Introduction
Los estudios genéticos en los organismos vivos utilizan con frecuencia el embrión de pollo como modelo porque en la electroporación in ovo representa un modo rápido y barato para transfectar parcialmente estructuras embrionarias in vivo con construcciones de ADN 1-5. Vectores de expresión bicistrónicos que codifican una transcripción que contiene un indicador fluorescente junto con el gen de interés, tales como pCIG 6 o 7 PMES, permiten una rápida verificación de la calidad de la transfección en la región deseada bajo un estereomicroscopio embriones antes de procesar para el análisis de aguas abajo.
Con los recientes avances en la secuenciación del ADN, ahora es posible obtener los perfiles de expresión del transcriptoma enteros digitales a partir de muestras de ARN usando ARN-Seq 8,9. Por lo tanto, en lugar de los métodos que requieren mucho tiempo que permiten el análisis de los pocos productos de genes en paralelo, tales como la hibridación in situ, inmunohistoquímica y qPCR, preparación de bibliotecas de ADNc parasecuenciación de alto rendimiento puede proporcionar información de todo el transcriptoma. La observación de los efectos experimentales sobre los niveles de expresión de cada gen puede a su vez proporciona una visión de gran alcance en las vías alteradas por la construcción utilizada. Esto es particularmente fácil si un conjunto genómico para el organismo utilizado está disponible, por lo tanto el embrión de pollo de nuevo es un modelo adecuado.
Si el usuario tiene acceso a un centro de secuenciación del genoma fiable, la cuestión principal es la obtención de muestras de ARN de alta calidad. Este trabajo demuestra un método para la obtención de muestras de ARN a partir de tubos neuronales transfectadas adecuadas para la RNA-Seq, así como los pasos aguas abajo para análisis in silico de los conjuntos de datos resultantes. Después de la electroporación en HH12-13 seguido de 48 horas de incubación, tronco transfectadas mitades de la médula espinal fueron disecados en condiciones libre de ribonucleasa, inmediatamente zadas y más protegidos de la degradación por la ultra-bajo de congelación hasta la purificación de ARN y la biblioteca preparatde iones.
El servidor público de la galaxia 10 proporciona acceso a recursos gratuitos para el análisis de datos de secuenciación de alto rendimiento. La cantidad de espacio que ofrece a los usuarios registrados es suficiente para pequeños experimentos, eliminando así la necesidad de una infraestructura computacional local. Análisis de datos RNA-Seq incluye filtrado, la alineación y la cuantificación / comparación de la expresión génica. Aunque existen pautas generales para el análisis de datos RNA-Seq, parámetros de filtrado dependerá en gran medida de la calidad de la secuencia y se deben determinar después de un análisis de control de calidad de los datos en bruto.
Este protocolo describe los pasos para obtener y comparar los perfiles de ARN-Seq de pollo embrionario médulas espinales transfectadas in vivo. Como un resultado representativo, la comparación de conjuntos de datos obtenidos a partir de dos muestras de control independientes transfectadas con un vector vacío mostró que el método es reproducible y debería permitir la identificación de expres diferencialmentetranscripciones de sed en las muestras experimentales. Por lo tanto, la aplicación de este método tiene el potencial de aumentar enormemente el número de descubrimientos después de un solo experimento y por lo tanto proporcionar un conjunto grande de datos para la investigación posterior.
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Protocol
1. electroporar la construcción de interés en los tubos neurales de HH12-13 pollo embriones in ovo
Utilice un indicador fluorescente, preferiblemente en una transcripción bicistrónico o fusionado a la proteína de interés con un intercalante péptido 2a viral 11, para permitir la identificación rápida de los individuos con niveles satisfactorios de la transfección. NOTA: El tiempo de incubación típico para esta etapa es de alrededor de 48 horas a 37,8 ° C.
- Abrir una pequeña ventana en los huevos después de la eliminación de 3 ml de albúmina con una jeringa acoplada a un 18 G x 1 1/2 aguja. Para mejorar la visualización de embriones, inyectar una pequeña cantidad de tinta china diluida 1:50 en solución de Ringer estéril debajo del embrión 1-4.
