Introduction
OVOエレクトロポレーションで部分的にDNAが1-5を構築して、in vivoでの胚の構造をトランスフェクトするための迅速かつ安価な方法を表しているので、ライブ生物に関する遺伝学的研究は、頻繁にモデルとしてニワトリ胚を使用しています。このようpCIG 6または7のPMEとして目的の遺伝子と一緒に蛍光レポーターを含むもの転写物をコードするシストロン性発現ベクターは、下流の分析のための胚を処理する前に、立体顕微鏡下で所望の領域でのトランスフェクションの質の迅速な検証を可能にする。
DNA配列決定における最近の進歩により、これは、RNA配列8,9を用いて、RNAサンプルからデジタル全トランスクリプトーム発現プロファイルを得ることが可能である。したがって、代わりにそのようなin situハイブリダイゼーション 、免疫組織化学および定量PCR、cDNAライブラリーの調製のためのように並列に少数の遺伝子産物の解析を可能にする時間のかかる方法のハイスループットシークエンシングは、全トランスクリプトームの情報を提供することができる。一つ一つの遺伝子の発現レベルに対する影響の実験的観察は、次に使用される構築物によって改変経路に対する強力な洞察を提供してもよい。使用される生物ゲノムアセンブリが利用可能である場合、これは、このように、ニワトリ胚を再度適切なモデルであり、特に容易である。
ユーザが信頼できるゲノム配列決定センターへのアクセス権がある場合、主な問題は、高品質のRNAサンプルを得ることである。この研究は、RNA-配列に適したトランスフェクトされた神経管、ならびに得られたデータセットのインシリコ分析における下流の工程からのRNAサンプルを得るための方法を示す。 48時間のインキュベーションに続いてHH12-13でエレクトロポレーション後、トランスフェトランク脊髄の半分は、リボヌクレアーゼを含まない条件下で解剖直後に溶解し、さらにRNA精製およびライブラリpreparatまで超低凍結による分解から保護されていたイオン。
ギャラクシー公開サーバ10は、ハイスループット配列決定データを分析するための空きリソースへのアクセスを提供する。登録ユーザーのために提供スペースの量は、このようにローカルな計算インフラの必要性を排除し、小規模な実験のために十分である。 RNA-配列データ解析、フィルタリング、整列および遺伝子発現の定量/比較を含む。 RNA-配列データ解析のための一般的なガイドラインがあるが、フィルタリングパラメータは、配列決定の品質に大きく依存し、生データの品質管理分析の後に決定されるべきである。
このプロトコルは、入手して、in vivoでトランスフェクトしたニワトリ胚性脊髄からRNA-配列プロファイルを比較する手順について説明します。代表的な結果として、空のベクターでトランスフェクトした二つの独立した対照試料から得られたデータセットの比較は、方法は、再現性があり、示差的EXPRESの同定を可能にするはずであることを示した実験試料におけるSEDの転写産物。従って、この方法の適用は大きく一つの実験後の発見の数を増加させ、したがって、その後の調査のために、大量のデータセットを提供する可能性を有する。
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Protocol
1.エレクトロポ卵内 HH12-13鶏胚の神経管への関心のコンストラクト
トランスフェクションの満足できるレベルを有する個体の迅速な同定を可能にするために、好ましくはシストロン性転写物に、蛍光レポーターを使用するか、またはインターカレーウイルス2Aペプチド11で目的のタンパク質に融合した。注：この段階のための典型的なインキュベーション時間は37.8℃で、周りの48時間である。
- ×1 1/2針18のGに結合された注射器でアルブミンの3ミリリットルを取り除いた後、卵に小さなウィンドウを開きます。胚の可視化を強化するために、胚1-4の下の滅菌リンゲル液中で1:50に希釈インド少量のインクを噴射する。
- 無菌のリンゲル液で胚をカバーした後、それが満杯になるまで神経管の後端を通しての2.5μg/μlのDNAを含む10mMのTris-HCl、pHが8.2と0.1％の食品色素（F、D＆C）溶液を注入後脳領域まで。 、腹部に沿って4ミリメートル1離れた位置の白金電極（直径0.5mm）をエレクトロポレーションし、それら4の間に100ミリ秒の間隔で5〜50ミリ秒のパルス及び20 Vを送達する。
- エレクトロポレーション後、彼らはステージHH23に達するまでより48時間操作された胚をインキュベートし、蛍光実体顕微鏡下に横腹領域において、トランスフェクションの高いレベルを提示する個人を識別する。
