Time-lapse avbildning av primära preneoplastiska bröstepitelialceller celler från genetiskt modifierade musmodeller av bröstcancer

Summary

Time-lapse avbildning används för att bedöma beteendet hos primära preneoplastiska bröst epitelceller från den genetiskt modifierade musmodeller av risken för bröstcancer för att avgöra om det finns samband mellan specifika beteendemässiga parametrar och distinkta genetiska skador.

Abstract

Time-lapse avbildning kan användas för att jämföra beteendet hos odlade primära preneoplastiska bröst epitelceller som härstammar från olika genetiskt modifierade musmodeller av bröstcancer. Till exempel kan tiden mellan celldelningar (cell livslängd), apoptotiska cellantal, utvecklingen av morfologiska förändringar och mekanism av kolonibildning kvantifieras och jämföras i celler som bär specifika genetiska skador. Primära bröstepitelialceller cellkulturer genereras från mjölkkörtlar utan påtaglig tumör. Körtlar noggrant opererande med tydlig separation från angränsande muskler, är lymfkörtlar bort och encelliga suspensioner av anrikad bröst epitelceller genereras av hackning bröstvävnad följt av enzymatisk dissociation och filtrering. Encelliga suspensioner pläterade och placeras direkt under ett mikroskop i en inkubator kammare för levande cell imaging. Sexton 650 nm x 700 nm fält i en 4x4-konfiguration från varje vell av en 6-brunnsplatta avbildas varje 15 min under 5 dagar. Tidsfördröjda bilder undersöks direkt för att mäta cellulära beteenden som kan innefatta mekanism och frekvens av cell kolonibildning inom de första 24 h av utstrykning av cellerna (aggregering kontra cellproliferation), förekomst av apoptos, och fördelningen av morfologiska förändringar. Encelliga spårning används för att generera kartor cellöde för mätning av enskilda celler livslängd och utredning av mönster celldelning. Kvantitativa data statistiskt analyserats för att fastställa om signifikanta skillnader i beteende korrelerade med specifika genetiska skador.

Introduction

Genetiskt modifierade musmodeller är verktyg för att studera och förstå hur olika genetiska skador bidrar till risken att utveckla bröstcancer. Till exempel, har genetiskt modifierade möss visat att kombinationen av tre faktorer: förlust av fullständig längd bröstcancer 1, tidig debut (BRCA1) genen i mammära epitelceller, tumör p53 (TP53) könslinjen haploinsufficiency, och bröstepitelialceller cell riktade uppreglerad Östrogenreceptor alfa (ERA) uttryck resulterar i utvecklingen av bröstcancer i 100% av BRCA1 ^{floxed (f) 11/f11/Mouse mammartumörvirus (MMTV) -Cre/p53 + / -/tetracycline-operator ( tet-op) -ER/MMTV-reverse tetracyklin transaktivator (rtTA} möss med 12 månaders ålder i jämförelse med de lägre procenttal som redovisas i BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + /} - möss utan ERA överuttryck (~ 50 - 60%) och BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre} möss utan TP53 haploinsuftivitet (<5%). ¹

Dynamisk time-lapse avbildning av beteendet hos preneoplastiska primära bröst epitelceller avslöjar skillnader i cell beteende som är mindre lätt uppskattas i statiska vävnadssnitt. Förändringar i proliferation och differentiering observeras i primära mammarceller från mänskliga bärare BRCA1 mutation. ² Skapande av encelliga suspensioner av primära bröst epitelceller från normala och genetiskt modifierade möss genereras genom enzymatisk dissociation av resekerade bröstkörtelvävnaden. ³ Time-lapse bilderna ses att bedöma mekanismen och tidpunkten för cell-kolonin utseende och förekomsten av morfologiska förändringar i celler, inklusive epitel-mesenkymala övergång (EMT) och apoptos. Generering av kartor cellöde, är kvantifiering av längden av tiden mellan celldelningar (cell livstider), och bestämning av mönster av celldelning underlättas genom användning av encelliga spårning. TimmS verktyg för spårning (TTT) är allmänt tillgänglig programvara som används för att generera encelliga öde kartor. Dess användbarhet för att belysa mekanismerna för cellens öde har fastställts ^4,5 undersöka normala hematopoetisk utveckling stamceller ^6-9 och generering av neuroner. ¹⁰

