Summary
يتم استخدام الوقت الفاصل بين التصوير لتقييم سلوك الخلايا الظهارية الثديية سابق للورم الأولية المستمدة من نماذج الماوس المعدلة وراثيا من خطر الاصابة بسرطان الثدي لتحديد ما إذا كانت هناك علاقة بين المعايير السلوكية والآفات الجينية المحددة متميزة.
Abstract
ويمكن استخدام الوقت الفاصل بين التصوير لمقارنة سلوك الخلايا الثديية الأولية مثقف سابق للورم الظهارة المستمدة من نماذج مختلفة الماوس المعدلة وراثيا للإصابة بسرطان الثدي. على سبيل المثال، يمكن أن يكون كميا الوقت بين انقسامات الخلية (أعمار الخلية)، وأرقام الخلية أفكارك، وتطور التغيرات المورفولوجية، وآلية تشكيل مستعمرة ومقارنة في خلايا تحمل آفات جينية محددة. وتولد انتخابات الثديية الثقافات من الخلايا الظهارية ورم الغدد الثديية دون اضح. ومقطوعة بعناية الغدد مع فصل واضح من العضلات المجاورة، تتم إزالة الغدد الليمفاوية، ويتم إنشاؤها وحيدة الخلية تعليق من الخلايا الظهارية الثديية المخصب من الأنسجة الثديية تنميق تليها التفكك الأنزيمية والترشيح. ومطلي وحيدة الخلية المعلقات وضعها مباشرة تحت المجهر داخل غرفة حاضنة للخلايا الحية التصوير. ستة عشر 650 ميكرومتر ميكرومتر X حقول 700 في تكوين 4X4 من كل ثوالتقط الذراع من لوحة 6 جيدا كل 15 دقيقة لمدة 5 أيام. يتم فحص الوقت الفاصل بين الصور مباشرة لقياس السلوكيات الخلوية التي يمكن أن تشمل آلية وتواتر تشكيل خلية داخل مستعمرة على مدار 24 ساعة الأولى من الطلاء الخلايا (التجميع مقابل تكاثر الخلايا)، حدوث موت الخلايا المبرمج، والتخلص من تغيرات شكلية. يتم استخدام وحيدة الخلية تتبع لتوليد خرائط مصير الخلية لقياس أعمار الخلايا الفردية والتحقيق في أنماط انقسام الخلايا. ويتم تحليل البيانات الكمية إحصائية لتقييم للفروق ذات دلالة إحصائية في السلوك يرتبط الآفات الجينية المحددة.
Introduction
نماذج الماوس المعدلة وراثيا هي أدوات لدراسة وفهم كيفية آفات جينية مختلفة تسهم في خطر الاصابة بسرطان الثدي. على سبيل المثال، أظهرت الفئران المعدلة وراثيا أن الجمع بين ثلاثة عوامل هي: فقدان الثدي كامل طول السرطان 1، بداية مبكرة (BRCA1) الجينات في الخلايا الظهارية الثديية، ورم P53 البروتين (TP53) الجرثومية الخط haploinsufficiency، والثدي الظهارية خلية مستهدفة حتى التنظيم ألفا الاستروجين مستقبلات النتائج التعبير (ERA) في تطوير سرطان الثدي في 100٪ من floxed BRCA1) و (فيروس الورم 11/f11/Mouse الثديية (MMTV) -Cre/p53 + / -/tetracycline-operator ( تيت-OP) -ER/MMTV-reverse التتراسيكلين transactivator (الفئران rtTA من 12 شهرا من العمر بالمقارنة مع انخفاض النسب المئوية الواردة في BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / - الفئران دون الإفراط في عصر التعبير (~ 50 - 60٪) وBRCA1 الفئران f11/f11/MMTV-Cre دون haploinsuf TP53ficiency (<5٪) 1
ديناميكية الوقت الفاصل بين التصوير من سلوك الخلايا الثديية سابق للورم الظهارة الأولية تكشف الاختلافات في سلوك الخلية التي هي أقل تقدير بسهولة في الأنسجة أقسام ثابتة. ويلاحظ تغييرات في الانتشار والتمايز في الخلايا الثديية الابتدائية من حاملات التحور BRCA1 الإنسان. يتم إنشاؤها من 2: إنشاء وحيدة الخلية تعليق من الخلايا الظهارية الثديية الأولية من العادي والفئران المهندسة وراثيا من خلال تفارق الأنزيمية من الأنسجة مقطوعة الغدة الثديية. 3 الوقت الفاصل بين وينظر إلى الصور لتقييم آلية وتوقيت ظهور مستعمرة الخلايا وحدوث تغيرات شكلية في الخلايا الظهارية، بما في ذلك الانتقال الوسيطة (EMT) وموت الخلايا المبرمج. جيل من الخرائط مصير الخلية، وتيسير الكمي لطول الفترة الزمنية بين انقسامات الخلية (أعمار الخلية)، وتحديد أنماط انقسام الخلايا عن طريق استخدام وحيدة الخلية تتبع. تيمأداة لتتبع (TTT) هو البرمجيات المتاحة للعموم استخدامها لتوليد خرائط مصير وحيدة الخلية. وقد أنشئت فائدته في توضيح آليات مصير الخلية خلية عادية 4،5 دراسة الجذعية المكونة للدم التنمية 6-9 و توليد الخلايا العصبية 10
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. مخطط العام
- توليد الثقافات الأولية من الخلايا preneoplastic الظهارية الثديية من الغدد الثديية من المهندسة وراثيا والتحكم من النوع البري الفئران.
- التقاط الصور الحية خلية كل 15 دقيقة باستخدام برنامج Volocity الحصول على الصور (الإصدار 5.3.1، PerkinElmer، التايم، MA) لمدة تصل إلى 5 أيام.
