Introduction
Genetische studies voor levende organismen gebruiken regelmatig het kippenembryo als model omdat in ovo elektroporatie is een snelle en goedkope manier gedeeltelijk transfecteren embryonale structuren in vivo met DNA constructen 1-5. Bicistronische expressie vectoren die een transcript met een fluorescerende reporter tezamen met het gen van belang, zoals pCIG 6 of 7 PME's coderen, zodat snelle verificatie van transfectie kwaliteit in het gewenste gebied onder een stereomicroscoop voor verwerking embryo voor downstream analyse.
Met de recente vooruitgang in DNA sequencing, is het nu mogelijk om digitale hele transcriptoom expressieprofielen verkrijgen van RNA-monsters met RNA-Seq 8,9. Daarom, in plaats van tijdrovende methoden die analyse van enkele genproducten parallel schakelen zoals in situ hybridisatie, immunohistochemie en qPCR, bereiding van cDNA bibliothekenhigh-throughput sequencing kan informatie van het hele transcriptoom bieden. Observatie van de experimentele effecten op de expressie van elk gen op hun beurt krachtige inzichten over de paden veranderd door het construct gebruikt. Dit is bijzonder gemakkelijk wanneer een genomische samenstel voor het gebruikte organisme beschikbaar, waardoor het kuiken embryo weer een geschikt model.
Als de gebruiker toegang tot een betrouwbare genoom sequencing centrum heeft, is het belangrijkste probleem het verkrijgen van hoge kwaliteit RNA monsters. Dit werk demonstreert een werkwijze voor het verkrijgen van RNA-monsters uit getransfecteerde neurale buisjes voor RNA-Seq, en het stroomafwaartse stappen in silico analyse van de resulterende datasets. Na elektroporatie bij HH12-13 gevolgd door 48 uur incubatie werden getransfecteerd kofferbak ruggenmerg helften ontleed in-ribonuclease vrije omstandigheden, onmiddellijk gelyseerd en verder beschermd tegen afbraak door ultra-lage bevriezing tot RNA zuivering en bibliotheek preparation.
De Galaxy publieke server 10 biedt toegang tot gratis middelen voor het analyseren van high-throughput sequencing data. De hoeveelheid ruimte voor geregistreerde gebruikers aangeboden is genoeg voor kleine experimenten, waardoor de noodzaak voor lokale computationele infrastructuur. RNA-Seq data-analyse omvat filtering, uitlijning en kwantificering / vergelijking van genexpressie. Hoewel er algemene richtlijnen voor RNA-Seq data analyse kan filterparameters grotendeels afhangen van de kwaliteit van sequencing en moet worden bepaald na kwaliteitscontrole analyse van de ruwe data.
Dit protocol beschrijft de stappen voor het verkrijgen en RNA-Seq profielen vergelijken van kip embryonale ruggenmerg getransfecteerd in vivo. Als representatief resultaat, vergeleken datasets verkregen uit twee onafhankelijke controlemonsters getransfecteerd met een lege vector is gebleken dat de methode reproduceerbaar is en moet identificatie van differentieel expres toestaansed transcripten in experimentele monsters. Derhalve toepassing van deze methode heeft mogelijkerwijs een grote verhoging van het aantal ontdekkingen na één enkel experiment en dus een groot aantal gegevens voor latere onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. electroporate de Construct of Interest in de Neural Tubes van HH12-13 kippenembryo's In ovo
Gebruik een fluorescerende reporter, bij voorkeur in een bicistronisch transcript of gefuseerd met het eiwit van belang met een intercalerende virale 2a peptide 11, snel identificeren van personen met bevredigende niveaus van transfectie mogelijk. OPMERKING: Typische incubatietijd voor deze fase bedraagt ongeveer 48 uur bij 37,8 ° C.
- Open een klein venster in de eieren na het verwijderen van 3 ml van albumine met een spuit gekoppeld aan een 18 G x 1 1/2 naald. Embryo visualisatie verbeteren, injecteert een kleine hoeveelheid Oostindische inkt 1:50 verdund in steriele Ringer's oplossing onder de embryo 1-4.
