Summary
We beschrijven het gebruik van een fluorescerende reporter koepokkenvirus die real-time meting van de virale besmettelijkheid en genexpressie in staat stelt door middel van het podium-specifieke expressie van spectraal verschillende reporter fluoroforen. We detail een plaat gebaseerde methode voor het nauwkeurig vaststellen van de fase waarin het virus replicatie wordt beïnvloed in reactie op kleine molecule remming.
Abstract
Poxviruses zijn een familie van dubbelstrengs DNA-virussen die actieve menselijke ziekteverwekkers zoals monkeypox, molluscum contagiousum en Contagalo virus bevatten. De familie omvat ook het pokkenvirus, Variola. Vanwege de complexiteit van pokkenvirus replicatie, veel vragen blijven over hun genexpressie strategie. In dit artikel beschrijven we de beeldvorming en het gebruik van recombinante vaccinia virussen die real-time meting van enkelvoudige en meervoudige stadia van virale genexpressie in een high-throughput laat toe. Dit wordt mogelijk gemaakt door het gebruik van spectraal verschillende fluorescente eiwitten reporters voor elk van de drie stadia van virale replicatie. Deze virussen zorgen voor een hoge signaal-ruisverhouding tijdens stadium specifieke expressiepatronen, zodat plaat gebaseerde testen en microscopische observaties van virusvermeerdering en replicatie behouden. Deze instrumenten hebben toepassingen voor antivirale ontdekking, studies van de interactie tussen virus en gastheer, en evolutionaire biologie.
Introduction
Traditioneel wordt virusexpressievectoren bestudeerd met behulp van moleculair biologische technieken (bijvoorbeeld Northernblotting, western blotting, microarray hybridisatie, etc.) 1. Hoewel deze methoden kunnen gedetailleerde informatie betreffende categoriseren expressie veranderingen van afzonderlijke mRNA of eiwitten zijn, zijn ze meestal niet ontvankelijk voor real-time en high-throughput processen. Alternatieve benaderingen met behulp van fluorescentie gebaseerde reporters zijn eerder toegepast bij het werken met poxviruses; echter, is hun ontwikkeling en gebruik ingegeven door gevarieerde doelstellingen. Verschillende van dergelijke werkwijzen zijn ontwikkeld voor de selectie van recombinante virussen 2,3. Deze technieken uiten EGFP op een correcte integratie en expressie van exogeen DNA van recombinant vaccinia klonen. Ook verscheidene vaccinia stammen die stabiel EGFP oplosbaar of GFP-gemerkte eiwitten tot expressie gebracht onder een natieve vaccinia promoter zijn op grote schaal gebruikt. Deze zijn typtisch gebruikt om virus entry en replicatie tijdens antilichamen gebaseerde neutralisatiebepalingen, chemische remming, of vergelijking van antivirale effectiviteit 4-6 kwantificeren. Hoewel deze virussen nuttig zijn gebleken, zijn zij beperkt in hun vermogen om gedetailleerde informatie over de bijzondere inhibitie door het gebruik van een dubbelzinnige vroege / late virale promoter. Vorige werkwijzen hebben ook gebruik van EGFP eiwit met suboptimale signaal-ruis-eigenschappen.
Vanwege de complexiteit van pokkenvirus replicatie en het ontbreken van bestaande hulpmiddelen beschikbaar om real-time veranderingen in virale genexpressie assay, hebben we een reeks van een of meerdere stage reporter 7,8 virussen ontwikkeld. Zoals beschreven in eerdere publicaties, deze virussen uiten een, twee, of drie spectraal verschillende fluorescerende eiwitten uit autochtone vaccinia initiatiefnemers tijdens de vroege, midden of late stadia in infectie. Deze virussen kunnen onsed als indicatoren van het virus replicatie vooruitgang met behulp van een fluorescentie microscoop en ze zijn even goed geschikt voor high-throughput plaat-en-reader gebaseerde testen. Deze virussen zijn makkelijk te gebruiken in plaats van wild type virus, groeit met vergelijkbare kinetiek gelijkwaardige titers 7 bereiken. Bij de planning en het creëren van deze virussen is veel zorg besteed aan het selecteren van fluoroforen die hoge signaal-achtergrond kenmerken met superieure vouwen efficiëntie betrouwbare kwantificatie met snelle feedback aan veranderingen in expressie (Venus, mCherry en TagBFP) vergemakkelijken. Bovendien, combinaties van virale promotors werden gekozen die high fidelity, eenduidige fase-specifieke expressie, het verstrekken van informatie over het volledige scala van vroege (C11R promotor), intermediair (G8R promotor) en late (F17R promotor) genexpressie te produceren, in tegenstelling tot dubbelzinnige vroege / late promoters.