- عرض الوقت الفاصل بين الصور مباشرة لتقييم توقيت وآلية الخلية الظهارية تشكيل مستعمرة، حدوث موت الخلايا المبرمج، والتخلص التدريجي من التغيرات الشكلية.
- تحويل Volocity إنشاؤها. مداخن TIFF إلى ملفات JPG باستخدام الميكروسكوب MetaMorph أتمتة وصورة برامج التحليل (الأجهزة الجزيئية، LLC سانيفيل CA) وإعادة تسمية ملفات الصور الرقمية (THE إعادة تسمية 2.1.6، http://www.softpedia.com/get / النظام / إدارة الملفات / THE-Rename.shtml ) لتمكين التوافق مع البرامج في تيم أداة تتبع (TTT،tz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index.html "الهدف =" _blank "> http://www.helmholtz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index. أتش تي أم أل).
- باستخدام TTT، وتوليد الخرائط مصير الخلية لتحديد الوقت بين انقسامات الخلية (خلية أعمار) وأنماط انقسام الخلايا (متماثل غير المتماثلة مقابل).
- تحليل البيانات الكمية من الخطوات 3 و 5 أعلاه لتحديد ما إذا كانت هناك فروق ذات دلالة إحصائية بين مختلف نماذج الماوس المعدلة وراثيا و / أو عناصر التحكم من النوع البري.
2. جيل من الثقافات الابتدائية الثديية الخلايا الظهارية
- إعداد وسائل الإعلام كاملة لعزل الخلايا الظهارية الثديية واحد بعد الاختلاف من تعليمات الشركة الصانعة (EpiCult-B ماوس متوسطة كيت، Stemcell تكنولوجيز، فانكوفر، BC). الجمع بين 450 مل برنامج التحصين الموسع، عبادة-B المتوسط، 50 مل برنامج التحصين الموسع، عبادة الملحق B الانتشار، 5٪ مصل بقري جنيني (FBS)، ميكروغرام / 50 مل البنسلين / الستربتوميسين (PenStrEP) و 10 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة (EGF).
- إعداد التفكك وسائل الإعلام من خلال الجمع بين 1 جزء من خليط كولاجيناز / هيالورونيداز 10X مع 9 أجزاء كاملة من وسائل الإعلام 2.1.
- الموت ببطء الماوس والشروع فورا في التشريح. مكان الماوس على ظهرها على منصة التشريح الستايروفوم وتأمين جميع الأطراف الأربعة حتى الجلد البطني هو مشدود. تشبع الجلد البطني والشعر، بما في ذلك تغمر أطرافه، مع الايثانول 70٪. فضح # 2/3 (الصدر) و # 4/5 (الأربية) الغدد الثديية من خلال جعل شق خط الوسط من خلال الجلد (لا تدخل الصفاق) التي يتم تمديدها إلى شق-Y من خلال الجلد وسطي من كل أطرافه الأمامية و رأسا على عقب شق Y من خلال الجلد وسطي من كل أطرافه الخلفية.
- باستخدام تشريح حادة، فصل الجلد من underlyingperitoneum، والتراجع على جانبي الجلد حتى يصبح مشدود، وضمان الحصول عليها إلى منصة التشريح الستايروفوم باستخدام الدبابيس. بدءا من الجانب الخارجي، استخدم تشريح حادة مع الاستخدام الحكيم للdisseمقص ction لعزل الأربية سليمة و / أو الغدد الثديية الصدري من النسيج الضام والعضلات الأساسية. وضع لا يزيد عن اثنين الغدد الثديية في طبق بتري معقمة 10 سم والانتقال إلى غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة.
- في غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة، ودراسة الغدد الثديية الغدد الليمفاوية ليتم تحديدها صغيرة العقيدات جيدا مقيدة، مع لون مصفر. إزالة الغدد الليمفاوية من الغدة باستخدام مشرط معقم المحيطة وملقط. اللحم المفروم الأنسجة الثديية في ~ 1 مكعبات 3 مم باستخدام اثنين من المشارط العقيمة، واحدة في كل يد.
- مفروم مكان الأنسجة الثديية وسائل الإعلام في 5 مل التفكك، مزيج من pipetting بلطف صعودا وهبوطا 2-3 مرات باستخدام ماصة 10 مل، واحتضان بين عشية وضحاها (إلى ~ 16 ساعة) في الحاضنة 37 درجة درجة مع 5٪ CO 2 في أنبوب مخروطي 50 مل مع غطاء خففت.
- في صباح اليوم التالي، وإعداد خليط من البرد الحل 1 جزء هانكس "سولت المتوازن (HBSS) التي تحتوي على 2٪ FBS و4 أجزاء مخزنة الأمونيوم كلوريد الحل لتعزيز الحمراء BLالعود تحلل الخلايا (HFAmCl) وكذلك HBSS تستكمل مع FBS الباردة 2٪ (HF). قبل الدافئة التربسين EDTA-(0.25٪)، و 5 ملغ / مل في Dispase الحل المتوازن هانك ملح التعديل، 1 ملغ / مل الدناز I، والإعلام الكامل.
- إزالة أنبوب الطرد المركزي المخروطية مع الأنسجة الثديية من الحاضنة والنبض بلطف دوامة 2-3 ثانية مرتين. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب ز × 450 لمدة 5 دقائق (درجة حرارة الغرفة أو 4 ° C)، وتجاهل طاف.
- إعادة تعليق بيليه في ما لا يقل عن 10 مل HFAmCl وأجهزة الطرد المركزي في ز × 450 لمدة 5 دقائق (درجة حرارة الغرفة أو 4 ° C) وتجاهل طاف.
