Introduction
Genetiske undersøgelser af levende organismer ofte bruger kyllingefosteret som en model for in ovo elektroporering repræsenterer en hurtig og billig måde til delvist at transficere embryoniske strukturer in vivo med DNA-konstruktioner 1-5. Bicistronisk ekspressionsvektorer, der koder for en udskrift, som indeholder et fluorescerende reporter sammen med genet af interesse, såsom pCIG 6 eller PME'er 7, giver mulighed for hurtig kontrol af transfektion kvalitet i den ønskede region under et stereomikroskop før behandlingen embryoner for downstream analyse.
Med de seneste fremskridt inden for DNA-sekventering, er det nu muligt at opnå digitale hele transkriptom udtryk profiler fra RNA-prøver ved anvendelse af RNA-Seq 8,9. Derfor, i stedet for tidskrævende metoder, der muliggør analyse af kun et par genprodukter parallelt, såsom in situ hybridisering, immunhistokemi og qPCR, fremstilling af cDNA-biblioteker forhigh-throughput sekventering kan give oplysninger af hele transkriptomet. Observation af de eksperimentelle virkninger på ekspressionsniveauer af hvert enkelt gen kan igen give kraftige indsigt på veje ændret ved konstruktionen, der anvendes. Dette er særligt let, hvis en genomisk forsamling for anvendte organisme er tilgængelig, således kyllingefosteret igen er en egnet model.
Hvis brugeren har adgang til en pålidelig genomsekvensering center, er det vigtigste emne at opnå høj kvalitet RNA-prøver. Dette arbejde viser en fremgangsmåde til opnåelse af RNA-prøver fra transficerede neurale slanger egnede til RNA-Seq samt de efterfølgende trin i silico analyse af de resulterende datasæt. Efter elektroporation på HH12-13 efterfulgt af 48 timers inkubation blev transficeret bagagerum rygmarv halvdele dissekeret i ribonuklease-fri betingelser, straks lyseret og yderligere beskyttet mod nedbrydning af ultra-lavt frysepunkt indtil RNA oprensning og bibliotek forberedelse;ion.
Galaxy offentlig server 10 giver adgang til gratis ressourcer til at analysere high-throughput sekventering data. Den mængde plads, der tilbydes for registrerede brugere er nok for små eksperimenter, hvilket eliminerer behovet for lokal beregningsmæssige infrastruktur. RNA-Seq dataanalyse inkluderer filtrering, justering og kvantificering / sammenligning af genekspression. Selv om der er generelle retningslinjer for RNA-Seq dataanalyse, vil filtreringsparametre i høj grad afhænge af kvaliteten af sekventering og bør bestemmes efter kvalitetskontrol analyse af de rå data.
Denne protokol beskriver de trin for at opnå og sammenligne RNA-Seq profiler fra kylling embryonale rygmarv transficeret in vivo. Som et repræsentativt resultat, sammenligning af datasæt opnået fra to uafhængige kontrolprøver transficeret med en tom vektor viste, at metoden er reproducerbar og det bør tillade identifikation af differentielt ExpresSED udskrifter i eksperimentelle prøver. Derfor anvendelse af denne metode har potentiale til at øge antallet af opdagelser efter et enkelt eksperiment, og således tilvejebringe et stort sæt af data til efterfølgende undersøgelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. elektroporere Construct af interesse i de neurale Rør af HH12-13 Chicken embryoner i ovo
Brug en fluorescerende reporter, fortrinsvis i en bicistronisk transkript eller kondenseret til proteinet af interesse med en interkalerende viral 2a peptid 11, for at muliggøre hurtig identifikation af personer med tilfredsstillende niveauer af transfektion. BEMÆRK: Typisk inkubationstid for denne fase er omkring 48 timer ved 37,8 ° C.
- Åbne et lille vindue i æggene efter fjernelse af 3 ml albumin med en sprøjte koblet til en 18 G x 1 1/2 nål. At forbedre embryo visualisering, injiceres en lille mængde af tusch fortyndet 1:50 i steril Ringers opløsning under embryo 1-4.
