Birincil Preneoplastic Meme Epitel Hücrelerinin Time-lapse görüntüleme Meme Kanseri Genetik Fare Modelleri türetilen

Summary

Time-lapse görüntüleme özgü davranışsal parametreler ve farklı genetik lezyonlar arasında bir korelasyon olup olmadığını belirlemek için meme kanseri riskinin genetik fare modelleri türetilmiştir birincil preneoplastic meme epitel hücrelerinin davranışlarını değerlendirmek için kullanılır.

Abstract

Zaman aralıklı görüntüleme meme kanseri farklı genetik olarak fare modelleri elde edilen kültür birincil preneoplastic meme epitelyal hücrelerinin davranışını karşılaştırmak için kullanılabilir. Örneğin, hücre bölünmeleri (hücre yaşam), apoptotik hücre sayıları, morfolojik değişiklikler evrimi ve koloni oluşum mekanizması arasındaki zaman ölçülebilir ve belirli genetik lezyonlar taşıyan hücreler karşılaştırıldı. Primer meme epitel hücre kültürlerinde palpabl tümör olmadan meme bezleri tarafından üretilir. Bezler dikkatlice bitişik kas açık bir ayrım ile eksize edilir, lenf düğümleri kaldırılır ve zenginleştirilmiş meme epitelyal hücrelerinin tek hücre süspansiyonları enzimatik çözünme ve süzme, ardından kıyma meme dokusu tarafından oluşturulur. Tek hücre süspansiyonları canlı hücre görüntüleme için bir inkübatör içinde kaplama ve mikroskop altında doğrudan yerleştirilir. Her w bir 4x4 konfigürasyonunda Onaltı 650 mikron x 700 mikron alanları6-kuyulu plakanın arşın 5 gün için her 15 dakikada görüntülü. Time-lapse görüntüleri doğrudan ilk 24 hücreleri kaplama ve sa (agregasyon karşı hücre çoğalması), apoptoz insidansı ve morfolojik değişikliklerin aşamalı içinde hücre koloni oluşum mekanizması ve frekans içerebilir hücresel davranışları ölçmek için incelenmiştir. Tek hücreli izleme bireysel hücre yaşam ve hücre bölünmesi desen soruşturma ölçümü için hücre kaderinin haritaları oluşturmak için kullanılır. Nicel veriler istatistiksel olarak belirli genetik lezyonlar ile ilişkili davranış önemli farklılıklar için değerlendirmek için analiz edilir.

Introduction

Genetik mühendisliği fare modelleri incelemek ve farklı genetik lezyonlar meme kanseri riskine katkıda anlamak için kullanılan araçlardır. Örneğin, genetiğiyle oynanmış farelerin göstermiştir ki, üç faktörün kombinasyonu: tam uzunlukta meme kanseri 1, erken başlangıçlı (BRCA1) meme epitel hücrelerinde gen, tümör protein p53 (TP53) germ-line haploinsufficiency ve epitel meme kaybı hücre hedefli up-regüle östrojen reseptör alfa, BRCA1 ^{floxed (f) 11/f11/Mouse Meme Tümör Virüsü (MMTV) -Cre/p53 + / -/tetracycline-operator (%} 100 oranında meme kanseri gelişiminde (ERA) ifadesi sonuçları ^{tet-op) -ER/MMTV-reverse tetrasiklin Transaktivatörü (BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre/p53} bildirilen düşük yüzdeler ^{+ /} karşılaştırıldığında yaş 12 ay ^rtTA farelerde - ERA olmadan fareler aşırı ekspresyonu (~ 50 - % 60) ve TP53 haploinsuf olmadan BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre} farelerdeficiency (<% 5). ¹

Preneoplastic birincil meme epitel hücrelerinin davranış Dinamik time-lapse görüntüleme az kolayca statik doku kesitlerinde takdir hücre davranış farklılıkları ortaya koymaktadır. Proliferasyon ve farklılaşma değişiklikler insan BRCA1 mutasyon taşıyıcılarında primer meme hücrelerinde görülmektedir. Tek hücre normalden birincil meme epitel hücrelerinin süspansiyonlar ve genetiğiyle oynanmış farelerin ² Yaratılış Rezeke meme bezi dokusu enzimatik ayrışma yoluyla üretilir. ^3. Time-lapse görüntüleri hücre kolonisi görünümü ve epitelyal-mezenkimal geçiş (EMT) ve apoptoz gibi hücrelerinde morfolojik değişikliklerin insidansı mekanizmasını ve zamanlamasını değerlendirmek için görüntülenebilir. Hücre kaderinin harita üretimi, hücre bölünmeleri (hücre yaşam) ve hücre bölünmesi kalıplarının belirlenmesi arasındaki sürenin uzunluğu ölçümü tek hücreli izleme kullanımı ile kolaylaştırılmaktadır. Timm'S Takip Aracı (TTT) tek hücre kaderinin haritaları oluşturmak için kullanılan kamuya açık yazılım. Hücre kaderinin mekanizmalarının aydınlatılmasına Onun programı normal hematopoetik kök hücre gelişimi ^6-9 ve nöronların nesil inceleyerek ^4,5 kurulmuştur. ^10.