- Wanneer het voertuig embryo met steriele Ringer's oplossing, Injecteer 10 mM Tris-HCl, pH 8,2 en 0,1% Eten Dye (F, D & C) oplossing bevattende 2,5 pg / ul DNA door het achterste uiteinde van de neurale buis totdat het vulttot de achterhersenen regio. Om elektroporatie, positie platina elektroden (0,5 mm in diameter) gescheiden door 4 mm 1 langs de flank regio en leveren 5 pulsen van 50 msec en 20 V met een interval van 100 msec tussen 4 hen.
- Na elektroporatie, incubeer gemanipuleerde embryo's voor 48 uur meer totdat ze het podium HH23 bereiken en identificeren van natuurlijke personen die een hoge mate van transfectie op de flank regio onder een tl-stereomicroscoop.
Opmerking: De duur van incubatie na elektroporatie afhankelijk van het doel van het experiment. De geëlektroporeerde plasmiden aanzienlijke expressieniveaus na 2 uur 2 genereren. Dus als de interesse ligt in early onset genen post-elektroporatie incubatieperiode kan worden verminderd.
2. Harvest succesvol Getransfecteerd Embryo's en Ontleden de geëlectroporeerd Spinal Cord Helften
OPMERKING: Deze procedure duurt 2-3 uur voor elke 10 embryo's en opbrengsten 1-2 Ug totaal RNA per embryo. De dissectie van neurale buizen vereist fijne bewegingen en enkele oefensessies kan nodig zijn voor de toepassing ervan tot experimentele monsters.
- Ontsmetten metallic dissectiemateriaal met RNase decontaminatie oplossing of door bakken bij 150 ° C gedurende 4 uur en 12 bereiden DEPC-behandeld PBS. Gebruik alleen nieuwe gecertificeerde RNase vrij plasticware.
OPMERKING: Na het oogsten is het belangrijk standaardzorg volgen RNase verontreiniging tijdens dissectie voorkomen. - Oogst de embryo's met behulp van een paar fijne ontleden schaar en een gezeefde collectie lepel. Houd de embryo koud DEPC behandeld PBS in een 100 mm petrischaal.
- Met een paar fijne pincet, knip de hele flank regio (tussen de achterste begrenzing van de voorste ledematen knop en de voorste grens van de achterste ledematen knop) en breng dit gedeelte om een nieuwe schotel met koude-DEPC behandeld PBS.
- Gebruik twee fijne glazen naalden te perforeren op drie verschillendepunten aan elke zijde van het dorsolaterale embryo tussen de neurale buis en de paraxiale mesoderm.
- Introduceren de twee glazen naalden in de centrale perforatie en langzaam bewegen een van hen weg langs de neurale buis anterior-posterior-as. Herhaal dit voor de perforaties die niet werden bereikt door de eerste bewegingen. Verwijder de vrijstaande paraxiale mesoderm met een paar fijne pincet.
- Draai de embryo zijdelings Plaats de uiteinden van de pincet tussen de neurale buis en de notochord en schuif ze in tegengestelde richtingen langs de anterior-posterior as om de twee structuren te scheiden.
OPMERKING: Dit moet ook verwijderen van de meeste van de mesoderm nog aan de neurale buis. - Verwijder indien nodig eventuele grotere stukken mesodermic weefsel dat verbonden blijven door te trekken met een pincet en tevens licht houden van de neurale buis met een andere pincet. Wanneer u klaar bent, voorzichtig overdracht van de neurale buis naar de andere schotel met koude-DEPC behandeld PBS met behulp van eenRNase-vrij glas Pasteur pipet gekoppeld aan een handmatige pipet pomp en blijf op ijs totdat alle buizen worden ontleed.
- Verdeel de neurale buizen in twee helften. Hiervoor plaatst u de scherpe punt van een gesloten pincet in het lumen en open de dakplaat door het verplaatsen van de pincet eruit doorheen. Daarna scheiden de helften door het snijden van de vloerplaat met de pincet tips.
- Sorteer geëlektroporeerd van niet geëlektroporeerd helften bij TL dissectie scope en transfer naar een 1,5 ml buis gevuld met ijskoud DEPC-treated PBS. Eventueel flick de microbuizen zachtjes elk weefsel aan de plastic wanden los en sedimentatie van de buizen te bevorderen.