- Efter at have dækket embryoet med steril Ringers opløsning, injiceres en 10 mM Tris-HCl, pH 8,2 og 0,1% madfarvestof (F, D & C) opløsning indeholdende 2,5 ug / ul DNA gennem den bageste ende af det neurale rør, indtil det fylderop til baghjerne region. Til at elektroporere, placering platinelektroder (0,5 mm i diameter) adskilt af 4 mm 1 langs flankeområdet og levere 5 impulser på 50 msek og 20 V med et interval på 100 ms mellem dem 4.
- Efter elektroporation, inkuberes genmanipulerede embryoner i 48 timer mere, indtil de når fase HH23 og identificere personer, der fremviser et højt niveau af transfektion på flanken region under en fluorescerende stereomikroskop.
BEMÆRK: Varigheden af inkubationen efter elektroporering afhænger af formålet med eksperimentet. De elektroporerede plasmider kan generere betydelige ekspressionsniveauer efter 2 timer 2. Så hvis interesse ligger i tidlig debut gener post-elektroporation inkubationsperiode kan reduceres.
2. Harvest Succesfuld Transficerede Embryoner og dissekere den elektroporerede rygmarven halvlege
BEMÆRK: Denne procedure varer 2-3 timer for hver 10 embryoner og udbytter 1-2 Ug total RNA per embryo. Dissektion af neurale rør kræver fine bevægelser og nogle træningssessioner kan være nødvendig, før du anvender det til eksperimentelle prøver.
- Dekontaminering metalliske dissektion værktøjer med RNase dekontaminering opløsning eller ved bagning ved 150 ° C i 4 timer 12 og forberede DEPC-behandlet PBS. Brug kun ny certificeret RNase-fri plastvarer.
BEMÆRK: Efter høst, er det vigtigt at følge standard omhu for at forhindre RNase kontaminering under dissektion. - Høst embryoner ved hjælp af et par fine Dissecting saks og en sigtet spoon samling. Holde embryoner i koldt DEPC-behandlet PBS i en 100 mm petriskål.
- Med et par fine pincetter, skåret ud hele flanke region (mellem den bageste grænse af den forreste knopskydninger og den forreste grænse af den bageste knopskydninger) og overføre denne del til en ny skål indeholdende kold DEPC-behandlet PBS.
- Brug to fine glas nåle til at perforere på tre forskelligepeger på hver dorsolateral side af embryo mellem neuralrøret og akseparallelle mesoderm.
- Introducere de to glas nåle i den centrale perforering og langsomt flytte en af dem væk langs neuralrøret anterior-posterior akse. Gentag dette for perforeringer som ikke blev nået af de første bevægelser. Fjern den adskilte paraksiale mesoderm med et par fine pincet.
- Drej embryo sidelæns indsætte spidsen af pincetten mellem neuralrøret og notochorden og skub dem i modsatte retninger langs anterior-posterior akse for at adskille de to strukturer.
NOTE: Dette bør også fjerne det meste af mesoderm stadig fastgjort til neuralrøret. - Hvis det er nødvendigt, fjern eventuelle større stykker mesodermic væv, der forbliver fastgjort ved at trække med en pincet, mens let holder den neurale rør med en anden pincet. Når du er færdig, forsigtigt overføre neuralrøret til en anden skål indeholdende kold DEPC-behandlet PBS ved hjælp af enRNase-fri glas Pasteur pipette koblet til en manuel pipette pumpe og opbevare på is, indtil alle rørene dissekeres.
- Opdel de neurale rør i to halvdele. Til dette, skal du indsætte den skarpe spids af en lukket pincet i lumen og åbn tag pladen ved at flytte pincet ud gennem det. Efter dette, skal du adskille de to halvdele ved at skære bundpladen med pincetten tips.
- Sorter elektroporeret fra ikke-elektroporeret halvdele under en fluorescerende dissektionsmikroskop og overføres til et 1,5 ml rør fyldt med iskold DEPC-behandlet PBS. Hvis det er nødvendigt, bladre mikrorør forsigtigt for at frigive noget væv knyttet til plastvæggene og fremme bundfældning af rørene.
