Summary
时间延时成像是用来评估初级癌前来自乳腺癌风险遗传工程小鼠模型，以确定是否有特定的行为参数之间的相关性和不同的遗传病变的乳腺上皮细胞的行为。
Abstract
延时成像可以用来比较原代培养的癌前来自不同的遗传工程小鼠模型的乳腺癌的乳腺上皮细胞的行为。例如，之间的时间（电池寿命）的细胞分裂，凋亡细胞的数量，进化形态的变化，和集落形成机制，可以量化和比较携带特定遗传病变的细胞。原发性乳腺上皮细胞培养物产生的未扪及肿瘤的乳腺。有明确的分离从邻近的肌肉，仔细切除腺体，淋巴结被删除，和切碎的乳腺组织，然后用酶解和过滤所产生的丰富的乳腺上皮细胞的单细胞悬液。单细胞悬液，接种和内直接放置在显微镜下活细胞成像的孵化室。十六个650微米×700微米领域的一个4x4的配置每一个W埃尔的6孔板中的成像，每15分钟，连续5天。时间推移的影像检查，直接测量细胞的行为，可以包括细胞集落形成的机理和频率范围内的第一个24小时的电镀细胞（聚集与细胞增殖），细胞凋亡的发生率，并逐步形态的变化。单细胞跟踪是用来产生用于测量个别细胞寿命和调查的细胞分裂模式的细胞命运地图。定量数据进行统计分析，以评估与特定的遗传病变显着的行为差异。
Introduction
遗传工程小鼠模型的工具来研究和了解不同的遗传病变患乳腺癌的风险。例如，已经表明，遗传工程小鼠的三个因素的结合：损失的全长1，乳腺癌发病初期（BRCA1基因 ）在乳腺上皮细胞中的基因，肿瘤蛋白p53（TP53）种系单倍剂量不足，和乳腺上皮细胞靶向上调雌激素受体α（ERA）的表达在乳腺癌的发展，在100％的BRCA1基因两侧装接loxP（F）11/f11/Mouse乳腺肿瘤病毒（MMTV）-Cre/p53 + / -/tetracycline-operator（ TET-运）-ER/MMTV-reverse“四环素反式激活（rtTA 12个月的年龄在小鼠相比，比例较低报道的 BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -小鼠没有时代的过度表达（约50 - 60％）和BRCA1基因f11/f11/MMTV-Cre没有TP53 haploinsuf的小鼠效率（<5％）。
癌前原发性乳腺上皮细胞的行为的动态时间推移成像揭示在细胞的行为差异，在静态的组织切片，不太容易理解。在细胞增殖和分化的改变主要观察乳腺细胞从人类BRCA1基因突变携带者。2创造的单细胞悬液，主要从正常乳腺上皮细胞和基因工程小鼠产生切除的乳腺组织通过酶的解离。时间的推移观看影像，以评估机制和时机的细胞集落的外观和细胞的形态学变化包括上皮 - 间质转化（EMT）和细胞凋亡的发生率。细胞命运的图的生成，促进细胞分裂（电池寿命），并且确定的细胞分裂的模式之间的时间的长度的定量通过使用单细胞的跟踪。蒂姆“跟踪工具（TTT）是公开可用的软件，用于生成单细胞的命运地图。其效用在阐明细胞命运的机制已经建立4,5检查正常造血干细胞发育6-9和神经元的产生。
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Protocol
1。总体方案
- 生成基因工程乳腺的癌前病变的乳腺上皮细胞的原代培养和控制野生型小鼠。
- 捕捉活细胞图像，每15分钟使用Volocity图像采集软件（版本5.3.1，珀金埃尔默，位于Waltham，MA）长达5天。
- 查看时间推移图像直接评估的时间和上皮细胞的集落形成机制，细胞凋亡的发生率，并逐步形态的变化。
- Volocity产生。TIFF堆栈转换的JPG文件使用的MetaMorph的显微镜自动化图像分析软件（Molecular Devices公司，LLC，加利福尼亚州桑尼维尔市）和重命名的数字图像文件（重命名2.1.6， http://www.softpedia.com/get /系统/文件管理/ THE Rename.shtml ），使与蒂姆的跟踪工具软件（TTT的兼容性，tz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index.html“目标=”_blank“> http://www.helmholtz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index。 HTML）。
