Summary
시간 경과 영상은 특정 행동 매개 변수 독특한 유전 적 병변 사이에 상관 관계가 있는지 확인하기 위해 유방암 위험 유전자 변형 마우스 모델에서 파생 된 기본 preneoplastic 유방 상피 세포의 행동을 평가하는 데 사용됩니다.
Abstract
시간 경과 영상은 유방암의 여러 유전자 변형 마우스 모델에서 파생 된 배양 주요 preneoplastic 유방 상피 세포의 행동을 비교하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 세포 분열 (세포 수명), apoptotic 세포 번호, 형태학의 변화의 진화, 그리고 식민지 형성의 메커니즘 사이의 시간은 정량 할 수 있으며, 특정 유전 병변을 가진 세포에 비교했다. 기본 유방 상피 세포 문화가 만져서 알 수있는 종양이없는 유방 땀샘에서 생성됩니다. 분비는 신중하게 인접 근육의 명확한 분리와 resected 있으며, 림프절이 제거되며, 풍부한 유방 상피 세포의 단일 셀 중지는 효소 분해 및 여과 뒤에 날카 유방 조직에 의해 생성됩니다. 단일 셀 중지는 라이브 세포 이미징을위한 보육 챔버 내에서 도금과 현미경 바로 아래에 배치됩니다. 각 w에서 4x4 구성에서 열 여섯 650 μm X 700 μm 분야6 잘 접시의 엘자은 5 일 동안 매 15 분 이미징 있습니다. 시간 경과 이미지는 직접 처음 24 세포를 도금 시간 (집계 대 세포 증식), apoptosis의 입사 및 형태학의 변경 사항을 단계적으로 내 세포 식민지 형성의 메커니즘과 주파수를 포함 할 수있다 세포 행동을 측정하는 검사입니다. 단일 셀 추적은 개별 셀 수명과 세포 분열 패턴 조사 측정을위한 세포 운명지도를 생성하는 데 사용됩니다. 양적 데이터는 통계적으로 특정 유전 병변과 상관 행동에 상당한 차이를 평가하기 위해 분석하고 있습니다.
Introduction
유전 공학 마우스 모델은 공부하고 다른 유전자 병변이 유방암을 개발의 위험에 기여하는 방법을 이해하는 도구입니다. 예를 들어, 유전자 변형 마우스가 게재 한 광고 세 가지 요소의 조합 : 전체 길이 유방암 암 1, 초기 발병 (Brca1) 유방 상피 세포에서 유전자, 종양 단백질 p53의 (Tp53) 세균 라인 haploinsufficiency, 그리고 상피 유방의 손실 셀은 목표 상향 조절 에스트로겐 수용체 알파 Brca1 floxed (F) 11/f11/Mouse 유방 종양 바이러스 (MMTV) -Cre/p53 + / -/tetracycline-operator (의 100 %에서 유방암의 개발에 (시대) 식 결과 tet 조합) -ER/MMTV-reverse 테트라 사이클린 transactivator (Brca1 f11/f11/MMTV-Cre/p53에서보고 된 낮은 비율 + /에 비해 세 12 개월로 rtTA 쥐 - 시대없이 마우스 이상 표현 (~ 50 - 60 %)와 Tp53 haploinsuf없이 Brca1 f11/f11/MMTV-Cre 마우스ficiency (<5 %) 1.
preneoplastic 기본 유방 상피 세포의 행동의 동적 시간 경과 영상 적은 쉽게 정적 조직 섹션에 부탁드립니다 셀 동작의 차이를 보여줍니다. 증식과 분화에 변경이 인간의 BRCA1 변이 캐리어의 기본 유방 세포에서 관찰됩니다. 단일 셀 정상적인에서 기본 유방 상피 세포의 중지 및 유전 공학 마우스의 2 제작이 resected 유선 조직의 효소 disassociation을 통해 생성됩니다. 3 시간 경과 이미지는 셀 식민지의 모양과 상피 - 중간 엽 전이 (EMT) 및 apoptosis를 포함한 세포의 형태학의 변화의 입사 메커니즘 및 타이밍을 평가하기 위해 볼 수 있습니다. 세포 운명지도의 생성은 세포 분열 (세포 수명) 및 세포 분열의 패턴 결정 사이의 시간 길이의 정량화는 단일 셀 추적의 사용에 의해 촉진된다. Timm의 추적 도구 (TTT)는 단일 셀의 운명지도를 생성하는 데 사용 공개적으로 사용 가능한 소프트웨어입니다. 세포 운명의 메커니즘을 elucidating에서의 유틸리티는 정상적인 조혈 줄기 세포 개발 6-9 뉴런의 생성을 조사 4,5 설립되었습니다. 10
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Protocol
1. 전체 계획
- 유전 공학의 유방 땀샘에서 preneoplastic 유방 상피 세포의 주요 문화를 생성하고 야생 형 생쥐을 관리 할 수 있습니다.
- 라이브 셀 이미지에게 최대 5 일에 Volocity 이미지 수집 소프트웨어 (버전 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA)를 사용하여 매 15 분 캡처합니다.
- 타이밍 및 상피 세포 식민지 형성의 메커니즘, apoptosis의 입사 및 형태학의 변경 중단을 평가하기 위해 직접 시간 경과 이미지를 볼 수 있습니다.
