Zeitraffer-Imaging of Primary Präkanzeröse Brustepithelzellen aus gentechnisch veränderten Mausmodellen der Breast Cancer Abgeleitet

Summary

Zeitraffer-Bildgebung verwendet wird, um das Verhalten von primären präneoplastischen Brustepithelzellen aus gentechnisch veränderten Mausmodellen Brustkrebsrisiko abgeleitet, um zu bestimmen, ob es Korrelationen zwischen spezifischen Verhaltensparametern und unterschiedlichen genetischen Läsionen sind beurteilen.

Abstract

Zeitraffer-Aufnahmen verwendet werden, um das Verhalten von kultivierten primären präneoplastischen Brustepithelzellen aus verschiedenen gentechnisch veränderten Mausmodellen von Brustkrebs ableiten zu vergleichen. Zum Beispiel kann zwischen Zellteilungen (Zelle Lebensdauern), apoptotischen Zellzahlen, Evolution von morphologischen Veränderungen, und der Mechanismus der Koloniebildung quantifiziert und verglichen werden Zellen, die spezifische genetische Läsionen. Primäre Brustepithelzellen Zellkulturen aus Milchdrüsen ohne tastbaren Tumor erzeugt. Drüsen sorgfältig mit klare Trennung von angrenzenden Muskels reseziert werden Lymphknoten entfernt, und Einzelzellsuspensionen von angereichertem Brustepithelzellen werden durch Zerkleinern Brustgewebe durch enzymatische Dissoziation und anschließender Filtration erzeugt. Single-Zellsuspensionen ausplattiert und direkt unter dem Mikroskop platziert innerhalb einer Inkubatorkammer für Live-Cell-Imaging. Sixteen 650 um x 700 um Felder in einer 4x4-Konfiguration von jedem well einer 6-Well-Platte werden alle 15 min 5 Tage lang abgebildet. Zeitraffer-Bilder untersucht direkt an zellulären Mechanismus Verhaltensweisen, und die Häufigkeit der Zellkolonie Bildung innerhalb der ersten 24 Stunden der Ausplattieren der Zellen (Aggregation gegenüber Zellproliferation), Auftreten von Apoptose und Auslaufen von morphologischen Veränderungen gehören zu messen. Single-cell-Tracking wird verwendet, um das Schicksal der Zelle Karten für die Messung der einzelnen Zelle Lebensdauer und Untersuchung der Zellteilung Muster zu erzeugen. Quantitative Daten werden statistisch ausgewertet, um auf signifikante Unterschiede im Verhalten mit spezifischen genetischen Läsionen korreliert beurteilen.

Introduction

Gentechnisch veränderte Mausmodelle sind Werkzeuge, um zu studieren und zu verstehen, wie verschiedene genetische Läsionen das Risiko an Brustkrebs zu erkranken beitragen. Beispielsweise wurden gentechnisch Mäusen gezeigt, dass die Kombination von drei Faktoren ab: Verlust des Volllängen-Brustkrebs 1, früher Ausbruch (BRCA1) Gens in Brustepithelzellen, Tumor Protein p53 (TP53) Keimbahn Haploinsuffizienz und Brustepithelzellen Zelle gezielt hochreguliert Östrogenrezeptor alpha (ERa) Expression zur Entwicklung von Brustkrebs in 100% der BRCA1 ^{floxed (f) 11/f11/Mouse Mammary Tumor Virus (MMTV) -Cre/p53 + / -/tetracycline-operator ( Tet-op) -ER/MMTV-reverse Tetracyclin-Transaktivator (rtTA} Mäusen durch Alter von 12 Monaten im Vergleich zu den niedrigeren Prozentsätzen in BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53} berichteten ^{+ /} - Mäuse ohne ERa Überexpression (~ 50 - 60%) und BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre} Mäuse ohne TP53 haploinsufenz (<5%). ¹

Dynamische Zeitraffer-Bildgebung des Verhaltens von präneoplastischen primäre Brustepithelzellen zeigt Unterschiede in Zellverhalten, die weniger leicht in statischen Gewebeschnitte sind erwünscht. Änderungen in der Proliferation und Differenzierung in der primären Mamma-Zellen aus menschlichen BRCA1-Mutation Träger beobachtet. ² Erstellung von Einzel-Zell-Suspensionen von primären Brustepithelzellen von normalen und gentechnisch veränderten Mäusen durch enzymatische Dissoziation von resezierten Brustdrüsengewebe generiert werden. ³ Zeitraffer Bilder betrachtet werden, um den Mechanismus und den Zeitpunkt der Zellkolonie Aussehen und Auftreten von morphologischen Veränderungen in Zellen, einschließlich epithelial-mesenchymale Transition (EMT) und Apoptose zu beurteilen. Erzeugung Zellschicksals Karten werden Quantifizierung der Länge der Zeit zwischen Zellteilungen (Zelle Lebensdauern), und Bestimmung von Mustern der Zellteilung durch Verwendung von Single-Cell-Tracking erleichtert. Timm'S Tracking Tool (TTT) ist öffentlich verfügbaren Software verwendet, um einzelne Zellen Schicksal Karten zu erzeugen. Ihre Nutzbarkeit in der Aufklärung der Mechanismen Zellschicksals wurde festgestellt ^4,5 Prüfung normalen hämatopoetischen Stammzelle Entwicklung ^6-9 und die Erzeugung von Neuronen. ¹⁰

