Summary
Vi beskriver användningen av en fluorescerande reporter vacciniavirus som möjliggör realtidsmätning av viral smittsamhet och genuttryck genom scenen specifika uttryck för spektralt distinkta reporter fluoroforer. Vi detalj en plåt-baserad metod för exakt identifiering av det stadium då virusreplika påverkas som svar på små molekyler hämning.
Abstract
Poxvirus är en familj av dubbelsträngade DNA-virus som inkluderar aktiva humana patogener såsom monkeypox, molluscum contagiousum och Contagalo virus. I familjen ingår även den smittkoppsvirus, Variola. På grund av komplexiteten av poxvirus replikering, många frågor fortfarande om deras genuttryck strategi. I den här artikeln beskriver vi begreppsbildning och användning av rekombinanta vacciniavirus som möjliggör realtidsmätning av en eller flera stadier av viral genuttryck i en hög genomströmning format. Detta möjliggörs genom användning av spektralt distinkta fluorescerande proteiner som reportrar för var och en av tre stadier av viral replikation. Dessa virus tillhandahåller en hög signal-till-brusförhållande under bibehållande av scen specifika uttrycksmönster, vilket gör att plattbaserade analyser och mikroskopiska observationer av virus förökning och replikation. Dessa verktyg har användningsområden för antiviral upptäckt, studier av virus-värd interaktioner, och evolutionär bionik.
Introduction
Traditionellt studeras virus uttryck med hjälp av molekylärbiologisk teknik (t.ex. Northern blotting, western blotting, microarray hybridisering, etc.) 1. Även om dessa metoder kan ge detaljerad information avseende kategori uttrycket ändras enskilda mRNA eller proteiner, de är oftast inte mottagliga för realtid och hög kapacitet processer. Alternativa tillvägagångssätt med fluorescensbaserade reportrar har tillämpats tidigare när man arbetar med poxvirus; dock har deras utveckling och användning motiverats av olika syften. Flera sådana metoder utformades för val av rekombinanta virus 2,3. Dessa tekniker uttrycker EGFP vid korrekt införlivande och uttryck av exogena DNA från rekombinanta vaccinia kloner. Likaså flera vacciniastammar stabilt uttrycker lösliga EGFP eller GFP-märkta proteiner som uttrycks i en infödd vaccinia promotor har använts i stor utsträckning. Dessa är typmatiskt för att kvantifiera virus inresa och replikering under antikroppsbaserade neutraliseringsanalyser, kemisk hämning, eller jämförelse av antiviral effektivitet 4-6. Även om dessa virus har visat sig användbara, de är begränsade i sin förmåga att ge detaljerad information om platsen för inhibition på grund av deras användning av en enda tvetydiga tidig / sen viral promotor. Tidigare metoder har också använt sig av EGFP protein med suboptimala signal-till-brus-karakteristika.
På grund av komplexiteten av poxvirus replikering och avsaknaden av befintliga verktyg för att analysera realtid förändringar i viral genuttryck, har vi utvecklat en svit av enkel-och flerstegs reporter virus 7,8. Som beskrivits i tidigare publikationer, dessa virus uttrycker en, två, eller tre spektralt distinkta fluorescerande proteiner från infödda vaccinia tagare under tidig, mellanliggande, eller sena stadier i infektion. Dessa virus kan vara ossed som indikatorer på virusreplika framsteg med hjälp av en fluorescensmikroskop och de är lika väl lämpade för hög genomströmning plåt-och-läsarbaserade analyser. Dessa virus är enkla att använda i stället för vildtypsvirus, växer med liknande kinetik för att nå motsvarande titer 7. Under planeringen och skapandet av dessa virus, var mycket omsorg på att välja fluoroforer som har höga signal-till-bakgrundsegenskaper med överlägsen fällbara effektivitet för att underlätta tillförlitlig kvantifiering med snabb återkoppling på förändringar i uttryck (Venus, mCherry och TagBFP). Dessutom var kombinationer av virala promotorer väljs som producerar high fidelity, entydig skede specifika uttryck, som ger information om hela utbudet av tidigt (C11R promotor), intermediär (G8R promotor) och sena (F17R promotor) genuttryck, till skillnad från tvetydiga tidiga / sena promotorer.