- 에 생성 Volocity. TIFF 스택을 변환합니다. MetaMorph의 현미경 자동화 및 이미지 분석 소프트웨어 (분자 장치, LLC 서니 베일, CA) 및 이름 바꾸기 디지털 이미지 파일 (이름 바꾸기 2.1.6 사용하여 JPG 파일을 http://www.softpedia.com/get은 / 시스템 / 파일 관리 /-Rename.shtml ) Timm의 추적 도구 소프트웨어 (TTT,과의 호환성을 사용하도록 설정하는 방법tz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index.html "대상 ="_blank "> http://www.helmholtz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index. html)을 선택합니다.
- TTT 사용하여, 세포 분열 (세포 수명)과 세포 분열의 패턴 (대칭 대 비대칭) 사이의 시간을 결정에 대한 세포 운명지도를 생성합니다.
- 다른 유전 공학 마우스 모델 및 / 또는 야생 형 컨트롤 사이에 통계적으로 의미있는 차이가 있는지 확인하기 위해 3 단계 이상 5에서 양적 데이터를 분석합니다.
2. 기본 유방 상피 세포 문화의 생성
- 제조업체의 지시 사항 (EpiCult-B 마우스 중간 키트, Stemcell 기술, 밴쿠버, BC)의 변화에 따라 하나의 유방 상피 세포의 분리에 대한 전체 미디어를 준비합니다. 450 ML 에피 컬트-B 매체, 50 ML 에피 컬트 B 확산 보충, 5 % 태아 소 혈청 (FBS), 50 μg / ML 페니실린 / 스트렙토 마이신 (PenStr을 결합EP) 10 NG / ML 표피 성장 인자 (EGF).
- 2.1에서 9 부품 전체 미디어가 10 배 Collagenase / Hyaluronidase 혼합물의 한 부분을 결합하여 분리 미디어를 준비합니다.
- 마우스를 안락사시켜야 즉시 검시를 진행합니다. 장소 스티로폼 검시 플랫폼에서의 뒷면에 마우스와 복부 피부가 팽팽하도록 사지를 확보. 하는 70 %의 에탄올과 팔다리 놓인 포함 복부 피부와 머리를, 포화. 중간 각 프런트 사지의 피부를 통해 Y-절개로 확장되는 피부를 통해 중간 선 절개를 (복막를 입력하지 않음)하여 # 2 / 3 (가슴) 및 # 4 / 5 (사타구니) 유방 땀샘에 노출 각 후면 다리의 안쪽 피부를 통해 Y 절개 아래 거꾸로.
- 무딘 절개를 사용 underlyingperitoneum에서 피부를 분리,이 긴장 될 때까지 피부의 양쪽에 철수하고, 핀을 사용하여 스티로폼 검시 플랫폼에 고정하십시오. 바깥 쪽부터, 아까 그 바 말인데의 사려 분별이있는 사용과 무딘 절개를 사용하여ction 가위는 그대로 사타구니 및 / 또는 기본 결합 조직과 근육에서 가슴 유방 땀샘을 분리합니다. 10cm 무균 배양 접시에 더 이상 두 개보다 유방 땀샘을 놓고 조직 문화 후드로 이동합니다.
- 조직 문화 후드에서 노란 색 작은 잘 circumscribed nodules로 표시되어 있습니다 유방 림프절에 대한 분비를 검사합니다. 멸균 메스와 집게를 사용하여 주변 선에서 림프절을 제거합니다. 이 멸균 메스, 각 손에 하나를 사용하여 ~ 1mm 세 조각으로 유방 조직을 이기다.
- 장소 부드럽게 10 ML 피펫을 사용하여 2 ~ 3 배를 아래로 pipetting과로 5 ML 분리 미디어 믹스에서 유방 조직을 다진하고, 5 %의 CO 2와 37 ° C 배양기에서 (최대 ~ 16 시간) 밤 품다 느슨하게 뚜껑이있는 50 ML 원뿔 튜브.
- 다음 날 아침, 붉은 색 BL을 홍보하기 위해 염화 암모늄 솔루션을 버퍼 2퍼센트 FBS, 4 부분을 포함하는 한 부분 행크스 '균형 소금 솔루션 (HBSS)의 차가운 혼합물을 준비ood 세포 용해 (HFAmCl)뿐만 아니라 차가운 HBSS는 2 % FBS (HF)와 보충. 미리 따뜻한 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (0.25 %)는 행크의 균형 소금 솔루션 5 MG / ML Dispase, 1 MG / ML DNase I,와 전체 미디어를 수정.
- 보육의 유방 조직과 원뿔 원심 분리기 튜브를 제거하고 부드럽게 소용돌이 2-3 초를 두 번 파동. 5 분 (실내 온도 또는 4 ° C)를 450 × g에서 튜브를 원심 분리기하고, 표면에 뜨는 폐기하십시오.
- 5 분 (실내 온도 또는 4 ° C)를 450 × g에서 10 ML의 HFAmCl과 원심 분리기의 최소의 펠렛을 Resuspend하고 표면에 뜨는 폐기하십시오.
- 펠렛에 3 ML 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 추가하고 5 ML 피펫 처음에 혼합 한 후 실 (1-3 분)까지 P1000 micropipettor와 함께. 5 분 (실내 온도 또는 4 ° C)에 대해 450 10 ML HF, 원심 분리기 × g을 추가하고 표면에 뜨는 폐기하십시오.