Protocol

Ein. Insgesamt Scheme

1. Generieren Primärkulturen von präneoplastischen Brustepithelzellen aus Brustdrüsen von gentechnisch hergestellten und zu steuern Wildtyp-Mäusen.
2. Nehmen Sie live-cell Bilder alle 15 min mit Volocity Bildaufnahme-Software (Version 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA) für bis zu 5 Tagen.
3. Erfahren Zeitraffer-Bilder direkt auf Timing und den Mechanismus der Epithelzelle Koloniebildung, Auftreten von Apoptose und Auslaufen von morphologischen Veränderungen beurteilen.
4. Konvertieren Volocity generiert. TIFF Stacks. JPG-Dateien mit MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software (Molecular Devices, LLC Sunnyvale, CA) und rename digitalen Bilddateien (THE Rename 2.1.6, http://www.softpedia.com/get / System / File-Management / THE-Rename.shtml ), um die Kompatibilität mit Tracking Tool Timm-Software (TTT,tz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index.html "target =" _blank "> http://www.helmholtz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index. html).
5. Mit TTT erzeugen Zellschicksals Karten für die Ermittlung der Zeit zwischen Zellteilungen (Zelle Lebensdauer) und Muster der Zellteilung (symmetrischen gegenüber asymmetrischen).
6. Analysieren quantitative Daten aus den Stufen 3 und 5, um festzustellen, ob statistisch signifikante Unterschiede zwischen verschiedenen Mausmodellen gentechnisch und / oder Wildtyp-Steuerelemente sind.

2. Generation of Primary Brustepithelzellen Zellkulturen

1. Bereiten Komplette Medien zur Isolierung von einzelnen Brustepithelzellen nach einer Variation des Herstellers (EpiCult-B Maus Medium Kit, Stemcell Technologies, Vancouver, BC). Kombinieren Sie 450 ml Epi-Cult-B-Medium, 50 ml Epi-Cult B Verbreitung Ergänzung, 5% Fetal Bovine Serum (FBS), 50 ug / ml Penicillin / Streptomycin (PenStrep) und 10 ng / ml Epidermal Growth Factor (EGF).
2. Bereiten Dissoziation Medien durch die Kombination von 1 Teil eines 10x Collagenase / Hyaluronidase Mischung mit 9 Teilen Komplett Media von 2,1.
3. Einschläfern Maus und sofort zur seziert. Bewegen Sie die Maus auf dem Rücken auf einem Styropor-Autopsie-Plattform und sichern Sie alle vier Gliedmaßen so ventrale Haut ist straff. Sättigen ventralen Haut und Haar, einschließlich, dass die über den Gliedern, mit 70% Ethanol. Expose # 2/3 (Thorax) und # 4/5 (inguinal) Brustdrüsen, indem Sie einen Medianschnitt durch die Haut (nicht in das Bauchfell), die in einer Y-Schnitt durch die mediale Haut jedes vorderen Gliedmaßen und wird verlängert eine umgedrehte Y Schnitt durch die mediale Haut jedes hinteren Extremität.
4. Mit stumpf, trennen die Haut vor underlyingperitoneum, ziehen wieder auf beiden Seiten der Haut, bis es gespannt ist, und befestigen Sie es an den Styropor-Sektion Plattform mit Pins. Ausgehend von der Außenseite, verwenden Sie stumpfe Dissektion mit gezielten Einsatz von dissection Schere zu isolieren die intakte inguinal und / oder Thorax Milchdrüsen aus den zugrunde liegenden Bindegewebe und Muskulatur. Nicht mehr als zwei Milchdrüsen in einem 10 cm sterile Petrischale und zu bewegen, um Gewebekultur Kapuze.
5. In Gewebekulturen Kapuze, untersuchen Verschraubungen für Mamma Lymphknoten, die als kleine, gut abgegrenzte Knötchen mit einer gelblichen Farbe identifiziert werden. Entfernen Lymphknoten aus der umgebenden Drüse mit sterilen Skalpell und Pinzette. Mince Brustgewebe in ~ 1 mm ³ Würfel mit zwei sterilen Skalpellen, ein in jeder Hand.
6. Ort zerkleinert Brustgewebe in 5 ml Dissoziation Media, Mischung durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren 2-3 mal mit einer 10 ml Pipette, und über Nacht (bis zu ~ 16 h) in einem 37 ° C Inkubator mit 5% CO ₂ in einem 50 ml konischen Röhrchen mit gelockerten Kappe.
7. Am nächsten Morgen, bereiten eine kalte Mischung aus Balanced Salt 1 Teil Hanks 'Solution (HBSS) mit 2% FBS und 4 Teilen gepufferte Ammoniumchloridlösung auf rot bl fördernood Zelllyse (HFAmCl) sowie kaltem HBSS mit 2% FBS (HF) ergänzt. Pre-warm Trypsin-EDTA (0,25%), Modified 5 mg / ml Dispase in Balanced Salt Hank-Lösung, 1 mg / ml DNase I und Complete Media.
8. Nehmen Sie die konische Zentrifugenröhrchen mit dem Brustgewebe aus dem Inkubator und sanft pulsieren Vortex 2-3 sec zweimal. Zentrifugieren bei 450 × g für 5 min (Raumtemperatur oder 4 ° C) und den Überstand verwerfen.
9. Das Pellet in einem Minimum von 10 ml HFAmCl und Zentrifuge bei 450 × g für 5 min (Raumtemperatur oder 4 ° C) und Überstand verwerfen.
10. 3 ml Trypsin-EDTA zu dem Pellet und mischen zuerst mit einer 5 ml-Pipette und dann mit einer Mikropipette bis P1000 fadenziehend (1-3 min). 10 ml HF, Zentrifuge bei 450 × g für 5 min (Raumtemperatur oder 4 ° C) und Überstand verwerfen.
11. 2 ml 5 mg / ml Dispase und 200 ul 1 mg / ml DNase I zu dem Pellet und mischen mit einem P1000 Mikropipette für 1 min. Die Probe sollte clo werdenudy aber nicht faserig. Wenn sehnig, mit 100 ul von DNase I und nochmals mischen.
12. 10 ml kaltem HF, Belastung durch ein 40 um Zellsieb und Zentrifuge bei 450 × g für 5 min (Raumtemperatur oder 4 ° C) und Überstand verwerfen.
13. Resuspendieren Endpellet in Complete Media. Quantifizierung der Gesamtzahl der Zellen (unter Verwendung eines Hämozytometers oder Coulter Counter). Zwei Milchdrüsen die ungefähr 1 x 10 ⁶ bis 1 x 10 ⁷ Zellen. Platte primären Epithelzellen in einem flachem Boden 6-Well-Platte mit einer Dichte von 1,5 x 10 ⁵ Zellen pro Vertiefung.