- Spin bij 100 xg gedurende 3 seconden en verwijder langzaam zoveel mogelijk PBS met 1 ml micropipet. Doe dit terwijl u naar een lichtbron die schijnt door de microtube te controleren of geen embryonale materiaal wordt gezogen om de pipet tip; als dit gebeurt, langzaam ontladen en herhaal de centrifugatie.
- Voeg 70 ul van lysis oplossing voor RNA-extractie per neurale buis helft en flick de buis om de inhoud te mengen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min en vortex krachtig. Herhaal de 5 min incubatie en vortexen twee keer. Bewaren bij -80 ° C.
- Vang minimaal acht neurale buis helften per monster voldoende rendement voor de volgende stap te waarborgen. Pool kleinere monsters als meerdere elektroporatie / dissectie sessies nodig zijn om voldoende aantal neurale buizen vergaren. Bewaar voldoende monsters voor duplicaten of drie exemplaren voor elke conditie.
3. Zuiveren RNA en Bereid Bibliotheken voor Illumina Sequencing
- Verwijderen monsters van -80 ° C opslag en plaats op ijs gedurende 15-30 min. Hervat ontdooien bij kamertemperatuur tot volledige.
- Vortex goed en laat bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Vortex opnieuw en centrifugeer bij 15.000 xg gedurende 1 min tot onoplosbaar materiaal te pelletiseren.
- Breng de bovenstaande vloeistof over in een nieuwe tubeen ga verder met RNA extractie volgens het totale RNA isolatie kit handleiding instructies. Elueren in de minimaal aanbevolen hoeveelheid om de concentratie te verhogen.
OPMERKING: DNase behandeling na clean-up wordt aanbevolen om mogelijke besmetting van genomische DNA-sequenties in RNA-Seq datasets voorkomen. - Flick de buis om inhoud te mengen en te verwijderen 5 pl voor kwaliteitscontrole analyse. Bewaar de resterende monster bij -80 ° C totdat bibliotheek bereiding; deze monsters mogen slechts één keer worden ontdooid om RNA degradatie te voorkomen.
- Run gezuiverd RNA in een Bioanalyzer instrument met de RNA 6000 Nano kit; RIN waarde moet in ieder geval boven 7 te gaan.
- Genereer bibliotheken met behulp van een Illumina compatibel RNA-Seq voorbereiding bibliotheek kit en multiplex tot 4 bibliotheken in één rijstrook van een HiSeq instrument ingesteld op 100 bp enkel leest genereren. Indien mogelijk, alle monsters in dezelfde run om eventuele technische artefacten te minimaliseren.
OPMERKING: Dit moet wijken voor 50 miljoen reads per monster, wat meer dan voldoende dekking te verkrijgen voor de meeste genen 13.
4. Vergelijk RNA-Seq Datasets in de Melkweg Public Server 10.
OPMERKING: Server opslagruimte is beperkt en experimenten vergelijken van vele monsters kunnen verwijderen van tijdelijke bestanden gegenereerd in de filtering stappen vereisen.
- Maak een gebruikersaccount in de Galaxy publieke server ( https://usegalaxy.org ) en FTP upload de Illumina datasets in fastq formaat.
- Bereid geüploade bestanden met de FastqGroomer 14 hulpmiddel onder de NGS: QC en manipulatie menu; als de kwaliteit scores reeds zijn gecodeerd in Phred + 33 (Sanger), sla deze stap door simpelweg het veranderen van het bestandstype om fastqsanger onder de attributen voor elke dataset.
- Analyseer de algemene kwaliteit van elke dataset met behulp van de FastQC hulpmiddel onder de NGS: QC en manipulatie menu.
OPMERKING: Er moet speciale aandacht worden geschonken aan de resulterende afbeeldingen voor per basenvolgorde kwaliteit en per basenvolgorde inhoud, omdat deze schattingen voor de parameters die worden gebruikt voor het trimmen van de uiteinden van de leest te bieden. - Trim leest te ontdoen 3 'eindigt met een lage kwaliteit van de gegevens met behulp van de functie FASTQ Quality Trimmer 14 onder de NGS: QC en manipulatie menu. Stel het gereedschap om te verwerken maar 3 'eindigt voor kwaliteit score lager dan 20.