Protocol

1. Genel Şeması

1. Genetiği ve meme bezlerinden preneoplastic meme epitel hücrelerinin primer kültürlerinde üretmek ve wild-tip farelerden kontrol.
2. Canlı hücre görüntüleri 5 gün için Volocity görüntü alma yazılımı (sürüm 5.3.1, Perkin Elmer, Waltham, MA) kullanılarak her 15 min.
3. Zamanlama ve epitel hücre koloni oluşum mekanizması, apoptoz insidansı ve morfolojik değişikliklerin aşamalı değerlendirmek için doğrudan zaman atlamalı görüntüleri görüntüle.
4. Için oluşturulan Volocity. TIFF yığınlarının dönüştürün. MetaMorph Mikroskopi Otomasyon ve Görüntü Analiz Yazılımı (Molecular Devices, LLC Sunnyvale, CA) ve rename dijital görüntü dosyaları (Rename 2.1.6 kullanarak JPG dosyaları http://www.softpedia.com/get / Sistem / Dosya Yönetimi /-Rename.shtml ) Timm en Takip Aracı yazılımı (TTT, uyum sağlamak için,tz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index.html "target =" _blank "> http://www.helmholtz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index. html).
5. TTT kullanarak, hücre bölünmeleri (hücre yaşam) ve hücre bölünmesi desenleri (simetrik karşı asimetrik) arasındaki süresinin belirlenmesinde hücre kaderinin haritaları oluşturmak.
6. Farklı genetik fare modelleri ve / veya vahşi tip kontroller arasında anlamlı farklılık olup olmadığını belirlemek için adım 3 ve üzeri 5 kantitatif verileri analiz.

2. Primer Meme Epitel Hücre Kültürleri Nesil

1. Üreticinin talimatlarına (EpiCult-B Fare Orta Takımı, Stemcell Technologies, Vancouver, BC) bir varyasyon takiben tek meme epitel hücrelerinin izolasyonu için Komple Media hazırlayın. 450 ml Epi-Cult-B ortam, 50 ml Epi-Cult B proliferasyon takviyesi,% 5 fetal sığır serumu (FBS), 50 ug / ml penisilin / streptomisin (PenStr Kombineep) ve 10 ng / ml 'Epidermal Büyüme Faktörü (EGF).
2. 2.1 9 parça Komple Media ile 10x kollajenaz / Hyaluronidaz karışımı, 1 kısım birleştirerek Ayrılma Medya hazırlayın.
3. Fare Euthanize ve hemen otopsiye geçin. Sıra bir styrofoam otopsi platformda sırtında fare ve ventral deri gergin olduğunu bu yüzden tüm dört bacağı sabitleyin. O% 70 etanol ile, bacaklarda örten dahil ventral deri ve saç, doyurabilecek. Medial her ön ekstremite cilt ve yoluyla bir Y-kesi içine uzatılır deri yoluyla ortadan ensizyon (periton girmeyin) yaparak # 2/3 (göğüs) ve # 4/5 (inguinal) meme bezlerinin Açığa her iki arka ekstremite medial deri yoluyla Y insizyonu baş aşağı bir.
4. Künt diseksiyon kullanarak underlyingperitoneum cilt ayırmak, bu gergin kadar cildin her iki tarafına geri çekin ve işaretçilerine kullanarak strafor otopsi platforma sabitleyin. Dış taraftan başlayarak, disse akılcı kullanımı ile künt diseksiyon kullanabilirsinizction makas sağlam kasık ve / veya altta yatan bağ dokusu ve kas torasik meme bezleri izole etmek. 10 cm steril Petri kabındaki ikiden fazla meme bezlerinin yerleştirin ve doku kültürü kaputu taşımak.
5. Doku kültürü kaputu içinde, sarımsı bir renk ile küçük, iyi sınırlı nodüller olarak tanımlanan meme lenf düğümleri için bezleri inceleyin. Steril neşter ve forseps kullanarak çevredeki bezinden lenf düğümleri kaldırın. İki steril neşter, her biri bir el kullanarak ~ 1 mm ³ küpler halinde meme dokusu Kıyma.
6. Sıra yavaşça 10 ml pipet kullanarak 2-3 kez aşağı yukarı pipetleme ve tarafından 5 ml Ayrışma Medya, mix meme dokusu kıyılmış ve% 5 CO ₂ ile 37 ° C inkübatör (en fazla ~ 16 saat) bir gece inkübe gevşeyen kapaklı 50 ml konik tüp.
7. Ertesi sabah, kırmızı bl teşvik etmek için amonyum klorür çözeltisi tamponlanmış% 2 FBS ve 4 kısım ihtiva eden 1 kısım Hanks Dengelenmiş Tuz Çözeltisi (HBSS) bir soğuk karışım hazırlamakood hücre lizisi (HFAmCl) yanı sıra, soğuk HBSS% 2 FBS (HF) ile desteklenmiştir. Ön sıcak Tripsin-EDTA (% 0.25), Hank Dengeli Tuz Çözeltisi içinde 5 mg / ml dispase, 1 mg / ml DNase I, ve Komple Media modifiye edilmiştir.
8. Inkübatör meme dokusu ile konik santrifüj tüpü çıkarın ve yavaşça girdap 2-3 sn iki kez darbe. 5 dk (oda sıcaklığında ya da 4 ° C) için 450 x g'de santrifüjleyin tüp, ve süpernatan atılır.
9. 5 dk (oda sıcaklığında ya da 4 ° C) için 450 x g hızında 10 ml HFAmCl ve santrifüj içinde en az bir pelet yeniden süspanse edin ve süpernatan atılır.
10. Pelet 3 ml tripsin-EDTA ekleyin ve 5 ml'lik pipet ile ilk karıştırın ve daha sonra tel (1-3 dk) kadar P1000 mikropipet ile. 5 dk (oda sıcaklığında ya da 4 ° C) 450 10 ml HF, santrifüj × g ekleyin ve supernatant atın.
11. 5 mg / ml dispase 2 ml ve 1 mg / ml DNase I pelet ve 1 dakika süreyle bir P1000 mikropipet ile karıştırmak için 200 ul ekle. Örnek clo olmalıdırudy ama kılçıklı değil. Lifli ise, DNaz I 100 ul ekleyin ve tekrar karıştırın.
12. 5 dk (oda sıcaklığında ya da 4 ° C) 10 ml soğuk HF, 450 bir 40 mikron hücre süzgecinden ve santrifüj yoluyla gerginlik × g ekleyin ve supernatant atın.
13. Komple Media nihai pelletini tekrar. Hücrelerin toplam sayısı (hemasitometre veya Coulter Sayacı kullanılarak) ölçmek. İki meme bezlerinin yaklaşık 1 x 10 ⁶ 1 x 10 ⁷ hücre verim. Kuyu başına 1,5 x 10 ⁵ hücre yoğunluğunda bir düz dipli 6 plaka Plak primer epitelyal hücreler.