- إضافة 3 مل التربسين EDTA-إلى بيليه ومزيج الأولى مع ماصة 5 مل ثم مع micropipettor P1000 حتى مفتول العضلات (دقيقة 1-3). إضافة 10 مل HF، الطرد المركزي في 450 × ز لمدة 5 دقائق (درجة حرارة الغرفة أو 4 ° C) وتجاهل طاف.
- إضافة 2 مل من 5 ملغ / مل و 200 Dispase ميكرولتر من 1 ملغ / مل الدناز الأول لهذا بيليه ومزيج مع micropipettor P1000 لمدة 1 دقيقة. يجب أن تكون العينة اومهولكن لا udy مفتول العضلات. إذا مفتول العضلات، إضافة 100 ميكرولتر من الدناز I وتخلط مرة أخرى.
- إضافة 10 مل الباردة HF، سلالة من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرون وأجهزة الطرد المركزي في 450 × ز لمدة 5 دقائق (درجة حرارة الغرفة أو 4 ° C) وتجاهل طاف.
- إعادة تعليق بيليه النهائي في وسائل الإعلام كاملة. تحديد العدد الإجمالي للخلايا (باستخدام عدادة الكريات أو مكافحة كولتر). اثنين الغدد الثديية تسفر حوالي 1 × 06 حتي 01 أكتوبر X 10 7 الخلايا. لوحة الخلايا الظهارية الأساسي في لوحة 6 جيدا مسطحة القاع في مناطق ذات كثافة تبلغ 1.5 X 5 10 خلايا لكل بئر.
3. التصوير الخلية الحية
- مباشرة بعد الطلاء الخلايا، ضع لوحة 6 جيدا بشكل آمن على مرحلة المجهر في غضون 5٪ CO 2 / مشبعة humidity/37 درجة حرارة C ° غرفة الحضانة. ضبط مكثف لإضاءة كوهلر ومركز حلقات المرحلة. لتجارب المعروضة هنا، مقلوب نيكون الكسوف TE300/PerkinElmer غزل متحد البؤر القرصتم استخدام نظام المجهر في المرحلة widefield وضع التباين مع عدسة الهدف 10X.
- البرمجيات مفتوحة الحصول على الصور، إنشاء وتسمية مكتبة للصور مرور الزمن، وحفظ لموقع مع مساحة كافية للملفات الكبيرة. عرض التجارب هنا استخدمت الحصول على الصور برنامج Volocity (الإصدار 5.3.1، PerkinElmer، التايم، MA).
- تسمح لوحة لتتوازن في الحاضنة المجهر مدة لا تقل عن 15 دقيقة. خفض العدسات لتجنب تدخل مرحلة عدسة. تحت عنوان "المرحلة"، حدد "معايرة المرحلة". إعادة الاستحواذ على التنسيق الطائرة، مجموعة Z = صفر نقاط تحت التصوير X، Y، Z وعلامة التبويب من خلال تحديد "نقطة إضافة" في إطار "المرحلة" البند. قد يكون مشوهة نقاط مكان في منتصف كل بئر من لوحة 6 جيدا للتصوير والتصوير النقيض مرحلة بالقرب من محيط الآبار البلاستيكية. ترتيب النقاط في 4 مجالات في مربع 4 × (650 ميكرومتر ميكرومتر X 700 الحقول)، ولكل منها التداخل صغيرة (حوالي 5٪). حفظ النقاط المحددة تحت عنوان "الأيله ".
- تحت عنوان "المرحلة" تحديد "جعل التركيز الخريطة" واتبع التعليمات لتعيين التركيز من كل نقطة. مجموعة صورة توقيت اقتناء لالتقاط 4 صور للساعة الواحدة (كل 15 دقيقة). ويمكن تعديل هذه اعتمادا على متطلبات محددة التجربة. حفظ الخريطة التركيز تحت عنوان "المرحلة".
- انقر بزر الماوس الأيمن على الجانب الأيمن أداة "الحصول على صورة" شريط وحفظ الإعدادات التصوير. اضغط على زر التسجيل لبدء التصوير. بعد 1 ساعة، والتحقق من التركيز من الصور لمعرفة ما اذا هناك حاجة إلى أي تعديل.
- رصد ومتابعة التصوير الحي لمدة 5 أيام، وتنتهي عندما تصبح الخلايا متموجة.
4. مشاهدة مباشرة من الزمن الفاصل بين الصور لتقييم التوقيت والآلية الأولية الخلية طلائي تشكيل مستعمرة، حدوث موت الخلايا المبرمج، والتخلص من التغيرات المورفولوجية
- يمكن مشاهدة مباشرة لمرور الزمن تكون الصور باستخدام أي أداء مشاهدة فيديو متوافقة البرمجيات (مثل HTTP:/ / www.real.com/ RealPlayer أو غيرها من البرامج مجانية أو متاحة تجاريا). يمكن الاطلاع على الصور في شكل TIFF. في هذه الخطوة أو بعد تحويلها إلى ملفات JPG (انظر الخطوة 5).
- لتحديد آلية تشكيل مستعمرة الأولية، وتبدأ مع كومة صورة واحدة تمثل موقع واحد على لوحة التصوير. في اطر الأولية، سوف تكون الخلايا العائمة. اتبع الصور المسلسل لتحديد الخلية الأولى عندما تلتزم الظهارية لوحة. في هذه الخطوة، يمكن تحديد الخلايا الظهارية ومتباينة من الخلايا الليفية من التشكل بصورة أكثر مكعبي الشكل. اتبع هذه الخلية الظهارية واحدة من خلال الصور واتبع المسلسل مصيره على مدار 24 ساعة اللاحقة. تسجيل إذا أصبح محاطا الخلايا الظهارية إضافية أو يخضع لانقسام الخلايا أو موت الخلايا المبرمج. إذا تحيط بها الخلايا الظهارية، يمكن تحديد آلية تشكيل مستعمرة مباشرة عن طريق عرض إذا وتستمد الخلايا المحيطة من الخلايا العائمة التي تجميع ثم مع خلية تمسكا الأولية (ق) أومن تقسيم الخلية تمسكا الأولي. تسجيل عدد من المستعمرات التي شكلتها تجميع الخلية مقابل انقسام الخلايا خلال أول 24 ساعة.