Protocol

1. Övergripande system

1. Generera primära kulturer av preneoplastiska bröstepitelialceller celler från mjölkkörtlar hos genetiskt modifierade och styra vildtypsmöss.
2. Fånga levande cellbilder varje 15 min med Volocity programvara bildtagning (version 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA) i upp till 5 dagar.
3. Visa tidsfördröjda bilder direkt bedöma timing och mekanismen för epitelceller kolonibildning, förekomst av apoptos, och utfasning av morfologiska förändringar.
4. Konvertera Volocity genereras. TIFF stackar till. JPG-filer med Metamorph Mikroskopi Automation & bildanalys programvara (Molecular Devices, LLC Sunnyvale, CA) och byta namn digitala bildfiler (Byt namn 2.1.6, http://www.softpedia.com/get / System / File-Management / THE-Rename.shtml ) för att möjliggöra kompatibilitet med Timm s Tracking Tool (TTT,tz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index.html "target =" _blank "> http://www.helmholtz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index. html).
5. Med hjälp av TTT, generera kartor cellöde för bestämning av tiden mellan celldelningar (cell livslängd) och mönster för celldelning (symmetrisk mot asymmetrisk).
6. Analysera kvantitativa data från steg 3 och 5 ovan för att avgöra om det finns statistiskt signifikanta skillnader mellan olika genmanipulerade musmodeller och / eller vildtyp kontroller.

2. Generering av primära Mammary Epithelial Cell Cultures

1. Förbered Kompletta media för isolering av enstaka bröst epitelceller efter en variation av tillverkarens instruktioner (EpiCult-B Mouse Medium Kit, StemCell Technologies, Vancouver, BC). Kombinera 450 ml Epi-Cult-B-medium 50 ml Epi-Cult B proliferering tillägg, 5% fetalt bovint serum (FBS), 50 ng / ml penicillin / streptomycin (PenStrep) och 10 ng / ml epidermal tillväxtfaktor (EGF).
2. Förbered Dissociation Media genom att kombinera 1 del av en 10x Kollagenas / Hyaluronidas blandning med 9 delar Kompletta media från 2,1.
3. Avliva musen och omedelbart vidare till obduceras. Placera musen på rygg på en frigolit obduktion plattform och säkra alla fyra lemmar så ventrala hud är spänd. Mätta ventrala hud och hår, inklusive överliggande armar och ben, med 70% etanol. Exponera # 2/3 (bröst) och # 4/5 (inguinal) mjölkkörtlar genom att göra en mittlinjesnitt genom huden (inte in i bukhinnan) som är utsträckt i en Y-snitt genom den mediala hud varje främre lem och en upp och ned Y-snitt genom den mediala hud varje bakre lem.
4. Med hjälp av trubbig dissektion, separera huden från underlyingperitoneum, dra tillbaka på båda sidor i huden tills den är spänd, och fäst den på frigolit obduktion plattform med hjälp stift. Med utgångspunkt från utsidan, använd dissektion med förnuftig användning av disseInsatser sax för att isolera intakta ljumsk-och / eller bröstkorg bröstkörtlar från underliggande bindväv och muskler. Placera inte mer än två bröstkörtlar i en 10 cm steril petriskål och flytta till vävnadsodling huva.
5. I vävnadsodling huva, granska körtlar för bröst lymfkörtlar som identifieras som små, väl avgränsade knutor med en gulaktig färg. Avlägsna lymfkörtlar från den omgivande körtel med steril skalpell och pincett. Finhacka bröstvävnad i ~ 1 mm ³ kuber med två sterila skalpeller, en i varje hand.
6. Plats hackad bröstvävnad i 5 ml Dissociation media, blanda genom att försiktigt pipettera upp och ned 2-3 gånger med användning av en 10 ml pipett, och inkubera över natten (upp till ~ 16 timmar) i en 37 ° C inkubator med 5% CO ₂ i en 50 ml koniskt rör med lossade lock.
7. Nästa morgon, förbereda en kall blandning av 1 del Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) innehållande 2% FBS och 4 delar buffrat ammoniumkloridlösning att främja röd blood cellys (HFAmCl) liksom kall HBSS kompletterat med 2% FBS (HF). Pre-varm trypsin-EDTA (0,25%), 5 mg / ml Dispase i Hanks Balanced Salt Solution modifierad, 1 mg / ml DNas I och kompletta medier.
8. Ta bort den koniskt centrifugrör med bröst vävnad från inkubatorn och försiktigt puls virvel 2-3 sek två gånger. Centrifugera röret vid 450 x g under 5 minuter (rumstemperatur eller 4 ° C), och kassera supernatanten.
9. Resuspendera pelleten i ett minimum av 10 ml HFAmCl och centrifugera vid 450 x g under 5 minuter (rumstemperatur eller 4 ° C) och kassera supernatanten.
10. Tillsätt 3 ml trypsin-EDTA till pelleten och blanda först med en 5 ml pipett och därefter med en P1000 mikropipett tills trådiga (1-3 minuter). Tillsätt 10 ml HF, centrifugera vid 450 x g under 5 minuter (rumstemperatur eller 4 ° C) och kassera supernatanten.
11. Tillsätt 2 ml av 5 mg / ml Dispase och 200 pl 1 mg / ml DNas I till pelleten och blanda med en P1000 mikropipett under 1 min. Prov bör cloUdy men inte trådiga. Om trådiga, tillsätt 100 pl av DNas I och blanda igen.
12. Tillsätt 10 ml kall HF, stam genom en 40 | im cellfilter och centrifugera vid 450 x g under 5 minuter (rumstemperatur eller 4 ° C) och kassera supernatanten.
13. Resuspendera den sista pelleten i Complete Media. Kvantifiera det totala antalet celler (med användning av en hemocytometer eller Coulter Counter). Två bröstkörtlarna ge ca 1 x 10 ⁶ till 1 x 10 ⁷ celler. Plate primära epitelceller i en flatbottnad 6-brunnsplatta vid en densitet av 1,5 x 10 ⁵ celler per brunn.