3. Live-cell Imaging

1. Unmittelbar nach Ausplattieren der Zellen, platzieren Sie den 6-Well-Platte sicher auf einem Mikroskoptisch in einem 5% CO ₂ / gesättigte humidity/37 ° C Temperatur Inkubationskammer. Stellen Sie den Kondensator für Kohler Beleuchtung und in der Mitte die Phase Ringe. Für die Experimente hier vorgestellten Spinning eine invertierte Nikon Eclipse TE300/PerkinElmer Disc KonfokaleMikroskop-System in Weitfeld Phasenkontrast-Modus mit einem 10x Objektiv verwendet wurde.
2. Offene Bildaufnahme-Software, erstellen und benennen eine Bibliothek für die Zeitraffer-Aufnahmen, und speichern Sie an einen Ort mit ausreichend Platz für große Dateien. Die Experimente hier vorgestellten genutzt Volocity Bildaufnahme-Software (Version 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA).
3. Damit die Platte im Mikroskop Inkubator für mindestens 15 min sich ausgleichen lassen. Senken Sie die Linsen auf die Bühne-lens Interferenzen zu vermeiden. Unter der "Stage" Überschrift, wählen Sie "Kalibrieren Bühne." Rückkauf der Fokalebene, Set Z = Null unter den x, y, z Registerkarte und markieren Bildgebung Punkten durch Auswahl von "Add point" im Rahmen der "Stage" Überschrift. Platz Punkte in der Mitte jeder Vertiefung der Platte mit 6 Vertiefungen als zur Abbildung der Phasenkontrast-Abbildung kann in der Nähe der Peripherie des Kunststoffvertiefungen verzerrt. Vereinbaren Punkten auf einem Platz in 4 x 4 Felder (650 um x 700 um Felder), die jeweils mit einer kleinen Überlappung (ca. 5%). Speichern Sie die ausgewählten Punkte unter "Stage ".
4. Unter "Stage" "Make Fokus map" und folgen Sie den Anweisungen, um den Fokus von jedem Punkt zu setzen. Set Bildaufnahme Timing zu 4 Bilder pro Stunde (alle 15 min) zu erfassen. Dies kann eingestellt abhängig von den Anforderungen der spezifischen Experiment werden. Speichern Sie die Fokus-Karte unter "Stage".
5. Rechts auf der rechten Seite tool bar "Image Acquisition" klicken und speichern Sie die Bildeinstellungen. Drücken Sie die Aufnahmetaste, um die Abbildung zu beginnen. Nach 1 Stunde, überprüfen Sie den Fokus der Bilder, um zu sehen, ob eine Anpassung erforderlich ist.
6. Überwachen und weiterhin Live-Bildgebung für 5 Tage und endet, wenn die Zellen konfluent geworden.

4. Direkte Anzeige von Zeitraffer-Aufnahmen, um Timing und Mechanismus der Initial Epithelial Cell Colony Formation, Inzidenz von Apoptose, und Phasing von morphologischen Veränderungen zu beurteilen