Dessa virus kan användas som ett verktyg för att investigating livscykeln för den prototypiska poxviruset, vacciniavirus. Mycket är fortfarande inte känt om samspelet värd-virus trots sin långa historia av studien. Vaccinia är komplex, som producerar över 200 unika proteiner, av vilka många är immunmodulerande och värd antagonistiska. Vid infektion, vacciniavirus börjar omedelbart tidig mRNA-transkription. Detta underlättas av en RNA-polymeras och transkriptionsfaktorer som lästs in på det virala genomet under virion förpackningar och hålls i ett paustillstånd tills efterföljande infektion. Denna tidiga uttryck producerar proteiner som krävs för undertryckande av värdens immunsystem (mRNA decapping, dsRNA kvarstad, och lockreceptorproteiner samt hämmare av apoptos, stress, och Toll, IL, och NF-kB-signalering) och genom replikering. Tidig uttryck producerar också transkriptionsfaktorer som är nödvändiga för mellanliggande uttryck. Mellan uttryck med uttrycket av sena skede transkriptionsfaktorer. Dettauttrycks kaskad leder till produktion av strukturella och enzymatiska virusproteiner under sena stadier av infektion, som är nödvändiga för kompletta enheter av den mogna vaccinia virus.
Vår uppsättning av fluorescerande reporter virus möjliggör snabba framsteg i förståelsen av poxvirus biologi. En av de vanligaste och mest tidskrävande metoder inom virologi är tillväxtanalys. Detta involverar typiskt att infektera celler, anta en rad behandlingar, skörd viruset genom att lysera infekterade celler, och att kvantifiera den resulte virustiter genom plackanalys. Använda reporter virus som beskrivs här möjliggör realtidsmätning av virustillväxt som lätt kan analyseras och jämföras mellan många behandlingar som utförs parallellt. Vi förutser denna uppsättning av reagens kommer att användas i olika protokoll för att identifiera förändringar i viralt genuttryck som svar på läkemedelsbehandling, RNAi knockdown, eller begränsning värdområde.
Denna metod gör det också hög innehållsanalys i större skala än tidigare, vilket möjliggör hög kapacitet antivirala läkemedel skärmar för särskilt definierade mål stadier av intresse. Medan många potentiella behandlingar för att bekämpa poxvirus infektion har identifierats godkände enda FDA terapier effektiva för behandling av poxvirus infektion är den acykliska fosfonat nukleosid, Cidofovir, och behandling med vacciniavirus immunglobulin 9,10. Trots att utrota smittkoppor 1977 11, poxvirus står ett betydande hot mot människors hälsa 12. Upphörande av utbredd vaccination mot Variola virus har lett till ökad mottaglighet för andra poxvirus 13. Till exempel är områden i Centralafrika tidigare skyddade genom vaccination upplever ett uppsving i Monkeypox virusinfektioner 14. Betydande problem har också varithöjde avseende latent känslighet för avsiktliga utsläpp av Variola virus. På grund av begränsade behandlingar nu tillgängliga, finns det ett akut behov av utveckling av nya behandlingar. Dessa reporter virus tillåter snabb och high-throughput screening småmolekylära hämmare för hämning av ett visst skede av virusreplikation. Identifiering av inhibitorer som riktar virala uttryckssteg för närvarande inte föremål för inhibition kommer att underlätta utvecklingen av kombinationsbehandlingar med ökad styrka.
Mycket kan utläsa om vaccinia cellbiologi genom att observera förändringar i varje steg är genuttryck. Dämpning genom kemisk eller genetisk manipulering av en infekterad värdcell uttrycks typiskt i form av minskade virala titrar. Men genom att jämföra förändringar i varje skede av virusuttrycks kaskad, kan man få en mer fullständig förståelse av hur virus kondition är påverkaned av en viss behandling. Dessa uppgifter har visat sig korrelera väl med den traditionella virus titer utgång, men ger mer detaljerad mekanistisk information samt hög kapacitet kapacitet 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plate celler
- Dissociera HeLa-celler från plattan och späddes i tillväxtmedia (DMEM, 2 mM L-glut, 10% FBS) till ca 2,0 x 10 5 celler / ml. Dispensera 100 | il / brunn i en svart-walled, klar flatbottnad 96-brunnsplatta (20000 celler / brunn).
- Inkubera cellerna under 24 h tills sammanflytande i en 37 ° C inkubator + 5% CO2.
2. Infektera celler
- Späd virus och infektera celler.