3. Live-cell imaging

1. Omedelbart efter utstrykning av cellerna, placera 6-brunnars platta säkert på ett mikroskop skede inom en 5% CO ₂ / mättade humidity/37 ° C temperatur inkubationskammaren. Justera kondensorn för Kohler belysning och centrera fas ringar. För de experiment som presenteras här, en inverterad Nikon Eclipse TE300/PerkinElmer snurrande skiva Confocalmikroskop system Widefield faskontrast läge med en 10x objektiv användes.
2. Öppna bild förvärv programvara, skapa och namnge ett bibliotek för time-lapse bilder och spara till en plats med tillräckligt utrymme för stora filer. Experimenten som presenteras här används Volocity programvara bildtagning (version 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA).
3. Låt plattan jämvikt i mikroskopet inkubator under minst 15 minuter. Sänk linserna för att undvika steg-objektiv störningar. Under "Stage" rubrik, välj "Kalibrera scenen." Återförvärva fokalplanet, set Z = noll under x, y, z-fliken och markera avbildning pekar genom att välja "Lägg till punkt" under "Steg" rubrik. Placera punkter i mitten av varje brunn av 6-brunnar för avbildning som faskontrast avbildning kan förvrängas nära periferin av plast brunnar. Ordna poäng på ett torg i 4 x 4 fält (650 nm x 700 nm fält), vardera med en liten överlappning (ca 5%). Spara de valda punkterna under "Stage. "
4. Under "Stage" välj "Make fokus karta" och följ instruktionerna för att ställa in fokus på varje punkt. Ställ timing bildtagning att fånga 4 bilder per timme (var 15 min). Detta kan justeras beroende på kraven för den specifika experimentet. Spara fokus kartan under "Stage".
5. Högerklicka på höger sida verktygsfältet "Image Acquisition" och spara avbildning inställningar. Tryck på inspelningsknappen för att starta avbildning. Efter 1 timme, kontrollera fokus på bilderna för att se om några justeringar behövs.
6. Övervaka och fortsätta realtidsundersökningen för 5 dagar och slutar när cellerna blir sammanflytande.