注：エレクトロポレーション後のインキュベーションの持続時間は、実験の目的に依存します。電気穿孔プラスミドは2時間2の後に有意な発現レベルを生成することができる。関心が早期発症遺伝子である場合にはこのように、電気穿孔後の潜伏期間を短縮することができる。
2.収穫が正常胚をトランスフェクトし、エレクトロポ脊髄の半分を解剖
注：この手順は、それぞれ10胚および利回りのために2〜3時間から続く1胚あたり-2μgの全RNA。神経管の解剖は、微細な動きを必要とし、いくつかの練習セッションは、実験試料に適用する前に必要になることがあります。
- のRNase汚染除去溶液で、または4時間12 150℃で焼成することにより、金属解剖ツールを除染し、DEPC処理PBSを準備します。唯一の新しい認定RNaseフリープラスチック製品を使用してください。
NOTE：収穫した後、それは切開中のRNaseの混入を防ぐために、標準治療に従うことが重要である。 - 細かい解剖ハサミと篩い分けコレクションスプーンを使って胚を収穫。 100ミリメートルペトリ皿に冷たいDEPC処理PBSに胚を保つ。
- 細かいピンセットで、（前部肢芽と後肢芽の前方限界の後方限界の間）全体腹部を切り出し、冷たいDEPC処理PBSを含む新しい皿にこのセクションを転送します。
- 異なる3で穿孔する2本の細いガラス針を使用して、神経管と近軸中胚葉の間の胚の各背外側側に指摘している。
- 中央穿孔2枚のガラス針を導入し、ゆっくりと神経管前後軸に沿ってそれらのいずれかを離れて移動。最初の動きが到達していなかった穿孔のためにこれを繰り返します。細かいピンセットで取り外した近軸中胚葉を削除します。
- 、横向きに胚を回し神経管と脊索の間ピンセットの先端を挿入し、二つの構造を分離する前後軸に沿って反対方向でそれらをスライドさせます。
注：これは、まだ神経管に取り付けられた中胚葉のほとんどを除去する必要があります。 - 必要であれば、軽くピンセットの別のペアで神経管を保持しながら、ピンセットで引っ張ることにより、付着したままで中胚葉組織のいずれかの大きな部分を削除します。終了したら、そっと用いた冷DEPC処理PBSを含む別の皿に神経管を転送RNaseフリーのガラスパスツールピペット手動ピペットポンプに結合され、すべての管を解剖するまで氷上に保つ。
- 2半分に神経管を分割。このために、内腔にピンセットの閉じたペアの鋭い先端を挿入し、それを介してピンセットを移動することにより、屋根板を開く。この後、ピンセットの先端で床板を切断して半分を分ける。
- 替えの氷冷DEPC処理PBSで満たし1.5mlチューブに蛍光解剖スコープと転送の下で非エレクトロポ半分からエレクトロポレーション。必要であれば、プラスチック壁に取り付けられた任意の組織を解放するために、チューブの沈降を促進するために穏やかにマイクロチューブをフリック。
- 3秒間100×gでスピンし、1mlのマイクロピペットで非常にゆっくりと、できるだけ多くのPBSを取り除く。どんな胚性物質がピペットチップに吸引されるかどうかを監視するためにマイクロチューブを通して輝く光源を見ながら、これを行う。これが発生した場合には、ゆっくりと放電しcentrifugaを繰り返する。
- 神経管の半分あたりのRNA抽出のための溶解液70μlのを追加し、内容物を混合するチューブをフリック。 5分間激しくボルテックス、室温でインキュベートする。 5分のインキュベーションを繰り返し、さらに2回ボルテックスする。 -80℃で保存してください。
- 次のステップのための十分な収量を確保するために、サンプルごとに少なくとも8神経管の半分を収集します。いくつかのエレクトロポレーション/切開セッションは神経管の十分な数を蓄積する必要がある場合に小さいサンプルをプールする。各条件について、重複や三連のために十分なサンプルを格納。
3. RNAを精製し、イルミナシーケンシング用のライブラリを準備
- -80℃の貯蔵からのサンプルを取り出し、15〜30分間氷上に置きます。完了するまで室温で解凍を再開します。
- 渦ウェルと5分間室温で残す。 1分間15000×gで再びボルテックスと遠心機は、不溶性物質をペレット化する。
- 上清を新しいチューブに移し、総RNA単離キット取扱説明書に従ってRNA抽出に進む。濃度を高めるために推奨される最小ボリュームで溶出する。