3. Canlı hücre Görüntüleme

1. Hemen hücreleri kaplama sonra, ₂ / humidity/37 doymuş ° C sıcaklıkta inkübasyon odası% 5 CO içinde bir mikroskop sahne üzerine güvenli bir şekilde 6-plaka yerleştirin. Kohler aydınlatması ve merkezi faz halkaları için kondenser ayarlayın. Burada sunulan deneyler için, ters çevrilmiş bir Nikon Eclipse TE300/PerkinElmer Disk konfokal İplik10x objektif lens ile Widefield faz kontrast modunda mikroskop sistemi kullanılmıştır.
2. Açık görüntü toplama yazılımı, oluşturmak ve zaman atlamalı görüntüler için bir kütüphane isim ve büyük dosyalar için yeterli alana sahip bir yere kaydedin. Deneyleri burada kullanılan Volocity görüntü alma yazılımı (sürüm 5.3.1, Perkin Elmer, Waltham, MA) sundu.
3. Plaka 15 dk en az mikroskop inkübatör dengelemek için izin verin. Aşamasında objektif bir girişimi engellemek için lensler indirin. "Sahne" başlığı altında, "Aşama kalibre edin." Seçeneğini Odak düzlemi, set Z başlığı "Sahne" altında "Add noktası" seçerek x, y, z sekmesi ve işareti görüntüleme puan altında = sıfır. Reacquire Faz kontrast görüntüleme gibi görüntüleme için 6-plaka Her kuyunun ortasına yerleştirin puan plastik kuyuların çevre yakın bozulabilir. 4 x 4 alan (650 mikron x 700 mikron alanları), küçük bir örtüşme (yaklaşık% 5) her bir kare noktaları düzenleyin. "Stag altında seçilen noktalarını kaydedine ".
4. "Sahne" altında seçin "odak harita olun" ve her noktasındaki odağı ayarlamak için yönergeleri izleyin. Saatte 4 fotoğraf (her 15 dakikada) yakalamak için görüntü toplama zamanlaması ayarlayın. Bu özel deney gereksinimlerine bağlı olarak ayarlanabilir. "Sahne" altında odak haritayı kaydedin.
5. Sağ sağ tarafında araç çubuğu "Image Acquisition" üzerine tıklayın ve görüntüleme ayarları kaydedin. Görüntüleme başlamak için kayıt düğmesine basın. 1 saat sonra, herhangi bir ayarlama gerekip gerekmediğini görmek için görüntülerin odağı kontrol.
6. Monitör ve hücreler konfluent olunca biten, 5 gün boyunca canlı görüntüleme devam eder.