4. Direkt sikt Time-lapse bilder att utvärdera Timing och mekanism Initial epitelceller kolonibildning, Förekomst av apoptos och Utfasning av morfologiska förändringar

1. Direkt visning av tid-lapse bilder kan utföra med någon kompatibel programvara videovisning (t.ex. http:/ / Www.real.com/ RealPlayer eller annan freeware eller kommersiellt tillgänglig programvara). Bilder kan visas i. TIFF-format i detta steg eller efter omvandling till. JPG-filer (se steg 5).
2. För att bestämma mekanismen för första kolonibildning, börja med en enda bild stack representerar en avbildning plats på plattan. I initiala ramar, kommer celler att vara flytande. Följ seriella bilderna att avgöra när den första epitelcell vidhäftar till plattan. I detta steg kan epitelceller identifieras och särskiljas från fibroblaster genom sin mer cuboidal morfologi. Följ denna enda epitelceller genom seriella bilder och följa dess öde under den efterföljande 24 timmar. Spela om det blir omgivna av ytterligare epitelceller eller genomgår celldelning eller apoptos. Om omgiven av epitelceller, kan mekanismen för kolonibildning bestämmas direkt genom att visa om de omgivande cellerna är härledda från flytande celler som sedan aggregatet med den initiala vidhäftande celler (er) ellerfrån uppdelning av den ursprungliga vidhäftande cellen. Registrera antalet kolonier bildade av cellaggregation kontra celldelning under de första 24 tim.
3. För att bestämma antalet initialt vidhäftande celler som genomgår apoptos under en viss tidsperiod, följ seriella bilder för uppkomsten av klassiska drag av apoptos utvecklas i en cell som har vidhäftande ( http://www.alsa.org/research/about -als-research/cell-death-and-apoptosis.html ) och antalet apoptotiska celler identifierats under hela den tid som avbildning eller inom specifika tidsramar in.
4. Med tiden epitelceller i kultur förändrar deras morfologi från en initial cuboidal form till en mer långsträckt utseende som överensstämmer med EMT. Följ seriella bilder för att bestämma dag / timme efter plätering när detta inträffar.

5. Image File Ändring

1. Byt namn på bilden mappar och filer i enlighet med kraven för Timm s verktyg för spårning programvara Använd ett gratis program som Byt namn 2.1.6 ( http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml ) att byta namn på filer i grupper. Skapa en mapp som innehåller alla mappar och filer i experimentet och namnge mappen (t.ex.
2. Skapa en undermapp för varje punkt / position där kulturen avbildas. Namnge undermapparna: EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER. Positionsnumret bör ha 3 siffror. Exempel: 072511RN_p001. Lägg alla bildfiler i den individuella position i undermappen.
3. Tillsätt tidpunkt (med 5 siffror) och kanalnummer (eftersom det bara finns en ljusfält kanal, använd "0") i slutet av varje filnamn i detta format:
   EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER_tTIMEPOINT_wCHANNELNUMBER.jpgExample: 072511RN_p001_t00001_w0.jpg
4. Skapa en loggfil för varje position genom att först ladda ner gratis program TTTlogfileconverter från TTT hemsida. Starta TTTlogfileconverter programmet och välj experimentet mapp. Ingång en bild (i sekunder). För en bild tas varje 15 min, anger 900 sek. Tryck sedan på den gröna hemliga loggfiler knappen.

6. Generering av kartor cellöde av enskilda celler Använda TTT

1. Create en mapp som heter TTTexport och en undermapp som heter TTTfiles där alla celler spårning data kommer att lagras enligt TTT programvara instruktioner
2. Starta TTT programmet, välj användaren initialer, och klicka på "Fortsätt."
3. Tryck på "Set NAS," välj användaren skapade "TTTexport"-mappen, och klicka på Ok. I webbläsaren väljer ett experiment mapp väljer du läge mapp och tryck sedan på "Load läget"-knappen.
4. Ställ okulär faktor "10x." Fyll önskat antal bilder (laddar alla bilder rekommenderas för första gången).
5. I cell redaktör fönstret väljer du "Ny koloni" under Arkiv-menyn. I Filmfönstret, tryck på "Track cell" eller F2 för att börja spåra en cell.
6. Identifiera en cell i MOvie fönster och använda musen för att placera markören över cellen. En cirkel med antalet cellen ska visas efter F2 har klickat. Använd "0"-tangenten på det numeriska tangentbordet på tangentbordet för att spåra placeringen av cellen och gå vidare till nästa bild. Flytta markören att följa placeringen av varje cell genom varje ram. För att radera ett spår och gå tillbaka till föregående bild tryck "Del" på det numeriska tangentbordet. För att flytta framåt ramar utan att spåra cell tryck "3" och för att gå bakåt utan spårning tryck "1" på det numeriska tangentbordet.
7. För att markera en celldelning klicka på "division"-knappen i Filmfönstret. För att markera celldöd klicka på "Celldöd" i Filmfönstret. När en division har skett, kan dottercellerna spåras i samma cell öde karta genom att högerklicka på den cirkel symbol utsedda dottern cell i cell redigeringsfönstret för att börja spåra automatiskt.
8. Tryck på F10 för att spara trädet. Varje träd kommer att spara i den angivna utgående gångerER (TTTExport). För att starta en ny karta cell öde, välj "Ny koloni" under "File" och sedan "Öppna"-menyn i Cell redigeringsfönstret.
9. Tabellform datacell livstid efter att samla från "celldata" fliken i Cell redigeringsfönstret.