- Spin ved 100 xg i 3 sek og fjern meget langsomt så meget PBS som muligt med en 1 ml mikropipette. Gør dette, mens du kigger på en lyskilde, der skinner igennem mikrorør at overvåge eventuelle embryonale materiale suges til pipettespidsen; hvis dette sker, aflades langsomt og gentag centrifugation.
- Tilføje 70 pi lyseringsopløsning til RNA-ekstraktion pr neural halvt rør og bladre rør for at blande indholdet. Der inkuberes ved stuetemperatur i 5 minutter og vortex kraftigt. Gentag 5 min inkubation og vortexing to gange mere. Opbevar ved -80 ° C.
- Saml mindst otte neuralrørsdefekter halvdele per prøve at sikre en passende udbytte til det næste trin. Pool mindre prøver, hvis flere elektroporation / dissektion sessioner er forpligtet til at samle tilstrækkeligt antal neurale rør. Opbevar tilstrækkelige prøver for dubletter eller triplikater for hver tilstand.
3. Purify RNA og Forbered Biblioteker for Illumina sekventering
- Fjern prøver fra -80 ° C opbevaring og anbring på is i 15-30 min. Genoptage optøning ved stuetemperatur, indtil fuldstændig.
- Vortex godt og henstår ved stuetemperatur i 5 min. Vortex igen og centrifugeres ved 15.000 xg i 1 min for at pelletere uopløseligt materiale.
- Supernatanten overføres til et nyt rørog fortsæt til RNA-ekstraktion i henhold til de samlede RNA isolation kit manuelle instruktioner. Eluer i minimum anbefalede volumen for at øge koncentrationen.
BEMÆRK: DNase behandling efter oprydning anbefales for at undgå potentiel forurening af genomiske DNA-sekvenser i RNA-Seq datasæt. - Flick røret for at blande indholdet og fjern 5 pi til kvalitetskontrol analyse. Den resterende prøve Opbevar ved -80 ° C, indtil biblioteket forberedelse; disse prøver skal optøs kun en gang for at undgå RNA-nedbrydning.
- Kør renset RNA i en Bioanalyzer instrument ved hjælp af RNA 6000 Nano kit; RIN værdi skal være mindst over 7 for at fortsætte.
- Generer biblioteker anvender et Illumina kompatibel RNA-Seq forberedelse bibliotek kit og multiplex op til 4 biblioteker i én vognbane af en HiSeq instrument indstillet til at generere 100 bp enkelt læser. Hvis det er muligt, omfatte alle prøver i samme løb for at minimere potentielle tekniske artefakter.
BEMÆRK: Dette skulle give op til 50 mio rEADS per prøve, hvilket er mere end nok til at få dækning for de fleste gener 13.
4. Sammenlign RNA-Seq Datasets i Galaxy Public Server 10.
BEMÆRK: Server lagerplads er begrænset og eksperimenter sammenligner mange prøver kan kræve sletning af midlertidige filer genereres i filtrering trin.
- Opret en brugerkonto på Galaxy offentlig server ( https://usegalaxy.org ) og FTP upload Illumina datasæt i fastq format.
- Forbered uploadede filer med FastqGroomer 14 værktøj under NGS: QC og manipulation menuen; hvis de kvalitetskrav scores allerede er kodet i Phred + 33 (Sanger), skal du springe dette trin over ved blot at ændre filtypen til fastqsanger under attributter for hvert datasæt.
- Analysere den generelle kvalitet af de enkelte datasæt ved hjælp af FastQC værktøjet under NGS: QC og manipulation mignu.
BEMÆRK: Der bør lægges særlig vægt på de resulterende grafik til pr basesekvens kvalitet og pr basesekvens indhold, da disse vil give et skøn for de parametre, der bruges til at trimme enderne af læser. - Trim læser til at skille 3'-ender med data af lav kvalitet ved hjælp af værktøjet FASTQ Quality Trimmer 14 under NGS: QC og manipulation menu. Indstil værktøjet til at behandle kun 3 'ender for kvalitet score under 20.