- 使用的TTT，产生的细胞分裂之间的时间（电池寿命）和模式（对称与不对称的细胞分裂）测定细胞的命运地图。
- 分析上述步骤3和5的定量数据，以确定是否存在统计上的显着差异不同的遗传工程小鼠模型和/或野生型对照。
2。原代乳腺上皮细胞培养物的生成
- 准备完整的介质隔离的单乳腺上皮细胞的变化，制造商的说明（EpiCult-B鼠标中包，干细胞技术，温哥华，BC）。结合450毫升EPI-邪教-B中，50毫升EPI-邪教乙扩散补充，5％胎牛血清（FBS），50微克/ ml青霉素/链霉素（PenStr聚酯）和10 ng / ml的表皮生长因子（EGF）。
- 准备解离媒体通过组合1的一部分，10倍胶原酶/透明质酸酶混合物与9份完整的媒体从2.1。
- 安乐死鼠标，并立即进行尸检。把鼠标在它的后面一个发泡胶剖检平台上，并确保所有四肢，所以腹侧皮肤被拉紧。饱和腹侧的皮肤和毛发，包括覆盖在四肢，用70％的乙醇。暴露2/3（胸）和＃4/5（腹股沟）正中切口，通过皮肤（不进入腹膜），通过Y形切口延伸到每个前翼内侧的皮肤和乳腺每个后肢内侧皮肤的Ÿ切口通过一个上下颠倒的。
- 使用钝性分离，分离的皮肤从underlyingperitoneum，双方的皮肤上拉回来，直到它被拉紧，并确保它的发泡胶剖检平台，利用销。从外侧开始，使用钝性分离，如果使用得当，狄氏ction剪刀分离出完整的的腹股沟及/或从底层的结缔组织和肌肉的胸乳腺。将不超过两个乳腺在10厘米无菌培养皿中，并移动到组织培养罩。
- 在组织培养罩，检查小，外接结节，一个黄色的颜色被确定为乳腺淋巴结肿大的腺体。清除淋巴结周围腺体，用无菌手术刀和镊子。 3〜1毫米的立方体，用无菌手术刀，每手切碎，乳腺组织。
- 地点在5ml解离媒体，混合乳腺组织绞碎轻轻移液管向上和向下的2-3倍，使用了10毫升移液管，并孵育过夜（可达〜16小时），在37℃的培养箱中，用5％的CO 2，在一个50毫升锥形管与放松帽。
- 第二天早上，准备一个寒冷的1 Hanks平衡盐溶液（HBSS）含2％FBS和4份混合缓冲氯化铵溶液，以促进红色bl洪水细胞的裂解（HFAmCl）以及冷的HBSS补充含2％FBS（HF）。预暖胰蛋白酶-EDTA（0.25％），5毫克/毫升中性蛋白酶在汉克的平衡盐溶液改性，1毫克/毫升的DNA酶I，和完整的媒体。
- 与乳腺组织从孵化器中取出离心管中，轻轻的脉冲涡流2-3秒2倍。管在450×g下离心5分钟（室温下或4℃），并弃去上清液。
- 将沉淀重悬于10毫升HFAmCl和离心机在450×g下最低为5分钟（室温下或4℃），并弃去上清液。
- 加入3ml胰蛋白酶-EDTA至沉淀中，并充分混合先用5毫升移液管，然后用P1000的微量移液器直到弦（1-3分钟）。添加10毫升HF，离心450×g的5分钟（室温或4°C），弃去上清液。
- 加入2毫升5毫克/毫升Dispase酶和200微升的1毫克/毫升DNA酶I的颗粒和混合1分钟与P1000微量移液器。样品应CLO乌德，但没有粘性的。如果弦，加入100μl的DNA酶I，再次混合。
- 加入10毫升冷HF，通过40微米的细胞过滤器和离心机的压力在450×g的5分钟（室温或4°C），弃去上清液。
- 最终的沉淀重悬在完整的媒体。量化的细胞总数（使用血球计数器或Coulter计数器）。两个乳腺收率约1×10 6〜1×10 7个细胞。板原发性上皮细胞在平底的6孔板中，在1.5×10 5个细胞每孔的密度。
3。活细胞成像
- 电镀后的细胞，立即安全地放置在6孔板中，在显微镜载物台上，在5％CO 2，/饱和humidity/37°C的温度孵化室内。调整冷凝器柯勒照明和中心的相位环。对于这里提出的实验，一个倒置的尼康的Eclipse TE300/PerkinElmer纺纱影碟共焦显微镜系统在广角与10倍物镜相衬模式。
- 打开图像采集软件，创建和命名时间的推移图像库，并有足够的空间大文件保存到的位置。这里介绍的实验使用Volocity图像采集软件（版本5.3.1，珀金埃尔默，位于Waltham，MA）。