- Tina TrpV (Triple virus, Early Venus, Intermediate mCherry, Late TagBFP) och PLV (Promoter lösa Venus) fluorescerande virus och dela upp med hjälp av ultraljudsbehandling i 5 minuter. Alternativt kan råviruslagren blandas 1:1 med 0,25 mg / ml trypsin i infektionsmedia och inkuberades vid 37 ° C under 30 min.
- Späd råvirusförråd i 37 ° C-infektion media (DMEM, 2 mM L-glut, 2% FBS). För höga MOI-infektioner (10 PFU / cell), späd viruset lager till 1,0 x 10 7 PFU / ml antar 5 x 10 4celler / brunn och en ymp volym av 50 | il. Planerar att infektera 3 likadana brunnar för varje behandling med TrpV och ytterligare 3 likadana brunnar för samma behandling med PLV att redogöra för bakgrunden fluorescens specifika för varje behandling.
- Infect brunnar genom tillsats av 50 | il / brunn utspädd virus i infektionsmediet. Detta definieras som tid = 0 h efter infektion (0 hpi).
- Späd önskade behandlingsföreningar i infektions media. För alla behandlingar en 2x Master Mix spädning bör göras och tillämpas för att replikera brunnar (t.ex. 350 l totala volymen för sex 96-brunnar med 50 pl vardera).
- Späd experimentella föreningar i infektions media.
- Späd vehikelkontrollgrupp lösningsmedel (t.ex. PBS, DMSO) i infektions media. OBS: Liknande slutkoncentrationer av fordon-kontroll lösningsmedel bör användas som tillämpas för försöksföreningar (t.ex. om din IBT lager görs med DMSO och användes vid en slutlig Koncentrations av 1 pl / ml, sedan använda DMSO ensam på 1 pl / ml som fordonsstyrning).
- Späd kontrollföreningar i infektions media. Rekommenderade styr föreningar innefattar: 3,6 ^ M (1 ^ g / ml) 1-β-D-arabinofuranosylcytosin (AraC), 50 ^ M (11,7 | j, g / ml) isatin β-tiosemikarbazon (IBT), 60 ^ M (50 | ig / ml) rifampicin, eller 5 ^ M (1,9 | ig / ml) ST-246 8,15,16. Se Representativa resultat för förväntade effekter. Anmärkning: göra denna utspädning vid två gånger (2x) av den önskade slutkoncentrationen, eftersom detta tillsätts vid en 1:01-förhållande till den volym som redan är i brunnen.
- Omedelbart efter tillsats av virus, tillsätt 50 | il infektion media innehållande önskade behandlingar och kontroller späddes i steg 2,2. OBS: För att analysera om inhibition innan tidigt uttryck, förening (s) kan antingen tillsättas direkt till det utspädda virus inokulat (steg 2.1.2) eller till värdceller före infektion (före steg 2.1.3).
- Inkubera 6-24 tim på en 37 & #176; C inkubator + 5% CO2.
3. Fix celler
- Fix-celler genom att tillsätta 100 | il 8% paraformaldehyd till infektion mediet redan i varje brunn. Inkubera vid rumstemperatur i 15 minuter skyddade från ljus. OBS: Det rekommenderas att lägga till 2x PFA (8%) direkt till infektions media för att förhindra aerosolbildning av smitt vaccinia som kan uppstå om hög-titer media inverteras direkt i avfalls skål före fixering.
- Ta bort fixativ genom att vända plattan i avfalls skålen.
- Tillsätt 100 l av rumstemperatur PBS.
- Förslut plattan med optiskt klara adhesiv film. Anm: Plattorna kan lagras vid 4 ° C om inte läsa omedelbart. Se till att återvända förseglade plåtar till rumstemperatur innan du läser för att förhindra att kondens förvränga spektrofotometer mätningar.
4. Kvantifiera Virus Tillväxt
- Mät endpoint fluorescens vid 515:530 för Venus, 587:610 för mCherry och 415:457 feller TagBFP (Excite: Emission våglängd i nm). Fyra mätningar bör i genomsnitt per brunn med hjälp av optimerade förstärkningsinställningar för varje kanal. Obs: lämplig våglängd utsläpp kan variera beroende på den specifika modellen och filteregenskaper plattläsaren. Detta kan bestämmas empiriskt genom att utföra en våglängd scan emissions att bestämma den punkt där det är den största skillnaden mellan TrpV och PLV för varje kanal.