Deze virussen kunnen worden gebruikt als instrument voor INVEstigating de levenscyclus van de prototypische pokkenvirus, vaccinia virus. Veel is nog niet bekend over de host-virus interactie ondanks de lange geschiedenis van de studie. Vaccinia is complex, productie van meer dan 200 unieke eiwitten, waarvan vele zijn immunomodulerende en gastheer antagonistische. Na infectie begint vacciniavirus onmiddellijk vroege mRNA transcriptie. Dit wordt vergemakkelijkt door een RNA-polymerase en transcriptiefactoren die op het virale genoom werden geladen tijdens virion verpakking en vastgehouden in een onderbroken toestand tot daaropvolgende infectie. Deze vroege uitdrukking produceert eiwitten vereist voor het onderdrukken van de gastheer immuunsysteem (mRNA decapping, dsRNA opslag en decoy receptor eiwitten alsook remmers van apoptose, stressrespons en Toll, IL en NF-KB-signalering) en genoom replicatie. Vroege uitdrukking produceert ook transcriptiefactoren die nodig zijn voor intermediaire expressie. Intermediate meningsuiting de expressie van late stadium transcriptiefactoren. Dezeexpressie cascade leidt tot productie van structurele en enzymatische virus eiwitten tijdens de late stadia van de infectie, die noodzakelijk zijn voor volledige assemblage van het rijpe virion vaccinia.
Onze reeks van fluorescerende reporter virussen zorgt voor een snelle vooruitgang wordt geboekt in het begrijpen van pokkenvirus biologie. Een van de meest voorkomende en tijdrovende methoden op het gebied van de virologie is de groei assay. Dit betekent meestal infecteren cellen vaststelling van een reeks behandelingen, oogsten virus door geïnfecteerde cellen lyseren en kwantificeren van de virale titer verkregen door plaque assay. De reporter virussen beschreven maakt real-time meting van de virusgroei die gemakkelijk kunnen worden getest en vergeleken tussen talrijke behandelingen parallel uitgevoerd. Wij voorzien deze set reagentia worden gebruikt in verschillende protocollen voor het identificeren van veranderingen in virale genexpressie in respons op behandeling met geneesmiddelen, RNAi knockdown, of host range beperking.
Deze methode maakt het ook mogelijk hoge inhoudsanalyse op grotere schaal dan voorheen beschikbaar, waardoor voor high-throughput anti-virale medicijn schermen voor specifiek omschreven doel fasen van belang. Terwijl talrijke potentiële behandelingen pokkenvirus infectie bestrijden zijn geïdentificeerd, het enige door de FDA goedgekeurde therapie effectief voor de behandeling pokkenvirus infectie het acyclische nucleoside fosfonaat, cidofovir, en behandeling met vaccinia immunoglobuline 9,10. Ondanks de uitroeiing van pokken in 1977 11, poxviruses blijven een belangrijke bedreiging voor de gezondheid van de mens 12. Stopzetting van wijdverbreide vaccinatie tegen variolavirus heeft geleid tot een verhoogde gevoeligheid voor andere pokkenvirussen 13. Bijvoorbeeld, zijn de regio's van Centraal-Afrika eerder door vaccinatie beschermd ervaren van een stijging van de Apenpokken virusinfecties 14. Belangrijke zorg is ookgeuit over de latente gevoeligheid voor opzettelijke vrijlating van variolavirus. Vanwege de beperkte therapieën die momenteel beschikbaar zijn, is er een dringende behoefte aan ontwikkeling van nieuwe behandelingen. Deze verslaggever virussen toestaan snelle en high-throughput klein molecuul-remmer screening op remming van een specifieke fase van virale replicatie. Identificatie van remmers die virale uitdrukking stadia richten momenteel niet het doelwit van remming zal de ontwikkeling van combinatietherapieën vergemakkelijken met een verhoogde potentie.
Er kan veel worden afgeleid over vacciniavirussen celbiologie door het observeren van veranderingen in elke fase van de genexpressie. Verzwakking door chemische of genetische manipulatie van een geïnfecteerde gastheercel wordt typisch uitgedrukt als de virale titers. Echter, door veranderingen in elke fase van de virale expressie cascade vergelijken, kan een vollediger begrip van hoe virus fitness effect is te vindened door een bepaalde behandeling. Deze gegevens zijn getoond om goed correleren met de traditionele virustiter uitgang, maar meer gedetailleerde mechanistische informatie en high throughput mogelijkheden 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plate Cellen
- Distantiëren HeLa-cellen van de plaat en verdund in kweekmedium (DMEM, 2 mM L-glut, 10% FBS) tot ongeveer 2,0 x 10 5 cellen / ml. Pipetteer 100 ul / putje in een zwarte wanden, duidelijke platte bodem 96-well platen (20.000 cellen / putje).