- لتحديد عدد الخلايا الملتصقة في البداية أن موت الخلايا المبرمج الخضوع خلال فترة زمنية محددة، اتبع الصور المسلسل لظهور ملامح كلاسيكية من موت الخلايا المبرمج في تطوير خلية التي كانت ملتصقة ( http://www.alsa.org/research/about -als-research/cell-death-and-apoptosis.html مسجل)، وعدد الخلايا أفكارك التي تم تحديدها خلال كامل مدة التصوير أو ضمن أطر زمنية محددة.
- مع مرور الوقت، الخلايا الظهارية في الثقافة مورفولوجيا يغير من شكل ومكعبي الشكل من الأولي إلى مظهر أكثر ممدود يتفق مع EMT. اتبع الصور المسلسل لتحديد يوم / ساعة بعد الطلاء وعندما يحدث هذا.
5. صورة ملف تعديل
- إعادة تسمية المجلدات والملفات الصور وفقا لمتطلبات البرنامج أداة تتبع لتيم استخدام برنامج مجاني مثل إعادة تسمية 2.1.6 ( http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml ) لإعادة تسمية الملفات في مجموعات. إنشاء مجلد واحد يحتوي على جميع الملفات والمجلدات من التجربة واسم المجلد (على سبيل المثال
- إنشاء مجلد فرعي لكل نقطة / حيث تم تصوير موقف الثقافة. اسم المجلدات الفرعية: EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER. يجب أن يكون موقف عدد 3 أرقام. مثال: 072511RN_p001. وضع جميع ملفات الصور من هذا الموقف الفردية في المجلد الفرعي.
- إضافة timepoint (باستخدام 5 أرقام) ورقم القناة (لأنه ليس هناك قناة واحدة فقط حقل مشرق، استخدم "0") في نهاية كل اسم الملف في هذا التنسيق:
EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER_tTIMEPOINT_wCHANNELNUMBER.jpgExample: 072511RN_p001_t00001_w0.jpg - إنشاء ملف سجل لكل منصب عن طريق تحميل البرنامج أولا TTTlogfileconverter مجانا من موقع TTT. بدء تشغيل البرنامج TTTlogfileconverter وحدد المجلد التجربة. إدخال فاصل زمني الصورة (في ثانية). للحصول على صورة اتخاذ كل 15 دقيقة، أدخل 900 ثانية. ثم اضغط الزر الأخضر سرية ملفات السجل.
6. توليد خرائط مصير خلية من خلايا واحدة باستخدام TTT
- Create مجلد يسمى TTTexport ومجلد فرعي يسمى TTTfiles حيث سيتم تخزين كافة البيانات تتبع خلية باتباع إرشادات البرمجيات TTT
- بدء تشغيل البرنامج TTT، حدد الأحرف الأولى المستخدم، ثم انقر على "متابعة".
- اضغط على "مجموعة NAS"، حدد المستخدم إنشاء "TTTexport" المجلد ثم انقر فوق موافق. في المستعرض، حدد مجلد التجربة، حدد مجلد الموقف، ثم اضغط على "تحميل الموقف" الزر.
- تعيين عامل العين إلى "10X". تحميل عدد من الصور المطلوبة (تحميل كافة الصور يستحب للمرة الأولى).
- في إطار محرر الخلية، حدد "مستعمرة جديدة" ضمن القائمة ملف. في إطار الفيلم، اضغط على "خلية المسار" أو F2 لبدء تعقب خلية.
- تحديد خلية في Movie النافذة واستخدام الماوس لوضع المؤشر فوق الخلية. وينبغي أن يكون دائرة مع عدد من الخلية تظهر بعد النقر F2. استخدام "0" مفتاح على لوحة الأرقام من لوحة المفاتيح لتتبع موضع الخلية وتقدم إلى الصورة التالية. تحريك المؤشر لمتابعة وضع كل خلية من خلال كل إطار. لحذف المسار والعودة إلى السابق "ديل" صورة الصحافة على لوحة الأرقام. للانتقال إلى الأمام دون إطارات تتبع الصحافة خلية "3"، وللانتقال إلى الخلف دون يتعقب اضغط على "1" على لوحة الأرقام.
- لوضع علامة على انقسام الخلايا انقر فوق "شعبة" الزر في نافذة الفيلم. بمناسبة موت الخلايا انقر فوق "موت الخلية" الزر في نافذة الفيلم. مرة واحدة في شعبة حدث، يمكن تتبع الخلايا الوليدة في خريطة خلية نفس المصير من جانب الحق النقر على رمز دائرة الخلية ابنة المعينة في إطار محرر خلية تتبع لبدء وضع تلقائيا.
- اضغط F10 لحفظ شجرة. وكل شجرة إلا في حظيرة الانتاج المعينةإيه (TTTExport). لبدء مصير الخلية الجديدة الخريطة، اختر "مستعمرة جديدة" تحت "ملف" ثم قائمة "فتح" في إطار محرر الخلية.
- جدولة البيانات مدى الحياة بعد جمع الخلايا من علامة التبويب "خلية البيانات" في إطار محرر الخلية.