- Normalisera rådata för att underlätta jämförelser mellan experimenten.
- För varje kanal bestämma medelvärdet av replikat TrpV och PLV brunnar.
- Subtrahera medelvärdet PLV-infekterade bakgrundsmätningar från medelvärdet TrpV-infekterade experimentella mätningar för varje behandling.
- Normalisera data genom att dela varje bakgrund subtraheras värdet av fordons-bara värde väl.
- När ett experiment har upprepats flera gånger, en envägs variansanalys (envägs ANOVA) prov och flera c.ÄMFÖRELSE post-test kan utföras för att bestämma om någon av de behandlingar som reflekterar en statistiskt signifikant skillnad jämfört med den vehikel-enda behandling för varje kanal.
. 5 Alternativ protokoll: Kinetic Plate Analyser
- Utför alla steg genom tillsats av behandlingar (steg 2,3).
- Tätningsplatta med självhäftande film och placera i plattläsare kammaren till jämvikt till 37 ° C. Anm: Särskild försiktighet måste vidtas för att hålla plattorna konsekvent vid 37 ° C för att förhindra onödig cellstress och kondens. För kinetiska analyser är det särskilt viktigt att använda ett buffrat medium (natriumbikarbonat och HEPES) för att upprätthålla lämpligt pH utan tillsats av 5% CO2.
- Ställ plattläsare vinna manuellt för att förhindra mättnad av senare tidpunkter. Obs: Korrekt vinst optimering kan erhållas genom att utföra en endpoint analyser under liknande förhållanden.
- Förvärva timvärden för 8-24 hpi och normalisera använda simiLAR förfarande som i slutpunktsanalys (steg 4.2).
- Individuell tidpunkter kan analyseras med avseende på statistisk signifikans med användning av liknande metoder som den tidigare beskrivna slutpunktsanalys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som ett exempel på den typiska användningen av dessa virus, var trippel fluorescens-reporter virus som används för att jämföra den grad av inhibering av flera väldefinierade poxvirus-inhibitorer.
HeLa-celler ströks ut i vävnadsodlingsbehandlade svarta väggar tydliga flatbottnade 96-brunnars plattor och inkuberades över natten. Sammanflytande monoskikt infekterades vid en mångfald av infektion (MOI) av 10 med antingen trippel reporter virus (TrpV, tabell 1) eller promotor-mindre Venus (PLV) enligt beskrivningen på plattan kartan (Figur 1). Infektion medier innehållande behandlingar tillsattes för erhållande av en slutlig koncentration av 0,1% DMSO, 3,6 ^ M (1 | ig / ml) AraC, 50 ^ M (11,7 | j, g / ml) IBT, 5 ^ m (1,9 | ig / ml) ST-246 eller 60 | iM (50 pg / ml) Rifampicin i triplikat. 0,1% DMSO användes som vehikelkontroll eftersom all inhibitor lagren användes vid 1 | il / ml i DMSO. Plattan återfördes till en 37 ° C incubator tills 18 hpi. Cellerna fixerades under 15 minuter genom tillsats av 100 ^ il 8% PFA i alla brunnar och lagrades i PBS skyddad från ljus tills avlästes på en plattläsare. Fluorescens mätningar utfördes med hjälp av en Tecan Oändlig M1000 plattläsare och i-styrprogram (v1.5.14.0) genom botten läsa 4 poäng per brunn vid excitation: emissionsvåglängder av 515:530, 587:610, 415:457 nm för Venus , mCherry och TagBFP fluoroforer, respektive. Före slut mätningar, var vinst optimerad för att möjliggöra maximal signal utan mättnad av sensorer (vinsten var typiskt 235, 255, 235 för grönt, rött och blått mätningar, respektive).
Figur 1. Representativa layout av infektioner och läkemedelsbehandlingar på 96-brunnar. Diagram av den 96-brunnars platta infektion och liten molekyl tillsats schemat som används för cräta representativa resultat. Triple fluorescerande virus (TrpV, ljusare grå) uttrycker tidigt Venus, mellan mCherry, och sen TagBFP eller promotor-mindre Venus (PLV, mörkare grå) används i trippel kolumner. 1-β-D-arabinofuranosylcytosin (AraC), isatin β-tiosemikarbazon (IBT), Rifampicin, ST-246 och DMSO fordonskontroll med testade koncentrationen indikeras till höger. Klicka här för att visa en större bild.