- 5 MG / ML Dispase 2 ML 1 MG / ML DNase I 펠릿 1 분을위한 P1000 micropipettor과 믹스에 200 μl를 추가합니다. 샘플 클리오해야udy하지만 실 수 없습니다. 실 경우, DNase I 100 μl를 추가하고 다시 섞는다.
- 5 분 (실내 온도 또는 4 ° C) 10 ML 추운 HF, 450에서 40 μm 셀 스트레이너 및 원심 분리기를 통해 변형 × g을 추가하고 표면에 뜨는 폐기하십시오.
- 전체 미디어의 최종 펠렛을 Resuspend. 세포의 총 수를 (hemocytometer이나 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 카운터를 사용하여) 수량화. 두 유방 땀샘은 약 1 개 10월 6일부터 1일까지 X 10 7 세포를 얻을 수 있습니다. 물론 당 1.5 × 10 5 세포의 밀도를 평면 바닥 6 잘 플레이트에 플레이트 기본 상피 세포.
3. 라이브 셀 이미징
- 즉시 세포를 도금 후, 2 / humidity/37를 포화 ° C 온도 배양 챔버 5 % CO 내 현미경 무대에서 안전하게 6 잘 판을 놓습니다. Kohler 조명 및 센터 위상 반지의 콘덴서를 조정합니다. 실험 여기에 제시된를 들어, 역 니콘 이클립스 TE300/PerkinElmer는 디스크 공 촛점을 스피닝10X 목적 렌즈와 widefield 위상 콘트라스트 모드에서 현미경 시스템이 사용되었습니다.
- 오픈 이미지 수집 소프트웨어는 생성하고 시간 경과 이미지에 대한 라이브러리 이름을, 대형 파일에 대한 충분한 공간이있는 위치에 저장합니다. 실험은 여기 활용 Volocity 이미지 수집 소프트웨어 (버전 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA)를 발표했다.
- 플레이트는 15 분의 최소 현미경 보육에 평형 수 있도록 허용합니다. 무대 렌즈 간섭을 방지하기 위해 렌즈를 낮 춥니 다. "무대"제목 아래, "스테이지 조정 '을 선택합니다. 초점 평면, 세트 Z 제목의 "스테이지"아래 "추가 포인트"를 선택하여 X, Y, Z 탭과 마르크 이미징 포인트 미만 = 0.을 Reacquire 위상 콘트라스트 이미지와 같은 이미지를위한 6 잘 플레이트의 각 우물의 중앙에 자리 포인트는 플라스틱 우물의 주변 근처 왜곡 될 수 있습니다. 4 × 4 분야 (650 μm는 x 700 μm 분야), 작은 오버랩 (약 5 %)이 각각의 사각형에 포인트를 마련합니다. "남성 아래의 선택한 지점을 저장전자. "
- "무대"에서 선택 "초점을지도하기 '와 각 지점의 포커스를 설정하라는 메시지가 나타납니다 따릅니다. 시간 당 4 장의 사진을 (매 15 분) 캡처 이미지 수집 타이밍을 설정합니다. 이것은 특정 실험의 요구 사항에 따라 조정할 수 있습니다. "무대"아래의 초점지도를 저장합니다.
- 오른쪽 오른쪽 도구 모음 '이미지 수집 "을 클릭하고 이미지 설정을 저장합니다. 이미지를 시작 레코드 버튼을 누릅니다. 1 시간 후에는, 조정이 필요한 경우 보려면 이미지의 초점을 확인합니다.
- 모니터링 및 세포가 합류 될 때 종료, 5 일 동안 라이브 영상을 계속합니다.
4. 타이밍 및 초기 상피 세포의 콜로니 형성의 메커니즘, Apoptosis의 입사 및 형태학의 변경을 단계적으로 중지를 평가하기 위해 시간 경과 이미지를 직접보기
- 시간 경과 이미지를 직접 볼 수는 호환 비디오보기 소프트웨어 (예 : 사용 실적을 할 수 있습니다 HTTP를 :/ / www.real.com/ 리얼 플레이어 또는 기타 프리웨어 또는 상용 소프트웨어). 이미지는이 단계에서 나. JPG 파일 (5 단계 참조)로 변환 한 후. TIFF 형식으로 볼 수 있습니다.
- 초기 식민지 형성의 메커니즘을 확인하려면 접시에 하나 이미징 사이트를 대표하는 단일 이미지 스택과 함께 시작합니다. 초기 프레임에서 셀은 플로팅 될 것입니다. 첫 번째 상피 세포는 판에 부합시기를 결정하는 일련의 이미지를 따르십시오. 이 단계에서 상피 세포 식별 할 수 있으며, 그들보다 더 cuboidal 형태의 섬유 아세포에서 차별화. 직렬 이미지를 통해이 하나의 상피 세포에 따라 이후 24 시간 동안의 운명을 따르십시오. 이 추가 상피 세포로 둘러싸여되거나 세포 분열 또는 apoptosis를 겪 경우 기록합니다. 상피 세포로 둘러싸여 경우 주변 셀이 다음 초기 점착성의 셀 (들) 또는와 종합 부동 세포에서 파생하는 경우, 식민지 형성의 메커니즘은보고 직접 결정하실 수 있습니다초기 자기편 세포의 분열에서. 처음 24 시간 동안 세포 집계 대 세포 분열에 의해 형성된 콜로니 수를 기록합니다.