- 允许板在显微镜培养箱平衡为最少15分钟。降低镜片以避免阶段透镜干扰。在“舞台”的标题，选择“校准阶段。”重新获得的焦平面，集Z =零，选择“添加点”下的“舞台”标题下的x，y，z标签和标记成像点。将在6孔板的各孔中的中间点作为相位衬度成像的成像可能会扭曲塑料井的周边附近。排列在4×4个字段（650微米×700微米的字段），每一个与一小部分重叠（约5％）在一个正方形的点。保存选定的点下“雄鹿（五）“
- 在“舞台”，选择“焦点图”，并按照提示设置的每一个点的重点。设置图像采集的定时拍摄4张照片每小时（每15分钟）。这取决于特定的实验的要求，可以调整。保存焦点图下的“舞台”。
- 右键单击右侧工具栏中的“图像采集并保存的成像设置。按下录制按钮开始进行成像。 1小时后，检查的重点的图像，看看是否有任何需要调整。
- 监控和持续5天，结束细胞成为合流时，实时成像。
4。评估的时机和机制的初步上皮细胞集落形成，细胞凋亡的发生率，并逐步形态的变化直接观察时间的推移图片
- 直接观察时间推移图像可以使用任何兼容的视频观看软件（ 如 HTTP：/ / www.real.com/的Realplayer或其他免费或商业软件）。在这一步后转换为JPG文件（见步骤5），可以查看图像。TIFF格式。
- 要确定初始群体的形成机制，从一个单一的图像堆栈的成像板网站。在初始帧，细胞都会有所上浮。按照串行的图像，以确定当第一上皮细胞粘附到板。在此步骤中，可以识别和上皮细胞从他们更多立方形的形态的成纤维细胞的分化。按照这个单一的上皮细胞，通过序列图像，并按照它的命运在随后的24小时。记录，如果它变得包围额外的上皮细胞进行细胞分裂或细胞凋亡。如果由上皮细胞包围，集落形成的机制可以直接测定，如果周围的细胞来源于漂浮的细胞，然后聚合的初始粘附细胞（s）或通过查看从最初的贴壁细胞的分裂。在第一个24小时的细胞聚集对细胞分裂的菌落形成的记录的数目。
- 最初在特定的时间内贴壁细胞发生凋亡的数量来确定的，按照序列图像的外观经典功能的发展已经贴壁的细胞凋亡（ http://www.alsa.org/research/about -als-research/cell-death-and-apoptosis.html ），凋亡细胞的数量确定的成像的整个持续时间期间或在特定时间范围内记录。
- 随着时间的推移，上皮细胞的培养改变其形态从最初的长方体形状以与EMT更细长的外观一致。按照序列图像发生这种情况时，确定电镀后的日子/小时。
5。图片文件修改
- 根据要求蒂姆的跟踪工具软件，重命名图像文件夹和文件使用“重命名2.1.6（ http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml ）的一个免费的程序，如重命名文件组。创建一个文件夹中的所有文件夹和文件的实验和命名的文件夹（ 例如：
- 创建一个子文件夹中的每个点/位置的文化成像。命名的子文件夹：EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER。的位置应该有3个数字。例：072511RN_p001。把所有的图像文件，子文件夹中的个别位置。
- 添加时间点（5位）和信道数（因为只有一个明亮的磁场通道，使用“0”），在这种格式中的每个文件名的末尾：
EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER_tTIMEPOINT_wCHANNELNUMBER.jpgExample：072511RN_p001_t00001_w0.jpg - 每个位置生成一个日志文件，先下载的的免费程序TTTlogfileconverter从TTT网站。启动TTTlogfileconverter程序和选择实验文件夹。输入图像的时间间隔（以秒计）。每15分钟拍摄的照片中，输入900秒。然后按绿色的秘密日志文件按钮。
6。产生单细胞的细胞命运地图使用TTT
- Çreate一个称为TTTexport的文件夹和子文件夹称为TTTfiles TTT软件指令后，所有细胞的跟踪数据将被存储