Relativa fluorescensenheter (RFU) för varje replikat normaliserades för varje kanal. Först framställdes den genomsnittliga fluorescensintensiteten för PLV brunnarna subtraherades från den genomsnittliga intensiteten hos TrpV brunnar för varje behandling för att redovisa bakgrundsintensiteten skjutet från varje läkemedel. Därefter detta värde delat med bakgrunden subtraheras medelvärdet intensitet DMSO-behandlad TrpV brunnar (vildtyp tillväxt). De resultat som erhölls efter behandling med kända poxvirus hämmare var i linje med tidigare publicerade resultat och deras förstått verkningsmekanism. Upphörandet av tidig gentranskription och övergången till mellan genuttryck har visat sig kräva DNA-replikation 17. I överensstämmelse med detta, AraC, en hämmare av DNA-replikation, visade en dramatisk ökning i början av genuttryck (210% av DMSO behandlas tidigt uttryck, figur 2) och en total avsaknad av mellanliggande och sen uttryck (0,4% och 0,3% av DMSO behandlad mellanliggande och sent uttryck, respektive, fig. 2). Den exakta verkningsmekanismen inte är definierad för IBT, är det tänkt att främja genomläsning transkription, vilket resulterar i ökade mängder av dsRNA, aktivering av RNas L vägen och apoptos 18-20. Som svar på IBT behandling ett progressivt svår fenotyp observerades där var mellanliggande och sena uttryck betydligt mindre än enbart DMSO (24,7%och 2,9% av DMSO behandlades för mellanliggande och sent uttryck, respektive, fig. 2). En konsekvent, men inte statistiskt signifikant minskning tidigt fluorescens observerades också; Men detta är det sannolikt på grund av IBT-inducerad apoptos vid denna senare tidpunkt (74,0% av DMSO vid 18 hpi). I motsats till AraC och IBT, poxvirus droger ST-246 och Rifampicin både hämmar efter sent genuttryck under virionens montering och mognad 15,16. Inga förändringar i genuttryck sågs under alla stadier när cellerna behandlades med antingen ST-246 (100,9%, 98,5% och 94,5% av DMSO behandlas tidigt, mellan-och sen uttryck, respektive; Figur 2) eller rifampicin (107,6%, 104,2% och 106,5% av DMSO behandlas tidigt, mellan-och sen uttryck, respektive).
Historiskt har en kombination av låg MOI (0,01 till 0,1 pfu / cell) och hög MOI (5-10 PFU / cell) tillväxtanalyser används när utforska den inhiberande effekten av en ny liten molekyl eller virus-mutant. Vid en låg MOI, är övergripande hämmande effekter ofta överdrivits av även mindre hämning eftersom endast en delmängd av celler initialt infekterade. När man försöker definiera den punkt under en infektion cykel vid vilken ett virus hämmas, är en högt MOI infektion sannolikt lämpligare, eftersom alla celler är infekterade av din primära inokulat. Experimentet som visas i figur 3 utfördes såsom i Figur 2 med tillägget av en uppsättning av brunnar som var infekterade med en lägre MOI = 1. Som en inhibitor som fungerar post-transkriptionellt, bör ST-246 inte att påverka något stadium av genuttryck ; emellertid är det klart att när endast en delmängd av celler är infected (Figur 3, MOI = 1) det inte är uppenbart hämning av alla stadier av expression (38,4%, 48,9% och 52,9% DMSO i förhållande till 100,9%, 98,5% och 94,5% för MOI = 1 vs MOI = 10 infektionsnivån tidig, mellan och sen uttryck, respektive; Figur 3). Om man antar 100% inhibering av mogen virionbildning av ST-246, innebär detta 100% av cellerna var infekterade med MOI = 10 infektioner och någonstans mellan 50 och 70% av cellerna var produktivt infekterade under MOI = 1-infektion.