7. إحصائية تحليلات
- إما استخدام الطالب اختبار t (إذا المقارنة بين اثنين من المورثات) أو ANOVA (إذا بمقارنة> اثنان المورثات) لتحديد ما إذا الاختلافات في البيانات حدودي مثل أعداد المستعمرات الخلية الأولية، أعمار خلية أو ساعات حتى ظهور EMT بين الأنماط الجينية المختلفة إحصائيا كبيرة. ويمكن مقارنة أفكارك التردد وعدد / العدد الإجمالي الخلايا مطلي باستخدام الطالب اختبار t أو ANOVA أو مع مان ويتني أو كروسكال واليس، عندما تستمد كنسبة مئوية من الخلايا الملتصقة.
- إجراء اختبارات الطاقة باستخدام بيانات من تحليل التجارب الأولية لتحديد عدد التجريبية تحتاج إلى إجراء نسخ متماثلة والخرائط مصير الخلايا المتولدة من كل تكرار ليالي كافيةtatistical الطاقة باستخدام مجانية متاحة (مثل http://statpages.org/ ). في التجارب المقدمة هنا، كانت مزارع الخلايا المشتقة من ثلاثة الفئران في التركيب الوراثي كافية لتحديد ما إذا كانت هناك فروق ذات دلالة إحصائية في تشكيل مستعمرة الخلية والخلية أعمار عندما تم إجراء تعديلات وراثية محددة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويمكن تمييز الخلايا الظهارية والخلايا الليفية من شكل الخلية. الخلايا الظهارية لها شكل مكعبي الشكل (الشكل 1A-B) والمستعمرات الخلية شكل (الشكل 1A). الخلايا الليفية، وهو نوع من الخلايا اللحمية، لها مورفولوجيا ممدود (الشكل 1C).
تم تقريب الخلايا والعائمة في بداية التصوير (الشكل 2A-D). بعد الحجز على لوحة مسطحة وأصبحوا أظهرت ظهور مكعبي الشكل من نوع (2E الشكل، H). بنسبة 4 أيام الثقافة غالبية الخلايا الظهارية ممدود إلى التشكل EMT مثل (الشكل 2I-L). حدث هذا التغيير مع نفس التسلسل الزمني في جميع التراكيب الوراثية المدروسة. وكانت بعض الصور الرقمية ضبابية لأنه لم يتم تعيين كوهلر الإضاءة والمرحلة بشكل صحيح محاذاة الدائري (الشكل 2D، H، L).
الخلايا العائمة وضعت في تعريف الفرد coloni الخلايا الظهاريةES من 24 ساعة بعد الطلاء (الشكل 3A، B). كشفت المسلسل تحليل الصور التي تم إنشاؤها بواسطة هذه المستعمرات تجميع الخلايا بدلا من انقسام الخلية. بينما تعطل BRCA1 في حد ذاته لم يغير عدد من المستعمرات المشكلة، إضافة TP53 haploinsufficiency إلى خفض كبير في عدد من المستعمرات وشكلت إضافة ERα الإفراط في التعبير زيادة كبيرة في عدد من المستعمرات تشكيل (الشكل 3C).
فمن الأهمية بمكان لرصد الصور الرقمية المكتسبة وضبط الخريطة كثيرا خلال التركيز على مدار 24 ساعة الأولى والخلايا نعلق على لوحة ومن ثم على الأقل مرتين يوميا لضمان البقاء في خلايا التركيز والثقافات ليست ملوثة. للخطر دقة التحليلات إذا الخلايا المصورة ليست في التركيز (الشكل 4).
في التجربة ممثل المعروضة هنا، وكان السؤال الحاسم لتحديد إذا كانت التغييرات في مستوى التعبيرتغيير الصورة من الجينات المعروفة للتأثير خطر الاصابة بسرطان الثدي (BRCA1، TP53، ومستقبلات هرمون الاستروجين 1 (Esr1) 1) عدد الساعات بين انقسامات الخلية (خلية مدى الحياة) أو أثرت على أنماط تقسيم (متماثل غير المتماثلة مقابل) في غير سرطانية الابتدائي الخلايا الظهارية الثديية. لإنجاز هذا، وقد تم توليد خرائط الفردية مصير الخلية (الأشجار) باستخدام TTT. ويوضح أمثلة لخرائط ممثل مصير الخلية لكل من التراكيب الوراثية 4 اختبار (الشكل 5A-D). كانت المورثات الأربعة للاختبار الخلايا البرية من نوع (لا التلاعب الجيني) (الشكل 5A)، وفقدان كامل طول BRCA1 (BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre) (الشكل 5B)، وفقدان كامل طول BRCA1 في تركيبة مع TP53 haploinsufficiency (BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -) (الشكل 5C)، وفقدان كامل طول BRCA1 بالاشتراك مع haploinsuffici TP53ency وكسب Esr1 (BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -/MMTV-rtTA/tet-op-ER) (الشكل 5D). تم إيقاف توليد خرائط مصير الخلية عندما أصبحت الخلايا متموجة (~ أجيال 3-4) منذ القاطعة لتتبع الخلايا واحدة لم يعد ممكنا بعد ذلك. لم تدرج الجيل 0 (الوقت لتقسيم الخلية الأولى) في تحليل أعمار الخلية لمدة كان الجيل 0 أطول وأكثر من متغير الأجيال اللاحقة. وقد جمعت الأجيال 1، 2، 3، و 4 معا من أجل التحليلات النهائية بسبب عدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية في متوسط أعمار خلية أو خطأ المعياري للمتوسط (SEM) بين هذه الأجيال. كشفت المقارنات بين أعمار خلية متوسط بين الأنماط الجينية المختلفة (الشكل 5E) أن فقدان كامل طول BRCA1 تخفيض عدد الساعات بين انقسامات الخلية من 21.3 ± 1.6 ساعة (من النوع البري) إلى 16.5 ± 1.0 ساعة (BRCA1 f11/f11 / MMTV-لجنة المساواة العرقية). لاtably، على الرغم من ارتباط فقدان أليل واحد في TP53 بالإضافة إلى فقدان كامل طول BRCA1 مع زيادة كبيرة في سرطان الثدي development1، يعني مدى الحياة لم تتغير الخلية (16.3 ± 1.2 ساعة) مقابل الفئران التي تفتقر BRCA1 فقط. ومن المثير للاهتمام من كسب Esr1 في BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -/MMTV-rtTA/tet-op-ER الفئران استعادة العمر الخلية مدد إلى مستويات قريبة من النوع البري (19.3 ± 2.1 ساعة)، وإن كان هذه الفئران لديها درس أعلى نسبة من سرطان الثدي من تطوير جميع النماذج here.1 هذه النتائج تشير إلى أن فقدان كامل طول BRCA1 لم يترافق دائما مع عمر الخلية تقصير، بدلا تعديل لهذه بسبب الإفراط في التعبير عنها ERα. يمكن المحتملة التالية خطوة التجارب باستخدام هذه التكنولوجيا تكون الجرعة والاستجابة التجارب باستخدام الاستروجين مختلفة، وعوامل النمو الأخرى، أو التداوي مرشح لقياس أثرها على حياة الخلية في backgro الجينية المختلفةجهاز الأمم المتحدة الإنمائي. وعلى النقيض من تأثير على حياة الخلية مدة، ودرس أي من تغيرات جينية تغيير أنماط هنا انقسام الخلايا.