7. Statistiska analyser

1. Använd antingen Students t-test (om man jämför två genotyper) eller ANOVA (om man jämför> två genotyper) för att avgöra om skillnader i parametriska data såsom antalet initiala cellkolonier, livslängder cell eller timmar tills uppkomsten av EMT mellan olika genotyper är statistiskt signifikant. Apoptotiska frekvens kan jämföras som / totalt antal pläterade celler med hjälp av Students t-test eller ANOVA eller med Mann-Whitney eller Kruskal-Wallis om de kommer som en procentandel av vidhäftande celler.
2. Utför ström tester med data från analyser av initiala experiment för att bestämma hur många experimentella replikerar behöver utföras och cellöde kartor genereras från varje replikat för adekvat statistical effekt med tillgängliga gratisprogram (t.ex. http://statpages.org/ ). I försöken presenteras här var cellkulturer härledda från tre möss per genotyp tillräckligt för att avgöra om det fanns statistiskt signifikanta skillnader i cell koloni bildning och livslängd cell när specifika genetiska ändringar gjordes.

Representative Results

Epiteliala och fibroblastceller kan särskiljas genom cellmorfologi. Epitelceller har en kubformig form (fig. 1A-B) och bildar kolonier cell (Figur 1A). Fibroblaster, en typ av stromal, har en långsträckt morfologi (figur 1C).

Celler rundade och flytande vid början av avbildning (Figur 2A-D). Efter fastsättning till plattan blev platt och visade en kubformigt-typ utseende (figur 2E, H). Med 4 dagars odling huvuddelen av epitelceller långsträckta i en EMT-liknande morfologi (Figur 2I-L). Denna förändring skedde med samma kronologi i alla studerade genotyper. Vissa digitala bilder var suddiga eftersom Kohler belysning och fas ring justering inte korrekt inställd (Figur 2D, H, L).

De flytande cellerna utvecklats till definierade individuella epitelceller Colonies av 24 timmar efter plätering (figur 3A, B). Seriell bildanalys visade att dessa kolonier genererades genom cellaggregation snarare än celldelning. Även avbrott i BRCA1 sig inte förändrar antalet bildade kolonier, tillsättning av TP53 haploinsufficiency signifikant minskade antalet bildade kolonier och tillägg av ERa överuttryck signifikant ökade antalet kolonier bildade (figur 3C).

Det är viktigt att övervaka de digitala förvärvade bilderna och justera fokus kartan ofta under de första 24 timmar som celler fäster plattan och sedan minst två gånger dagligen för att säkerställa att cellerna förblir i fokus och kulturer inte kontamineras. Noggrannhet analyser äventyras om avbildade cellerna inte är i fokus (Figur 4).