Figur 3. Effekt av infektionsnivån på skenbar ST-246-hämning. HeLa-celler infekterade som i figur 2 med både hög (MOI = 10) och låg (MOI = 1) TrpV behandlades med ST-246. Relativa fluorescensenheter (RFU, bakgrund subtraheras varje kanal bygger on PLV tillväxt för varje behandling och normaliserade till TrpV + DMSO) för tidig (grön), intermediär (röd), och sen (blå) viral uttryck i celler infekterade med antingen MOI = 1 eller MOI = 10 och behandlades med 20 ^ M ST- 246. Klicka här för att visa en större bild.
| Namn | Beskrivning | Ref. |
| TrpV | Triple virus; C11R (Early) främjas Venus, G8R (bra) främjas mCherry, F17R (Late) främjade mTagBFP | 7 |
| PLV | Promoter-less Venus | |
| EO | C11R (Early) främjade Venus | |
| IV | G8R (mellanprodukt) främjas Venus | |
| LV | F17R (Late) främjade Venus | |
| IREV | G8R (Intermediate) främjas mCherry och C11R (Early) främjade Venus | |
| LREV | F17R (Late) främjas mCherry och C11R (Early) främjade Venus | |
| LR | F17R (Late) främjade mCherry | |
| mCherry-A4L | N-terminal fusion av VENUS fluoroforen till den sena-uttryckt viralt kärnprotein A4L |
Tabell 1. Lista med vacciniavirus reporterstammar. Tabell som beskriver fluorescens reporter virus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här har vi beskrivit den praktiska användningen av en flerstegs vacciniavirus reporter virus (TrpV), vilket ger reproducerbara, realtidsrespons åtgärder för virusreplikation. Genom att använda väldefinierade poxvirus hämmare, kunde vi visa att TrpV reagerar på ett sätt som överensstämmer med den förstod verkningsmekanism för varje inhibitor. Medan TrpV viruset ger den mest omfattande information om virus skede progression, två steg (IREV, LREV) och enda steg (EV, IV, LV)-virus kan också användas på samma sätt, att dra nytta av den optimala proteinveckning, stabilitet, och överlägsen signal-till-brusförhållandet hos Venus fluorofor.
Den proof-of-concept-analys i detta protokoll visar möjligheterna att identifiera stadiet av viral genuttryck påverkas av kända poxvirus hämmare i en enkel, hög genomströmning plattanalys. Denna analys kan utökas för att slutföra snabb, omfattande screeningav okända kemiska bibliotek också. De virus som kan användas för att infektera små molekyler behandlade cellerna vid låg MOI, vilket möjliggör specifik identifiering av föreningar som blockerar något stadium av den virala livscykeln. De hämmare kan sedan screenas med hjälp TrpV vid flera MOI för att avgöra i vilket skede av viruslivscykeln hämmas, från posten (ingen genuttryck), för tidigt, mellanliggande, eller sent genuttryck eller montering (full genuttryck men ingen virusspridning). Vi har använt denna teknik för att lyckas identifiera en ny anti-poxviruspartikel hämmare med aktivitet mot flera poxvirus, bland Monkeypox 8.
Samtidigt som vi har lämnat uppgifter för att använda dessa virus i en plattläsare format, är det lika väl lämpad för mikroskopisk undersökning. Infektion och observation via fluorescensmikroskop (se Figur 2B) medger en cell-för-cell undersökning av viral skede fortgång, vilket kan vara användbart ien blandad cellkultur miljö, såsom infektion av en vävnad eller i virala eller bakteriella saminfektion betingelser. Dessutom, medan dessa virus har skapats i syfte att antiviral screening 8, förväntar vi oss att de ska vara lika användbarhet i grundforskning undersöker livscykel vacciniavirus. Till exempel kan dessa virus lätt modifieras med hjälp av traditionella tekniker till antingen brist eller överuttrycker virala proteiner; kinetiken för virus genuttryck och spridning kan sedan övervakas i realtid för alla stadier av viral transkription.
Undersökningar av virus-värd interaktioner kan dra nytta av användningen av dessa reporter virus också. Dessa reportrar tillåter snabb identifiering av det skede av virusreplika klar under infektion av icke-tillåtande celltyper, till exempel vissa primära cellinjer, perifert blod leukocyter, eller olika arter 21,22. Information som samlas in från att använda dettaVerktyget skulle främja vår kunskap om poxvirus värd range begränsningsfaktorer och funktionen av virus immunmodulerande proteiner. Virusen kan också vara användbara för att identifiera stadiet av virusreplikation hämmas av knockdown av värdfaktorer som krävs för infektion, i antingen en hel-genom skala skärmen eller i en riktad litet bibliotek skärm.