- 특정 기간 동안 apoptosis를 받아야 처음 자기편 세포의 수를 확인하려면 자기편 된 셀에 개발 apoptosis의 고전적인 기능의 모양에 대한 일련 이미지를 따라 ( http://www.alsa.org/research/about -als-research/cell-death-and-apoptosis.html ) 및 이미지의 전체 기간 동안 또는 특정 시간 프레임 내에서 식별 된 apoptotic 세포의 수를 기록했다.
- 시간이 지남에 따라 문화의 상피 세포가 EMT와 일치보다 가늘고 긴 모양으로 초기 cuboidal 모양에서 자신의 형태를 변경합니다. 이러한 경우가 발생하면 도금 후 일 / 시간을 결정하는 일련 이미지를 따르십시오.
5. 이미지 파일 수정
- Timm의 추적 도구 소프트웨어에 대한 요구 사항에 따라 이미지 폴더와 파일의 이름을 바꿉니다 이름 바꾸기 2.1.6 (같은 프리웨어 프로그램을 사용 http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml을 그룹으로 파일 이름을 바꾸는 것이). 실험의 모든 폴더와 파일을 포함하는 하나의 폴더를 생성하고 (예를 들어 폴더 이름을
- 문화 이미징 된 각 점 / 위치에 대한 하위 폴더를 만듭니다. 하위 폴더의 이름을 지정 : EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER합니다. 위치 번호는 3 자리 숫자가 있어야합니다. 예 : 072511RN_p001. 하위 폴더에서 해당 개인 위치의 모든 이미지 파일을 놔.
- timepoint (5 자리 숫자를 사용)이 형식의 각 파일 이름의 끝 부분에 채널 번호 (하나의 시야 채널이 있기 때문에, "0"사용) 추가 :
EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER_tTIMEPOINT_wCHANNELNUMBER.jpgExample : 072511RN_p001_t00001_w0.jpg - 먼저 TTT 웹 사이트에서 무료로 프로그램 TTTlogfileconverter를 다운로드하여 각 위치에 대한 로그 파일을 생성합니다. TTTlogfileconverter 프로그램을 시작하고 실험 폴더를 선택합니다. 입력 이미지 간격 (초). 매 15 분 촬영 사진의 경우, 900 초를 입력합니다. 그런 다음 녹색 비밀 로그 파일 버튼을 누릅니다.
6. TTT를 사용하여 단일 셀의 셀 운명지도 생성
- CTTTexport라는 폴더를 reate 모든 셀 추적 데이터가 TTT 소프트웨어 지침에 따라 저장 될 위치와 하위 폴더는 TTTfiles라고
- TTT 프로그램을 시작한 사용자의 이니셜을 선택하고를 클릭하십시오 "계속."
- 키를 눌러 "설정 NAS를", "TTTexport"폴더를 생성 한 사용자를 선택하고 확인을 클릭합니다. 브라우저에서 다음 Enter 키를 누릅니다 "로드 위치"버튼을, 실험 폴더를 선택 위치 폴더를 선택합니다.
- 에 안구 요소를 설정 "10 배." 필요한 이미지의 수를로드 (모든 이미지를로드하는 것은 처음 권장합니다).
- 셀 편집기 창에서 파일 메뉴에서 "새 식민지"를 선택합니다. 영화 창에서 셀을 추적 할 수있는 '트랙 셀 "또는 F2 키를 누릅니다.
- M의 셀을 식별ovie 창 및 셀 위로 커서를 할 때 사용하는 마우스. F2를 클릭 한 후 세포의 번호와 원이 나타납니다. 다음 사진에 셀 사전의 위치를 추적 할 수 키보드의 숫자 패드에있는 "0"키를 사용합니다. 각 프레임을 통해 각 셀의 위치를 따라 커서를 이동합니다. 트랙을 삭제하고 숫자 패드에있는 이전 이미지 프레스 "푸"로 돌아갑니다. "3"셀 프레스를 추적하지 않고 앞으로 프레임을 이동하려면, 전화 번호 패드에 눌러 "1"을 추적하지 않고 뒤로 이동합니다.
- 세포 분열은 영화 창에서 "부"버튼을 클릭 표시합니다. 세포 사망을 표시하려면 영화 창에서 '셀 사망'버튼을 클릭합니다. 부서가 발생되면, 딸 세포는 바로 자동 모드를 추적 할 수있는 셀 편집기 창에서 지정 딸 셀의 원 기호를 클릭하여 동일한 세포 운명지도에서 추적 할 수 있습니다.
- 트리를 저장 F10을 누르십시오. 각 나무는 지정된 출력 배에 저장됩니다어 (TTTExport). 새로운 세포 운명지도를 시작하려면 셀 편집기 창에서 "파일"다음 "열기"메뉴에서 "새 식민지"를 선택합니다.
- 셀 편집기 창에서 '셀 데이터'탭에서 수집 한 후 세포 수명 데이터를 집계.