4. Zamanlama Başlangıç ​​ve Epitel Hücre Colony Oluşum Mekanizması, Apoptozis insidansı ve Morfolojik Değişikliklerin Aşamalandırma Değerlendirememesi Time-lapse Görüntüler Doğrudan İzlenimi

1. Zaman atlamalı görüntüleri Doğrudan görüntüleme uyumlu herhangi bir video izleme yazılımı (örneğin kullanılarak performans alınabilir http:/ / Www.real.com/ realplayer veya diğer ücretsiz ya da ticari olarak temin yazılımı). Görüntüler bu aşamada ya. JPG dosyaları (Adım 5) dönüşüm sonra. TIFF formatında izlenebilir.
2. İlk koloni oluşum mekanizmasını belirlemek için, plaka üzerinde bir görüntüleme alanını temsil eden tek bir görüntü yığını ile başlar. İlk çerçeve, hücreler yüzen olacaktır. Birinci epitel hücre plaka yapışır belirlemek için seri görüntü izleyin. Bu aşamada, epitel hücreleri tespit edilebilir ve bunların daha cuboidal morfolojisi ile fibroblastlar ayırt. Seri görüntüler aracılığıyla bu tek katlı epitel hücre izleyin ve sonraki 24 saat boyunca kendi kaderine izleyin. Bu ek epitel hücreleri tarafından çevrili olur veya hücre bölünmesi veya apoptoz görmesi durumunda kaydedin. Epitel hücreleri ile çevrili ise çevreleyen hücreleri daha sonra, ilk yapışık hücre (ler) i ya da toplayabilir yüzen hücrelerde elde edilir ise, koloni oluşumu mekanizmasını görüntüleyerek direkt olarak tespit edilebilirİlk yapışık hücre bölünmesi gelen. İlk 24 saat boyunca hücre agregasyonu karşı hücre bölünmesi ile oluşturulan kolonilerin sayısını kaydedin.
3. Belirli bir süre içinde apoptoza başlangıçta yapışık hücre sayısını belirlemek için, yapışık olan bir hücrede gelişen apoptozisin klasik özelliklerin görülmesi için seri görüntüleri izleyin ( http://www.alsa.org/research/about -als-research/cell-death-and-apoptosis.html ) ve görüntüleme tüm süresi boyunca ya da belirli süreler dahilinde belirlenen apoptotik hücre sayısı kaydedildi.
4. Zamanla, kültür epitel hücreleri EMT ile tutarlı daha ince uzun bir görünüm için bir ilk kübik şekle morfoloji değiştirebilir. Bu oluştuğunda Kaplama sonrası gün / saat belirlemek için seri görüntüleri izleyin.

5. Görüntü Dosyası Modifikasyon

1. Timm en Takip Aracı yazılım gereksinimlerine göre görüntü klasörleri ve dosyaları yeniden adlandırın Rename 2.1.6 (gibi ücretsiz bir program kullanın http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml gruplar halinde dosyaları yeniden adlandırmak için). Deneyin tüm klasörleri ve dosyaları içeren bir klasör oluşturun ve (örneğin, klasör adını
2. Kültür görüntülendi her noktası / pozisyon için bir alt klasör oluşturun. Alt Ad: EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER. Pozisyon numarası 3 haneli olmalıdır. Örnek: 072511RN_p001. Alt bireysel konumunun tüm görüntü dosyalarını koyun.
3. Timepoint (5 basamak kullanarak) ve bu biçimde her dosya adının sonunda kanal numarasını (tek bir parlak alan kanal olmadığı için, "0" kullanın) ekleyin:
   EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER_tTIMEPOINT_wCHANNELNUMBER.jpgExample: 072511RN_p001_t00001_w0.jpg
4. İlk TTT web sitesinden ücretsiz program TTTlogfileconverter indirerek her pozisyon için bir günlük dosyası oluşturur. TTTlogfileconverter programını başlatın ve deney klasörü seçin. Girdi bir görüntü aralığını (saniye olarak). Her 15 dakikada çekilen bir resmi için 900 sn girin. Sonra yeşil örtülü log dosyaları düğmesine basın.

6. TTT Kullanarak Tek Hücre Hücre Kader Harita Üretimi

1. CTTTexport adında bir klasör REATE ve tüm hücre izleme verileri TTT yazılım talimatları izleyerek saklanacağı bir alt TTTfiles denir
2. TTT programını başlatın, kullanıcı harfleri seçin ve tıklayın "Devam."
3. Basın "Set NAS," "TTTexport" klasörü oluşturulur kullanıcıyı seçin ve Tamam 'ı tıklatın. Tarayıcıda tuşuna basın "Load konumu" düğmesi, bir deney klasörü seçin bir pozisyon klasörü seçin ve.
4. Için oküler faktörü belirle "10x." Gerekli görüntü sayısını yükleyin (tüm görüntüleri yükleme ilk kez tavsiye edilir).
5. Hücre editörü penceresinde, Dosya menüsü altındaki "Yeni koloni" seçeneğini seçin. Film penceresinde, bir hücre izlemeye başlamak için "Parça hücre" veya F2 tuşuna basın.
6. M bir hücrenin belirlenmesiOvie penceresi ve hücre üzerine imleci yerleştirmek için kullanmak fare. F2 tıklandığında sonra hücre sayısı ile bir daire görünür. Sonraki resme hücre ve avans yerleşim izlemek için Klavyenin numara pad üzerinde "0" tuşunu kullanın. Her çerçeve ile her hücrenin yerleştirme takip götür. Bir parçayı silmek ve sayı pad üzerinde önceki görüntü basın "Del" geri dönmek için. ", 3" hücre basın izleme olmadan ileriye kareleri hareket etmek ve numara pad basın "1" izleme olmadan geri gitmek için.
7. Bir hücre bölünmesi Film penceresinde "Bölüm" butonuna tıklayın işaretlemek için. Hücre ölümü münasebetiyle Film penceresinde "Hücre ölümü" düğmesini tıklatın. Bir bölünme oluştu sonra, kızı Hücreleri sağa otomatik modunda izlemeye başlamak için Hücre editör penceresinde belirlenen yavru hücre çemberi sembolü tıklayarak aynı hücre kaderinin harita izlenebilir.
8. Ağaç kaydetmek için F10 tuşuna basın. Her ağaç belirlenen çıkış kat kaydederer (TTTExport). Yeni bir hücre kaderinin haritası başlatmak için, Hücre editör penceresinde "Dosya" ardından "Aç" menüsü altındaki "Yeni koloni" seçeneğini seçin.
9. Hücre düzenleyicisi penceresinde "Hücre veri" sekmesinden toplama sonra hücrenin ömür veri sıralayınız.