1. Direkte Anzeige von Zeitraffer-Aufnahmen kann die Durchführung mit einem kompatiblen Video-Wiedergabe-Software (zB http:/ / Www.real.com/ realplayer oder andere Freeware oder kommerziell erhältliche Software). Bilder können in der. TIFF-Format bei diesem Schritt oder nach der Umstellung auf. JPG-Dateien (siehe Schritt 5) eingesehen werden.
2. Mechanismus zur anfänglichen Koloniebildung zu bestimmen, mit einer ein-Bildstapels repräsentiert ein Abbildungsstelle auf der Platte zu beginnen. In ersten Frames werden Zellen zu schweben. Folgen seriellen Bilder, um zu bestimmen, wenn der erste Epithelzelle haftet an der Platte. Bei diesem Schritt kann Epithelzellen identifiziert und differenziert von Fibroblasten durch ihren mehreren quaderförmigen Morphologie. Folgen Sie dieser einzelnen Epithelzellen über serielle Bilder und folgen ihr Schicksal über die folgenden 24 Stunden. Aufnehmen, wenn es wird umgeben von zusätzlichen Epithelzellen oder erfährt Zellteilung oder Apoptose. Wenn von Epithelzellen umgeben, kann der Mechanismus der Koloniebildung durch Betrachten direkt bestimmt werden, wenn die umgebenden Zellen aus schwimmenden Zellen, die dann mit der anhaftenden ersten Zelle (n) oder aggregieren abgeleitetaus der Division des ersten adhärenten Zellen. Notieren Sie die Anzahl der Kolonien durch Zellaggregation gegenüber Zellteilung während der ersten 24 Stunden gebildet.
3. Um die Anzahl der anfänglich adhärenten Zellen, die Apoptose durchlaufen über einen bestimmten Zeitraum zu bestimmen, gehen seriellen Bilder für das Aussehen von klassischen Merkmale der Apoptose in einer Zelle die Entwicklung, die bereits adhärenten hat ( http://www.alsa.org/research/about -als-research/cell-death-and-apoptosis.html ), und die Anzahl der apoptotischen Zellen während der ganzen Dauer der Bildgebung oder in bestimmten Zeitfenstern identifiziert aufgezeichnet.
4. Im Laufe der Zeit verändern Epithelzellen in Kultur ihre Morphologie von einer Anfangsposition zu einer Quaderform mehrere längliche Erscheinungsbild konsistent mit EMT. Folgen seriellen Bilder, um die Tag / Stunde nach der Beschichtung bestimmen, wann dies geschieht.

5. Image File Modification

1. Benennen Sie die Bild Ordner und Dateien gemäß den Anforderungen für Tracking Tool Timm-Software Verwenden Sie ein Freeware-Programm wie THE Rename 2.1.6 ( http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml ), um Dateien in Gruppen umbenennen. Erstellen Sie einen Ordner mit allen Ordnern und Dateien des Experiments und nennen Sie den Ordner (z. B.
2. Erstellen Sie einen Unterordner für jeden Punkt / Position, wo die Kultur wurde abgebildet. Benennen Sie die Unterordner: EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER. Die Positionsnummer sollten 3-stellig. Beispiel: 072511RN_p001. Legen Sie alle Bilddateien dieser einzelnen Position in den Unterordner.
3. Fügen Sie den Zeitpunkt (mit 5 Ziffern) und Kanalnummer (da es nur ein Hellfeldkanal, verwenden Sie "0") am Ende des Dateinamens in diesem Format:
   EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER_tTIMEPOINT_wCHANNELNUMBER.jpgExample: 072511RN_p001_t00001_w0.jpg
4. Generieren Sie eine Protokolldatei für jede Position, indem Sie zuerst den Download der kostenlosen Programm TTTlogfileconverter aus dem TTT Website. Starten Sie den TTTlogfileconverter Programm und wählen Sie das Experiment Ordner. Eingang ein Bild Intervall (in Sekunden). Für ein Bild gemacht alle 15 min, geben Sie 900 sec. Dann drücken Sie die grüne verdeckte Protokolldateien Taste.

6. Generation of Cell Fate Karten von Einzelzellen mit TTT

1. Create einen Ordner namens TTTexport und ein Unterordner mit dem Namen TTTfiles wo alle Zellen Tracking-Daten nach TTT Software-Anweisungen gespeichert werden
2. Starten Sie das TTT-Programm, wählen Sie den Benutzer Initialen, und klicken Sie auf "Weiter".
3. Drücken Sie die "Set NAS", wählen Sie den Benutzer erstellt "TTTexport"-Ordner, und klicken Sie auf Ok. In den Browser, wählen Sie ein Experiment Ordner, wählen Sie eine Position Ordner, und drücken Sie dann "Load Position"-Taste.
4. Set okuläre Faktor "10x". Legen Sie die Anzahl der Bilder erforderlich (Laden aller Bilder wird zum ersten Mal empfohlen).
5. In Zell-Editor-Fenster, wählen Sie "New Kolonie" im Datei-Menü. Im Filmfenster, drücken Sie die "Track Zelle" oder F2 zu beginnen Verfolgung einer Zelle.
6. Identifizieren einer Zelle, in der Movie Fenster und verwenden Sie die Maus, um den Cursor über die Zelle zu platzieren. Ein Kreis mit der Anzahl der Zelle erscheinen soll nach F2 geklickt wurde. Verwenden Sie die Taste "0" auf dem Ziffernblock der Tastatur, um die Platzierung der Zelle und zum nächsten Bild zu verfolgen. Bewegen Sie den Cursor, um die Platzierung der einzelnen Zelle durch jeden Frame folgen. Um einen Titel zu löschen und zum vorherigen Bild drücken "Entf" auf dem Ziffernblock. Um vorwärts Frames ohne Tracking die Zelle Presse zu bewegen "3" und rückwärts zu bewegen, ohne Tracking press "1" auf dem Ziffernblock.
7. So markieren Sie eine Zellteilung auf die "Division" in der Movie-Fenster. Zum Zelltod markieren klicken Sie auf den "Cell death"-Taste im Filmfenster. Sobald eine Division aufgetreten ist, können die Tochterzellen in der gleichen Zelle Schicksal Karte mit der rechten Maustaste auf den Kreis Symbol der benannten Tochter Zelle in der Zelle Editor-Fenster, um das Tracking automatisch verfolgt werden.
8. Drücken Sie F10, um den Baum zu retten. Jeder Baum wird in den dafür vorgesehenen Ausgang fach sparener (TTTExport). Um eine neue Zellschicksals Karte zu starten, wählen Sie "Neu Kolonie" im "Datei" und dann auf "Öffnen"-Menü in der Zelle Editor-Fenster.
9. Tabellieren Zelle Lebensdauer von Daten nach dem Sammeln von "Cell Daten" in der Zelle Editor-Fenster.