- Después de cubrir el embrión con solución de Ringer estéril, inyectar una solución mM Tris-HCl 10, pH 8.2 y 0.1% del tinte de Alimentos (F, D & C) que contiene 2,5 g / l de ADN a través del extremo posterior del tubo neural hasta que llenahasta la región posterior del cerebro. Para electroporar, electrodos de platino de posición (0.5 mm de diámetro) separados por 4 mm 1 a lo largo de la región de flanco 5 y entregar pulsos de 50 ms y 20 V con un intervalo de 100 mseg entre ellos 4.
- Después de la electroporación, se incuban los embriones manipulados durante 48 horas más hasta que llegan a la etapa HH23 y identificar a las personas que presentan alto nivel de transfección en la región del flanco bajo un microscopio estereoscópico fluorescente.
NOTA: La duración de la incubación después de la electroporación depende del objetivo del experimento. Los plásmidos electroporadas pueden generar niveles de expresión significativos después de 2 horas 2. Así, si el interés reside en genes de aparición temprana el período de incubación después de la electroporación puede ser reducido.
2. Cosecha transfectadas con éxito embriones y diseccionar las mitades de la médula espinal a electroporación
NOTA: Este procedimiento dura 2-3 horas por cada 10 embriones y los rendimientos de 1-2 RNA total g por embrión. La disección de los tubos neurales requiere movimientos finos y algunas sesiones de práctica puede ser necesario antes de aplicarlo a las muestras experimentales.
- Descontaminar las herramientas metálicas disección con RNasa solución de descontaminación o de hornear a 150 ° C durante 4 h 12 y preparar PBS tratada con DEPC. Utilice sólo recipientes de plástico nueva RNasa libre de certificado.
NOTA: Después de la cosecha, es importante seguir la atención estándar para prevenir la contaminación de ARNasa durante la disección. - Coseche los embriones utilizando un par de tijeras de disección finas y una cuchara colección tamizada. Mantener los embriones en PBS frío tratada con DEPC en un plato de Petri de 100 mm.
- Con un par de pinzas finas, cortar toda la región del flanco (entre el límite posterior de la yema del miembro anterior y el límite anterior de la yema de la extremidad posterior) y la transferencia de esta sección a un nuevo plato que contiene frío PBS tratada con DEPC.
- Utilice dos agujas finas de vidrio para perforar en tres diferentespuntos a cada lado dorsolateral del embrión entre el tubo neural y el mesodermo paraxial.
- Introducir las dos agujas de cristal en la perforación central y mover lentamente uno de ellos de distancia a lo largo del eje antero-posterior del tubo neural. Repita esto para las perforaciones que no fueron alcanzados por los primeros movimientos. Retire el mesodermo paraxial unifamiliar con un par de pinzas finas.
- Gire el embrión de lado, insertar las puntas de las pinzas entre el tubo neural y la notocorda y deslice en direcciones opuestas a lo largo del eje antero-posterior para separar las dos estructuras.
NOTA: Esto también se debe eliminar la mayor parte del mesodermo todavía unido al tubo neural. - Si es necesario, retire todos los trozos más grandes de tejido mesodérmico que permanecen unidas tirando con un par de pinzas, mientras sujeta ligeramente el tubo neural con otro par de pinzas. Cuando haya terminado, transferir suavemente el tubo neural a otro plato que contiene fría tratada con DEPC PBS utilizando unaRNasa libre Pasteur de vidrio pipeta acoplado a una bomba de pipeta manual y mantener en hielo hasta que se diseccionan todos los tubos.
- Divida a los tubos neurales en dos mitades. Para ello, inserte la punta afilada de un par de pinzas de cierre en el lumen y abra la chapa de techo moviendo las pinzas a través de ella. Después de esto, separe las mitades por el corte de la placa de suelo con las puntas de pinzas.
- Ordenar electroporación de mitades no electroporación bajo un microscopio de disección fluorescente y la transferencia a un tubo de 1,5 ml lleno con PBS tratada con DEPC enfriado con hielo. Si es necesario, chasquear los microtubos suavemente para liberar cualquier tejido unido a las paredes de plástico y para promover la sedimentación de los tubos.
- Centrifugado a 100 xg durante 3 segundos y retirar muy lentamente tanto PBS como sea posible con una micropipeta de 1 ml. Haga esto mientras mira a una fuente de luz que brilla a través del microtubo para monitorear si cualquier material embrionario se aspira a la punta de la pipeta; si esto sucede, se descargan lentamente y repita la centrifugación.