7. İstatistiksel Analizler

1. Ya Student t-testi kullan (iki genotipi karşılaştırarak) veya ANOVA belirlemek için (> iki genotipi karşılaştırarak varsa) gibi başlangıç ​​hücre kolonileri, hücre yaşam veya saat numaraları gibi parametrik veriler farklılıklar farklı genotipleri arasındaki EMT görünümünü istatistiksel kadar ise önemli. Apoptotik frekans numarası / Student t-testi ve ANOVA kullanılarak toplam sayısı kaplamalı hücreler veya yapışık hücrelerin yüzdesi olarak türetilmiş Mann-Whitney veya Kruskal-Wallis ile mukayese edilebilir.
2. Gerek deneysel çoğaltır kaç belirlemek için ilk deneyleri analiz verileri kullanarak güç testleri gerçekleştirin yeterli s için yapılan ve hücre kaderinin haritalar her çoğaltmak eldemevcut ücretsiz kullanarak tatistical güç (örn. http://statpages.org/ ). Burada sunulan deneylerde, genotip başına üç fareler türetilmiş hücre kültürlerinde spesifik genetik değişiklikler yapılmış iken hücre koloni oluşumu ve hücre yaşamlarda istatistiksel olarak anlamlı farklılık olup olmadığını belirlemek için yeterli idi.

Representative Results

Epitel ve fibroblast hücreleri hücre morfolojisi ile ayırt edilebilir. Epitel hücreleri kübik şekil (Şekil 1A-B) ve form hücre kolonileri (Şekil 1A) var. Fibroblastlar, stromal hücre türü olan bir ince uzun morfoloji (Şekil 1C) sahiptir.

Hücreler yuvarlak ve görüntüleme başlangıçlı (Şekil 2A-D) yüzen edildi. Plakasına eki sonra onlar düz oldu ve kübik tipi görünümü (Şekil 2E, H) göstermiştir. Kültür 4 gün olarak epitel hücrelerinin çoğunluğu bir EMT benzeri morfoloji (Şekil 2I-L) içine uzamıştır. Bu değişiklik, incelenen tüm genotipleri aynı kronolojisi ile oluştu. Kohler aydınlatma ve faz halka hizalama doğru ayarlanmış (Şekil 2B, H, L) değildi çünkü bazı dijital görüntüler bulanık.

Tanımlanan bireysel epitel hücre koloni haline yüzen hücrelerKaplama sonrası 24 saat ile es (Şekil 3A, B). Seri görüntü analizi bu kolonilerin yerine hücre bölünmesi daha hücre agregasyonu meydana geldiğini ortaya koymuştur. Kendisi tarafından BRCA1 bozulması oluşan kolonilerin sayısı, TP53 haploinsufficiency ilavesi değiştirmez etmezken anlamlı oluşan kolonilerin sayısı azalır ve ERα ilavesi aşırı ekspresyonu anlamlı (Şekil 3C) oluşan kolonilerin sayısı arttı.

Bu hücrelerin hücre odak içinde kalmasını ve kültürleri kontamine emin olmak için en az günde iki kez sonra plakasına takılır ve edinilen dijital görüntüleri izlemek ve ilk 24 saat boyunca sık sık odağı haritayı ayarlamak için önemlidir. Görüntülü hücreleri (Şekil 4) odakta değilse analizlerin doğruluğu tehlikeye düşer.