- Incubeer cellen gedurende 24 uur tot confluent in een 37 ° C incubator + 5% CO2.
2. Cellen infecteren
- Verdun virus en cellen infecteren.
- Dooi TRPV (Triple virus; Vroege Venus, Intermediate mCherry, Late TagBFP) en PLV (Promotor-minder Venus) TL-virus en splitsen met behulp van sonicatie gedurende 5 minuten. Alternatief kan ruw virusvoorraden worden 1:1 gemengd met 0,25 mg / ml trypsine in infectie media en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
- Verdunnen ruwe virusvoorraden in 37 ° C infectie media (DMEM, 2 mM L-glut, 2% FBS). Voor hoge MOI infecties (10 PFU / cel), vul virus voorraad tot 1,0 x 10 7 PFU / ml veronderstelling 5 x 10 4cellen / putje en een inoculum volume van 50 pl. Plan infecteren 3 herhalingsputjes voor elke behandeling met TRPV en nog 3 herhalingsputjes voor dezelfde behandeling PLV om rekening te achtergrondfluorescentie specifiek voor elke behandeling.
- Infecteren putten door toevoeging van 50 ul / putje verdund virus infectie media. Dit wordt gedefinieerd als de tijd = 0 uur na infectie (0 hpi).
- Verdun gewenste behandeling stoffen in infectie media. Voor alle behandelingen een enkel 2x master mix verdunning moet worden gemaakt en toegepast op bronnen (bv. 350 ul totaal volume voor zes 96-putten met 50 pi elk) repliceren.
- Verdun experimentele verbindingen in infectie media.
- Verdun voertuig controle oplosmiddel (bijv. PBS, DMSO) in infectie media. Opmerking: Vergelijkbare uiteindelijke concentraties van voertuig-control oplosmiddelen worden gebruikt, zoals toegepast voor experimentele verbindingen (bijvoorbeeld als je IBT voorraad is gemaakt met DMSO en gebruikt bij een uiteindelijke concentrations van 1 pi / ml, vervolgens alleen DMSO bij 1 ul / ml als voertuig controle).
- Verdun control stoffen in infectie media. Aanbevolen control verbindingen omvatten: 3,6 pM (1 ug / ml) 1-β-D-arabinofuranosylcytosine (AraC), 50 uM (11,7 ug / ml) isatine β-thiosemicarbazon (IBT), 60 uM (50 ug / ml) Rifampicine, of 5 uM (1.9 ug / ml) ST-246 8,15,16. Zie Representatieve resultaten voor de verwachte effecten. Opmerking: maken deze verdunning tweemaal (2x) de gewenste eindconcentratie aangezien dit in de verhouding 1:1 wordt toegevoegd om het volume reeds in de put.
- Onmiddellijk na de toevoeging van het virus, voeg 50 ul infectie media die gewenste behandelingen en controles als verdund in stap 2.2. Opmerking: Voor het analyseren van de remming voordat vroeg stadium uitdrukking, verbinding (s) kan direct worden toegevoegd aan de verdunde virusinoculum (stap 2.1.2) of aan gastheercellen vóór infectie (vóór stap 2.1.3).
- Incubeer 6-24 uur in een 37 & #176, C incubator + 5% CO2.
3. Fix Cells
- Fix cellen door het toevoegen van 100 pi 8% paraformaldehyde om besmetting media reeds in elk putje. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 min beschermd tegen licht. Opmerking: Het wordt aanbevolen om 2x PFA (8%) rechtstreeks aan infectie media aan aerosolization van besmettelijke vaccinia die kan optreden voorkomen als een hoge-titer media rechtstreeks wordt omgekeerd in afval schaal voorafgaand aan de fixatie.
- Verwijder fixatief door het omkeren plaat in het afval gerecht.
- Voeg 100 ul van PBS kamertemperatuur.
- Seal plaat met optisch heldere zelfklevende folie. Opmerking: Platen kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C als niet onmiddellijk lezen. Zorg ervoor dat u verzegelde platen op kamertemperatuur komen vóór het lezen om condensvorming te voorkomen vervormen spectrofotometer metingen.