7. 통계 분석
- 어느 학생의 t-테스트를 사용하여 (두 genotypes을 비교하는 경우) 또는 ANOVA 결정 (> 두 genotypes을 비교하는 것은 경우) 등 초기 세포 식민지, 세포 수명 또는 시간 숫자로 파라 메트릭 데이터의 차이는 다른 genotypes 사이 EMT의 모습은 통계적 때까지 경우 중요 하지요. Apoptotic 주파수 번호 / 학생의 t-test 또는 ANOVA를 사용하여 총 도금 셀 또는 자기편 세포의 비율로 파생 맨 - 휘트니 또는 Kruskal-월리스와 비교할 수 있습니다.
- 필요한 실험은 복제 얼마나 많은 결정하는 초기 실험의 분석에서 데이터를 사용하여 전력 테스트를 수행 충분한 s에 대한 수행과 세포 운명지도는 각 복제에서 생성 된사용 가능한 프리웨어를 사용하여 tatistical 전원 (예 : http://statpages.org/ ). 여기에 제시된 실험에서 유전자형 당 3 쥐에서 파생 된 세포 문화는 특정 유전 수정이 만들어 질 때 세포 식민지 형성과 세포 수명의 통계적으로 의미있는 차이가 있었다 여부를 결정하기에 충분했다.
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Representative Results
상피 및 섬유 아세포 세포는 세포 형태에 의해 구별 할 수 있습니다. 상피 세포는 cuboidal 모양 (그림 1A-B) 및 양식 세포 식민지 (그림 1A)를 갖추고 있습니다. 섬유 아세포, stromal 세포의 종류, 가늘고 긴 형태 (그림 1C)을 갖추고 있습니다.
세포는 반올림 및 이미징의 시작 (그림 2A-D)에 떠 있었다. 플레이트에 부착 후에는 평면이되었고, cuboidal 형 모양 (그림 2E, H)를 보여 주었다. 문화 4 일까지 상피 세포의 대부분은 EMT과 같은 형태 (그림 2I-L)에 가늘고 긴. 이 변경 사항은 연구 모든 genotypes에서 동일한 연대기가 발생했습니다. Kohler 조명 및 위상 링 정렬이 제대로 설정합니다 (그림 2D, H, L)되지 않았기 때문에 일부 디지털 이미지를 흐리게했다.
정의 개별 상피 세포 coloni로 발전 부동 세포도금 후 24 시간의 에스 (그림 3A, B). 직렬 이미지 분석이 식민지는 오히려 세포 분열보다 셀 집합에 의해 생성 된 것으로 밝혀졌습니다. 그 자체로 Brca1의 중단이 형성 콜로니의 수, Tp53 haploinsufficiency의 추가 변경하지 않았지만 크게 형성 콜로니의 수를 감소 ERα의 추가는 끝났 표현 크게 (그림 3C) 형성 콜로니의 수를 증가했다.
이 세포는 세포가 초점에 남아와 문화가 오염되지 않도록 적어도 두 번 매일 다음 판에 부착하고 다른 이름으로 구입 한 디지털 이미지를 모니터링하고 처음 24 시간 동안 자주 초점지도를 조정하는 것이 중요합니다. 이미징 세포 (그림 4) 초점이없는 경우 분석의 정확성이 노출됩니다.
여기에 제시된 대표 실험에서 중요한 문제를 결정하는 것이 었습니다 if 문 수준의 변화유방암 위험을 (Brca1, Tp53 및 에스트로겐 수용체 1 (Esr1) 1)에 영향을하는 것으로 알려져 유전자의 S는 세포 분열 (세포 수명) 사이 시간의 수를 변경 또는 비 암에 부서의 패턴을 (대칭 대 비대칭) 영향을 기본 유방 상피 세포. 이를 위해 각각의 세포 운명지도 (나무) TTT를 사용하여 생성되었습니다. 테스트 네 개의 genotypes의 각 대표 셀의 운명지도의 예는 (그림 5A-D) 설명되어 있습니다. 테스트 셀의 네 가지 genotypes는 (그림 5A) (없음 유전자 조작) 전체 길이 Brca1의 손실 (Brca1 f11/f11/MMTV-Cre) (그림 5B), 조합 전체 길이 Brca1의 손실 야생 형이었다 (Brca1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -) (그림 5C), 그리고 Tp53 haploinsuffici와 함께 전체 길이 Brca1의 손실 Tp53 haploinsufficiency로ency 및 Esr1 (Brca1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -/MMTV-rtTA/tet-op-ER) (그림 5D)의 이득. 세포는 단일 세포의 단호한 추적 그 후 더 이상 수 없었으므로 (~ 3-4 세대) 합류되었을 때 세포 운명지도의 생성이 중단되었습니다. 의 세대 0 (첫 번째 세포 분열에 시간) 전지 수명의 분석에 포함되지 않았습니다 때문에 기간 세대 0 이상이고 다음 세대보다 더 많은 변수. 평균 셀 수명 또는 이들 세대 사이의 평균 (SEM)의 표준 오류에 큰 차이가 없었 으니까 세대 1, 2, 3, 4는 최종 분석을 위해 함께 그룹화되었습니다. 다른 genotypes (그림 5E 호야) 사이 평균 세포 수명의 비교는 전체 길이 Brca1의 손실이 21.3에서 세포 분열 사이의 시간 수를 감소 ± 1.6 시간을 (야생 유형) 16.5에 공개 ± 1.0 시간 (/ Brca1 f11/f11 MMTV-Cre). 아니전체 길이 Brca1 손실에 추가 한 Tp53 allele의 손실은 유방암의 development1 크게 증가와 연결되어 있지만 tably, 세포 수명은 Brca1이 부족한 생쥐에 비해 (16.3 ± 1.2 시간) 변경했습니다 의미합니다. 흥미롭게도 Brca1 f11/f11/MMTV-Cre/p53에 Esr1의 습득 + / -/MMTV-rtTA/tet-op-ER 마우스가 셀 수명이 마우스이라도 근처의 야생 타입 수준 (19.3 ± 2.1 시간)에 기간 복원이가 모든 모델의 유방암 개발의 높은 발병률은 이러한 연구 결과는 그 전체 길이 Brca1의 손실이 늘 단축 셀 수명, 대신이이 오버 표현 ERα으로 바뀌 었습니다와 관련된 아니었다 표시 here.1을 공부했습니다. 이 기술을 사용 가능한 다음 단계 실험은 서로 다른 유전 backgro에 세포 수명에 미치는 영향을 측정하기 위해 서로 다른 estrogens, 다른 성장 요인, 또는 후보 치료학을 사용하여 용량 - 반응 실험 될 수unds. 세포 수명 기간에 미치는 영향 대조적으로, 유전자 변경 중 어느 것도 여기에 변경 세포 분열 패턴을 공부하지 않습니다.