- Verwijder adapter sequenties uit leest met behulp van het Clip gereedschap ( http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ ) onder het NGS: QC en manipulatie menu. Stel het gereedschap te ontdoen leest minder dan 45 bp links ingang de volgorde van de gebruikte adapter en kies uitgevoerd naar geknipt en niet geknipt sequenties. Daarnaast kiezen niet om sequenties met onbekende bases weggooien omdat de meeste lage kwaliteit bases reeds in de laatste stap werden verwijderd. Behulp van de functie Trim sequenties ( http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ ) onder het NGS: QC en manipulatie menu, trim de eerste grondslagen van de leest tot 5 'sequence vooringenomenheid gedetecteerd door FastQC (gewoonlijk 10) te verwijderen.
NB: Op dit punt, is het een goed idee om FastQC opnieuw uit te voeren en te vergelijken met de eerdere analyse om te bepalen of de dataset kwaliteit is verbeterd. - Download en pak de laatste kip genoom assemblage voor de UCSC genoom browser van Illumina iGenomes ( http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn ) en upload het hele genoom fasta formaat bestand en de genen annotatie GTF formaat bestand om de Galaxy geschiedenis met behulp van de functie Bestand uploaden onder het menu Get Data.
- Kaart leest voor elk monster om de kip genoom met behulp van de aligner TopHat2 15 onderhet NGS: RNA menu Analyse. Kies ervoor om een genoom uit geschiedenis gebruiken (selecteer de fasta bestand geupload in stap 4.7).
- Bouw een voorspelde transcriptome voor elk monster met behulp van Manchetknopen 16 onder de NGS: RNA menu Analyse. Kies ervoor om verwijzing annotatie te gebruiken als een gids (selecteer de GTF bestand geupload in stap 4.7) en zet de opties Perform Bias Correction (van Geschiedenis, fasta bestand uit stap 4.7) en Gebruik multi-lezen correct.
- Samenvoegen voorspeld transcriptomes voor alle monsters met behulp Cuffmerge 16 onder het NGS: menu RNA Analysis. Kies ervoor om verwijzing annotatie (GTF bestand uit stap 4.7) en de volgorde gegevens te gebruiken (van Geschiedenis, fasta bestand uit stap 4.7).
- Vergelijk BAM-bestanden gegenereerd door TopHat2 voor elk monster met behulp Cuffdiff 16 onder het NGS: menu RNA Analysis. In het veld Afschriften selecteer het merged transcriptome gegenereerd door Cuffmerge en schakel de opties Perform Bias Correction (van Geschiedenis, fasta bestand uit stap 4.7) en Gebruik multi-lezen correct.
- Sorteren differentiële expressie testen tafels numeriek oplopend in kolom 13 (q-waarde) met behulp van de functie Sort onder het Filter en menu sorteren.
OPMERKING: Genen / transcripties tonen significante differentiële expressie tussen experimentele omstandigheden zal de laagste q waarden presenteren. - Om de resultaten visueel te controleren met dekking grafieken, eerste BAM-bestanden te converteren naar bedGraph formaat met behulp van de functie Maak een BedGraph van genoom dekking 17 onder het menu BEDTools. Schakel rapportage van gebieden zonder afdekking, kiezen gesplitste gegevens als afzonderlijke intervallen behandelen en schaal het dekkingsgebied van een factor die sequencing diepte normaliseert alle datasets vergeleken.
- Omzetten de resulterende bedGraph bestand naar bobo-formaat met behulp van dehulpmiddel Pruik / BedGraph-to-bobo ( http://www.genome.ucsc.edu/ ) onder het menu Converteren Formats. Upload de bobo bestanden als aangepaste tracks in de UCSC genoom browser ( http://www.genome.ucsc.edu/ ) voor de galGal4 assemblage en zoek een gen van belang om de dekking te visualiseren in de datasets.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de beschreven methode te valideren, werden twee controlemonsters gegenereerd uit embryo geëlektroporeerd met de lege vector PMEs 7 en één monster uit embryo's getransfecteerd met dezelfde vector die het insert construeren SCRT2-ZNF, die het zink-vinger domeinen van kip SCRT2 18 codeert. Monsters waarbij 11-22 ug totaal RNA elk werden verkregen van pools van 8 tot 12 embryo. Alle drie monsters scoorden optimale RIN waarde van 10 in een kwaliteitscontrole uitgevoerd met de Bioanalyzer instrument (figuur 1), waaruit blijkt dat een hoge kwaliteit RNA kan worden verkregen met dit protocol.