- Fjern adaptorsekvenser fra læser ved hjælp af Clip værktøjet ( http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ ) under NGS: QC og manipulation menu. Indstille værktøjet til at skille læser med mindre end 45 bp til venstre, input sekvensen af adaptoren anvendt, og vælge output omfatter både klippede og ikke-afskårne sekvenser. Derudover vælger ikke at skille sig af sekvenser med ukendte baser, da de fleste lav kvalitet baser allerede blev fjernet i det sidste trin. Brug værktøjet Trim sekvenser ( http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ ) under NGS: QC og manipulation menu, trimme de første baser i læser at fjerne 5'-sekvensen partiskhed påvist ved FastQC (typisk 10).
BEMÆRK: På dette tidspunkt er det en god ide at køre FastQC igen og sammenlignes med den tidligere analyse at bestemme, om datasættet kvalitet blev forbedret. - Hent og pak den nyeste kylling genom forsamling for UCSC genom browser fra Illumina iGenomes ( http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn ) og uploade hele genomet FASTA format filen og generne annotation GTF format fil til Galaxy historie hjælp Upload fil under Get Data-menuen.
- Kort læser for hver prøve til kyllingen genomet ved hjælp af aligner TopHat2 15 underNGS: RNA Analyse menu. Vælger at bruge et genom fra History (vælg FastA filen uploadet i trin 4.7).
- Byg en forudsagt transkriptom for hver prøve ved hjælp Manchetknapper 16 under NGS: RNA Analysis menu. Vælger at bruge henvisningen annotation som en guide (vælg GTF filen uploadet i trin 4.7) og tænd for de muligheder Udfør Bias Correction (fra History, FASTA fil fra trin 4.7) og Brug multi-læst korrekt.
- Flet forudsagte transcriptomes for alle prøver med Cuffmerge 16 under NGS: menu RNA-analyse. Vælger at bruge henvisningen anmærkning (GTF fil fra trin 4.7) og sekvensdata (fra History, FASTA fil fra trin 4.7).
- Sammenlign BAM filer genereret af TopHat2 for hver prøve ved hjælp Cuffdiff 16 under NGS: menu RNA-analyse. I marken Udskrifter vælge migrged transkriptom genereret af Cuffmerge og tænd mulighederne Udfør Bias Correction (fra History, FASTA fil fra trin 4.7) og Brug multi-læst korrekt.
- Sorter differentiel ekspression teste tabeller numerisk Stigende i kolonne 13 (q-værdi) ved hjælp af værktøjet Sortér under Filter og sortere menu.
BEMÆRK: Gener / udskrifter, der viser signifikant forskellig ekspression mellem eksperimentelle betingelser vil præsentere de laveste q-værdier. - For at kontrollere resultaterne visuelt med dækning grafer, først konvertere BAM-filer til bedGraph format hjælp af Opret en BedGraph af genom dækning 17 under BEDTools menuen. Deaktiver rapportering af områder uden dækning, vælger at behandle splejsede poster som adskilte intervaller og skalere dækning med en faktor, der normaliserer sekventering dybde for alle datasæt, der sammenlignes.
- Konverter den resulterende bedGraph fil til bigwig format ved hjælp afværktøj Wig / BedGraph-til-kanon ( http://www.genome.ucsc.edu/ ) under Konverter Formater menuen. Upload kanon-filer som brugerdefinerede spor i UCSC genom browser ( http://www.genome.ucsc.edu/ ) til galGal4 montage og søg et gen af interesse at visualisere dækning i datasæt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at validere den beskrevne fremgangsmåde, blev to kontrolprøver genereret fra embryoner elektroporeret med de tomme vektor PME'er 7 og én prøve fra embryoner transficeret med den samme vektor indeholdende insertet konstruere SCRT2-ZNF, som koder for zinkfinger-domæner af kylling SCRT2 18. Prøver der gav 11-22 pg totalt RNA hver blev opnået fra puljer af 8 til 12 embryoner. Alle tre prøver scoret en optimal RIN værdi på 10 i en kvalitetskontrol udført med Bioanalyzer instrument (figur 1), hvilket viser, at kvalitet RNA høj kan opnås med denne protokol.