4. Kwantificeren Virus Growth
- Meet eindpunt fluorescentie bij 515:530 voor Venus, 587:610 voor mCherry en 415:457 fof TagBFP (Opwinding: Emissie golflengte in nm). Vier metingen moeten worden gemiddeld per putje met behulp van geoptimaliseerde gain-instellingen voor elk kanaal. Opmerking: de juiste emissie golflengte kan verschillen, afhankelijk van het specifieke model en filter kenmerken van uw bord lezer. Dit kan empirisch worden bepaald door het uitvoeren van een emissiegolflengte scan tot het punt waar het grootste verschil tussen TRPV en PLV voor elk kanaal te bepalen.
- Normaliseren van de ruwe data om een vergelijking tussen experimenten te vergemakkelijken.
- Voor elk kanaal, bepalen het gemiddelde van repliceren TRPV en PLV putten.
- Trek de gemiddelde PLV-geïnfecteerde achtergrond metingen van de gemiddelde TRPV-geïnfecteerde experimentele metingen voor elke behandeling.
- Normaliseren van de gegevens die door elke achtergrond afgetrokken waarde te delen door het enige voertuig waarde ook.
- Zodra een experiment is meerdere keren, een one-way variantie-analyse (one-way ANOVA) testen en meerdere c herhaaldERGELIJKING post-test kan worden uitgevoerd om te bepalen of een van de behandelingen geeft een statistisch significant verschil met het enige voertuig behandeling voor elk kanaal.
. 5 Alternative Protocol: Kinetic plaatanalyses
- Voer alle stappen door toevoeging van behandelingen (stap 2.3).
- Seal plaat met zelfklevende folie en plaats in plaataflezer kamer evenwicht gebracht tot 37 ° C. Opmerking: Speciale zorg moet worden genomen om platen constant te houden bij 37 ° C tot onnodige cel stress en condensatie te voorkomen. Voor kinetische testen, is het bijzonder belangrijk om een gebufferd medium (natriumbicarbonaat en HEPES) om juiste pH te handhaven zonder toevoeging van 5% CO2.
- Set plaataflezer krijgen handmatig verzadiging van latere tijdstippen te voorkomen. Opmerking: Accurate winst optimalisatie kan worden verkregen door het uitvoeren van een eindpunt assays onder vergelijkbare omstandigheden.
- Acquire per uur lezingen voor 8-24 hpi en normaliseren met behulp van simiLAR-procedure zoals in eindpuntassay (stap 4.2).
- Individuele tijdstippen worden geanalyseerd op statistische significantie met vergelijkbare werkwijzen als eerder beschreven eindpunt assay.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Als voorbeeld van de typische gebruik van deze virussen, werd de drievoudige fluorescentie-reporter virus gebruikt voor het vergelijken van de plaats van remming van een aantal goed gedefinieerde pokkenvirus remmers.
HeLa-cellen werden uitgeplaat in weefselkweek behandelde zwarte wanden duidelijke platte bodem 96-well platen en overnacht geïncubeerd. Confluente monolagen werden geïnfecteerd bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 10 met behulp van drievoudige reporter virus (TRPV, tabel 1) of promoter-less Venus (PLV) zoals vermeld op de plaat kaart (figuur 1). Infectie media die behandelingen werd toegevoegd tot een eindconcentratie van 0,1% DMSO, 3,6 uM (1 ug / ml) te verkrijgen AraC, 50 uM (11,7 ug / ml) IBT, 5 uM (1.9 ug / ml) ST-246 of 60 uM (50 ug / ml) Rifampicine in drievoud. 0,1% DMSO werd gebruikt als het voertuig controle omdat alle remmer voorraden werden toegepast met 1 ul / ml in DMSO. De plaat werd teruggebracht naar een 37 ° C incubator tot 18 hpi. Cellen werden gefixeerd gedurende 15 minuten door toevoeging van 100 ul 8% PFA aan alle putjes en opgeslagen in PBS beschermd tegen licht tot lezen op een bord lezer. Fluorescentie metingen werden uitgevoerd met behulp van een Tecan Infinite M1000 plaat lezer en i-control software (v1.5.14.0) door-bottom lezen 4 punten per goed bij excitatie: emissiegolflengten van 515:530, 587:610, 415:457 nm voor Venus , mCherry en TagBFP fluoroforen, respectievelijk. Voorafgaand aan de definitieve metingen, werd winst geoptimaliseerd om maximale signaal mogelijk te maken zonder verzadiging van sensoren (winst was typisch 235, 255, 235 voor Groen, Rood en Blauw metingen, respectievelijk).
Figuur 1. Representatieve indeling van infecties en drugbehandelingen op 96-well plaat. Schema van de 96-well plaat infectie en kleine moleculen bovendien regeling voor creten representatieve resultaten. Triple fluorescerende virus (TRPV; lichter grijs) uiten vroeg Venus, intermediaire mCherry, en late TagBFP of promotor-minder Venus (PLV; donkerder grijs) worden gebruikt in drievoud kolommen. 1-β-D-arabinofuranosylcytosine (AraC), isatine β-thiosemicarbazon (IBT), Rifampicine, ST-246 en DMSO controle over het voertuig met geteste concentratie worden vermeld op rechts. Klik hier voor grotere afbeelding.