Burada sunulan temsil eden bir deneyde, kritik bir soru ortaya koymaktır halinde ifade seviyesinde değişikliklermeme kanseri riski (BRCA1, TP53 ve östrojen reseptör 1 (Esr1) ¹⁾ etkisi olduğu bilinen genlerin s hücre bölünmeleri (hücre ömrü) arasındaki saat numarası değiştirilmiş veya kanser olmayan bölünmeye desenleri (simetrik karşı asimetrik) etkiledi birincil meme epitel hücreleri. Bunu başarmak için, tek tek hücre kaderi haritalar (ağaçları) TTT kullanılarak oluşturulmuştur. Test edilen dört genotiplerinin her biri için temsili kaderin hücre haritaları örnekleri arasında (Şekil 5A-D) ile gösterilmiştir. Test edilen hücre dört genotipleri, (Şekil 5A) (bir genetik manipülasyon) tam uzunlukta BRCA1 kaybı (BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre)} (Şekil 5B), kombinasyon, tam-uzunlukta BRCA1 kaybı yabani-tip idi (BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -)} (Şekil 5C), ve TP53 haploinsuffici ile birlikte tam uzunlukta BRCA1 kaybı ile TP53 haploinsufficiencyency ve Esr1 (BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -/MMTV-rtTA/tet-op-ER)} (Şekil 5D) kazanç. Hücreleri tek hücre kesin takibi bundan sonra artık mümkün olduğundan (~ 3-4 kuşak) konfluent olunca hücre kaderinin harita üretimi durduruldu. Üretimi 0 (İlk hücrenin bölünmesi zamanı) hücre yaşamların analizleri dahil değildi çünkü süresi nesil 0 uzundu ve sonraki nesillere oranla daha değişkendir. Ortalama hücre ömürleri veya bu kuşaklar arasındaki ortalama (SEM) Standart Hata anlamlı farklılık vardı çünkü Generations 1, 2, 3, ve 4 final analizler için bir araya gruplandırıldı. Farklı genotip (Şekil 5E) arasındaki ortalama hücre yaşamların Karşılaştırmalar olduğunu tam uzunlukta BRCA1 kaybı 21.3 hücre bölünmeleri arasındaki saat sayısını azalttı ± 1.6 saat (wild-tip) 16.5 vahyetti ± 1,0 saat ^(/ BRCA1 ^{f11/f11 MMTV-Cre).} Hayırtam uzunlukta BRCA1 kaybına ek olarak bir TP53 allel kaybı meme kanseri development1 önemli bir artış ile ilişkili olsa da, tably, hücre kullanım süresi sadece BRCA1 eksik fareler ile karşılaştırıldığında (16.3 ± 1.2 saat) değişmemiş idi. İlginçtir BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53} içinde Esr1 arasında kazanç ^{+ / -/MMTV-rtTA/tet-op-ER} farelerde hücre ömrü bu farelerin de olsa, yakın yabani tip düzeyleri (19.3 ± 2.1 saat) sürelerini restore var Tüm modellerin meme kanseri gelişme insidansı en yüksek Bu bulgular tam uzunlukta BRCA1 kaybı kaçınılmaz kısaltılmış bir hücre ömrü, bunun yerine aşırı dile getirdikleri ERα tarafından güncellenmiştir ile ilişkili değildi belirtilmedikçe here.1 okudu. Bu teknolojiyi kullanan Olası sonraki adım deneyler farklı genetik arka plana hücre ömrü üzerindeki etkilerini ölçmek için farklı östrojen, diğer büyüme faktörleri, aday veya tedavi ile doz-yanıt deneyleri olabilirunds. Hücresi ömrü süresine etkisinin aksine, genetik değişikliklerin hiçbiri burada değiştirilmiş hücre bölünmesi desen eğitimi.

Şekil 1. Bir epitel hücreli koloni (A) Görünüş, epitel hücre (B) ve time-lapse görüntüleme dan fibroblast (C). Fibroblastlar daha uzamış görünür iken Epitel hücreleri daha cuboidal görünür. Boyut barlar = 50 mikron.

Şekil 2. Zaman 0 Temsilcisi seri time-lapse fotoğraf, 2 ve 4 gün süre ile görünüş olarak farklılıklar üzerinde ve Kohl olmadan hücresel morfolojik değişiklikler göstermektedirer aydınlatma. zamanı 0 At kaplamalı hücreler yapışık ve kübik tipi morfolojisi (kalın oklar E, H) görülebilir kültüründe iki gün ve uzamış kültür dört gün, (ok başları AD) yüzen ve bir olduğunu ispatlar EMT-benzeri morfolojisi (ince oklar IL). Kohler aydınlatma paneller AC, EG ve IK bulunur. Paneller D, H ve L Kohler aydınlatması olmadan görüntüleri göstermek. Gösterildiği Görüntüleri zamanla aynı görüntüleme noktadan vardır. Boyut çubuk = 200 mikron. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 3,. 1 gün epitel hücre kolonilerin sayısı genotipi ile değişmiştir. (A) hızlandırılmış görüntüleme başında yüzen hücrelerin yuvarlatılmıştır. (B) İki temsili epitel hücre kolonileri (oklar). Epithelia (C) Numaralarıl hücre kolonilerinin / çerçeve genotipi ile çeşitli 24 saatte kurdu. Çubuk grafikler ortalamanın ortalama ve standart hata göstermektedir. * P <0.05, ANOVA. Boyut çubuk = 200 mikron. 10 palpabl tümör olmadan meme bezlerinden izole Hücreleri - (n = 3), BRCA1 ^- 12 aylık BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre} (n = 4), BRCA1 ^{f11/f11 / MMTV-Cre / p53 + /} için ^{f11/f11/p53 + / -/MMTV-Cre/Tet-op/-ER/MMTV-rtTA} (n = 3) ve vahşi tip (n = 3) farelerde çalışmalar için görüntülenmiştir. Wild-tip ve genetiğiyle oynanmış farelerin farklı kombinasyonlarından oluşan beş bağımsız görüntüleme deneyler yapıldı. Medya fenol kırmızısı içeriyordu. Hayır östrojen eklendi. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 4. Out-of-odak görüntüleri doğru olamazly analiz. görüntüleme plaka önce, plaka dengelemek için 15 dakika görüntüleme inkübatörde oturtulmalıdır. Görüntüleme ilk olarak gün boyunca, odak noktası kontrol edilir ve birkaç saatte bir şekilde ayarlanmalıdır. Bundan sonra günde iki kez kontrol ama genellikle daha kararlı kalır edilmelidir. Ok bir out-of-odak epitel hücre kolonisi gösterir.