- Añadir 70 l de solución de lisis para la extracción de ARN por medio de tubo neural y la película del tubo para mezclar el contenido. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min y agitar vigorosamente. Repetir la incubación de 5 min y agitación en vórtex dos veces más. Almacenar a -80 ° C.
- Recoge al menos ocho mitades del tubo neural por muestra para asegurar un rendimiento adecuado para el siguiente paso. Reúnase muestras más pequeñas si se requieren varias sesiones de electroporación / disección amasar número suficiente de tubos neurales. Almacene las muestras suficientes para duplicados o triplicados para cada condición.
3. Purificar ARN y Preparar Bibliotecas para Illumina secuenciación
- Retire las muestras de -80 ° C almacenamiento y colocar en hielo durante 15-30 min. Reanudar la descongelación a temperatura ambiente hasta que se complete.
- Vortex bien y dejar a temperatura ambiente durante 5 min. Vortex de nuevo y se centrifuga a 15.000 xg durante 1 min para sedimentar el material insoluble.
- Transferir el sobrenadante a un tubo nuevoy proceder a la extracción de RNA de acuerdo con las instrucciones de aislamiento de ARN total del manual del kit. Eluir en el volumen mínimo recomendado para aumentar la concentración.
NOTA: después de tratamiento DNasa limpieza se recomienda con el fin de evitar la contaminación potencial de secuencias de ADN genómico en los conjuntos de datos de RNA-Seq. - Flick el tubo para mezclar el contenido y eliminar 5 l para el análisis de control de calidad. Conservar la muestra restante a -80 ° C hasta que la preparación de la biblioteca; estas muestras deben descongelarse sólo una vez para evitar la degradación del ARN.
- Ejecutar ARN purificado en un instrumento Bioanalyzer utilizando el kit RNA 6000 Nano; RIN valor debe ser al menos por encima de 7 para continuar.
- Generar bibliotecas utilizando un kit de preparación de la biblioteca de ARN-Seq compatible Illumina y multiplexar hasta 4 bibliotecas en un carril de un instrumento HiSeq configurar para generar 100 pb solo lee. Si es posible, incluir todas las muestras en el mismo plazo para reducir al mínimo los posibles artefactos técnicos.
NOTA: Esto debería producir hasta 50 millones de rEADS por muestra, lo cual es más que suficiente para obtener la cobertura para la mayoría de los genes 13.
4. Comparación de conjuntos de datos de RNA-Seq en el servidor de la galaxia público 10.
NOTA: el espacio de almacenamiento del servidor está limitada y experimentos que comparan muchas muestras puede requerir la eliminación de los archivos intermedios generados en los pasos de filtrado.
- Crear una cuenta de usuario en el servidor público de la galaxia ( https://usegalaxy.org ) y FTP subir los conjuntos de datos en formato de Illumina FASTQ.
- Preparar los archivos cargados con la herramienta FastqGroomer 14 bajo la NGS: menú de control de calidad y la manipulación; si las puntuaciones de calidad ya están codificados en Phred + 33 (Sanger), omita este paso, simplemente cambiando el tipo de archivo a fastqsanger bajo los atributos de cada conjunto de datos.
- Analizar la calidad general de cada conjunto de datos utilizando la herramienta de FastQC bajo la NGS: QC y la manipulación menu.
NOTA: Especial atención se debe dar a los gráficos resultantes para cada secuencia de bases de la calidad y por base el contenido de la secuencia, ya que éstos proporcionarán estimaciones de los parámetros que se utilizan para recortar los extremos de las lecturas. - Recortar lee descartar 3 'termina con datos de baja calidad utilizando la herramienta FASTQ Calidad Trimmer 14 bajo la NGS: menú de control de calidad y la manipulación. Ajuste la herramienta para procesar sólo 3 'termina para el nivel de calidad por debajo de 20.