Na sequentiebepaling beschreven filterproces verhoogde de aanpassing rate 83-91% van de leest (gegevens niet getoond). Zoals verwacht vergelijking van de transcriptoom twee controlemonsters vertoonden geen duidelijk verschil als globaal vergeleken spreidingsdiagram (figuur 2) en de Pearson correlatiecoëfficiënt was 0.99. Daarnaast weergave van dekking voor alle drie datasets langs de locus dat het gedeelte van de SCRT2 sequentie toonde een duidelijke toename van het aantal leest toegewezen aan deze regio in het experimentele monster (figuur 3), wat aangeeft dat de overexpressie was succesvolle en dat verschillen tussen controle en experimentele monsters detecteerbaar moeten zijn met de hier beschreven werkwijze.
Figuur 1:. RNA kwaliteitscontrole Bioanalyzer elektroferogrammen toont hoge integriteit voor de twee controlegroepen totaal RNA monsters aangegeven door de 18S en 28S ribosomale RNA pieken. Inzetstukken vertegenwoordigen een virtuele gel voor de run.
Figure 2:. Reproduceerbaarheid van RNA-Seq kwantificatie resultaten spreidingsdiagram blijkt dat RPKM meeste genen in beide controlemonsters. Vrijwel alle genen die niet voldoen aan dit patroon hebben een zeer lage RPKM waarden en dus worden meestal genegeerd uit transcriptome vergelijkingen.
Figuur 3: Visualisatie van verschillen in experimentele monster UCSC Genome Browser weergave van de SCRT2 locus in het genoom kip (galGal4) toont een duidelijke toename in de dekking van het gebied dat codeert voor het eiwit domein (SCRT2-ZNF) ectopisch uitgedrukt in de. experimentele monster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier geven we richtlijnen voor het analyseren van effecten na elektroporatie van de kip ruggenmerg. Hoewel elektroporatie van DNA vectoren wordt vaker gebruikt om een gen van interesse overexpressie kan men ook constructen coderen voor dominant negatieve, quimeric eiwitten of precursors gebruiken siRNAs van genfunctie neerhalen voorwaarden 19-21 genereren. In feite kan de vergelijking van transcriptome profielen als gevolg van zowel de gain en verlies-van-functie analyse wijzen genen verschillend tot expressie in tegengestelde manieren in elke conditie, dus hebben de potentie om meer specifieke effecten bloot te leggen.
Als een methode toegepast stroomafwaarts RNA-extractie, synthese van RNA-Seq bibliotheken vereist minimum eerste hoeveelheid uitgangsmateriaal. Met dit protocol moet 8 embryo voldoende zijn om ongeveer 10 ug totaal RNA verkregen worden. Beginnend met een lager aantal personen zonder afbreuk te doen de adequate concentratie is waarschijnlijkmogelijk het gebruik van RNA-extractie systemen eindverdunning in kleinere volumes mogelijk.
Duidelijke scheiding van de neurale buis uit alle mesoderm moet enkele malen worden uitgevoerd voordat belangrijke samples, aangezien dit een delicate stap die enige vertrouwdheid nodig. Om overmatige RNA afbraak tijdens de dissectie stap vermijden, is het ook belangrijk om de gehele procedure te voltooien voor neurale buizen in ongeveer 1-2 uur. Nogmaals, zal de praktijk van belang zijn om dissectie tijd te verbeteren. Een belangrijke vaststelling is dat het verband tussen mesoderm weefsel sterker is dan de verbinding tussen mesoderm en neurale buis, waardoor het trekken mesodermale structuren, speciaal de notochord, efficiënter dan proberen ongewenst weefsel te snijden. Ook moeten onderzoekers vrij om het ontwikkelen van hun eigen techniek geoptimaliseerd om hun eigen dissectie omstandigheden voelen. Toch moet worden gezorgd voor monsters vergeleken in een zelfde experiment op dezelfde manier worden ontleed zodat level verontreiniging met mesodermale weefsels zo homogeen mogelijk tussen de monsters.