I den representativa experiment som presenteras här, var en kritisk fråga för att avgöra om förändringar i expressionsnivås gener kända för att påverka bröstcancer risk (BRCA1, TP53 och östrogenreceptor 1 (Esr1) ¹⁾ ändrat antalet timmar mellan celldelningar (cell livstid) eller påverkat mönster division (symmetrisk mot asymmetrisk) i godartade primära mammära epitelceller. För att åstadkomma detta, har individuella cellöde kartor (träd) genereras med hjälp TTT. Exempel på representativa kartor cellöde för vardera av de fyra testade genotyperna illustreras (figur 5A-D). De fyra genotyper av de testade cellerna var vildtyp (ingen genetisk manipulation) (Figur 5A), förlust av full längd BRCA1 (BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre)} (Figur 5B), förlust av full längd BRCA1 i kombination med TP53 haploinsufficiency (BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -)} (figur 5C), och förlust av full längd BRCA1 i kombination med TP53 haploinsufficitransparensen och vinst Esr1 (BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -/MMTV-rtTA/tet-op-ER)} (Figur 5D). Generering av kartor cellöde stoppades när celler blev sammanflytande (~ 3-4 generationer) eftersom entydig spårning av enskilda celler var inte längre möjligt efter det. Generation 0 (tid till första celldelning) ingick inte i analysen av cell livstid eftersom varaktighet generation 0 var längre och mer varierande än kommande generationer. Generationer 1, 2, 3, och 4 grupperades tillsammans för de sista analyserna eftersom det fanns inga signifikanta skillnader i genomsnittlig cell livslängd eller standard för medelvärdet (SEM) mellan dessa generationer. Jämförelser av medelvärden cell livstid mellan olika genotyper (figur 5E) visade att förlusten av full längd BRCA1 minskat antalet timmar mellan celldelningar från 21,3 ± 1,6 h (vildtyp) till 16,5 ± 1,0 timmar (BRCA1 ^{f11/f11 / MMTV-Cre).} Nejtably Även förlust av en allel TP53 utöver förlust av full längd BRCA1 är associerad med en signifikant ökning av bröstcancer utveckling1, betyda cellen livslängd var oförändrad (16,3 ± 1,2 h) jämfört med möss som saknar BRCA1 endast. Intressant vinna på Esr1 i BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -/MMTV-rtTA/tet-op-ER} möss återställda cell livstid löptider till nära vildtyp nivåer (19,3 ± 2,1 timmar), även dessa möss har högsta incidensen av bröstcancer utvecklingen av alla de modeller studerade here.1 Dessa resultat visade att förlusten av full längd BRCA1 var inte alltid associerad med en förkortad cell livstid, utan detta ändrades genom överuttryckt ERa. Möjliga nästa steg experiment använder denna teknik skulle kunna vara dos-respons experiment med olika östrogener, andra tillväxtfaktorer eller terapi kandidat för att mäta deras inverkan på cell livstid i olika genetiska backgrounds. I motsats till effekterna på cellen livslängd varaktighet, studerade ingen av de genetiska förändringar här förändrade mönster celldelning.

Figur 1. Utseende av en epitelcell koloni (A), epitelceller (B) och fibroblast (C) från time-lapse avbildning. Epitelceller verkar mer cuboidal medan fibroblaster verkar mer långsträckt. Size barer = 50 pm.

Figur 2. Representativa seriella tidsfördröjda bilder från tiden 0, 2 och 4 dagar visar förändringar i cellulär morfologi över tid och skillnader i utseende med och utan KohlER belysning. Vid tiden 0 de strukna cellerna flyter (pilhuvuden AD), med två dagar i kultur de är vidhäftande och kan uppvisa en kubformigt-typ morfologi (tjocka pilar E, H) och av fyra dagar i kultur de långsträckta och uppvisa en EMT-liknande morfologi (tunn pilar IL). Kohler belysning finns i panelerna AC, EG, och IK. Paneler D, H och L visar bilder utan Kohler belysning. Bildarna är från samma avbildning punkten över tiden. Storlek barer = 200 nm. Klicka här för att se större bild .

Figur 3. Antal epitelceller kolonier vid 1 dag varierade genotyp. (A) Avrundad flytande celler i början av time-lapse avbildning. (B) Två representativa epitelceller cellkolonier (pilar). (C) Antalet epitell cellkolonier / ram bildas vid 24 timmar varierade genotyp. Stapeldiagram visar medelvärdet och standardavvikelsen för medelvärdet. * P <0,05, ANOVA. Size barer = 200 um. Celler som isolerats från mjölkkörtlar utan palpabel tumör från 10 - till 12-månader gamla BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre} (n = 4), BRCA1 ^{f11/f11 / MMTV-Cre / p53 + / -} (n = 3), BRCA1 ^{f11/f11/p53 + / -/MMTV-Cre/Tet-op/-ER/MMTV-rtTA} (n = 3), och vildtyp (n = 3) möss avbildades för studierna. Fem oberoende experiment avbildning består av olika kombinationer av vildtyp och genetiskt modifierade möss utfördes. Media innehöll fenolrött. Inget östrogen tillsattes. Klicka här för att se större bild .