注：クリーンアップ後のDNase処理はRNA-配列のデータセット中のゲノムDNA配列の潜在的な汚染を回避するために推奨される。 - 内容物を混合し、品質管理分析のための5μlを除去するためにチューブをフリック。ライブラリの準備まで-80℃で残ったサンプルを保存する。これらの試料は、RNAの分解を避けるために一回だけ解凍されるべきである。
- RNA 6000ナノキットを使用して、バイオアナライザー機器で精製RNAを実行する。 RIN値は続行するには、少なくとも7以上でなければならない。
- イルミナ互換性RNA-のSeqライブラリ調製キットを使用してライブラリを生成し、単一の読み取りは100bpを生成するように設定HiSeq器具の1レーンに4図書館まで多重化する。可能な場合は、潜在的な技術的なアーティファクトを最小化するために、同じランですべてのサンプルが含まれています。
注：これは、最大5000万Rが得られるはずですほとんどの遺伝子13のカバレッジを得るために十分以上のものですサンプルあたりEADS、。
4.ギャラクシー公開サーバ10においてRNA-配列データセットを比較してください。
NOTE：Serverストレージスペースが限られており、多数の試料を比較する実験では、フィルタリングステップで生成された中間ファイルの削除を要求することができる。
- （ギャラクシー公開サーバにユーザーアカウントを作成しhttps://usegalaxy.org ）とFTPはFASTQ形式でイルミナデータセットをアップロードします。
- NGS下FastqGroomer 14ツールでアップロードされたファイルを準備します。QCと操作メニュー 。品質スコアが既にのPhred + 33（サンガー）でエンコードされている場合、単純に各データセットの属性の下fastqsangerにファイルの種類を変更することで、このステップをスキップします。
- NGSの下FastQCツールを使用して各データセットの一般的な品質を分析：QCと操作私をNU。
注：これらの読み取りの端部をトリミングするために使用されるパラメータの推定値を提供するように特別な注意が、塩基配列の質ごとおよび塩基配列の含有量の結果のグラフィックスに与えられるべきである。 - QCと操作メニュー：トリムがNGSの下にツールFASTQ品質トリマー 14を用いて低品質データで終わる3 'を破棄するように読み取ります。唯一の3 'が20以下の品質スコアのために終了処理するためのツールを設定します。
- クリップツール（使用して読み取ってから、アダプター配列を除去http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/を QCと操作メニュー：NGSの下）。左未満45 bpの、入力に使用されるアダプタのシーケンスで読み込んで破棄し、両方のクリッピングおよび非クリッピング配列を含むよう出力を選択するためのツールを設定してください。さらに、ほとんどの低品質の塩基は既に最後の工程で除去されたため、未知の塩基とのシーケンスを破棄しないように選ぶ。 ツールトリム配列 （使用してhttp://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ NGS下）：FastQCによって検出された5 '配列バイアス（通常は10）を除去するために読み込んでのQCと操作メニューを、最初の拠点をトリミング。
注：この時点で、それは再びFastQCを実行し、データセットの品質が向上したかどうかを判断するために以前の分析と比較することをお勧めします。 - ダウンロードして、イルミナiGenomesからUCSCゲノムブラウザの最新のニワトリゲノムアセンブリをアンパック（ http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn ）および全ゲノムFASTA形式ファイルと遺伝子注釈GTF形式のファイルをアップロードする銀河の歴史にGETデータ]メニューの下にツールのアップロードファイルを使用して。
- マップはTopHat2 15歳未満のアライナーを使用したニワトリゲノムに各サンプルについて読み取っNGS：RNA分析メニュー 。履歴からゲノムを使用することを選択し（ ステップ4.7でアップロードFASTAファイルを選択します）。
- RNA分析メニュー：NGSの下カフス 16を使用して、各サンプルの予測トランスクリプトームを構築します。 （歴史、 ステップ4.7からFASTAファイルから） バイアス補正を実行し、 正しいマルチリードを使用して、ガイドとして参照アノテーションを使用するかを選択します（ ステップ4.7でアップロードGTFファイルを選択します）とオプションをオンにしてください。