- 启动的TTT程序，选择“用户名缩写，单击”继续“。
- 按“设置NAS”，选择创建的用户的“TTTexport”文件夹，然后单击“确定”。在浏览器中，选择一个实验文件夹，选择一个位置文件夹，然后按“加载位置”按钮。
- 眼系数设置为“10倍”。加载所需的图像（建议第一次加载的所有图像）。
- 在单元格编辑器“窗口中，选择”新殖民地“下的”文件“菜单上。在电影“窗口中，按”营业细胞“或F2开始跟踪一个细胞。
- 确定一个单元格中的MOVIE窗口，并用鼠标将光标在单元格。的细胞的数量的圆与应出现后F2已被点击。使用键盘的数字键盘上的“0”键的位置跟踪的细胞和提前至下一张照片。移动光标跟随的每一个细胞每一帧的位置。删除曲目并返回到上一张图像按“Del”的数字键盘上的。要前进的框架没有跟踪的单元格按“3”，并没有向后移动跟踪数字键盘上按“1”。
- 一个细胞分裂标记在电影“窗口中单击”该部门“按钮。为了纪念性细胞死亡在电影“窗口中，单击”细胞死亡“按钮。一旦发生了分裂，子细胞可以在同一个细胞的命运地图上点击右键开始自动跟踪模式的单元格编辑器“窗口中指定的子细胞中的圆圈符号的跟踪。
- 按F10保存的树。每棵树将保存在指定的输出倍ER（TTTExport）。要开始一个新的细胞命运的地图中，选择“新殖民地”下的“文件”，然后“打开”菜单中的“单元格编辑器”窗口中。
- 制表电池的寿命数据后收集在单元格编辑器“窗口中的”单元格数据“选项卡。
7。统计分析
- 使用任一学生的吨-测试（如果比较两种基因型）或方差分析（如果比较> 2基因型），以确定如果参数数据如初始细胞菌落，电池的寿命或小时数的差异，直到的外观EMT的不同基因型之间有统计学显著。细胞凋亡的频率可以作为数/总数镀敷用Student的t检验或方差分析的细胞或采用Mann-Whitney或Kruskal-Wallis来自作为贴壁细胞的百分比的比较。
- 使用的数据从最初的实验分析，以确定有多少实验重复进行功率测试需要有足够的小号，从每个重复产生的细胞的命运地图tatistical电源使用现有的免费（ 例如 http://statpages.org/ ）。在实验中，来自三只小鼠基因型的细胞培养足够，以确定是否有统计上的显着差异，细胞集落形成和细胞寿命时，特定的基因进行了修改。
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Representative Results
上皮细胞和成纤维细胞，可以区分细胞的形态。上皮细胞有一个长方体形状（ 图1A-B）和形式的细胞集落（ 图1A）。成纤维细胞，基质细胞的类型，有一个细长的形态（ 图1C）。
进行了舍入细胞，并漂浮在成像（ 图2A-D）的发病。连接到该板后，他们变得平坦，并表现出立方形型外观（ 图2E中的H）。按4天的培养的上皮细胞的大部分成EMT状的形态（ 图2I-L）伸长。发生这种变化的年代学研究不同基因型相同。有些数字图像是模糊的，因为科勒照明和相环对准设置不正确（ 图2D，H，L）。
漂浮的细胞发展成为定义的个人上皮细胞科洛尼ES电镀后24小时（ 图3A，B）。序列图像分析结果显示，这些菌落产生的，而不是细胞分裂的细胞聚集。虽然干扰BRCA1基因本身并没有改变形成的菌落数，此外， 具p53单倍形成的集落数显着减少了，和此外，ERα的过表达显着增加的数量的菌落形成（ 图3C）。
这是至关重要的监视数字化的图像获取和经常调节对焦地图在第一个24小时的细胞附着到板，然后每天至少两次，以确保细胞保持在焦点和文化不被污染。分析的精确度受到损害，如果成像的细胞是未聚焦（ 图4）。