Figur 4. Out-of-fokus bilder kan inte vara korrektly analyseras. Före avbildning plattan, bör plattan sitta i avbildande inkubator under 15 minuter till jämvikt. Under den första dagen av avbildning, bör fokus kontrolleras och justeras varannan timme. Efter det bör kontrolleras två gånger dagligen men i allmänhet förblir mer stabil. Pilen anger en out-of-fokus epitelceller koloni.

. Figur 5 cellöde kartor genereras från encelliga spårning med TTT för (A) vild-typ, (B) BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre,} (C) BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -,} och (D) BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -/MMTV-rtTA/tet-op-ER} möss. Celler som inte kan spåras på grund av förlust ur ram eller i ett sammanflytande cellskikt indikeras med ett frågetecken. När ingen frågeteckenanges, spårning var medvetet slutade på grund av cell-sammanflytning och oförmåga att entydigt följa encelliga öde. (E) Genomsnittlig cell livstid varierade genotyp. Stapeldiagram visar medelvärdet och standardfel av de genomsnittliga cell livstid (tid mellan celldelningar) över generationer 1-4 för varje genotyp. Mean cell livslängd var betydligt kortare i bröst epitelceller som härstammar från BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre} och BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -} jämfört med vildtyp möss. * P <0,05, ANOVA. Celler som isolerats från mjölkkörtlar utan palpabel tumör från 10 - till 12-månader gamla BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre} (n = 4), BRCA1 ^{f11/f11 / MMTV-Cre / p53 + / -} (n = 3), BRCA1 ^{f11/f11/p53 + / -/MMTV-Cre/Tet-op/-ER/MMTV-rtTA} (n = 3), och vildtyp (n = 3) möss avbildades för studierna. Fem oberoende experiment avbildning består av olika kombinationer av vildtyp och genetiskt Engineered möss utfördes. Media innehöll fenolrött. Inget östrogen tillsattes. Klicka här för att se större bild .

Discussion

Kritiska steg

Det är viktigt att se till att bröstkörtlar skördas från möss av samma ålder för att kontrollera åldersrelaterad variation i bröstepitelialceller cellbeteende. När utstrykning av cellerna, bör samma antal celler pläteras i varje brunn för varje försök. Celler bör vara relativt glesa när plätering så att kulturerna inte blir konfluenta alltför snabbt gör det möjligt att följa flera enskilda celler genom seriella bilderna. Det är viktigt att plattan är jämvikt i inkubatorn innan avbildning eftersom fokus kommer att förändras när plattan är i jämvikt. När avbildning har börjat, bör fokus kontrolleras ofta och justeras vid behov, särskilt inom de första 24 tim. Det är viktigt att ha en temperatur av inkubatorn reglerade och förvärmd. Antalet personer som går in och ut ur rummet bör begränsas så mycket som möjligt. Vi rekommenderar att öva alla aspekter av setting upp försöket i förväg för att säkerställa reproducerbarhet och kvalitetskontroll. Som med alla cellodling experiment är sterilitet en viktig fråga och standard sterila cellodling metoder bör användas vid alla tillfällen.

Spara och manipulera stora bildfiler kräver en betydande mängd minne. En delad nätverksenhet eller bärbara hårddiskar kan användas. När filerna konverteras det viktigt att se till att bilderna alltid är namngiven korrekt och placeras i motsvarande mappar. Frekvent sparar av digitala data skall utföras under hela processen.

Begränsningar

Denna metod använder en 2-D kultur system som inte tillåter för analys av beteendemässiga skillnader som kan bli tydligt i en 3-D odlingssystem. Löptider cell livstider kan endast reproducerbart värderas efter första observerade celldelning som antalet timmar till första celldelningen efter initIAL plätering av cellerna är variabel.