- RNA分析メニュー：NGSの下Cuffmerge 16を使用して、すべてのサンプルの予測トランスクリプトームをマージします。 （歴史、ステップ4.7からFASTAファイルから）とシーケンスデータ（ ステップ4.7からGTFファイル）参照アノテーションを使用するかを選択します。
- RNA分析メニュー：NGSの下Cuffdiff 16を用いて、各サンプルについてTopHat2によって生成されたBAMファイルを比較。分野では転写物は私を選択Cuffmergeによって生成されたトランスクリプトームをrgedと（歴史、 ステップ4.7からFASTAファイルから） バイアス補正を実行し、 正しいマルチリードを使用して、オプションをオンにします。
- ソート差動式はフィルターの下のツールを使って数値的にソート列13（q値）で昇順のテーブルをテストして、メニューをソートします 。
注：実験条件の間に有意な差発現を示す遺伝子/転写物は最も低いQ値を紹介します。 - カバレッジグラフで視覚的に結果を確認するには、最初のツールはBEDToolsメニューの下ゲノムカバレッジ 17 のBedGraphを作成し使用してbedGraph形式にBAMファイルを変換する。報道せずに地域の報告を無効にするには、明確な区間としてスプライスされたエントリを治療し、比較されているすべてのデータセットのためのシーケンシングの深さを正規化係数によってカバレッジを拡大することを選択した。
- 使用して大物形式に結果のbedGraphファイルを変換するツールウィッグ/ BedGraph·ツー·大物 （ http://www.genome.ucsc.edu/ ） 変換フォーマットメニューの下。 UCSCゲノムブラウザ（でカスタムトラックとして大物ファイルをアップロードhttp://www.genome.ucsc.edu/ galGal4アセンブリ用）とデータセット内のカバレッジを可視化するために目的の遺伝子を検索します。
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Representative Results
記載された方法を検証するために、2つの対照サンプルは、空のベクターのPME 7とインサートニワトリSCRT2 18のジンクフィンガードメインをコードSCRT2-ZNFの構築を含む同じベクターでトランスフェクトされた胚から1つのサンプルを用いてエレクトロポレーション胚から生成した。各11-22μgのトータルRNAを得た試料は、8〜12の胚のプールから得た。すべての3つのサンプルは、高品質のRNAがこのプロトコルを用いて得ることができることを実証し、バイオアナライザー機器（ 図1）を用いて行っ品質チェック10の最適RIN値を獲得した。
配列決定の後、記載され、フィルタ処理の読み取りの百分の83から91の配向率を増加させた（データは示さず）。予想されるように、全体的に比較した場合、二つの制御サンプルからのトランスクリプトームの比較は散布図には明確な差を示さなかった（ 図2）およびピアソン相関係数は0であった。99.さらに、SCRT2配列の一部を含んでいる軌跡に沿ってすべての3つのデータセットのカバレッジの表示が過剰発現したことを示す、実験サンプル（ 図3）で、この領域にマッピングされた読み取りの数の明確な増加を示した成功と対照および実験試料間の差は、ここで説明した方法で検出可能であるべきであること。
図1：RNAの品質管理バイオアナライザは、18Sおよび28SリボソームRNAピークによって示される2つの制御トータルRNAサンプルの完全性のための高いレベルを示す電気泳動図。挿入図は、実行のための仮想ゲルを表す。
Figu2 RE：。ほとんどの遺伝子のそれRPKMを示すRNA-のSeq定量結果の再現性散布図は、両方の対照試料においても同様である。このパターンに従わない実質的にすべての遺伝子が非常に低いRPKM値を有し、従って通常はトランスクリプトームの比較から無視されます。
図3：実験サンプルの違いの可視化タンパク質ドメイン（SCRT2-のZnF）をコードする異所的に発現した領域の報道で目に見える増加を示すニワトリゲノムにおけるSCRT2座（galGal4）のUCSCゲノムブラウザが表示されます。実験サンプル。
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Discussion