在这里代表的实验，一个关键的问题是要确定是否表达水平的变化s的影响乳腺癌的风险（BRCA1基因，TP53，与雌激素受体1（ESR1）1）的基因改变或影响细胞分裂（电池寿命）之间的小时数师（对称与不对称）的模式在非癌原发性乳腺上皮细胞。要做到这一点，使用单个细胞的命运地图（树）TTT。实施例中示出的每个测试的四个基因型的代表性细胞命运的地图（ 图5A-D）。四个测试细胞的基因型分别为野生型（无遗传操作）（ 图5A），全长BRCA1基因损失（BRCA1基因f11/f11/MMTV-Cre）（ 图5B），全长BRCA1基因的组合中的损失与具p53单倍（BRCA1基因f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / - ）（ 图5C），和全长BRCA1基因与TP53 haploinsuffici组合损失明度和增益ESR1（BRCA1基因f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -/MMTV-rtTA/tet-op-ER）的（ 图5D）。当细胞汇合（〜3-4代）明确跟踪单个细胞后，不再可能产生的细胞的命运地图被停止。代0（第一次细胞分裂的时间）不包括在细胞的生命周期的分析，因为时间 第0代比后代更长的时间和更多的变量。第1代，2，3，4，组合在一起，在最后的分析，因为没有显着差异，这些世代的平均值（SEM）之间的平均电池寿命或标准错误。不同的基因型（ 图5E）平均电池寿命之间的比较表明，全长BRCA1基因的损失，减少了细胞分裂之间的小时数从21.3±1.6小时（野生型），16.5±1.0小时（BRCA1 f11/f11 / MMTV-CRE）。没有tably，虽然损失了一具p53等位基因除了损失全长BRCA1基因乳腺癌发展1具有显着增加相关联，意味着电池的寿命是不变（16.3±1.2小时）相比，只缺乏BRCA1基因的小鼠。有趣的是获得的在BRCA1基因f11/f11/MMTV-Cre/p53中 ESR1的+ / -/MMTV-rtTA/tet-op-ER小鼠恢复电池的寿命持续时间接近野生型水平（19.3±2.1小时），但这些小鼠有发病率最高的乳腺癌的发展，所有的模型研究here.1这些研究结果表明，全长BRCA1基因的损失并不总是与一个电池的寿命缩短，而不是被修改过表达ERα。可能下一步的实验，利用这一技术可能是剂量 - 反应实验中使用不同的雌激素，生长因子，或候选人疗法在不同的遗传backgro的衡量其影响电池的寿命unds。在对电池的寿命持续时间的影响相反，没有在这里改变的遗传改变的研究细胞分裂模式。
图1。外观上皮细胞的上皮细胞的殖民地（A），（B），（C）延时成像和成纤维细胞，上皮细胞出现多立方，而纤维母细胞似乎更细长。大小酒吧= 50微米。
图2。代表串行时间推移从时刻0的图像，2和4天显示细胞形态的变化，随着时间的推移，在外观上的差异，并没有科尔在时间0的镀敷细胞呃照明。漂浮（箭头AD），由两个天在培养他们是贴壁，并可能表现出立方形型形态（粗箭头E，H）和由四个天在培养他们细长并展示一个EMT样形态（细箭头IL）。柯勒照明是存在于面板AC，EG和IK。面板D，H和L说明影像，而无需科勒照明。画像显示的是随着时间的推移从相同的成像点。大小酒吧= 200微米。 点击这里查看大图 。
图3。不同基因型的上皮细胞集落数为1天。 （A）圆形悬浮细胞在开始时移成像。 （B）两个有代表性的上皮细胞集落（箭头）。 （C）上皮细胞数L细胞形成的菌落/帧，24小时不同的基因型。酒吧图表说明的均值和标准差的平均值。 * P <0.05，ANOVA。大小酒吧= 200微米。细胞分离出乳腺未扪及肿瘤的10 - 12个月大的BRCA1基因f11/f11/MMTV-Cre组（n = 4），BRCA1 f11/f11 / MMTV-Cre重组酶/ P53 + / - （N = 3），BRCA1 f11/f11/p53 + / -/MMTV-Cre/Tet-op/-ER/MMTV-rtTA组（n = 3），和野生型小鼠组（n = 3）进行成像研究。野生型和转基因小鼠的不同组合的组成的5个独立的成像实验进行。媒体含有酚红。没有雌激素。 点击此处查看大图 。
图4。焦图像不能准确光年分析成像板，前板应该坐下成像孵化器中15分钟，达到平衡。在成像的第一天，应该把重点放在检查和调整，每隔几个小时。之后，它应该被检查，每天两次，但通常保持更稳定。箭头指示焦上皮细胞集落。