- Retire secuencias adaptadoras de lee con la función Clip ( http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ ) bajo la NGS: menú de control de calidad y la manipulación. Ajuste la herramienta para descartar lee con menos de 45 pb a la izquierda, la entrada de la secuencia del adaptador utilizado y elija el resultado de incluir ambas secuencias recortadas y no recortadas. Además, optar por no descartar las secuencias con bases desconocidos desde la mayoría de las bases de baja calidad ya fueron retirados en el último paso. Con la herramienta Recortar secuencias ( http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ ) bajo la NGS: control de calidad y el menú de la manipulación, corte las primeras bases de las lecturas para eliminar 5 'sesgo de secuencia detectada por FastQC (típicamente 10).
NOTA: En este punto, es una buena idea ejecutar FastQC de nuevo y comparar con el análisis previo para determinar si la calidad de conjunto de datos se ha mejorado. - Descargar y descomprimir la última asamblea del genoma de pollo para la UCSC genoma navegador de Illumina iGenomes ( http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn ) y cargar el archivo en formato fasta todo el genoma y el archivo de formato gtf genes anotación a la historia de la galaxia con la función de carga de archivos en el menú Obtener datos.
- Mapa lee para cada muestra que el genoma de pollo usando el alineador TopHat2 15 bajolos NGS: menú Análisis de ARN. Elija utilizar un genoma de Historia (seleccione el archivo fasta cargado en el paso 4.7).
- Construir un transcriptoma predicho para cada muestra usando Gemelos 16 bajo los NGS: menú de análisis de ARN. Elija utilizar la anotación de referencia como guía (seleccione el archivo gtf cargado en el paso 4.7) y encender las opciones Realizar sesgo de corrección (de la Historia, archivo fasta desde el paso 4.7) y uso correcto de lectura múltiple.
- Combinar transcriptomas previstos para todas las muestras utilizando Cuffmerge 16 bajo la NGS: menú Análisis de ARN. Elija utilizar la anotación de referencia (archivo gtf desde el paso 4.7) y datos de la secuencia (de Historia, archivo fasta desde el paso 4.7).
- Comparar archivos BAM generados por TopHat2 para cada muestra usando Cuffdiff 16 bajo la NGS: menú Análisis de ARN. En las transcripciones de campo seleccione el metranscriptoma rged generada por Cuffmerge y activar las opciones Realizar sesgo de corrección (de la Historia, archivo fasta desde el paso 4.7) y uso correcto de lectura múltiple.
- Ordenar expresión diferencial probar tablas numérico ascendente en la columna 13 (valor q) utilizando la herramienta Ordenar debajo del filtro y el menú Ordenar.
NOTA: Los genes / transcripciones muestran significativa expresión diferencial entre las condiciones experimentales se presentarán los valores q más bajos. - Para comprobar los resultados visualmente con gráficos de cobertura, primero convertir archivos a formato BAM bedGraph utilizando la herramienta Crear un BedGraph de cobertura del genoma 17 bajo el menú BEDTools. Desactivar la presentación de informes de las regiones sin cobertura, optar por tratar las entradas empalmados como intervalos distintos y la escala de la cobertura por un factor que normaliza profundidad secuenciación de todos los conjuntos de datos que se comparan.
- Convertir el archivo bedGraph resultante a formato utilizando el pez gordoherramienta peluca / BedGraph-a-pez gordo ( http://www.genome.ucsc.edu/ ) en el menú Formatos convertir. Sube los archivos bigwig como pistas personalizadas en la UCSC genoma navegador ( http://www.genome.ucsc.edu/ ) para el montaje galGal4 y la búsqueda de un gen de interés para visualizar la cobertura en los conjuntos de datos.
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Representative Results
Para validar el método descrito, dos muestras de control se generan a partir de embriones a electroporación con las PME vector vacío 7 y una muestra a partir de embriones transfectadas con el mismo vector que contiene el inserto construir SCRT2-ZNF, que codifica los dominios de dedos de zinc de 18 SCRT2 pollo. Las muestras que producen ARN total 11-22 mg cada se obtuvieron de las piscinas de 8 a 12 embriones. Las tres muestras se calificó como un valor óptimo de RIN 10 en un control de calidad realizado con el instrumento Bioanalyzer (Figura 1), lo que demuestra que el ARN de alta calidad se puede obtener con este protocolo.