. (A) için vahşi tip (B) BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre,} (C) BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + /} TTT kullanan tek hücre izleme elde Şekil 5 Hücre kader haritaları ^-, ve (D) BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -/MMTV-rtTA/tet-op-ER} fareler. Çerçeve veya birleşik hücre tabakası içine kaybı dışarı nedeniyle izlenemez Hücreler bir soru işareti ile gösterilir. Ne zaman bir soru işaretikasten nedeniyle hücre izdiham ve tümden tek hücreli kaderini takip yetersizlik sona erdi izleme belirtti. (E) genotipi ile çeşitli hücre ömürleri ortalama. Çubuk grafikler her genotip için nesiller 1-4 üzerinde ortalama hücre yaşamların ortalama ve standart hata (hücre bölünmeleri arasındaki süre) göstermektedir. Gibi yabani tip farelere kıyasla ^- Mean hücreli yaşam BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre} ve BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53} gelen ^{+ /} edilen meme epitel hücrelerinde anlamlı derecede kısa bulundu. * P <0.05, ANOVA. 10 palpabl tümör olmadan meme bezlerinden izole Hücreleri - (n = 3), BRCA1 ^- 12 aylık BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre} (n = 4), BRCA1 ^{f11/f11 / MMTV-Cre / p53 + /} için ^{f11/f11/p53 + / -/MMTV-Cre/Tet-op/-ER/MMTV-rtTA} (n = 3) ve vahşi tip (n = 3) farelerde çalışmalar için görüntülenmiştir. Wild-tip ve genetik engin farklı kombinasyonları oluşan beş bağımsız görüntüleme deneylerieered fareler yapıldı. Medya fenol kırmızısı içeriyordu. Hayır östrojen eklendi. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Discussion

Kritik adımlar

Bu meme bezlerinin meme epitel hücre davranışlarını yaşa bağlı değişkenlik kontrol etmek için aynı yaştaki farelerin hasat sağlamak için önemlidir. Hücreler kaplama, hücreler aynı sayıda her bir deney için her bir kuyuya kaplanacaktır. Kültürler mümkün seri görüntüleri aracılığıyla birden çok tek tek hücrelerin takip yapma çok hızlı konfluent olmazlar böylece kaplama yaparken Hücreleri nispeten seyrek olmalıdır. Bu plaka dengelenmiş sonra odağı değiştirmek çünkü plaka görüntüleme önce inkübatör dengelenmiş olması esastır. Bir kez görüntüleme başladı, odak özellikle ilk 24 saat içinde, sık kontrol ve gerektiği şekilde ayarlanması gerekmektedir. Bu kuluçka düzenlenmiş ve önceden ısıtılmış bir sıcaklıkta olması önemlidir. Oda içine ve dışına giden insanların sayısı mümkün olduğunca sınırlı olmalıdır. Biz settin tüm yönleriyle pratik öneriyorg üretim ve kalite kontrol sağlamak için önceden deney düzeneği. Tüm hücre kültürü deneylerinde olduğu gibi, sterilite önemli bir konudur ve standart steril hücre kültürü uygulamaları her zaman kullanılmalıdır.

Kaydetme ve büyük görüntü dosyalarını işlemek bellek alanı bir miktar gerektirir. Paylaşılan bir ağ sürücüsüne veya taşınabilir sabit sürücüler kullanılabilir. Bir kez dosyaları bu görüntüleri sürekli düzgün adlandırılmış ve karşılık gelen klasörlere yerleştirilir emin olmak için önemlidir dönüştürülür. Sık sık dijital veri kaydeder süreci boyunca yapılmalıdır.

Sınırlamalar

Bu yöntem, bir 3-B kültür sistemi belirgin hale gelebilir davranış farklılıkları analiz etmek için izin vermez bir 2-GE kültürü sistemi kullanır. İlk hücrenin bölünmesi için saat sayısını init aşağıdaki gibi hücrenin yaşam süreleri yalnızca tekrarlanabilir ilk gözlenen hücre bölünmesi sonrası ölçülebilirHücrelerin ial kaplama değişkendir.