图5。细胞产生的单细胞追踪的命运地图使用TTT（A）野生型（B）BRCA1基因f11/f11/MMTV-Cre，（C）BRCA1基因f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / - ，和（D）BRCA1基因f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -/MMTV-rtTA/tet-op-ER的小鼠。由于损耗掉帧或到一个融合细胞层不能跟踪的细胞显示一个问号。如果没有问号跟踪表明，由于细胞汇合，并不能明确地遵循单细胞的命运是故意结束。（E）平均电池寿命不同的基因型。酒吧图表说明了均值和标准差的各基因型细胞平均寿命（细胞分裂之间的时间）一代又一代1-4。平均细胞的寿命显着短于乳腺上皮细胞衍生BRCA1基因f11/f11/MMTV-Cre和BRCA1基因f11/f11/MMTV-Cre/p53的+ / -与野生型小鼠相比。 * P <0.05，ANOVA。细胞分离出乳腺未扪及肿瘤的10 - 12个月大的BRCA1基因f11/f11/MMTV-Cre组（n = 4），BRCA1 f11/f11 / MMTV-Cre重组酶/ P53 + / - （N = 3），BRCA1 f11/f11/p53 + / -/MMTV-Cre/Tet-op/-ER/MMTV-rtTA组（n = 3），和野生型小鼠组（n = 3）进行成像研究。野生型和转基因}的不同组合构成的5个独立的成像实验小鼠进行eered。媒体含有酚红。没有雌激素。 点击此处查看大图 。
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Discussion
关键步骤
重要的是要确保从小鼠同年龄控制在乳腺上皮细胞的行为与年龄有关的变化，乳腺腺体的收获。当镀敷的细胞，细胞的相同数目的应被镀在各孔中，为每一个实验。细胞应该是相对稀疏时，镀敷，使文化不成为汇合太快使得可以按照多个单独的细胞通过串行图像。至关重要的是，该板是在孵化器中平衡，因为焦点成像之前将更改后的板平衡。一次成像已经开始，应经常检查的重点，并根据需要进行调整，尤其是在第一个24小时。重要的是要具有培养箱稳压和预温热的温度。进入和离开房间的人的数目应尽可能地限制。我们建议练习各方面的设置。重力加速度的实验事前的重现性和质量控制，以确保。所有的细胞培养实验中，不育是一个重要的问题，在任何时候都应该使用标准的无菌细胞培养方法。
大型图像文件的保存和处理需要大量的存储空间。共享网络驱动器或便携式硬盘驱动器都可以使用。重要的是要确保图像始终正确命名，并放置在相应的文件夹，文件一旦转换。频繁的数字数据保存在整个过程中应执行。
限制
此方法使用的2-D的培养体系中，不允许进行分析的行为差异的3-D的培养体系中可能变得显而易见。电池寿命的持续时间可能仅可再现性测定后的第一个观察到的细胞分裂的小时数第一次细胞分裂后，初始化胶质细胞电镀是可变的。
可能的修改
根据实验的要求，时间推移图像可以采取更多或更少的频繁。例如，如果短暂的细胞结构是可以量化的，有5秒的时间间隔可能更合适。可以使用其他程序，以生成主乳腺上皮细胞培养。任何成像设备可被用于创建的时间推移的成像，只要它是能满足要求的实验。单细胞追踪的替代系统也可使用。对于这里描述的步骤，一个标准的塑料平底6孔板中是足够的。可用于所有的长工作距离空气诸如4倍，10倍和20倍的透镜塑料培养皿。重要的是要选择的塑料培养皿的中心附近的区域时，执行相位衬度成像由于塑料在大多数菜肴的边缘附近的弯曲和扭曲的光。盖玻片厚度玻璃底孔将需要正常工作距离浸没透镜（油，水，甘油等），这是典型的在较高的放大倍数。
故障排除
细胞是镀敷时，媒体应该是足以维持细胞生长5天，以减少需要用于操纵在舞台上的板，但是，如果必要的话，媒体可以被添加。建议蒸发保持在最低限度。孵化器内放置三到四道菜的灭菌去离子水和加气站并在必要时，应当由蒸发。这是可能的6孔板用无菌去离子水填充未使用的井。
如果图像不加载到TTT程序，首先检查并确保安排的文件和文件夹和文件名是否正确。接下来，请检查日志文件是在正确的文件夹中（请参见第5.5步）。
浮图掌握技术后重新申请或方向