Ons protocol toont de vergelijking van transcriptome profielen uit stadium HH23 kip embryonale ruggenmerg getransfecteerd in stadium HH12-13. Er moet echter kleine aanpassingen zijn toepassing op embryo's geoogst in eerdere stadia mogelijk te maken. Anderzijds, indien latere stadia gewenst voor analyse van het eindresultaat, genoemde bicistronische vectoren mogelijk niet geschikt vanwege een voortdurende vermindering van het aantal moleculen per cel ontwikkeling verloopt. Daarom, vooral als het beoogde eindpunt wordt bereikt na meer dan 72 uur na transfectie, kan het nodig zijn om vectoren coderend transposon gemedieerde genomische integratie van het construct gebruikt gebruikte 22.
Een ander probleem dat moet worden overwogen is de heterogeniteit van de elektroporatie efficiency. Het aantal niet-getransfecteerde cellen varieert van enkele tot een aanzienlijke amount, vooral degenen in de ventrale neurale buis. Aangezien alle cellen na dissectie onderworpen stroomafwaarts analyse een lage efficiëntie van elektroporatie gevoeligheid van de assay te verminderen. Een benadering om het monster te verrijken met geëlektroporeerde cellen is het gebruik van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) om de populatie van niet-getransfecteerde cellen te verminderen van het eindmonster 23. Wanneer een dergelijke benadering wordt gebruikt, maar een groter aantal embryo's nodig zijn om voldoende opbrengst voor RNA-Seq bibliotheek preparaat bereiken.
Illumina sequencing wordt aanbevolen omdat dit breder aangeboden door sequencing centra en in silico RNA-Seq gegevensanalyse wordt vereenvoudigd in vergelijking met andere beschikbare platforms 24. Echter, andere opties zijn nog steeds voldoende met wijzigingen in data filtering stappen meer geschikt voor het gekozen platform. RNA-Seq richtlijnen data-analyse zijn nog niet volledig vastgesteld en vergelijking van outputs frOM verschillende beschikbare instrumenten, waarvan sommige zijn reeds opgenomen in de Galaxy publieke server, is een aanrader. Toch moet hier beschreven het in silico analyse geschikt voor het verkrijgen van een goede vergelijking resultaten uit hoogwaardige datasets zijn. Zoals in alle andere gebieden in Biology, high-throughput sequencing verhoogt enorm de hoeveelheid informatie die kan worden verkregen uit een enkel experiment, en de hier beschreven methode is een manier toe te passen op de studie van ruggenmerg ontwikkeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Indian ink | Any supplier | ||
| 18G x 1 1/2 needle | BD | 305196 | |
| 3 ml syringe | BD | 309657 | |
| Tris | MP Biomedicals | 819620 | |
| F D & C Blue 1 | Spectra Colors Corporation | 5.FC.0010P0 | Food Dye used to visualize DNA injection |
| Ringer's solution (1 L) | |||
| - 7.2 g NaCl | Sigma-Aldrich | S-9888 | |
| - 0.37 g KCl | Sigma-Aldrich | P-4504 | |
| - 0.225 g CaCl2•2H2O | Fisher Scientific | 10043-52-4 | |
| - 0.217 g Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | S-9390 | |
| - 0.02 g KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| - ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.4 | |||
| - ddH2O to 1 L | |||
| - Filter and autoclave | |||
| PBS (Phosphate Buffered Solution) (1 L) | |||
| - 8 g NaCl | Sigma-Aldrich | S-9888 | |
| - 0.2 g KCl | Sigma-Aldrich | P-4504 | |
| - 1.15 g Na2HPO4•7H2O | Sigma-Aldrich | S-9390 | |
| - 0.2 g KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| - ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.2 | |||
| - ddH2O to 1 L and filter | |||
| - 1 ml DEPC (Diethylpyrocarbonate) | Sigma-Aldrich | D-5758 | |
| - Shake vigorously and let stand overnight at room temperature | |||
| - Autoclave | |||
| Sieved spoon | Any supplier | ||
| Sterile 60 x 15 mm polystirene Petri dishes | Corning Life Sciences | 351007 | |
| RNaseZap RNase decontamination solution | Life Technologies | AM9780 | |
| Fine point surgical scissors | Any supplier | ||
| Straight fine point tweezers | Any supplier | ||
| Pulled glass needle made from 1.1 x 75 mm glass capillary tubes | Kimble Chase | 40A502 | |
| 9'' glass Pasteur pipette | Any supplier | ||
| Manual pipette pump | Any supplier | ||
| Clear 1.5 ml microcentrifuge polypropilene tubes | Corning Life Sciences | MCT-150-C | |
| Microcentrifuge | Any supplier | ||
| RNAlater solution for RNA stabilization | Life Technologies | AM7020 | |
| RNAqueous total RNA isolation kit | Life Technologies | AM1912 | |
| Molecular Biology Grade Ethanol | Any supplier | ||
| RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2939AA | |
| Truseq RNA Sample Preparation Kit v2 | Illumina | RS-122-2001/RS-122-2002 |
References
- Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1 (8), 207-20 (1999).
- Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Dev. Dyn. 229 (3), 433-439 (2004).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos. J. Vis. Exp. (9), 10-3791 (2007).
- Sauka-Spengler, T., Barembaum, M. Gain- and loss-of-function approaches in the chick embryo. Methods Cell Biol. 87, 237-256 (2008).
- Ghadge, G. D., et al. Truncated wild-type SOD1 and FALS-linked mutant SOD1 cause neural cell death in the chick embryo spinal cord. Neurobiol. Dis. 21 (1), 205-20 (2006).
- Megason, S. G., McMahon, A. P. A mitogen gradient of dorsal midline Wnts organizes growth in the CNS. Development. 129 (9), 2087-2098 Forthcoming.
- Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations. Dev. Biol. 233 (1), 13-21 (2001).
- Cloonan, N., et al. Stem cell transcriptome profiling via massive-scale mRNA sequencing. Nat. Methods. 5 (7), 613-619 (2008).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat. Methods. 5 (7), 621-628 (2008).
- Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J. Galaxy Team. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11 (8), 86 (2010).
- Trichas, G., Begbie, J., Srinivas, S. Use of the viral 2A peptide for bicistronic expression in transgenic mice. BMC Biol. 6, 40 (2008).
- Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. Molecular cloning. A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1982).
- Wang, Y., et al. Evaluation of the coverage and depth of transcriptome by RNA-Seq in chickens. BMC Bioinformatics. 12, 10-1186 (2011).
- Blankenberg, D., et al. Manipulation of FASTQ data with Galaxy. Bioinformatics. 26 (14), 1783-1785 (2010).
- Kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R., Salzberg, S. L. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), 36 (2013).
- Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat Biotechnol. 28 (5), 511-515 (2010).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Vieceli, F. M., Simões-Costa, M., Turri, J. A., Kanno, T., Bronner, M., Yan, C. Y. The transcription factor chicken Scratch2 is expressed in a subset of early postmitotic neural progenitors. Gene Expr. Patterns. 13 (5-6), 189-196 (2013).
- Chesnutt, C., Niswander, L. Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo. Genesis. 39 (2), 73-78 (2004).
- Katahira, T., Nakamura, H. Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system. Dev. Growth. Differ. 45 (4), 361-367 (2003).
- Rao, M., Baraban, J. H., Rajaii, F., Sockanathan, S. In vivo comparative study of RNAi methodologies by in ovo electroporation in the chick embryo. Dev. Dyn. 231 (3), 592-600 (2004).
- Lu, Y., Lin, C., Wang, X. PiggyBac transgenic strategies in the developing chicken spinal cord. Nucleic Acids Res. 37 (21), 141 (2009).
- Simões-Costa, M., Tan-Cabugao, J., Antoshechkin, I., Sauka-Spengler, T., Bronner, M. E. Transcriptome analysis reveals novel players in the cranial neural crest gene regulatory network. Genome Res. 24 (2), 281-290 (2014).
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat. Protoc. 7 (3), 562-578 (2012).