ここでは、鶏脊髄のエレクトロポレーション後の効果を分析するためのガイドラインを提供する。 DNAベクターのエレクトロポレーションは、より頻繁に目的の遺伝子を過剰発現するために使用されるが、一方はまた、遺伝子機能のノックダウン条件19-21を生成するために、siRNAのためのドミナントネガティブ、quimericタンパク質または前駆体をコードする構築物を使用することができる。実際、gain-及び機能喪失型分析の両方から得られるトランスクリプトームプロファイルの比較は、より特異的な効果を発見する可能性を有する、示差的に、各条件での反対の方法で発現する遺伝子を指摘することができる。
いずれかの方法は、RNA抽出を下流適用される場合、RNA-配列ライブラリーの合成は、出発物質の最小初期量を必要とする。このプロトコルで、8胚は約10μgの全RNAのをもたらすのに十分であるべきである。十分な作業濃度を損なうことなく、個人の小さい番号から始まることはおそらくあり小さい体積の最終希釈を可能にRNA抽出システムの使用で可能。
これはある程度の知識が必要なデリケートなステップであるように、すべての中胚葉から神経管の適切な分離は、重要なサンプルに適用する前に数回の練習をしなければならない。解離工程中に過度のRNAの分解を避けるために、約1〜2時間ですべての神経管の全体の手順を実行するためにも重要である。ここでも、練習は解剖時間を向上させることが重要になります。一つの重要な観察は、中胚葉組織の間の接続は、このようにして中胚葉構造、特別に脊索を引っ張って、中胚葉および神経管の間の接続よりも強い不要な組織を切断しようとするよりも効率的であることである。また、研究者は、自分の解剖条件に最適化された独自の技術を開発して自由に感じるはずです。ただし、注意がleveのように、同様に解剖しなければ同じ実験で比較したサンプルについて、注意が必要です中胚葉組織による汚染lのサンプル間の可能な限り均一である。
我々のプロトコルは、ステージHH12-13でトランスフェクトしたステージHH23のニワトリ胚性脊髄からトランスクリプトームプロファイルの比較を示しています。しかし、小さな調整は早い段階で収穫された胚への応用を可能にするはずである。後の段階は、最終結果の分析のために所望される一方、上記シストロン性ベクターは、開発が進むにつれて、セル当たりの分子の数の連続的な減少に適していない場合がある。したがって、意図されたエンドポイントをトランスフェクション後72時間以上後に達成される場合は特に、それは22を使用している構築物のトランスポゾン媒介ゲノム組込みをコードするベクターを使用する必要があるかもしれない。
考慮すべき別の問題は、エレクトロポレーション効率の不均一性である。非トランスフェクト細胞の数が少ないからかなりAMOの範囲腹側神経管におけるUNT、特にもの。切開後、すべての細胞が下流分析に供されているので、低エレクトロポレーション効率は、アッセイの感度を減少させるであろう。エレクトロポレーションした細胞試料を濃縮するためのアプローチは、最終試料23からの非トランスフェクト細胞の集団を減少させるために蛍光活性化細胞選別（FACS）の使用である。このようなアプローチが使用される場合、しかしながら、胚より多数のRNA-配列のライブラリを調製するための十分な収率を達成するのに必要であろう。
これはより広く、他の利用可能なプラットフォーム24と比較すると、簡略化されてシーケンシングセンターによるとシリコ RNA-のSeqデータ解析で提供されているようにイルミナシーケンスを推奨します。しかし、他の選択肢はまだ選択されたプラットフォームに、より適切なデータフィルタリングステップでの変更と適切である。 RNA-のSeqデータ解析ガイドラインはまだ完全に確立され、出力FRの比較されていませんすでにギャラクシー公開サーバに含まれているそのうちのいくつかは、OM異なる利用可能なツールは、強くお勧めします。それにもかかわらず、ここで説明するインシリコ分析は、高品質のデータセットからの良好な比較結果を得るために適しているべきである。生物学の他のすべてのエリアのように、ハイスループットシークエンシングが増加する非常に単一の実験から得られる情報の量、及びここで説明する方法は、脊髄の発達の研究に適用する1つの方法である。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Indian ink | Any supplier | ||
| 18G x 1 1/2 needle | BD | 305196 | |
| 3 ml syringe | BD | 309657 | |
| Tris | MP Biomedicals | 819620 | |
| F D & C Blue 1 | Spectra Colors Corporation | 5.FC.0010P0 | Food Dye used to visualize DNA injection |