1 그림. 상피 세포 식민지 (A)의 외관, 상피 세포 (B), 시간 경과 영상에서 섬유 아세포 (C). 섬유 아세포 더 연장 표시하면서 상피 세포가 더 cuboidal 나타납니다. 크기 바 = 50 μm.
그림 2. 시간 0에서 대표 시리얼 시간 경과 이미지, 2, 4 일의 시간과 함께 외관의 차이 극복하고 콜이없는 세포 형태의 변화를 보여응급실 조명. 시간 0 도금 세포들은 자기편하고 cuboidal 타입 형태와 (두꺼운 화살표 E, H)가 발생할 수 있습니다 문화의 두 일까지하고 연장 문화에서 4 일까지 (화살촉의 AD) 떠과를 보여 아르 EMT과 같은 형태 (얇은 화살표의 IL). Kohler 조명 패널 AC, EG, 그리고 IK에 속해 있습니다. 패널 D, H와 L은 Kohler 조명없이 이미지를 보여줍니다. 표시 이미지는 시간이 지남에 따라 같은 이미징 지점에서 수 있습니다. 크기 바 = 200 μm. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. 일일의 상피 세포 식민지의 번호는 유전자형에 의해 다양. (A) 시간 경과 영상의 시작 부분에서 부동 셀을 반올림. (B) 두 대표 상피 세포 식민지 (화살표). 상피 조직의 (C) 번호난 세포 식민지 / 프레임은 유전자형에 의해 다양 24 시간에서 형성 될 수있다. 막대 그래프는 평균의 평균 및 표준 오류를 보여줍니다. * P <0.05, ANOVA. 크기 바 = 200 μm. 10 ~ 만져서 알 수있는 종양이없는 유방 땀샘으로부터 격리 세포 - (N = 3), Brca1 - 12 개월 Brca1 f11/f11/MMTV-Cre (N = 4), Brca1 f11/f11 / MMTV-Cre / p53의 + /로 f11/f11/p53 + / -/MMTV-Cre/Tet-op/-ER/MMTV-rtTA (N = 3) 및 야생 유형 (N = 3) 마우스는 연구에 대한 이미징했다. 야생 유형과 유전 공학 마우스의 서로 다른 조합으로 구성 다섯 독립적 인 이미징 실험이 수행되었다. 미디어 페놀 붉은 색이 포함되어 있습니다. 어떠한 에스트로겐이 추가되지 않았습니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
4 그림. 밖에서 초점 이미지는 정확하지 않을 수 있습니다통증은 분석했다. 이미징 플레이트 전에 접시 평형 15 분의 영상 보육에 앉아해야합니다. 영상의 첫 번째 날 동안, 초점은 확인하고 몇 시간마다 조정해야합니다. 그 후는 매일 두 번을 선택하지만, 일반적으로 더 안정적해야합니다. 화살표 밖에서 초점 상피 세포 식민지를 나타냅니다.