7. Statistische Analysen

1. Verwenden Sie entweder Student-t-Test (falls Vergleich zweier Genotypen) oder ANOVA (beim Vergleich> beiden Genotypen), um festzustellen, ob Unterschiede in der parametrischen Daten wie Anzahl der ersten Zellkolonien, Zell-Lebensdauer oder Stunden bis zum Erscheinen des EMT zwischen verschiedenen Genotypen sind statistisch signifikant. Apoptotische Frequenz kann als die Anzahl / Gesamtzahl plattierten Zellen unter Verwendung des Student-t-Test oder ANOVA oder mit Mann-Whitney oder Kruskal-Wallis als Prozentsatz von adhärenten Zellen abgeleiteten verglichen werden.
2. Leistungsmessung Tests unter Verwendung von Daten aus Analysen der anfänglichen Experimenten zu bestimmen, wie viele experimentelle repliziert müssen durchgeführt und das Schicksal der Zelle Karten aus jeder Wiederholung generiert für eine angemessene sTATISTISCHE Leistung anhand der verfügbaren Freeware (zB http://statpages.org/ ). In den Experimenten hier vorgestellten wurden Zellkulturen von drei Mäusen pro Genotyp abgeleitet ausreichend, um festzustellen, ob es statistisch signifikanten Unterschiede in der Zelle und Zelle Koloniebildung Lebensdauern wenn spezifische genetische Modifikationen vorgenommen wurden.

Representative Results

Epitheliale und Fibroblasten-Zellen können durch Zellmorphologie unterscheiden. Epithelialen Zellen eine Quaderform (1A-B) und Form Zellkolonien (1A). Fibroblasten, eine Art von Stromazellen, eine längliche Morphologie (Abbildung 1C).

Zellen wurden gerundet und schweben zu Beginn der Bildgebung (2A-D). Nach der Befestigung an der Platte wurden sie flach und zeigte eine quaderförmige-Typ Aussehen (2E, H). Von 4 Tagen Kultur die Mehrzahl der Epithelzellen in einem EMT-ähnliche Morphologie (2I-L) verlängert ist. Diese Änderung trat mit der gleichen Chronologie aller Genotypen untersucht. Einige digitale Bilder waren verschwommen, weil Kohler Beleuchtung und Phasenring Ausrichtung wurde nicht korrekt (Abbildung 2D, H, L) eingestellt.

Die schwimmenden Zellen in definierten einzelnen Epithelzellen coloni entwickeltes um 24 Stunden nach dem Ausstreichen (3A, B). Serielle Bildanalyse ergab, dass diese Kolonien Zellaggregation statt Zellteilung generiert wurden. Während Störung des BRCA1 selbst nicht änderte die Anzahl der gebildeten Kolonien, die Zugabe von TP53 Haploinsuffizienz reduzierte signifikant die Anzahl der gebildeten Kolonien und Zugabe von ERa over-Expression signifikant erhöhte sich die Zahl der gebildeten Kolonien (3C).

Es ist kritisch, um die digitalen Bilder erworben Überwachung und Anpassung des Fokus Karte häufig während der ersten 24 h als Zellen an der Platte anzubringen und dann mindestens zweimal täglich, um sicherzustellen, bleiben die Zellen im Fokus und Kulturen nicht kontaminiert werden. Die Genauigkeit der Analysen ist gefährdet, wenn abgebildeten Zellen nicht im Fokus liegt (Abbildung 4).