| Ringer's solution (1 L) | |||
| - 7.2 g NaCl | Sigma-Aldrich | S-9888 | |
| - 0.37 g KCl | Sigma-Aldrich | P-4504 | |
| - 0.225 g CaCl2•2H2O | Fisher Scientific | 10043-52-4 | |
| - 0.217 g Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | S-9390 | |
| - 0.02 g KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| - ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.4 | |||
| - ddH2O to 1 L | |||
| - Filter and autoclave | |||
| PBS (Phosphate Buffered Solution) (1 L) | |||
| - 8 g NaCl | Sigma-Aldrich | S-9888 | |
| - 0.2 g KCl | Sigma-Aldrich | P-4504 | |
| - 1.15 g Na2HPO4•7H2O | Sigma-Aldrich | S-9390 | |
| - 0.2 g KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| - ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.2 | |||
| - ddH2O to 1 L and filter | |||
| - 1 ml DEPC (Diethylpyrocarbonate) | Sigma-Aldrich | D-5758 | |
| - Shake vigorously and let stand overnight at room temperature | |||
| - Autoclave | |||
| Sieved spoon | Any supplier | ||
| Sterile 60 x 15 mm polystirene Petri dishes | Corning Life Sciences | 351007 | |
| RNaseZap RNase decontamination solution | Life Technologies | AM9780 | |
| Fine point surgical scissors | Any supplier | ||
| Straight fine point tweezers | Any supplier | ||
| Pulled glass needle made from 1.1 x 75 mm glass capillary tubes | Kimble Chase | 40A502 | |
| 9'' glass Pasteur pipette | Any supplier | ||
| Manual pipette pump | Any supplier | ||
| Clear 1.5 ml microcentrifuge polypropilene tubes | Corning Life Sciences | MCT-150-C | |
| Microcentrifuge | Any supplier | ||
| RNAlater solution for RNA stabilization | Life Technologies | AM7020 | |
| RNAqueous total RNA isolation kit | Life Technologies | AM1912 | |
| Molecular Biology Grade Ethanol | Any supplier | ||
| RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2939AA | |
| Truseq RNA Sample Preparation Kit v2 | Illumina | RS-122-2001/RS-122-2002 |
References
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