Efter sekventering beskrevet filtreringsprocessen øget tilpasningen rate 83-91% af læser (data ikke vist). Som forventet, sammenligning af transcriptomes fra to kontrolprøver viste ingen tydelig forskel, når globalt sammenlignet i et punktdiagram (figur 2) og Pearson korrelationskoefficienten var 0.99. Derudover display dækning for alle tre datasæt langs locus, der indeholder den del af SCRT2 sekvens viste en klar stigning i antallet af læser kortlagt til denne region i den eksperimentelle prøve (figur 3), hvilket indikerer, at overekspression var succes, og at forskellene mellem kontrol og eksperimentelle prøver bør være påviseligt med den her beskrevne metode.
Figur 1:. RNA kvalitetskontrol Bioanalyzer elektroferogrammer viser høj grad af integritet for de to kontrolgrupper samlede RNA-prøver angivet af de 18S og 28S ribosomale RNA-toppe. Insets repræsenterer en virtuel gel for turen.
FiguAd 2:. Reproducerbarhed af RNA-Seq kvantificeringsfremgangsmåder resultater punktdiagram viser, at RPKM for de fleste gener er den samme i begge kontrolprøver. Stort set alle gener, der ikke følger dette mønster har meget lave RPKM værdier, og derfor er normalt ignoreret fra transkriptom sammenligninger.
Figur 3: Visualisering af forskelle i en eksperimentel prøve UCSC Genome Browser visning af SCRT2 locus i kyllingen genomet (galGal4), der viser en tydelig stigning i dækningen af den region, der koder for proteinet domæne (SCRT2-ZnF) ectopically udtrykt i. eksperimentel prøve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her giver vi retningslinjer for undersøgelse af virkninger efter elektroporering af kylling rygmarven. Selv elektroporering af DNA-vektorer oftere anvendes til overekspression af et gen af interesse, kan man også anvende konstruktioner, der koder for dominante negativer quimeric proteiner eller prækursorer for siRNAs at generere genfunktion knock-down forhold 19-21. Faktisk kan sammenligning af transkriptom profiler som følge af både GAIN- og tab af funktion analyse påpege gener udtrykkes forskelligt i modsatte måder i hver betingelse, og dermed har potentiale til at afdække mere specifikke virkninger.
Som helst fremgangsmåde anvendes nedstrøms til RNA-ekstraktion, syntese af RNA-Seq biblioteker kræver et minimum indledende mængde udgangsmateriale. Med denne protokol, skal 8 embryoer være tilstrækkelig til at give omkring 10 ug totalt RNA. Begyndende med et lavere antal individer uden at kompromittere en tilstrækkelig bearbejdning koncentration er sandsynligvismuligt med anvendelse af RNA-ekstraktionsmetoder systemer, som muliggør endelig fortynding i mindre mængder.
Korrekt adskillelse af neuralrøret fra alle mesoderm bør praktiseres et par gange før anvendelse til vigtige prøver, da dette er en delikat trin, der kræver et vist kendskab. At undgå overdreven RNA-nedbrydning under dissektion trin, er det også vigtigt at fuldføre hele proceduren for alle neurale rør i ca. 1-2 timer. Igen, vil praksis være vigtigt at forbedre dissektion tid. En vigtig observation er, at forbindelsen mellem mesoderm væv er stærkere end forbindelsen mellem mesoderm og neurale rør, således at trække mesodermale strukturer, specielt rygstrengen, er mere effektivt end at forsøge at skære uønsket væv. Desuden bør forskerne velkommen til at udvikle deres egen teknik optimeret deres egne dissektion betingelser. Dog bør der udvises forsigtighed for prøver sammenlignet i en samme eksperiment, der skal dissekeres på samme måde, således at nivel af forurening med mesodermale væv er så homogen som muligt mellem prøverne.