In der repräsentativen Experiment hier vorgestellten war eine kritische Frage zu bestimmen, ob Änderungen in Expressionsniveaus von Genen bekannt, Brustkrebs Risiko (BRCA1, TP53 und Östrogen-Rezeptor 1 (ESR1) ¹⁾ auswirken verändert die Anzahl der Stunden zwischen Zellteilungen (Zelle Lebensdauer) oder beeinflusst die Muster der Teilung (symmetrischen gegenüber asymmetrischen) in Nicht-Krebs primäre Brustepithelzellen. Um dies zu erreichen, wurden einzelne Zellschicksals Karten (Bäume) unter Verwendung TTT. Beispiele für repräsentative Zellschicksals Karten für jeden der vier Genotypen getestet dargestellt sind (5A-D). Die vier Genotypen der Zellen getestet wurden Wildtyp (keine genetische Manipulation) (5A), Verlust der full-length BRCA1 (BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre)} (5B), Verlust der full-length BRCA1 in Kombination mit TP53 Haploinsuffizienz (BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -)} (5C), und der Verlust der full-length BRCA1 in Kombination mit TP53 haploinsufficiTransparenz und Verstärkung von ESR1 (BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -/MMTV-rtTA/tet-op-ER)} (5D). Generation Zellschicksals Karten gestoppt wurde, wenn die Zellen konfluent (~ 3-4 Generationen) seit eindeutige Verfolgung von einzelnen Zellen nicht mehr, nachdem das möglich. Generation 0 (Zeit bis zur ersten Zellteilung) wurde nicht in den Analysen von Zell-Lebensdauer enthalten, weil Dauer Generation 0 war länger und variabler als die nachfolgenden Generationen. Generations 1, 2, 3 und 4 wurden zusammen für die letzten Analysen zusammengefasst, denn es gab keine signifikanten Unterschiede in der mittleren Zelle Lebenszeiten oder Standard des Mittelwerts (SEM) zwischen diesen Generationen. Vergleiche der mittleren Zelle Lebenszeiten zwischen den verschiedenen Genotypen (Abbildung 5E) zeigten, dass der Verlust in voller Länge BRCA1 reduziert die Anzahl der Stunden zwischen Zellteilungen von 21,3 ± 1,6 h (Wildtyp) auf 16,5 ± 1,0 h (BRCA1 ^{f11/f11 / MMTV-Cre).} Nichtläufig, obwohl Verlust eines Allels TP53 neben Verlust von Volllängen-BRCA1 mit einer deutlichen Erhöhung der Brustkrebs entwicklungskosten1 verknüpft ist, bedeuten Zelle Lebensdauer unverändert war (16,3 ± 1,2 Stunden) im Vergleich zu Mäusen, denen nur BRCA1. Interessanterweise von ESR1 gewinnen in BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -/MMTV-rtTA/tet-op-ER} Mäusen wiederhergestellt Zelle Lebensdauer Dauern in der Nähe Wildtyp-Niveaus (19,3 ± 2,1 Stunden), allerdings diesen Mäusen haben die höchste Inzidenz von Brustkrebs Entwicklung aller Modelle untersucht here.1 Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass der Verlust in voller Länge BRCA1 war nicht immer mit einer verkürzten Zelle Lebensdauer, sondern dies wurde von überexprimierten ERa modifiziert verbunden. Mögliche nächsten Schritt Experimente unter Verwendung dieser Technologie könnte Dosis-Wirkungs-Experimente mit verschiedenen Östrogene, andere Wachstumsfaktoren, oder Bewerber Therapeutika, um ihre Auswirkungen auf die Zelle Lebensdauer in der unterschiedlichen genetischen backgro zu messenunds. Im Gegensatz zu den Auswirkungen auf die Zelle die gesamte Lebenszeit, studierte keiner der genetischen Veränderungen hier geändert Zellteilung Muster.

Abbildung 1. Aussehen einer Epithelzelle Kolonie (A), Epithelzelle (B) und Fibroblasten (C) von Zeitraffer-Aufnahmen. Epithelzellen erscheinen quaderförmigen während Fibroblasten mehr längliche erscheinen. Größe Balken = 50 um.

Abbildung 2. Repräsentative seriellen Zeitraffer-Bilder von der Zeit 0, demonstrieren 2 und 4 Tagen Veränderungen der zellulären Morphologie über die Zeit und Unterschiede im Aussehen mit und ohne Kohler Ausleuchtung. Zum Zeitpunkt 0 die plattierten Zellen schwimmen (Pfeilspitzen AD), die von zwei Tagen in Kultur sind adhärente und können eine quaderförmige-Typ Morphologie (dicke Pfeile E, H) aufweisen und von vier Tagen in Kultur sie länglichen und zeigen ein EMT-ähnliche Morphologie (dünne Pfeile IL). Kohler Beleuchtung ist in Platten AC, EG und IK. Panels D, H und L zeigen Bilder ohne Kohler Beleuchtung. Gezeigten Bilder sind aus dem gleichen Abbildungspunkt über die Zeit. Größe Balken = 200 um. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

Abbildung 3. Die Zahl der Epithelzellen Kolonien 1 Tag nach Genotyp variiert. (A) abgerundet schwimmende Zellen zu Beginn der Zeitraffer-Bildgebung. (B) Zwei repräsentative Epithelzellen Kolonien (Pfeile). (C) Anzahl der Epithelienl Zellkolonien / frame bei 24 Stunden nach Genotyp variiert gebildet. Balkendiagramme zeigen den Mittelwert und Standardfehler des Mittelwerts. * P <0,05, ANOVA. Größe Balken = 200 um. Zellen aus Milchdrüsen ohne tastbaren Tumor von 10 isoliert - bis 12-Monate-alten BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre} (n = 4), BRCA1 ^{f11/f11 / MMTV-Cre / p53 + / -} (n = 3), BRCA1 ^{f11/f11/p53 + / -/MMTV-Cre/Tet-op/-ER/MMTV-rtTA} (n = 3) und Wildtyp (n = 3)-Mäuse wurden für die Untersuchungen abgebildet. Fünf unabhängige Imaging Experimente verschiedener Kombinationen von Wildtyp-Mäusen und gentechnisch zusammengesetzt wurden durchgeführt. Medien enthalten Phenolrot. Kein Östrogen aufgenommen. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

Abbildung 4. Out-of-focus Bilder können nicht genauly analysiert. Vor Bildgebung der Platte, die Platte sollte in der Bildgebung Inkubator für 15 min ins Gleichgewicht zu setzen. Am ersten Tag der Bildgebung, sollte der Schwerpunkt überprüft und eingestellt werden alle paar Stunden. Danach sollte es zweimal täglich kontrolliert werden, sondern bleibt im Allgemeinen stabiler. Pfeil gibt eine out-of-Fokus Epithelzelle Kolonie.