.에 대해 (A) 야생 형, (B) Brca1 f11/f11/MMTV-Cre, (C) Brca1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / TTT를 사용하여 단일 셀 추적에서 생성 그림 5 세포 운명지도 - 및 (D) Brca1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -/MMTV-rtTA/tet-op-ER 마우스. 프레임 또는 합류 셀 레이어에 손실 아웃으로 인해 추적 할 수없는 세포가 물음표로 표시되어 있습니다. 때없이 물음표의도적으로 인해 셀 합류하고 명백하게 단일 셀 운명을 따르도록 못할 종료했습니다 추적 지적했다. (E) 유전자형에 의해 다양한 세포 수명을 뜻합니다. 막대 그래프는 각 유전자형에 대한 세대 1-4 이상 평균 셀 수명의 평균 및 표준 오류 (세포 분열 사이의 시간)을 보여줍니다. 와 같은 야생 형 생쥐에 비해 - 평균 전지 수명은 Brca1 f11/f11/MMTV-Cre와 Brca1 f11/f11/MMTV-Cre/p53에서 + /를 파생 유방 상피 세포에서 크게 단축했다. * P <0.05, ANOVA. 10 ~ 만져서 알 수있는 종양이없는 유방 땀샘으로부터 격리 세포 - (N = 3), Brca1 - 12 개월 Brca1 f11/f11/MMTV-Cre (N = 4), Brca1 f11/f11 / MMTV-Cre / p53의 + /로 f11/f11/p53 + / -/MMTV-Cre/Tet-op/-ER/MMTV-rtTA (N = 3) 및 야생 유형 (N = 3) 마우스는 연구에 대한 이미징했다. 야생 유형 및 유전자 engin의 다른 조합으로 구성된 다섯 독립적 인 이미징 실험eered 쥐들이 수행되었다. 미디어 페놀 붉은 색이 포함되어 있습니다. 어떠한 에스트로겐이 추가되지 않았습니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
중요 단계
그것은 유방 땀샘은 유방 상피 세포의 행동에 연령 관련 변화에 대한 제어 할 수있는 같은 시대의 마우스에서 수확되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 세포를 도금 할 때, 셀의 동일한 번호가 모든 실험에 대한 각각의 우물에 도금해야합니다. 문화가 가능한 직렬 이미지를 통해 여러 개별 셀을 따르도록하고 너무 빨리 합류가되지 않도록 도금 할 때 세포는 상대적으로 희박한해야합니다. 이 플레이트는 equilibrated 후 포커스가 변경됩니다 때문에 접시 이미징 전에 보육에 equilibrated 것이 중요합니다. 일단 영상이 시작되었습니다 초점은 특히 첫 24 시간 이내에 자주 확인하고 필요에 따라 조정해야합니다. 이 보육 규제 및 사전 예열의 온도가 중요합니다. 방을 들락날락 사람들의 수는 가능한 한 제한해야합니다. 우리는 보인의 모든 측면을 연습하는 것이 좋습니다g 재현성 및 품질 관리를 보장하기 위해 사전에 실험까지. 모든 세포 배양 실험과 마찬가지로, 불임은 중요한 문제이며, 표준 무균 세포 배양 관행은 항상 사용되어야합니다.
저장 및 대형 이미지 파일을 조작하는 메모리 공간의 상당한 금액이 필요합니다. 공유 네트워크 드라이브 또는 이동식 하드 드라이브를 사용할 수 있습니다. 일단 파일이 이미지가 지속적으로 올바르게 이름 및 해당 폴더에 배치되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다 변환됩니다. 자주는 디지털 데이터를 저장하는 과정에서 수행해야합니다.
제한
이 방법은 3-D 문화 시스템에 명백해질 수도 행동 차이 분석을 허용하지 않습니다 2-D 문화 시스템을 사용합니다. 첫번째 세포 분열에 시간 수는 초기화 아래와 같이 세포 수명의 기간은 reproducibly 처음 관찰 된 세포 분열 후 측정 될 수있다세포의 ial 도금 변수입니다.
가능한 수정
실험의 요구에 따라 시간 경과 이미지는 더 많거나 적은 자주 드실 수 있습니다. 과도 세포 구조 정량화 할 경우 예를 들어, 5 초 간격이 더 적합 할 수 있습니다. 기본 유방 상피 세포 문화를 생성하는 다른 절차를 사용할 수 있습니다. 모든 영상 장비 등의 그것이 실험의 요구 사항을 충족 할 수있는 바와 같이, 시간 경과 영상을 만드는 데 사용할 수 있습니다. 단일 셀 추적에 대한 대체 시스템이 채용 할 수 있습니다. 절차는 여기에서 설명한를 들어, 표준 플라스틱 평면 아래 6 잘 플레이트는 충분한했습니다. 플라스틱 요리 등 4 배, 10 배, 그리고 20x 등 모든 긴 작업 거리 공기 렌즈에 사용할 수 있습니다. 이 플라스틱은 대부분의 요리에 가장자리 근처에 곡선과 빛을 왜곡 때문에 위상 콘트라스트 이미지를 수행 할 때 플라스틱 요리의 중심에서 가까운 지역을 선택하는 것이 중요합니다.Coverslip 두께 유리 바닥 우물은 높은 배율에서 일반적으로 정상 작동 거리 침적 렌즈 (석유, 물, 글리세롤 등), 위해 필요한 될 것입니다.
문제 해결
세포 도금 때, 미디어는 스테이지에있는 판을 조작하기위한 필요성을 줄일 5 일 세포의 성장을 유지하기에 충분해야합니다, 필요한 경우에는 미디어에 추가 할 수 있습니다. 그것은 증발이 최소로 유지하는 것이 좋습니다. 증발은 보육 내부 살균 탈 이온수의 3-4 요리를 배치하고 필요한 경우를 충진에 의해 관리되어야한다. 그것은 살균 탈 이온수와 6 잘 플레이트의 사용하지 않는 우물을 채울 할 수 있습니다.
이미지가 TTT 프로그램에로드되지 않은 경우 먼저 확인하고 파일과 폴더가 올바르게 배열과 이름이되어 있는지 확인하십시오. 로그 파일이 (단계 5.5 참조) 올바른 폴더에있는 경우 다음을 확인하십시오.