الشكل 1. ظهور مستعمرة الخلايا الظهارية (A)، الخلايا الظهارية (B)، والخلايا الليفية (C) من الوقت الفاصل بين التصوير. الخلايا الظهارية في حين تبدو أكثر مكعبي الشكل الخلايا الليفية تبدو أكثر ممدود. قضبان حجم = 50 ميكرومتر.
الشكل 2. ممثل المسلسل الوقت الفاصل بين الصور من الوقت 0 و 2 و 4 أيام إظهار التغييرات في مورفولوجية الخلوية مع مرور الوقت والاختلاف في المظهر مع وبدون كولإيه الإضاءة. وفي الوقت 0 الخلايا مطلي تطفو (النصال م)، لمدة يومين في الثقافة فهي ملتصقة، وربما يحمل مورفولوجيا مكعبي الشكل من نوع (الأسهم سميكة E، H)، وأربعة أيام في الثقافة التي استطال وإثبات وجود EMT مثل مورفولوجيا (IL رقيقة السهام). كوهلر الإضاءة موجودة في لوحات AC، EG، وIK. لوحات D، H L وتوضيح الصور دون إضاءة كوهلر. الصور المعروضة هي من وجهة التصوير نفسه مع مرور الوقت. قضبان حجم = 200 ميكرومتر. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
الشكل 3. عدد المستعمرات في الخلايا الظهارية 1 يوم تختلف بحسب التركيب الوراثي. (A) خلايا مدورة العائمة في بداية الوقت الفاصل بين التصوير. (B) مستعمرتين ممثل الخلايا الظهارية (الأسهم). (C) أرقام من ظهائرالمستعمرات خلية ل / الإطار شكلت في 24 ساعة متنوعة من النمط الجيني. الرسوم البيانية لتوضيح الخطأ ويعني المعياري للمتوسط. * p <0.05، ANOVA. قضبان حجم = 200 ميكرومتر. خلايا معزولة من الغدد الثديية دون ورم واضح في الفترة من 10 - إلى 12-f11/f11/MMTV-Cre BRCA1 اشهر (ن = 4)، f11/f11 BRCA1 / MMTV لجنة المساواة العرقية، / P53 + / - (ن 3 =)، BRCA1 تم تصوير f11/f11/p53 + / -/MMTV-Cre/Tet-op/-ER/MMTV-rtTA (ن = 3)، والبرية من نوع (ن = 3) الفئران للدراسات. أجريت خمس تجارب التصوير مستقلة تتألف من مجموعات مختلفة من الفئران البرية من نوع وراثيا. الواردة سائل الإعلام الأحمر الفينول. تم إضافة أي هرمون الاستروجين. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
الشكل 4. يمكن الخروج من التركيز الصور لا تكون دقيقةتحليل لاي. قبل التصوير لوحة، لوحة لابد وأن تقف في الحاضنة لمدة 15 دقيقة التصوير لتتوازن. خلال اليوم الأول من التصوير، ينبغي التحقق من التركيز وضبط كل بضع ساعات. وينبغي بعد ذلك أن يتم التحقق مرتين يوميا لكنها لا تزال عموما أكثر استقرارا. سهم يشير إلى خارج مستعمرة التركيز الخلايا الظهارية.