Vores protokol viser sammenligning af transkriptomet profiler fra scenen HH23 kyllingeembryoniske rygmarv transficeret på stadium HH12-13. Dog bør små justeringer tillade dens anvendelse på embryoner, der er høstet i tidligere etaper. På den anden side, hvis der ønskes senere trin til analyse af det endelige resultat, de bicistroniske vektorer nævnt ikke kan være egnet på grund af en stadig reduktion i antallet af molekyler per celle som skrider frem. Derfor, især hvis den påtænkte slutpunkt opnås efter mere end 72 timer efter transfektion, kan det være nødvendigt at anvende vektorer, der koder for transposon-medieret genomisk integration af konstruktionen anvendes 22.
Et andet spørgsmål, der skal overvejes, er heterogenitet elektroporation effektivitet. Antallet af ikke-transficerede celler varierer fra et par til en betydelig amoUNT især dem i den ventrale neurale rør. Eftersom alle celler efter dissektion udsættes for downstream analyse vil en lav elektroporation effektivitet reducere testens følsomhed. En fremgangsmåde til at berige prøven med elektroporerede celler er anvendelsen af fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) for at reducere populationen af ikke-transficerede celler fra slutprøven 23. Hvis der anvendes en sådan tilgang vil dog være nødvendigt med en større antal embryoner for at opnå tilstrækkelig udbytte for RNA-Seq bibliotek forberedelse.
Anbefales Illumina sekventering som det er mere almindeligt tilbydes af sekventering centre og in silico RNA-Seq dataanalyse er forenklet i forhold til andre tilgængelige platforme 24. Er dog stadig tilstrækkelig med modifikationer andre muligheder i datafiltrering trin mere egnet til den valgte platform. RNA-Seq retningslinjer dataanalyse er stadig ikke helt etableret og sammenligning af output frOM forskellige tilgængelige værktøjer, hvoraf nogle allerede er opført på Galaxy offentlig server, er stærkt anbefales. Ikke desto mindre bør i silico analyse beskrevet her være egnet til opnåelse af gode resultater fra sammenligning kvalitet datasæt høj. Som i alle andre områder i biologi, high-throughput sekventering stiger enormt mængden af oplysninger, der kan opnås fra et enkelt forsøg, og den her beskrevne metode er en måde at anvende den til studiet af rygmarven udvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Indian ink | Any supplier | ||
| 18G x 1 1/2 needle | BD | 305196 | |
| 3 ml syringe | BD | 309657 | |
| Tris | MP Biomedicals | 819620 | |
| F D & C Blue 1 | Spectra Colors Corporation | 5.FC.0010P0 | Food Dye used to visualize DNA injection |
| Ringer's solution (1 L) | |||
| - 7.2 g NaCl | Sigma-Aldrich | S-9888 | |
| - 0.37 g KCl | Sigma-Aldrich | P-4504 | |
| - 0.225 g CaCl2•2H2O | Fisher Scientific | 10043-52-4 | |
| - 0.217 g Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | S-9390 | |
| - 0.02 g KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| - ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.4 | |||
| - ddH2O to 1 L | |||
| - Filter and autoclave | |||
| PBS (Phosphate Buffered Solution) (1 L) | |||
| - 8 g NaCl | Sigma-Aldrich | S-9888 | |
| - 0.2 g KCl | Sigma-Aldrich | P-4504 | |
| - 1.15 g Na2HPO4•7H2O | Sigma-Aldrich | S-9390 | |
| - 0.2 g KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| - ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.2 | |||
| - ddH2O to 1 L and filter | |||
| - 1 ml DEPC (Diethylpyrocarbonate) | Sigma-Aldrich | D-5758 | |
| - Shake vigorously and let stand overnight at room temperature | |||
| - Autoclave | |||
| Sieved spoon | Any supplier | ||
| Sterile 60 x 15 mm polystirene Petri dishes | Corning Life Sciences | 351007 | |
| RNaseZap RNase decontamination solution | Life Technologies | AM9780 | |
| Fine point surgical scissors | Any supplier | ||
| Straight fine point tweezers | Any supplier | ||
| Pulled glass needle made from 1.1 x 75 mm glass capillary tubes | Kimble Chase | 40A502 | |
| 9'' glass Pasteur pipette | Any supplier | ||
| Manual pipette pump | Any supplier | ||
| Clear 1.5 ml microcentrifuge polypropilene tubes | Corning Life Sciences | MCT-150-C | |
| Microcentrifuge | Any supplier | ||
| RNAlater solution for RNA stabilization | Life Technologies | AM7020 | |
| RNAqueous total RNA isolation kit | Life Technologies | AM1912 | |
| Molecular Biology Grade Ethanol | Any supplier | ||
| RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2939AA | |
| Truseq RNA Sample Preparation Kit v2 | Illumina | RS-122-2001/RS-122-2002 |
References
- Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1 (8), 207-20 (1999).
- Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Dev. Dyn. 229 (3), 433-439 (2004).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos. J. Vis. Exp. (9), 10-3791 (2007).
- Sauka-Spengler, T., Barembaum, M. Gain- and loss-of-function approaches in the chick embryo. Methods Cell Biol. 87, 237-256 (2008).
- Ghadge, G. D., et al. Truncated wild-type SOD1 and FALS-linked mutant SOD1 cause neural cell death in the chick embryo spinal cord. Neurobiol. Dis. 21 (1), 205-20 (2006).
- Megason, S. G., McMahon, A. P. A mitogen gradient of dorsal midline Wnts organizes growth in the CNS. Development. 129 (9), 2087-2098 Forthcoming.
- Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations. Dev. Biol. 233 (1), 13-21 (2001).
- Cloonan, N., et al. Stem cell transcriptome profiling via massive-scale mRNA sequencing. Nat. Methods. 5 (7), 613-619 (2008).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat. Methods. 5 (7), 621-628 (2008).
- Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J. Galaxy Team. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11 (8), 86 (2010).
- Trichas, G., Begbie, J., Srinivas, S. Use of the viral 2A peptide for bicistronic expression in transgenic mice. BMC Biol. 6, 40 (2008).
- Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. Molecular cloning. A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1982).
- Wang, Y., et al. Evaluation of the coverage and depth of transcriptome by RNA-Seq in chickens. BMC Bioinformatics. 12, 10-1186 (2011).
- Blankenberg, D., et al. Manipulation of FASTQ data with Galaxy. Bioinformatics. 26 (14), 1783-1785 (2010).
- Kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R., Salzberg, S. L. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), 36 (2013).
- Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat Biotechnol. 28 (5), 511-515 (2010).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Vieceli, F. M., Simões-Costa, M., Turri, J. A., Kanno, T., Bronner, M., Yan, C. Y. The transcription factor chicken Scratch2 is expressed in a subset of early postmitotic neural progenitors. Gene Expr. Patterns. 13 (5-6), 189-196 (2013).
- Chesnutt, C., Niswander, L. Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo. Genesis. 39 (2), 73-78 (2004).
- Katahira, T., Nakamura, H. Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system. Dev. Growth. Differ. 45 (4), 361-367 (2003).
- Rao, M., Baraban, J. H., Rajaii, F., Sockanathan, S. In vivo comparative study of RNAi methodologies by in ovo electroporation in the chick embryo. Dev. Dyn. 231 (3), 592-600 (2004).
- Lu, Y., Lin, C., Wang, X. PiggyBac transgenic strategies in the developing chicken spinal cord. Nucleic Acids Res. 37 (21), 141 (2009).
- Simões-Costa, M., Tan-Cabugao, J., Antoshechkin, I., Sauka-Spengler, T., Bronner, M. E. Transcriptome analysis reveals novel players in the cranial neural crest gene regulatory network. Genome Res. 24 (2), 281-290 (2014).
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat. Protoc. 7 (3), 562-578 (2012).