Futu마스터 기술 후 다시 응용 프로그램 또는 방향
동일한 일반 절차는 인간의 기본 유방 상피 세포뿐만 아니라 유방암 세포 등 다른 세포 유형의 행동을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, genotypic 특정 동작 및 / 또는 후보 트리트먼트에 대한 응답으로 분석 할 수 있습니다. 또한, 형광 활성화 된 세포의 이미징 (포워드 액티브)가 정렬 된 셀 인구는 수행 또는 형광 라벨은 특정 세포 유형을 모니터링하기 위해 추가 할 수 있습니다.
기존의 방법에 관하여이 기술의 의의
전통 세포 배양 및 분류 기술로 시간이 지남에 따라 세포의 행동 시간 경과 영상과 분석의 추가 시간이 아닌 단 전체 인구 역학의 단독 세포의 양적 데이터를 제공합니다. 이 기술은 하나의 세포 만 분리 timepoints에서 관찰을 허용 전통적인 방법과는 달리, 지속적으로 관찰 할 수 있습니다. 엠oreover 전통적인 방법은 세포가 그 접근 방식이 여기에 설명 된 반면 현미경을 볼 보육의 경찰에 복용하고 아웃을 방해 할 필요하면 셀이 전송되지 않고 관찰 할 수 있습니다. 마지막으로, 시간 경과 영상이 더 분석을 위해에 반환 할 수 있습니다 관찰 아래에있는 세포의 불후의 기록을 제공합니다. 개별 셀의 행동을 추적 할 수 TTT의 사용은 여러 개의 매개 변수의 단호한 분석을 허용하고 형광 라벨의 사용이 관찰 아래의 특정 셀을 지역화 할 필요가 없습니다. 기술은 유선의 정적 조직 섹션에 측정하기 어렵 유방 상피 세포의 행동의 차이를 보여줍니다. 셀 수명 측정 mitotic 이벤트 사이의 시간 수를 수량화. 이 측정은 시간 세포주기의 길이를 나타내는 세포 분열 사이의 시간의 실제 수에 특정 데이터를 제공합니다. 연구원 방법을 결정하기 위해이 데이터를 사용할 수 있습니다특정 유전 변경 또는 문화 조건 영향을 미치는 세포주기의 길이.
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Disclosures
제작자들은 더 경쟁 금융 이익이 없다는 점 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 라이브 셀 이미징에 자신의 소개를 위해 기술 지원 및 마이클 Rieger에 Bofan 우와 기독교 Raithel 감사하고 싶습니다. NCI, NIH RO1CA112176 (PAF), NCI, NIH의 지원. R01CA89041-10S1 (PAF), Deutscher Akademischer Austaush Dienst EV A/09/72227 참조. 316 (REN), 국방부 W81XWH-11-1-0074 (REN), 교육 과학 기술부 (R31-10069)의 지원을받는 한국의 국립 연구 재단을 통해 WCU (세계 클래스 대학) 프로그램 (PAF ), NIH IG20 RR025828-01 (설치류 장벽 시설 장비), 그리고 NIH NCI 5P30CA051008 (현미경 및 이미징 및 동물 공유 자원).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EpiCult-B Basal Medium Mouse | StemCell Technologies | 05610 | |
| EpiCult-B Proliferation Supplements Mouse | StemCell Technologies | 05612 | |
| recombinant human Epidermal Growth Factor (rhEGF) | StemCell Technologies | 02633 | |
| Collagenase/Hyaluronidase | StemCell Technologies | 07912 | |
| Disposable Scapels | Feather | 2975#10 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | StemCell Technologies | 37150 | |
| Ammonium Chloride | StemCell Technologies | 07800 | |
| Tryspin-EDTA | StemCell Technologies | 07901 | |
| Dispase | StemCell Technologies | 07913 | |
| DNase I | StemCell Technologies | 07900 | |
| 40 μm cell strainer | StemCell Technologies | 27305 | |
| FBS | StemCell Technologies | 06100 | |
| PenStrep | Gibco | 15140 |
References
- Jones, L. P., et al. Activation of estrogen signaling pathways collaborates with loss of Brca1 to promote development of ERalpha-negative and ERalpha-positive mammary preneoplasia and cancer. Oncogene. 27, 794-802 (2008).
- Burga, L. N., et al. Altered proliferation and differentiation properties of primary mammary epithelial cells from BRCA1 mutation carriers. Cancer Res. 69, 1273-1278 (2009).
- Li, M., Wagner, K., Furth, P. A. Preparation of primary mammary epithelial cells and transfection by viral and nonviral methods. Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer. Ip, M., Asch, B. , Kluwer Academic, Plenum Press. (2000).
- Schroeder, T.
- Schroeder, T. Long-term single-cell imaging of mammalian stem cells. Nature Methods. 8, S30-S35 (2011).
- Eilken, H. M., Nishikawa, S. -I., Schroeder, T. Continuous single-cell imaging of blood generation from haemogenic endothelium. Nature. 457, 896-900 (2009).
- Kokkaliaris, K. D., Loeffler, D., Schroeder, T. Advances in tracking hematopoiesis at the single-cell level. Current opinion in hematology. , (2012).
- Rieger, M. A., Hoppe, P. S., Smejkal, B. M., Eitelhuber, A. C., Schroeder, T. Hematopoietic cytokines can instruct lineage choice. Science. 325, 217-218 (2009).
- Rieger, M. A., Schroeder, T. Instruction of lineage choice by hematopoietic cytokines. Cell Cycle. 8, 4019-4020 (2009).
- Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nat. Protoc. 6, 214-228 (2011).