الشكل 5 خرائط مصير الخلايا المولدة من وحيدة الخلية تتبع لاستخدام TTT (A) من النوع البري، (B) BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre، (C) BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -، و(D) BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -/MMTV-rtTA/tet-op-ER الفئران. يشار إلى الخلايا التي لا يمكن تعقب بسبب فقدان أو خارج الإطار إلى طبقة الخلايا متموجة من علامة استفهام. عندما لا علامة استفهاموأشارت، وتتبع وانتهت عمدا بسبب التقاء الخلية وعدم القدرة على تتبع بشكل لا لبس فيه وحيدة الخلية مصير. (E) متوسط أعمار متنوعة من الخلية الوراثي. الرسوم البيانية لتوضيح الخطأ ومستوى متوسط من أعمار خلية يعني (الوقت بين انقسامات الخلية) على مدى أجيال 1-4 لكل النمط الجيني. وكانت أعمار خلية يعني أقصر بكثير في الخلايا الظهارية الثديية المستمدة من f11/f11/MMTV-Cre BRCA1 و BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / - بالمقارنة مع الفئران البرية من نوع. * p <0.05، ANOVA. خلايا معزولة من الغدد الثديية دون ورم واضح في الفترة من 10 - إلى 12-f11/f11/MMTV-Cre BRCA1 اشهر (ن = 4)، f11/f11 BRCA1 / MMTV لجنة المساواة العرقية، / P53 + / - (ن 3 =)، BRCA1 تم تصوير f11/f11/p53 + / -/MMTV-Cre/Tet-op/-ER/MMTV-rtTA (ن = 3)، والبرية من نوع (ن = 3) الفئران للدراسات. خمس تجارب التصوير مستقلة تتألف من مجموعات مختلفة من انجين من النوع البري وراثياأجريت الفئران eered. الواردة سائل الإعلام الأحمر الفينول. تم إضافة أي هرمون الاستروجين. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الخطوات الحاسمة
من المهم للتأكد من أن يتم حصاد الغدد الثديية من الفئران من نفس العمر للتحكم عن التقلبات المرتبطة بالعمر في الخلايا الظهارية الثديية السلوك. عندما الخلايا تصفيح، ينبغي مطلي نفس العدد من الخلايا في كل بئر لكل تجربة. يجب أن تكون الخلايا متفرق نسبيا عند الطلاء المعدني بحيث لا تصبح الثقافات متموجة بسرعة كبيرة جدا مما يجعل من الممكن لمتابعة الخلايا الفردية متعددة من خلال الصور التسلسلية. من الضروري أن تكون لوحة معايرتها في الحاضنة قبل التصوير لأن التركيز سوف تتغير بعد معايرتها هي لوحة. مرة واحدة وقد بدأ التصوير، يجب فحص التركيز في كثير من الأحيان ويتم تعديلها حسب الحاجة، خاصة في أول 24 ساعة. فمن المهم أن يكون درجة حرارة منظم حرارة الحاضنة وقبل. ينبغي أن يقتصر عدد من الناس في الذهاب والخروج من الغرفة قدر المستطاع. نوصي ممارسة جميع جوانب settinز تصل التجربة مسبقا لضمان تكرار ومراقبة الجودة. كما هو الحال مع جميع تجارب زراعة الخلايا، والعقم مسألة مهمة ويجب أن تستخدم معيار زراعة الخلايا العقيمة الممارسات في جميع الأوقات.
الادخار والتلاعب في ملفات الصور الكبيرة يتطلب قدرا كبيرا من مساحة الذاكرة. ويمكن استخدام محرك أقراص شبكة مشترك أو محركات الأقراص الصلبة المحمولة. يتم تحويل الملفات مرة واحدة من المهم للتأكد من اسمه باستمرار الصور بشكل صحيح ووضعها في مجلدات المقابلة. كثرة يحفظ البيانات الرقمية يجب أن يتم تنفيذ جميع مراحل العملية.
القيود
هذا الأسلوب يستخدم نظام 2-D الثقافة التي لا تسمح لتحليل الاختلافات السلوكية التي قد تصبح واضحة في نظام الثقافة 3-D. لا يجوز مدد أعمار خلية يمكن قياس بتكاثر بعد انقسام الخلايا وحظ لأول مرة حيث وصل عدد ساعات لانقسام الخلية الأولى بعد الحرف الأولالطلاء الاتحاد العالمي للتعليم للخلايا هو متغير.
ممكن التعديلات
اعتمادا على متطلبات التجربة، يمكن اتخاذ الوقت الفاصل بين الصور أكثر أو أقل في كثير من الأحيان. على سبيل المثال، إذا الهياكل الخلوية عابرة هي ليكون كميا، قد فاصل زمني ثانية 5 سيكون أكثر ملاءمة. ويمكن استخدام إجراءات أخرى لتوليد الأولية الثديية الثقافات الخلايا الظهارية. ويمكن استخدام أي معدات التصوير لإنشاء الوقت الفاصل بين التصوير، طالما أنها قادرة على تلبية متطلبات التجربة. ويمكن استخدام نظم بديلة لوحيدة الخلية تتبع. وكان لهذا الإجراء الموصوفة هنا، وهو معيار مسطحة القاع البلاستيك 6 جيدا لوحة كافية. ويمكن استخدام الصحون البلاستيكية لجميع العدسات الطويلة المسافة الجوية العاملة مثل 10X، 4X، 20X و. من المهم أن تختار مناطق بالقرب من مركز الصحون البلاستيكية عند تنفيذ المرحلة التصوير النقيض منذ منحني من البلاستيك بالقرب من حواف الأطباق في معظم ويشوه الضوء.ستكون هناك حاجة ساترة الزجاج الآبار سمك القاع لعمل عادي العدسات الغمر مسافة (النفط والمياه، والجلسرين، الخ)، والتي عادة ما تكون في أعلى التكبير.
حل المشاكل
عندما الخلايا مطلي، وينبغي أن تكون وسائل الإعلام كافية للحفاظ على نمو الخلايا لمدة 5 أيام لتقليل الحاجة لمعالجة لوحة على المسرح، ولكن إذا لزم الأمر، يمكن إضافة وسائل الإعلام. فمن المستحسن أن تبقى التبخر إلى الحد الأدنى. وينبغي أن تدار من خلال وضع التبخر 03:57 الأطباق من الماء منزوع الأيونات معقمة داخل الحاضنة لهم وإعادة تعبئتها عند الضرورة. فمن الممكن لملء الآبار غير المستخدمة من لوحة 6 جيدا بالماء منزوع الأيونات العقيمة.
إذا لم يتم تحميل الصور في برنامج TTT، أولا التحقق والتأكد من ترتيب الملفات والمجلدات واسمه بشكل صحيح. المقبل، معرفة ما اذا كان ملف سجل في المجلد الصحيح (راجع الخطوة 5.5).