Después de la secuenciación, el proceso de filtrado descrito aumentó la tasa de alineación 83 a 91% de lecturas (datos no presentados). Como era de esperar, la comparación de los transcriptomes de dos muestras de control no mostró ninguna diferencia clara cuando se compara a nivel mundial en un gráfico de dispersión (Figura 2) y el coeficiente de correlación de Pearson fue 0.99. Además, la visualización de la cobertura de todos los tres conjuntos de datos a lo largo del locus que contiene la porción de la secuencia SCRT2 mostraron un claro aumento en el número de lecturas mapeado en esta región en la muestra experimental (Figura 3), indicando que la sobreexpresión se éxito y que las diferencias entre el control y las muestras experimentales deben ser detectables con el método descrito aquí.
Figura 1:. El control de calidad del ARN Bioanalyzer electroferogramas mostrando alto nivel de integridad de las muestras de ARN total de dos de control indicadas por los picos de ARN ribosomal 18S y 28S. Inserciones representan un gel virtual para la carrera.
Figure 2:. reproducibilidad de los resultados de cuantificación de ARN-Seq gráfico de dispersión que muestra que RPKM para la mayoría de genes es la misma en ambas muestras de control. Virtualmente todos los genes que no siguen este patrón tienen valores muy bajos RPKM y por lo tanto suelen ser ignorados de comparaciones transcriptoma.
Figura 3: La visualización de las diferencias en una muestra experimental pantalla UCSC Genome Browser del locus SCRT2 en el genoma de pollo (galGal4) que muestra un visible aumento en la cobertura de la región que codifica para la proteína de dominio (SCRT2-ZnF) expresan ectópica en el. muestra experimental.
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Discussion
Aquí proporcionamos directrices para el análisis de los efectos después de la electroporación de la gallina de la médula espinal. Aunque la electroporación de vectores de ADN se utiliza con más frecuencia para sobreexpresar un gen de interés, se puede también utilizar construcciones que codifican dominantes negativos, proteínas o precursores para quimeric siRNAs para generar las condiciones de la función de genes knock-down 19-21. De hecho, la comparación de los perfiles resultantes de transcriptoma tanto ganancia y análisis de la pérdida de función puede señalar genes expresados diferencialmente en sentidos opuestos en cada condición, teniendo así el potencial de descubrir efectos más específicos.
Como cualquier método aplicado aguas abajo para la extracción de RNA, la síntesis de bibliotecas de ARN-Seq requiere una cantidad mínima inicial de material de partida. Con este protocolo, 8 embriones deben ser suficientes para producir alrededor de 10 g de ARN total. Comenzando con un menor número de individuos sin comprometer una concentración de trabajo adecuada es probablementees posible con el uso de sistemas de extracción de RNA que permiten la dilución final en volúmenes más pequeños.
La segregación correcta del tubo neural de todo mesodermo se debe practicar un par de veces antes de aplicar a muestras importantes, ya que este es un paso delicado que requiere un poco de familiaridad. Para evitar la degradación del ARN excesiva durante el paso de la disección, también es importante completar todo el procedimiento para todos los tubos neurales en aproximadamente 1-2 horas. Una vez más, la práctica será importante para mejorar el tiempo de disección. Una observación importante es que la conexión entre los tejidos del mesodermo es más fuerte que la conexión entre el mesodermo y el tubo neural, tirando por lo tanto estructuras mesodérmicas, especialmente la notocorda, es más eficiente que intentando cortar el tejido no deseado. Además, los investigadores deben sentirse libres para desarrollar su propia técnica optimizada para sus propias condiciones de disección. Sin embargo, se debe tener cuidado para las muestras de comparación en un mismo experimento para ser diseccionado de manera similar para que level de contaminación con los tejidos mesodérmicos es lo más homogénea posible entre muestras.
Nuestro protocolo demuestra la comparación de los perfiles de transcriptoma del pollo estadio HH23 médulas espinales embrionarias transfectadas en la etapa HH12-13. Sin embargo, pequeños ajustes deben permitir su aplicación a los embriones cosechados en etapas anteriores. Por otro lado, si se desean etapas posteriores para el análisis del resultado final, los vectores bicistrónicos mencionados pueden no ser adecuados debido a una reducción continua en el número de moléculas por célula como avanza el desarrollo. Por lo tanto, especialmente si se alcanza el punto final deseado después de más de 72 horas después de la transfección, puede ser necesario el uso de vectores que codifican transposón mediada integración genómica de la construcción que se utiliza 22.