Relatieve fluorescentie-eenheden (RFU) per herhaling werden genormaliseerd voor elk kanaal. Ten eerste, de gemiddelde fluorescentie intensiteit PLV putjes werd afgetrokken van de gemiddelde intensiteit van de TRPV putjes voor elke behandeling te verantwoorden achtergrondintensiteit bijgedragen door elk geneesmiddel. Vervolgens werd deze waarde gedeeld door de achtergrond afgetrokken gemiddelde intensiteit van DMSO behandelde TRPV putjes (wildtype groei). De verkregen na behandeling met bekende po resultatenxvirus remmers consistent met eerder gepubliceerde resultaten en hun duidelijk werkingsmechanisme. Het staken van de vroege gentranscriptie en overgang naar tussenliggende genexpressie is aangetoond dat DNA replicatie 17 vereisen. Consistent hiermee AraC, een remmer van DNA-replicatie, vertoonden een dramatische toename in de vroege genexpressie (210% DMSO behandelde vroege expressie, figuur 2) en een compleet gebrek aan intermediaire en late expressie (0,4% en 0,3% DMSO behandeld intermediaire en late expressie, respectievelijk Figuur 2). Hoewel het exacte werkingsmechanisme niet te IBT gedefinieerd, wordt gedacht dat read-through transcriptie bevorderen, wat resulteert in verhoogde hoeveelheden dsRNA activering van RNase L pathway en apoptose 18-20. In antwoord op IBT behandeling een steeds ernstiger fenotype werd waargenomen waarvan intermediaire en late expressie significant minder dan alleen DMSO (24,7%en 2,9% DMSO behandeld intermediaire en late expressie, respectievelijk Figuur 2). Een consistente, maar niet statistisch significante afname vroege fluorescentie werd waargenomen; maar dit is waarschijnlijk te wijten aan IBT-geïnduceerde apoptose op dit later tijdstip (74,0% DMSO bij 18 hpi). In tegenstelling tot AraC en IBT, het pokkenvirus drugs ST-246 en Rifampicine beide remmen na late genexpressie tijdens virion montage en rijping 15,16. Geen veranderingen in genexpressie waargenomen in alle stadia wanneer cellen werden behandeld met ST-246 (100,9%, 98,5% en 94,5% DMSO behandeld vroeg, intermediaire en late expressie, respectievelijk figuur 2) of Rifampicine (107,6%, 104,2% en 106,5% DMSO behandelde vroege, intermediaire en late expressie, respectievelijk).
Historisch gezien, een combinatie van lage MOI (0,01-0,1 PFU / cel) en hoog MOI (5-10 PFU / cel) groei assays worden gebruikt bij het verkennen van het remmende effect van een nieuwe kleine molecuul of virus mutant. Bij een lage MOI, zijn algemeen remmende effecten vaak overdreven door zelfs kleine remming aangezien slechts een subset van cellen eerst geïnfecteerd. Wanneer het proberen om het punt tijdens een infectie cyclus waarop een virus wordt geremd definiëren, een hoog MOI infectie is waarschijnlijk meer geschikt, omdat alle cellen geïnfecteerd door uw primaire inoculum. De in figuur 3 experiment werd uitgevoerd zoals in figuur 2 met de toevoeging van een reeks putjes die werden geïnfecteerd bij een lagere MOI = 1. Als inhibitor die post-transcriptioneel functioneert, moet ST-246 laat enkel stadium van genexpressie ; het is echter duidelijk dat wanneer slechts een ondergroep van cellen infected (Figuur 3, MOI = 1) er blijkt remming van alle fasen van expressie (38,4%, 48,9% en 52,9% DMSO tegenover 100,9%, 98,5% en 94,5% voor MOI = 1 vs MOI = 10 infectie niveau van vroege, intermediaire en late expressie, respectievelijk figuur 3). Uitgaande van 100% remming van rijpe virion vorming van ST-246, betekent dit 100% van de cellen geïnfecteerd door de MOI = 10 infecties, en ergens tussen 50 en 70% van de cellen werden geïnfecteerd productief in de MOI = 1 infectie.