Futuتطبيق إعادة التوجيه أو بعد اتقان تقنية
ويمكن استخدام نفس الإجراء العام لتحليل سلوك أنواع الخلايا بما في ذلك الخلايا الثديية الأخرى الإنسان الظهارية الأولية وكذلك خلايا سرطان الثدي. على سبيل المثال، يمكن تحليل السلوك الوراثي محددة و / أو استجابة للعلاجات مرشح. يمكن أن يقوم السكان الخلية بدلا من ذلك، من التصوير مضان تنشيط الخلايا (FAC) أو تسميات مصنفة الفلورسنت وأضاف لمراقبة أنواع معينة من الخلايا.
أهمية هذه التقنية فيما يتعلق بأساليب القائمة
إضافة الوقت الفاصل بين التصوير وتحليلات للسلوك الخلية مع مرور الوقت لزراعة الخلايا التقليدية وتقنيات وضع العلامات يوفر بيانات كمية واحدة من الخلايا مع مرور الوقت بدلا من ديناميات السكان فقط. هذه التقنية تسمح لاحظ الخلايا واحد بشكل مستمر، على عكس الطرق التقليدية التي تسمح للمراقبة فقط في timepoints منفصلة. Moreover، هل الطرق التقليدية تتطلب أن يزعجك الخلايا عن طريق نقلهم من والى الحاضنة لعرضها تحت المجهر في حين أن النهج الموصوفة هنا يسمح لاحظ الخلايا دون تحويله. وأخيرا، الوقت الفاصل بين التصوير يوفر سجل دائم للخلايا تحت الملاحظة التي يمكن إرجاعها إلى لتحاليل أخرى. استخدام TTT لتتبع سلوك كل خلية يسمح تحليل القاطعة لمعلمات متعددة، ولا تتطلب استخدام تسمية الفلورسنت لتوطين خلايا معينة تحت الملاحظة. تقنية تكشف الاختلافات في السلوك الثديية الخلايا الظهارية التي يصعب قياسها في أقسام الأنسجة ثابت من الغدة الثديية. قياسات العمر الخلية تحديد عدد الساعات بين الأحداث الإنقسامية. هذا القياس يوفر بيانات محددة عن العدد الفعلي لساعات بين انقسامات الخلية مما يدل على طول دورة الخلية في ساعات. ويمكن لباحث استخدام هذه البيانات لتحديد كيفيةالجينية تعديلات محددة أو ثقافة الخلية تأثير ظروف طول الدورة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب تعلن أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة المالية.
Acknowledgments
الكتاب أود أن أشكر BOFAN وو وRaithel المسيحية للمساعدة التقنية وريجر مايكل على عرضه لخلية الحية التصوير. بدعم من NCI، NIH RO1CA112176 (PAF)، NCI، NIH. R01CA89041-10S1 (PAF)، الألمانية Akademischer Austaush DIENST فولت A/09/72227 المرجع. 316 (REN)، وزارة الدفاع W81XWH-11-1-0074 (REN)، WCU (الدرجة العالم جامعة) البرنامج من خلال مؤسسة البحوث الوطنية لكوريا بتمويل من وزارة التربية والتعليم والعلوم والتكنولوجيا (R31-10069) (PAF )، NIH IG20 RR025828-01 (مرفق معدات القوارض الجدار)، والمعاهد الوطنية للصحة NCI 5P30CA051008 (الميكروسكوب والتصوير والثروة الحيوانية المشتركة).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EpiCult-B Basal Medium Mouse | StemCell Technologies | 05610 | |
| EpiCult-B Proliferation Supplements Mouse | StemCell Technologies | 05612 | |
| recombinant human Epidermal Growth Factor (rhEGF) | StemCell Technologies | 02633 | |
| Collagenase/Hyaluronidase | StemCell Technologies | 07912 | |
| Disposable Scapels | Feather | 2975#10 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | StemCell Technologies | 37150 | |
| Ammonium Chloride | StemCell Technologies | 07800 | |
| Tryspin-EDTA | StemCell Technologies | 07901 | |
| Dispase | StemCell Technologies | 07913 | |
| DNase I | StemCell Technologies | 07900 | |
| 40 μm cell strainer | StemCell Technologies | 27305 | |
| FBS | StemCell Technologies | 06100 | |
| PenStrep | Gibco | 15140 |
References
- Jones, L. P., et al. Activation of estrogen signaling pathways collaborates with loss of Brca1 to promote development of ERalpha-negative and ERalpha-positive mammary preneoplasia and cancer. Oncogene. 27, 794-802 (2008).
- Burga, L. N., et al. Altered proliferation and differentiation properties of primary mammary epithelial cells from BRCA1 mutation carriers. Cancer Res. 69, 1273-1278 (2009).
- Li, M., Wagner, K., Furth, P. A. Preparation of primary mammary epithelial cells and transfection by viral and nonviral methods. Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer. Ip, M., Asch, B. , Kluwer Academic, Plenum Press. (2000).
- Schroeder, T.
- Schroeder, T. Long-term single-cell imaging of mammalian stem cells. Nature Methods. 8, S30-S35 (2011).
- Eilken, H. M., Nishikawa, S. -I., Schroeder, T. Continuous single-cell imaging of blood generation from haemogenic endothelium. Nature. 457, 896-900 (2009).
- Kokkaliaris, K. D., Loeffler, D., Schroeder, T. Advances in tracking hematopoiesis at the single-cell level. Current opinion in hematology. , (2012).
- Rieger, M. A., Hoppe, P. S., Smejkal, B. M., Eitelhuber, A. C., Schroeder, T. Hematopoietic cytokines can instruct lineage choice. Science. 325, 217-218 (2009).
- Rieger, M. A., Schroeder, T. Instruction of lineage choice by hematopoietic cytokines. Cell Cycle. 8, 4019-4020 (2009).
- Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nat. Protoc. 6, 214-228 (2011).