. Abbildung 5 Cell Schicksal Karten aus Single-Cell-Tracking unter Verwendung TTT (A) Wildtyp (B) BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre,} (C) BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -,} und (D) BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -/MMTV-rtTA/tet-op-ER} Mäusen. Zellen, die nicht verfolgt durch den Verlust aus dem Rahmen oder in einer konfluenten Zellschicht werden können, werden durch ein Fragezeichen angezeigt. Wenn kein Fragezeichenangegeben, Tracking wurde bewusst wegen Zellkonfluenz und die Unfähigkeit, eindeutig folgen Single-Cell Schicksal beendet. (E) Mittlere Zelle Lebensdauer durch den Genotyp variiert. Balkendiagramme zeigen den Mittelwert und Standardfehler der Mittelwerte Zelle Lebensdauer (Zeit zwischen Zellteilungen) über Generationen 1-4 für jeden Genotyp. Bedeuten Zelle Lebensdauern signifikant kürzer Brustepithelzellen aus BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre} und BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53} abgeleitet ^{+ / -} verglichen mit Wildtyp-Mäusen. * P <0,05, ANOVA. Zellen aus Milchdrüsen ohne tastbaren Tumor von 10 isoliert - bis 12-Monate-alten BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre} (n = 4), BRCA1 ^{f11/f11 / MMTV-Cre / p53 + / -} (n = 3), BRCA1 ^{f11/f11/p53 + / -/MMTV-Cre/Tet-op/-ER/MMTV-rtTA} (n = 3) und Wildtyp (n = 3)-Mäuse wurden für die Untersuchungen abgebildet. Fünf unabhängige Imaging-Experimente aus verschiedenen Kombinationen von Wildtyp-und genetisch engin zusammeneered Mäusen durchgeführt wurden. Medien enthalten Phenolrot. Kein Östrogen aufgenommen. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

Discussion

Kritische Schritte

Es ist wichtig sicherzustellen, dass Brustdrüsen von Mäusen des gleichen Alters für altersbedingte Variabilität Brustepithelzellen Zellverhalten steuern geerntet. Wenn Ausplattieren der Zellen, sollte die gleiche Anzahl an Zellen in jeder Vertiefung zu jedem Experiment plattiert werden. Zellen sollten relativ spärlichen beim Plattieren, so dass Kulturen nicht zu schnell konfluieren die es ermöglichen, mehrere einzelne Zellen durch serielle Bilder folgen. Es ist wichtig, dass die Platte äquilibriert in den Inkubator, bevor Bildgebung, weil der Fokus zu ändern, nachdem die Platte äquilibriert. Sobald Bildgebung begonnen hat, sollte der Schwerpunkt häufig überprüft werden und bei Bedarf angepasst, vor allem innerhalb der ersten 24 Stunden. Es ist wichtig, die Temperatur des Inkubators regulierten und vorgewärmte haben. Die Zahl der Menschen, die in und aus dem Zimmer sollte so weit wie möglich begrenzt werden. Wir empfehlen üben alle Aspekte des setting bis das Experiment im Vorfeld, um die Reproduzierbarkeit und Qualitätskontrolle zu gewährleisten. Wie bei allen Zellkultur-Experimenten ist die Sterilität ein wichtiges Thema und Standard sterile Zellkultur Praktiken sollten zu allen Zeiten verwendet werden.

Speichern und Bearbeiten der großen Bilddateien erfordert eine erhebliche Menge an Speicherplatz. Ein gemeinsames Netzlaufwerk oder tragbare Festplatten verwendet werden kann. Sobald die Dateien umgewandelt werden, ist es wichtig, um sicherzustellen, dass die Bilder konsequent richtig und Namen platziert in entsprechenden Ordnern. Häufige speichert digitale Daten sollte in dem Verfahren durchgeführt werden.

Begrenztheit

Dieses Verfahren verwendet eine 2-D-Kultursystem, das nicht für die Analyse von Verhaltensunterschiede, die offensichtlich könnte in einem 3-D-Kultursystem nicht zulässt. Dauern der Zelle nur Lebensdauern reproduzierbar nach der ersten beobachteten Zellteilung gemessen werden, wie die Anzahl der Stunden an der ersten Zellteilung nach initial Plattieren der Zellen variabel ist.