Möjliga modifieringar

Beroende på kraven i experimentet kan tidsförlopp bilder tas mer eller mindre ofta. Till exempel, om övergående cellstrukturer ska kvantifieras, kan en 5 sek intervall vara lämpligare. Andra förfaranden för att generera primära bröstepitelialceller cellkulturer kan användas. Varje bildutrustning kan användas för att skapa tid-lapse avbildning, så länge som det är i stånd att uppfylla kraven i experimentet. Alternativa system för encelliga spårning kan användas. För det förfarande som beskrivs här, en vanlig plast flatbottnad 6-brunnar var tillräcklig. Plastskålar kan användas för alla långa luft arbetsavstånd linser som 4x, 10x och 20x. Det är viktigt att välja områden nära centrum av plastskålar vid utförande bildåtergivning faskontrast eftersom plasten är krökt nära kanterna i de flesta rätter och förvränger ljuset.Coverslip tjocklek glas formade brunnar skulle krävas för normala linser avstånd nedsänkning (olja, vatten, glycerol, etc), vilka typiskt vid högre förstoring.

Felsökning

När celler är pläterade, bör mediet vara tillräcklig för att upprätthålla celltillväxt under 5 dagar för att minska behovet av att manipulera plattan på scenen, men om så är nödvändigt, kan mediet tillsättas. Det rekommenderas att avdunstning hållas till ett minimum. Avdunstning bör förvaltas genom att 3-4 rätter av sterilt avjoniserat vatten i inkubatorn och påfyllning dem vid behov. Det är möjligt att fylla de oanvända brunnarna i 6-brunnars platta med sterilt avjoniserat vatten.

Om bilderna inte laddas in i TTT-programmet, kontrollera först och se till att de filer och mappar ordnas och namngiven korrekt. Kontrollera sedan om loggfilen finns i rätt mapp (se steg 5,5).

Future program eller inriktning efter bemästra tekniken

Samma allmänna förfarande kan användas för att analysera beteendet hos andra celltyper inkluderande humana primära bröst epitelceller liksom bröstcancerceller. Exempelvis kan genotypiska-specifik beteende och / eller reaktion på kandidat behandlingar analyseras. Alternativt, avbildning av fluorescens-aktiverad cell (FAC) sorterat cellpopulationer kan utföras eller fluorescerande markörer tillsätts för att övervaka specifika celltyper.

Betydelsen av denna teknik med avseende på befintliga metoder

Tillsättning av time-lapse avbildning och analys av cell beteende över tid till traditionella cellodling och tekniker märkning ger kvantitativa data från enstaka celler över tiden snarare än endast hela populationsdynamik. Denna teknik tillåter enstaka celler som observeras kontinuerligt, till skillnad från traditionella metoder som tillåter observation endast vid diskreta tidpunkter. Moreover, traditionella metoder kräver cellerna att störas genom att ta dem in och ut ur inkubatorn för att se dem i mikroskop, medan det tillvägagångssätt som beskrivs här gör att cellerna kan observeras utan överförs. Slutligen ger tidsförlopp avbildning en bestående rekord av cellerna under observation som kan returneras till för vidare analyser. Användningen av TTT att spåra individuell cell beteende tillåter en entydig analys av flera parametrar och inte kräver användning av en fluorescerande etikett lokalisera de specifika cellerna under observation. Tekniken avslöjar skillnader i bröst epitelceller beteende som är svåra att mäta i statiska vävnadssnitt av bröstkörtel. Cell livstid mätningar kvantifiera antalet timmar mellan mitotiska händelser. Denna mätning ger data på det faktiska antalet timmar mellan celldelningar anger längden av cellcykeln i timmar. En forskare kan använda denna information för att avgöra hurspecifika genetiska modifieringar eller villkor kultur påverkar cellcykelns längd.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
EpiCult-B Basal Medium Mouse	StemCell Technologies	05610
EpiCult-B Proliferation Supplements Mouse	StemCell Technologies	05612
recombinant human Epidermal Growth Factor (rhEGF)	StemCell Technologies	02633
Collagenase/Hyaluronidase	StemCell Technologies	07912
Disposable Scapels	Feather	2975#10
Hanks' Balanced Salt Solution	StemCell Technologies	37150
Ammonium Chloride	StemCell Technologies	07800
Tryspin-EDTA	StemCell Technologies	07901
Dispase	StemCell Technologies	07913
DNase I	StemCell Technologies	07900
40 μm cell strainer	StemCell Technologies	27305
FBS	StemCell Technologies	06100
PenStrep	Gibco	15140