Olası değişiklikler

Deney gereksinimlerine bağlı olarak, hızlandırılmış görüntü daha fazla ya da daha az sıklıkla alınabilir. Geçici hücresel yapılar sayılabilir isteniyorsa Örneğin, 5 sn aralıklarla daha uygun olabilir. Birinci meme epitelyal hücre kültürleri oluşturmak için diğer prosedürler kullanılabilir. Herhangi bir görüntüleme ekipmanı sürece bu deney gereksinimlerini karşılamak için mümkün olduğu gibi, hızlandırılmış görüntü oluşturmak için kullanılabilir. Tek hücreli izleme için alternatif sistemler istihdam edilebilir. Burada anlatılan işlemde, bir standart plastik düz dipli 6 plaka yeterli oldu. Plastik yiyecekleri, 4x, 10x ve 20x gibi tüm uzun çalışma mesafesi hava lensler için de kullanılabilir. Bu plastik çoğu yemekleri kenarlarına yakın kavisli ve hafif bozan bu yana faz kontrast görüntüleme yaparken plastik tabaklar merkezine yakın bölgelerde seçmek önemlidir.Lamel kalınlığında cam dipli kuyularda yüksek büyütmede tipik olarak normal çalışma mesafesi immersiyon objektifleri (yağ, su, gliserol, vb) için gerekli olacaktır.

Sorun Giderme

Hücreler kaplama olduğunda, ortam sahne üzerinde plaka olarak kontrol edilmesi ihtiyacı azaltmak için 5 gün için hücre büyümesini sürdürmek için yeterli olmalıdır, ancak gerekli durumlarda, ortam ilave edilebilir. Bu buharlaşma asgari düzeyde tutulması tavsiye edilir. Buharlaşma inkübatör içinde steril deiyonize su üç dört yemekler yerleştirmek ve gerektiğinde bunları dolumu ile tedavi edilmelidir. Bu, steril deiyonize su ile 6-kuyulu plakanın kuyularının kullanılmayan doldurmak mümkündür.

Görüntüleri TTT programına yüklenirken değilseniz, ilk kontrol ve dosya ve klasörleri doğru düzenlenmiş ve adı olduğundan emin olun. Log dosyası (adım 5.5) doğru klasörde olup olmadığını Ardından, kontrol edin.

FutuMastering tekniği sonra yeniden uygulama veya yönü

Aynı genel prosedür insan birinci meme epitelyal hücrelerin yanı sıra meme kanseri hücreleri dahil olmak üzere başka hücre tipleri davranışını incelemek için kullanılabilir. Örneğin, genotipik özgü davranış ve / veya aday tedavilere yanıt olarak analiz edilebilir. Alternatif olarak, floresan aktive hücre görüntüleme (FAC) kriteri hücre popülasyonlarının gerçekleştirilen veya floresan etiket özgü hücre türleri izlemek için eklenebilir.

Mevcut yöntem ile ilgili olarak, bu tekniğin önemi

Geleneksel hücre kültürü ve etiketleme teknikleri zaman içinde hücre davranış time-lapse görüntüleme ve analizler eklenmesi yerine zaman yalnızca bütün populasyon dinamiği üzerinde tek hücrelerin nicel veriler sağlar. Bu teknik, tek tek hücrelerin farklı zaman noktalarında gözlem izin geleneksel yöntemlerin aksine, sürekli olarak tespit edilmesini sağlar. Moreover, geleneksel yöntemler hücreleri Burada tarif oysa bir mikroskop altında görüntülemek için bir kuluçka makinesi içinde onları alan ve çıkış tarafından rahatsız gerektirir hücrelerin aktarımı olmaksızın gözlemlenmiştir sağlar. Son olarak, zaman atlamalı görüntüleme analizler için iade edilebilir gözlem altında hücreleri kalıcı bir kaydını sağlar. Tek hücre davranışlarını izlemek için TTT kullanımı çoklu parametrelerin kesin bir analiz izin verir ve bir floresan etiket kullanımı gözlem altında belirli hücreleri yerelleştirmeniz gerekmez. Tekniği meme bezinin statik doku kesitlerinde ölçülmesi zor olan meme epitel hücre davranış farklılıkları ortaya koymaktadır. Hücre ömrü ölçümleri mitotik olayların arasındaki saat sayısını ölçmek. Bu ölçüm saat içinde hücre döngüsünün uzunluğunu gösteren hücre bölünmeleri saatleri arasında gerçek sayısını belirli bir veri sağlar. Bir araştırmacı nasıl belirlemek için bu verileri kullanabilirsinizBelirli genetik modifikasyon veya kültür koşulları etkisini hücre döngüsünün uzunluğu.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
EpiCult-B Basal Medium Mouse	StemCell Technologies	05610
EpiCult-B Proliferation Supplements Mouse	StemCell Technologies	05612
recombinant human Epidermal Growth Factor (rhEGF)	StemCell Technologies	02633
Collagenase/Hyaluronidase	StemCell Technologies	07912
Disposable Scapels	Feather	2975#10
Hanks' Balanced Salt Solution	StemCell Technologies	37150
Ammonium Chloride	StemCell Technologies	07800
Tryspin-EDTA	StemCell Technologies	07901
Dispase	StemCell Technologies	07913
DNase I	StemCell Technologies	07900
40 μm cell strainer	StemCell Technologies	27305
FBS	StemCell Technologies	06100
PenStrep	Gibco	15140