Figuur 3. Effect van infectie niveau schijnbare ST-246-remming. HeLa-cellen geïnfecteerd zoals in figuur 2 met zowel hoge (MOI = 10) en lage (MOI = 1) TRPV behandeld met ST-246. Relatieve fluorescentie-eenheden (RFU; achtergrond afgetrokken elk kanaal op basis van on PLV groei voor elke behandeling en genormaliseerd tot TRPV + DMSO) voor vroege (groen), tussenproduct (rood) en late (blauw) virale expressie in cellen geïnfecteerd met ofwel MOI = 1 of MOI = 10 en behandeld met 20 uM ST- 246. Klik hier voor grotere afbeelding.
| Naam | Beschrijving | Ref. |
| TRPV | Triple virus; C11R (Vroege) gepromoot Venus, G8R (Intermediate) gepromoot mCherry, F17R (Late) gepromoot mTagBFP | 7 |
| PLV | Promotor-minder Venus | |
| EV | C11R (Vroege) gepromoot Venus | |
| IV | G8R (Intermediate) gepromoot Venus | |
| LV | F17R (Late) gepromoot Venus | |
| IRev | G8R (Intermediate) gepromoot mCherry en C11R (Vroege) gepromoot Venus | |
| LREV | F17R (Late) gepromoot mCherry en C11R (Vroege) gepromoot Venus | |
| LR | F17R (Late) gepromoot mCherry | |
| mCherry-A4L | N-terminale fusie van de VENUS fluorofoor aan de late uitgedrukt virale kernproteïne A4L |
Tabel 1. Lijst van vacciniavirus reporter stammen. Tabel beschrijven fluorescentie reporter virussen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier hebben we het praktisch gebruik van een multi-stage vaccinia reporter virus (TRPV), die reproduceerbaar, real-time feedback maatregelen virus replicatie biedt beschreven. Door het gebruik van goed gedefinieerde pokkenvirus remmers, waren we in staat aan te tonen dat TRPV reageert op een wijze die in overeenstemming met de begrepen werkingsmechanisme voor elke remmer. Terwijl de TRPV virus biedt de meest uitgebreide informatie over virus fase progressie tweetraps (iRev, LREV) en eentraps (ES, IV, LV) virussen kunnen ook worden eveneens gebruikt, gebruik te maken van de optimale eiwitvouwing, stabiliteit, en superieure signaal-ruisverhouding van het Venus fluorofoor.
De proof-of-concept assay in dit protocol geeft de haalbaarheid van het identificeren de fase van virale genexpressie uitgevoerd door bekende remmers pokkenvirus in een eenvoudige, high throughput assay plaat. Deze test kan worden uitgebreid om een snelle, uitgebreide screening voltooienonbekende chemische bibliotheken ook. De virussen kunnen worden gebruikt om kleine moleculen behandelde cellen infecteren lage MOI, waardoor de specifieke identificatie van verbindingen die elk stadium van de virale levenscyclus blokkeren. De remmers kunnen vervolgens worden gescreend met TRPV bij verschillende MOI bepalen het stadium van de levenscyclus virus geremd, from entry (geen genexpressie), vroege, intermediaire of late genexpressie of verzameling (volledige genexpressie maar virusverspreiding). Wij hebben deze techniek succesvol identificeren van een nieuwe anti-pokkenvirusdeeltje remmer met activiteit tegen diverse pokkenvirussen, zoals Apenpokken 8.
Terwijl we gegevens hebben verstrekt voor het gebruik van deze virussen in een plaat-reader-formaat, het is even goed geschikt voor microscopisch onderzoek. Infectie en observatie via fluorescentie microscoop (zie figuur 2B) maakt een cel per cel onderzoek van virale progressie fase, die nuttig kunnen zijneen gemengde celkweek instelling, zoals infectie van een weefsel, of virale of bacteriële co-infectie omstandigheden. Bovendien, terwijl deze virussen werden gemaakt voor het doel van antivirale screening 8, verwachten wij ze van gelijke nut in fundamenteel onderzoek zijn levenscyclus van vacciniavirus. Bijvoorbeeld, kunnen deze virussen eenvoudig worden aangepast met behulp van traditionele technieken ontberen of overexpressie virale eiwitten; de kinetiek van het virus genexpressie en verspreiding kunnen dan worden gevolgd in real time voor alle stadia van de virale transcriptie.
Onderzoeken interactie virus-gastheer kan profiteren van het gebruik van deze reporter virussen ook. Deze verslaggevers laten snelle identificatie van het stadium van de virale replicatie voltooid tijdens infectie van niet-tolerante soorten cellen, zoals bepaalde primaire cellijnen, perifeer bloed leukocyten, of uiteenlopende soorten 21,22. Informatie verzameld uit het gebruik van dezegereedschap zou onze kennis van pokkenvirus gastheertraject beperking factoren en de functie van virale immuno-modulerende eiwitten bevorderen. De virussen ook nuttig zijn om de fase van virusreplicatie geremd door knockdown van gastheerfactoren vereist voor infectie, hetzij in een hele genoom schaal beginscherm of in een gerichte kleine bibliotheekscherm identificeren.
