific human CD4+ T cells by monocyte-derived dendritic cells. Blood. 96 (10), 3490-3498 (2000).
Soares, A., et al. Novel application of Ki67 to quantify antigen-specific in vitro lymphoproliferation. Journal of Immunological Methods. 362 (1-2), 43-50 (2010).
Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations. Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2009).
Bachmann, M. F., Oxenius, A. Interleukin 2: From immunostimulation to immunoregulation and back again. EMBO Reports. 8 (12), 1142-1148 (2007).
Koup, R. A., Douek, D. C. Vaccine design for CD8 T lymphocyte responses. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 1 (1), 007252 (2011).
Sassu, E. L., et al. Development and evaluation of a real-time PCR panel for the detection of 20 immune markers in cattle and sheep. Veterinary Immunology and Immunopathology. 227, 110092 (2020).

Immunology and Infection

Détermination de l’immunogénicité du vaccin à l’aide de cellules dendritiques dérivées de monocytes bovins

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.