相同的一般步骤，可以使用其他类型的细胞，包括人类初级乳腺上皮细胞以及乳腺癌细胞的行为分析。例如，基因型特定的行为和/或响应于候选处理可以进行分析。可以执行或者，成像的荧光激活细胞（FAC）的排序条件的细胞群，或荧光标记添加到监测特定的细胞类型。
这种技术相对于现有方法中的意义
增加传统的细胞培养和标记技术，随着时间的推移细胞的行为时移成像和分析提供了定量数据，从单细胞随着时间的推移，而不是只有整个种群动态。这种技术可以让单细胞进行连续观察，与传统的方法不同，只允许观察，在离散的时间点。中号oreover，传统的方法需要通过把他们在满分孵化器，以查看它们在显微镜下，而这里所描述的方法被干扰的细胞，使这些细胞没有被转印观察。最后，延时成像提供了一个持久的记录下观察细胞作进一步分析可以返回。使用TTT跟踪单个细胞的行为的多个参数，并允许一个明确的分析，不需要荧光标记的使用本地化下的特定的细胞观察。该技术发现在乳腺上皮细胞的行为差异是难以衡量的静态乳腺组织切片。电池的寿命定量测量的数个小时之间的有丝分裂活动。这种测量提供了特定的数据上的实际的细胞分裂，以小时表示的细胞周期的长度之间的小时数。研究人员可以利用这些数据来确定如何特定的基因修改或培养条件影响细胞周期的长度。
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Disclosures
作者宣称，他们没有竞争的金融利益。
Acknowledgments
作者要感谢“博凡吴基督教Raithel的为他介绍活细胞成像技术援助和迈克尔·丽格。由国家癌症研究所，美国国立卫生研究院RO1CA112176（PAF），美国国立癌症研究所，美国国立卫生研究院支持。 R01CA89041-10S1（PAF），，丁斯特的EV A/09/72227编号德国学术Austaush。 316（REN），国防部W81XWH-11-1-0074（REN），WCU（世界一流大学）计划，通过教育，科学和技术部（R31-10069）由韩国国家研究基金会（PAF ），美国国立卫生研究院IG20 RR025828-01（啮齿动物屏障设施设备），和，NIH：NCI 5P30CA051008（显微镜和影像和动物共享资源）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EpiCult-B Basal Medium Mouse | StemCell Technologies | 05610 | |
| EpiCult-B Proliferation Supplements Mouse | StemCell Technologies | 05612 | |
| recombinant human Epidermal Growth Factor (rhEGF) | StemCell Technologies | 02633 | |
| Collagenase/Hyaluronidase | StemCell Technologies | 07912 | |
| Disposable Scapels | Feather | 2975#10 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | StemCell Technologies | 37150 | |
| Ammonium Chloride | StemCell Technologies | 07800 | |
| Tryspin-EDTA | StemCell Technologies | 07901 | |
| Dispase | StemCell Technologies | 07913 | |
| DNase I | StemCell Technologies | 07900 | |
| 40 μm cell strainer | StemCell Technologies | 27305 | |
| FBS | StemCell Technologies | 06100 | |
| PenStrep | Gibco | 15140 |
References
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