Verschillende stappen in dit protocol moet kritisch worden overwogen wanneer beginnen deze virussen te gebruiken in een nieuw systeem. Verschillen in plaat-formaat, groeimedia en celtype mogelijk dat naar aanleiding van MOI, inenting tijd, of incubatieduur vereisen. Het wordt vooral belangrijk eindpunt incubatietijd optimaliseren voordat opschaling naar hoog-formaat. Om het ideale incubatietijd te bepalen, moet een piloot kinetische plaat test worden uitgevoerd (zie stap 5). Tijdens een kinetische assay worden fluorescentiemetingen per uur Bij 12-24 uur en kunnen worden gebruikt om de tijd te wijzen waarop de grdaarvan eet verschil wordt waargenomen tussen controle en behandeling virus expressie. Het belang van deze stap kan worden gezien in behandeling IBT, waarbij remming door verhoogde tarieven van apoptose leiden tot een duidelijke, maar niet statistisch significante afname in het begin van expressie. Als de eerdere tijdstippen (4-8 hpi) waargenomen er waarschijnlijk geen waarneembaar verschil zou zijn. Verder testen van een nieuwe remmende verbinding moet ook verschillende concentraties verbinding. Hoewel deze fluorescentie reporter virussen zijn in staat om minimale veranderingen in genexpressie te detecteren, kan de aanvullende informatie door meerdere concentraties leiden tot een beter begrip van hun totale effect.
Bij de planning en het creëren van deze virussen is veel zorg besteed aan het selecteren van fluoroforen die hoge signaal-achtergrondkenmerken 7 hebben. De Venus eiwit werd als significant beter dan alle andere geteste fluor geïdentificeerdophore, en daarom werd gebruikt in de ontwikkeling van drie-, twee-, en enkele fluorescerende reporter virussen. Een beperking bij het gebruik van deze fluorofoor is dat het niet kan worden gebruikt om een cellijn al groen fluorescerend reporter fusie-eiwit dat infecteren. Om analyse te pakken onder deze omstandigheden werden verschillende alternatieve virussen gemaakt met rood fluorescerende eiwitten (tabel 1). Met het uitspreken van ofwel oplosbaar mCherry van de F17R late promotor of een mCherry-A4L fusie-eiwit van de natuurlijke A4l late promotor zijn we in staat met vergelijkbare metingen te bereiken zonder Venus. Hoewel het gebruik van mCherry niet over het extra voordeel door de Venus eiwit zijn we nu in staat om de meting te ontvangen in groene expressie cellijnen.
Samengevat, hebben we een reeks reporter vaccinia-virussen met verschillende toepassingen, waaronder hoog-plaatlezer of een hoog imaging assa ontwikkeldys. Deze virussen zullen onderzoek van de virale levenscyclus veel sneller dan traditionele methodes, en kan worden gebruikt voor basis wetenschap als toegepast antivirale onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen en er geen patenten zijn aangevraagd voor virussen of screeningsmethoden.
Acknowledgments
Wij danken SIGA Technologies (Corvallis, OR) voor het verstrekken van ST-246. DKR werd ondersteund door een NIH opleiding subsidie in immunologie aan de Universiteit van Boston (5T32AI 7309). Dit werk werd mede ondersteund door P41 086.180, NIH RO1AI1096159-01, en RO3 (tot JHC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 | |
| Fetal Bovine Serum - Optima, Heat Inactivated (FBS) | Atlanta Biologicals | S12450H | |
| 200 mM L-Glutamine, (L-glut) | Gibco | 25030-081 | |
| 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3603 | |
| 384 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3712 | |
| Trypsin, 2X, Sterile, Irradiated | Worthington Biochemical Corp. | TRLVMF | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Dimethyl Sulfoxide, Cell Culture (DMSO) | American Bioanalytical | AB03091 | |
| 1-β-D-Arabinofuranosylcytosine (AraC), MW= 280 g/mol | SigmaAldrich Co | C6645 | |
| isatin β -thiosemicarbazone (IBT), MW= 234 g/mol | Fisher Scientific | NC9075202 | |
| Rifampicin, MW= 823 g/mol | SigmaAldrich Co | R3501 | |
| ST-246, MW= 376 g/mol | SIGA Labs, Corvallis, OR | ||
| 8% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| TempPlate RT optically clear film | USA Scientific | 2978-2700 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 |
References
- Yen, J., Golan, R., Rubins, K. Vaccinia virus infection & temporal analysis of virus gene expression: part 1. J Vis Exp. 26 (26), (2009).