Mögliche Änderungen

Je nach den Anforderungen des Experiments kann Zeitraffer-Bilder mehr oder weniger häufig getroffen werden. Zum Beispiel, wenn transiente Zellstrukturen zu quantifizieren sind, können einen 5 sec Intervall besser geeignet. Andere Verfahren, die primäre Brustepithelzellen Zellkulturen zu erzeugen, verwendet werden. Jede bildgebenden Geräten verwendet werden, um die Zeitraffer-Aufnahmen erzeugen, solange es in der Lage, die Anforderungen des Experiments zu erfüllen ist. Alternative Systeme zur Single-Cell-Tracking eingesetzt werden. Für das Verfahren hier beschrieben, wurde ein Standard-Kunststoff flachen Boden 6-Well-Platte war angemessen. Plastikschalen für alle langen Arbeitsabstand Luft Objektive wie 4x, 10x und 20x verwendet werden. Es ist wichtig zu Bereichen nahe der Mitte der Plastikschalen wählen beim Durchführen der Phasenkontrast-Abbildung da der Kunststoff in der Nähe der Ränder in den meisten Speisen gekrümmt ist und verzerrt das Licht.Deckglas Dicke Glasboden Vertiefungen würde für normale Arbeitsabstand Immersionslinsen (Öl, Wasser, Glycerin, etc.), die typischerweise bei höherer Vergrößerung erforderlich.

Trouble-shooting

Wenn Zellen plattiert sind, sollte ausreichend sein, um Medien Zellwachstum für 5 Tage aufrechtzuerhalten, um die Notwendigkeit zum Manipulieren der Platte auf die Bühne zu verringern, aber wenn notwendig, Medien hinzugefügt werden. Es wird empfohlen, dass die Verdampfung auf einem Minimum gehalten werden. Die Verdampfung sollte, indem drei vor vier Gerichte sterilem entionisiertem Wasser im Inneren des Inkubators und Nachfüllen, wenn es notwendig verwaltet werden. Es ist möglich, die unbenutzten Vertiefungen der Platte mit 6 Vertiefungen mit sterilem entionisiertem Wasser füllen.

Wenn Bilder nicht dem Laden in den TTT-Programm, überprüfen Sie zuerst, und sicherstellen, dass die Dateien und Ordner angeordnet sind und korrekt benannt. Als nächstes prüfen, ob die Protokolldatei im richtigen Ordner (siehe Schritt 5,5).

Future Anwendung oder Richtung nach Mastering-Technik

Dasselbe allgemeine Verfahren könnte verwendet werden, um das Verhalten von anderen Zelltypen, einschließlich humanen primären Brustepithelzellen sowie Brustkrebszellen analysieren. Beispielsweise kann genotypischen-spezifische Verhalten und / oder die Reaktion auf Kandidaten Behandlungen ausgewertet. Alternativ sortiert Abbildung von Fluoreszenz-aktiviertes Zell (FAC) Zellpopulationen könnte durchgeführt werden oder fluoreszierende Markierungen hinzugefügt zu spezifischen Zelltypen zu überwachen.

Bedeutung dieser Technik in Bezug auf bestehende Methoden

Zugabe von Zeitraffer-Aufnahmen und Analysen des Verhaltens von Zellen im Laufe der Zeit zu den traditionellen Zellkultur und Kennzeichnung Techniken liefert quantitative Daten aus einzelnen Zellen im Laufe der Zeit und nicht nur ganze Bevölkerung Dynamik. Diese Technik erlaubt es einzelne Zellen kontinuierlich beobachtet werden, im Gegensatz zu herkömmlichen Methoden, die Beobachtung erlauben nur an diskreten Zeitpunkten. Mine traditionellen Methoden erfordern die Zellen an, indem er sie in die und aus der Inkubator, um sie unter einem Mikroskop zu sehen, während die hier beschriebene Ansatz gestört werden können, ohne die Zellen zu übertragen beobachtet werden. Schließlich bietet Zeitraffer-Aufnahmen eine dauerhafte Aufzeichnung der Zellen unter Beobachtung, um für weitere Analysen zurückgegeben werden können. Die Verwendung von TTT einzelne Zellverhalten verfolgen lässt eine eindeutige Analyse mehrerer Parameter und erfordert nicht die Verwendung einer fluoreszierenden Markierung zur Lokalisierung der spezifischen Zellen unter Beobachtung. Die Technik offenbart Unterschiede in Brustepithelzellen Zellverhalten schwer in statischen Gewebeschnitten von Brustdrüse messen sind. Zell-Lebensdauer-Messungen quantifiziert die Anzahl der Stunden zwischen mitotischen Ereignissen. Diese Messung liefert Daten über die tatsächliche Anzahl der Stunden zwischen Zellteilungen, die die Länge des Zellzyklus in Stunden. Ein Forscher kann diese Daten verwenden, um festzustellen, wiespezifische genetische Modifikationen oder Kulturbedingungen Auswirkungen Zellzyklus.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
EpiCult-B Basal Medium Mouse	StemCell Technologies	05610
EpiCult-B Proliferation Supplements Mouse	StemCell Technologies	05612
recombinant human Epidermal Growth Factor (rhEGF)	StemCell Technologies	02633
Collagenase/Hyaluronidase	StemCell Technologies	07912
Disposable Scapels	Feather	2975#10
Hanks' Balanced Salt Solution	StemCell Technologies	37150
Ammonium Chloride	StemCell Technologies	07800
Tryspin-EDTA	StemCell Technologies	07901
Dispase	StemCell Technologies	07913
DNase I	StemCell Technologies	07900
40 μm cell strainer	StemCell Technologies	27305
FBS	StemCell Technologies	06100
PenStrep	Gibco	15140