Flera steg i detta protokoll bör betraktas kritiskt när man börjar använda dessa virus i ett nytt system. Skillnader i plattformat, tillväxtmedier, och celltyp kan kräva förändring av MOI, inympning tid, eller inkubation varaktighet. Det blir särskilt viktigt att optimera endpoint inkubationstid innan skala upp till hög kapacitet format. För att bestämma den ideala inkuberingstid bör en pilot kinetisk plattanalys utföras (se steg 5). Under en kinetisk analys är fluorescensmätningar gjordes varje timme under 12 till 24 timmar och kan användas för att peka ut den tid vid vilken gräter av skillnad observeras mellan kontroll och behandling virus expression. Betydelsen av detta steg kan ses i behandlingen med IBT, där inhibering på grund av ökade hastigheter av apoptos leder till en uppenbar, även om inte statistiskt signifikant minskning i början av uttrycket. Om tidigare tidpunkter (4-8 HPI) observerades att det skulle sannolikt inte finnas någon skillnad noteras. Dessutom bör testa en roman inhiberande föreningen inkludera flera föreningskoncentrationer. Även om dessa fluorescens reporter virus kan upptäcka minimala förändringar i genuttryck, kan den ytterligare information som flera koncentrationer leda till en bättre förståelse för deras övergripande effekt.
Under planeringen och skapandet av dessa virus, var mycket omsorg på att välja fluoroforer som har höga signal-till-bakgrundsegenskaper 7. Venus protein identifierades som betydligt bättre än någon annan testad fluorophore och därför användes under hela utvecklingen av trippel, dubbel-och enkel fluorescerande reporter virus. En begränsning att använda denna fluorofor är att den inte kan användas för att infektera någon cellinje som redan innehåller ett grönt fluorescerande reporter av fusionsproteinet. För att ta itu med analys under dessa omständigheter, har flera alternativa virus som skapats med röda fluorescerande proteiner (tabell 1). Genom att uttrycka antingen lösliga mCherry från F17R sena promotor eller en mCherry-A4L fusionsprotein från naturliga A4L sena promotor har vi möjlighet att utföra liknande mätningar utan Venus. Även om användningen av mCherry inte har den ytterligare fördelen ges av Venus-proteinet kan vi nu att rymma mätning i grön-uttryckande cellinjer.
Sammanfattningsvis har vi utvecklat en rad reporter vacciniavirusen med olika tillämpningar, inklusive hög genomströmning plattläsare eller hög halt bildbehandling assays. Dessa virus kommer att göra undersökning av den virala livscykeln mycket snabbare än traditionella metoder, och kan användas för grundforskning och tillämpad antiviral forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut och inga patentsökt efter virus eller screeningmetoder.
Acknowledgments
Vi tackar SIGA Technologies (Corvallis, OR) för att ge ST-246. DKR stöddes av en NIH utbildningsbidrag inom immunologi till Boston University (5T32AI 7309). Detta arbete stöddes delvis av P41 086.180, NIH RO1AI1096159-01, och RO3 (till JHC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 | |
| Fetal Bovine Serum - Optima, Heat Inactivated (FBS) | Atlanta Biologicals | S12450H | |
| 200 mM L-Glutamine, (L-glut) | Gibco | 25030-081 | |
| 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3603 | |
| 384 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3712 | |
| Trypsin, 2X, Sterile, Irradiated | Worthington Biochemical Corp. | TRLVMF | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Dimethyl Sulfoxide, Cell Culture (DMSO) | American Bioanalytical | AB03091 | |
| 1-β-D-Arabinofuranosylcytosine (AraC), MW= 280 g/mol | SigmaAldrich Co | C6645 | |
| isatin β -thiosemicarbazone (IBT), MW= 234 g/mol | Fisher Scientific | NC9075202 | |
| Rifampicin, MW= 823 g/mol | SigmaAldrich Co | R3501 | |
| ST-246, MW= 376 g/mol | SIGA Labs, Corvallis, OR | ||
| 8% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| TempPlate RT optically clear film | USA Scientific | 2978-2700 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 |
References
- Yen, J., Golan, R., Rubins, K. Vaccinia virus infection & temporal analysis of virus gene expression: part 1. J Vis Exp. 26 (26), (2009).
- Hansen, S. G., Cope, T. A., Hruby, D. E. BiZyme: a novel fusion protein-mediating selection of vaccinia virus recombinants by fluorescence and antibiotic resistance. BioTechniques. 32 (5), 1182-1187 (2002).