- Hansen, S. G., Cope, T. A., Hruby, D. E. BiZyme: a novel fusion protein-mediating selection of vaccinia virus recombinants by fluorescence and antibiotic resistance. BioTechniques. 32 (5), 1182-1187 (2002).
- Popov, S., Mirshahidi, S., Essono, S., Song, R., Wang, X., Ruprecht, R. M. Generation of recombinant vaccinia viruses via green fluorescent protein selection. DNA and Cell Biology. 28 (3), 103-108 (2009).
- Bartee, E., Mohamed, M. R., Lopez, M. C., Baker, H. V., McFadden, G. The addition of tumor necrosis factor plus beta interferon induces a novel synergistic antiviral state against poxviruses in primary human fibroblasts. Journal of Virology. 83 (2), 498-511 (2009).
- Ward, B. M., Moss, B. Visualization of intracellular movement of vaccinia virus virions containing a green fluorescent protein-B5R membrane protein chimera. Journal of Virology. 75 (10), 4802-4813 (2001).
- Johnson, M. C., Damon, I. K., Karem, K. L. A rapid, high-throughput vaccinia virus neutralization assay for testing smallpox vaccine efficacy based on detection of green fluorescent protein. Journal of Virological Methods. 150 (1-2), 14-20 (2008).
- Dower, K., Rubins, K. H., Hensley, L. E., Connor, J. H. Development of Vaccinia reporter viruses for rapid, high content analysis of viral function at all stages of gene expression. Antiviral Research. 91 (1), 72-80 (2011).
- Dower, K., et al. Identification of a pyridopyrimidinone inhibitor of orthopoxviruses from a diversity-oriented synthesis library. Journal of Virology. 86 (5), 2632-2640 (2012).
- De Clercq, E. Clinical Potential of the Acyclic Nucleoside Phosphonates Cidofovir, Adefovir, and Tenofovir in Treatment of DNA Virus and Retrovirus Infections. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 569-596 (2003).
- Prichard, M. N., Kern, E. R. Orthopoxvirus Targets for the Development of New Antiviral Agents. Antiviral Research. 10, (2012).
- Fenner, F. A successful eradication campaign. Global eradication of smallpox. Reviews of Infectious Diseases. 4 (5), 916-930 (1982).
- Breman, J. G., Henderson, D. A. Poxvirus dilemmas--monkeypox, smallpox, and biologic terrorism. The New England. Journal of Medicine. 339 (8), 556-559 (1998).
- Baker, R. O., Bray, M., Huggins, J. W. Potential antiviral therapeutics for smallpox, monkeypox and other orthopoxvirus infections. Antiviral Research. 57, 1-2 (2003).
- Rimoin, A. W., et al. Major increase in human monkeypox incidence 30 years after smallpox vaccination campaigns cease in the Democratic Republic of Congo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 107 (37), 16262-167 (2010).
- Sodeik, B., Griffiths, G., Ericsson, M., Moss, B., Doms, R. W. Assembly of vaccinia virus: effects of rifampin on the intracellular distribution of viral protein p65. Journal of Virology. 68 (2), 1103-1114 (1994).
- Grosenbach, D. W., Jordan, R., Hruby, D. E. Development of the small-molecule antiviral ST-246 as a smallpox therapeutic. Future Virology. 6 (5), 653-671 (2011).
- Broyles, S. S.
- Condit, R. C., Niles, E. G. Regulation of viral transcription elongation and termination during vaccinia virus infection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and Expression. 1577 (2), 325-336 (2002).
- Díaz-Guerra, M., Rivas, C., Esteban, M. Inducible expression of the 2-5A synthetase/RNase L system results in inhibition of vaccinia virus replication. Virology. 227 (1), 220-228 (1997).
- Cohrs, R. J., Condit, R. C., Pacha, R. F., Thompson, C. L., Sharma, O. K. Modulation of ppp(A2’p)nA-dependent RNase by a temperature-sensitive mutant of vaccinia virus. Journal of Virology. 63 (2), 948-951 (1989).
- Sánchez-Puig, J. M., Sánchez, L., Roy, G., Blasco, R. Susceptibility of different leukocyte cell types to Vaccinia virus infection. Virology Journal. 1 (1), (2004).
- Bengali, Z., Satheshkumar, P. S., Yang, Z., Weisberg, A. S., Paran, N., Moss, B. Drosophila S2 cells are non-permissive for vaccinia virus DNA replication following entry via low pH-dependent endocytosis and early transcription. PLoS One. 6 (2), (2011).