Otra cuestión a considerar es la heterogeneidad de la eficiencia de la electroporación. El número de células no transfectadas oscila entre unos pocos a un amo considerableunt, especialmente los que están en el tubo neural ventral. Dado que después de la disección todas las células se someten a análisis de aguas abajo, una baja eficiencia de la electroporación reducirá la sensibilidad del ensayo. Un enfoque para enriquecer la muestra con células sometidas a electroporación es el uso de células activadas por fluorescencia (FACS) para reducir la población de células no transfectadas de la muestra final 23. Si se utiliza un enfoque de este tipo, sin embargo, será necesario un mayor número de embriones para alcanzar el rendimiento suficiente para la preparación de biblioteca de ARN-Seq.
Se recomienda la secuenciación de Illumina, ya que esto es más ampliamente ofrecido por centros de secuenciación y análisis in silico de datos RNA-Seq se simplifica en comparación con otras plataformas disponibles 24. Sin embargo, otras opciones son aún adecuados con modificaciones en el filtrado de los datos de los pasos más adecuados para la plataforma elegida. ARN-Seq directrices de análisis de datos todavía no están completamente establecidos y comparación de las salidas from diferentes herramientas disponibles, algunos de los cuales ya están incluidos en el servidor público de la galaxia, es muy recomendable. Sin embargo, el análisis in silico descrito aquí debe ser adecuado para la obtención de buenos resultados de la comparación de conjuntos de datos de alta calidad. Al igual que en todas las otras áreas de la biología, de alto rendimiento de secuenciación aumenta enormemente la cantidad de información que se puede obtener a partir de un solo experimento, y el método descrito aquí es una manera de aplicarlo al estudio del desarrollo de la médula espinal.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Indian ink | Any supplier | ||
| 18G x 1 1/2 needle | BD | 305196 | |
| 3 ml syringe | BD | 309657 | |
| Tris | MP Biomedicals | 819620 | |
| F D & C Blue 1 | Spectra Colors Corporation | 5.FC.0010P0 | Food Dye used to visualize DNA injection |
| Ringer's solution (1 L) | |||
| - 7.2 g NaCl | Sigma-Aldrich | S-9888 | |
| - 0.37 g KCl | Sigma-Aldrich | P-4504 | |
| - 0.225 g CaCl2•2H2O | Fisher Scientific | 10043-52-4 | |
| - 0.217 g Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | S-9390 | |
| - 0.02 g KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| - ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.4 | |||
| - ddH2O to 1 L | |||
| - Filter and autoclave | |||
| PBS (Phosphate Buffered Solution) (1 L) | |||
| - 8 g NaCl | Sigma-Aldrich | S-9888 | |
| - 0.2 g KCl | Sigma-Aldrich | P-4504 | |
| - 1.15 g Na2HPO4•7H2O | Sigma-Aldrich | S-9390 | |
| - 0.2 g KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| - ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.2 | |||
| - ddH2O to 1 L and filter | |||
| - 1 ml DEPC (Diethylpyrocarbonate) | Sigma-Aldrich | D-5758 | |
| - Shake vigorously and let stand overnight at room temperature | |||
| - Autoclave | |||
| Sieved spoon | Any supplier | ||
| Sterile 60 x 15 mm polystirene Petri dishes | Corning Life Sciences | 351007 | |
| RNaseZap RNase decontamination solution | Life Technologies | AM9780 | |
| Fine point surgical scissors | Any supplier | ||
| Straight fine point tweezers | Any supplier | ||
| Pulled glass needle made from 1.1 x 75 mm glass capillary tubes | Kimble Chase | 40A502 | |
| 9'' glass Pasteur pipette | Any supplier | ||
| Manual pipette pump | Any supplier | ||
| Clear 1.5 ml microcentrifuge polypropilene tubes | Corning Life Sciences | MCT-150-C | |
| Microcentrifuge | Any supplier | ||
| RNAlater solution for RNA stabilization | Life Technologies | AM7020 | |
| RNAqueous total RNA isolation kit | Life Technologies | AM1912 | |
| Molecular Biology Grade Ethanol | Any supplier | ||
| RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2939AA | |
| Truseq RNA Sample Preparation Kit v2 | Illumina | RS-122-2001/RS-122-2002 |
References
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