- Popov, S., Mirshahidi, S., Essono, S., Song, R., Wang, X., Ruprecht, R. M. Generation of recombinant vaccinia viruses via green fluorescent protein selection. DNA and Cell Biology. 28 (3), 103-108 (2009).
- Bartee, E., Mohamed, M. R., Lopez, M. C., Baker, H. V., McFadden, G. The addition of tumor necrosis factor plus beta interferon induces a novel synergistic antiviral state against poxviruses in primary human fibroblasts. Journal of Virology. 83 (2), 498-511 (2009).
- Ward, B. M., Moss, B. Visualization of intracellular movement of vaccinia virus virions containing a green fluorescent protein-B5R membrane protein chimera. Journal of Virology. 75 (10), 4802-4813 (2001).
- Johnson, M. C., Damon, I. K., Karem, K. L. A rapid, high-throughput vaccinia virus neutralization assay for testing smallpox vaccine efficacy based on detection of green fluorescent protein. Journal of Virological Methods. 150 (1-2), 14-20 (2008).
- Dower, K., Rubins, K. H., Hensley, L. E., Connor, J. H. Development of Vaccinia reporter viruses for rapid, high content analysis of viral function at all stages of gene expression. Antiviral Research. 91 (1), 72-80 (2011).
- Dower, K., et al. Identification of a pyridopyrimidinone inhibitor of orthopoxviruses from a diversity-oriented synthesis library. Journal of Virology. 86 (5), 2632-2640 (2012).
- De Clercq, E. Clinical Potential of the Acyclic Nucleoside Phosphonates Cidofovir, Adefovir, and Tenofovir in Treatment of DNA Virus and Retrovirus Infections. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 569-596 (2003).
- Prichard, M. N., Kern, E. R. Orthopoxvirus Targets for the Development of New Antiviral Agents. Antiviral Research. 10, (2012).
- Fenner, F. A successful eradication campaign. Global eradication of smallpox. Reviews of Infectious Diseases. 4 (5), 916-930 (1982).
- Breman, J. G., Henderson, D. A. Poxvirus dilemmas--monkeypox, smallpox, and biologic terrorism. The New England. Journal of Medicine. 339 (8), 556-559 (1998).
- Baker, R. O., Bray, M., Huggins, J. W. Potential antiviral therapeutics for smallpox, monkeypox and other orthopoxvirus infections. Antiviral Research. 57, 1-2 (2003).
- Rimoin, A. W., et al. Major increase in human monkeypox incidence 30 years after smallpox vaccination campaigns cease in the Democratic Republic of Congo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 107 (37), 16262-167 (2010).
- Sodeik, B., Griffiths, G., Ericsson, M., Moss, B., Doms, R. W. Assembly of vaccinia virus: effects of rifampin on the intracellular distribution of viral protein p65. Journal of Virology. 68 (2), 1103-1114 (1994).
- Grosenbach, D. W., Jordan, R., Hruby, D. E. Development of the small-molecule antiviral ST-246 as a smallpox therapeutic. Future Virology. 6 (5), 653-671 (2011).
- Broyles, S. S.
- Condit, R. C., Niles, E. G. Regulation of viral transcription elongation and termination during vaccinia virus infection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and Expression. 1577 (2), 325-336 (2002).
- Díaz-Guerra, M., Rivas, C., Esteban, M. Inducible expression of the 2-5A synthetase/RNase L system results in inhibition of vaccinia virus replication. Virology. 227 (1), 220-228 (1997).
- Cohrs, R. J., Condit, R. C., Pacha, R. F., Thompson, C. L., Sharma, O. K. Modulation of ppp(A2’p)nA-dependent RNase by a temperature-sensitive mutant of vaccinia virus. Journal of Virology. 63 (2), 948-951 (1989).
- Sánchez-Puig, J. M., Sánchez, L., Roy, G., Blasco, R. Susceptibility of different leukocyte cell types to Vaccinia virus infection. Virology Journal. 1 (1), (2004).
- Bengali, Z., Satheshkumar, P. S., Yang, Z., Weisberg, A. S., Paran, N., Moss, B. Drosophila S2 cells are non-permissive for vaccinia virus DNA replication following entry via low pH-dependent endocytosis and early transcription. PLoS One. 6 (2), (2011).
