Introduction
ओवो electroporation में डीएनए 1-5 constructs के साथ आंशिक रूप से विवो में भ्रूण संरचनाओं transfect करने के लिए एक तेज और सस्ता तरीका का प्रतिनिधित्व करता है क्योंकि जीना जीवों पर आनुवंशिक अध्ययन अक्सर एक मॉडल के रूप में चिकन भ्रूण का उपयोग करें. ऐसे pCIG 6 या pMES 7 के रूप में ब्याज की जीन के साथ एक साथ एक फ्लोरोसेंट संवाददाता युक्त एक प्रतिलिपि सांकेतिक शब्दों कि Bicistronic अभिव्यक्ति वैक्टर, बहाव के विश्लेषण के लिए भ्रूण प्रक्रिया से पहले एक stereomicroscope के तहत वांछित क्षेत्र में अभिकर्मक गुणवत्ता के त्वरित सत्यापन अनुमति देते हैं.
डीएनए अनुक्रमण में हाल के अग्रिमों के साथ, यह आरएनए Seq 8,9 का उपयोग कर शाही सेना के नमूने से डिजिटल पूरे transcriptome अभिव्यक्ति प्रोफाइल प्राप्त करने के लिए अब संभव है. इसलिए, बजाय ऐसे सीटू संकरण, immunohistochemistry और qPCR, सीडीएनए पुस्तकालयों की तैयारी के लिए के रूप में समानांतर में केवल कुछ जीन उत्पादों का विश्लेषण कर सकें कि समय लेने वाली विधियों कीउच्च throughput अनुक्रमण पूरे transcriptome की जानकारी प्रदान कर सकते हैं. हर एक जीन की अभिव्यक्ति के स्तर पर प्रयोगात्मक प्रभाव का अवलोकन बारी में प्रयुक्त निर्माण से बदल रास्ते पर शक्तिशाली अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है. यह प्रयोग किया जाता जीव के लिए एक जीनोमिक विधानसभा उपलब्ध है अगर विशेष रूप से आसान है, इस प्रकार लड़की भ्रूण फिर से एक उपयुक्त मॉडल है.
उपयोगकर्ता एक विश्वसनीय जीनोम अनुक्रमण केंद्र तक पहुँच गया है, तो मुख्य मुद्दा उच्च गुणवत्ता शाही सेना के नमूने प्राप्त है. इस काम के परिणामस्वरूप डेटासेट के सिलिको विश्लेषण में के लिए शाही सेना Seq के लिए उपयुक्त ट्रांसफ़ेक्ट तंत्रिका ट्यूब, साथ ही नीचे की ओर कदम से शाही सेना के नमूने प्राप्त करने के लिए एक विधि को दर्शाता है. 48 घंटा ऊष्मायन द्वारा पीछा HH12-13 पर electroporation के बाद, ट्रांसफ़ेक्ट ट्रंक रीढ़ की हड्डी हिस्सों, ribonuclease मुक्त परिस्थितियों में विच्छेदित तुरंत lysed और आगे शाही सेना शुद्धि और पुस्तकालय preparat तक अल्ट्रा कम ठंड से गिरावट से बचाया गयाआयन.
आकाशगंगा सार्वजनिक सर्वर 10 उच्च throughput अनुक्रमण डेटा का विश्लेषण करने के लिए मुक्त संसाधनों तक पहुँच प्रदान करता है. पंजीकृत उपयोगकर्ताओं के लिए पेशकश की अंतरिक्ष की राशि इस प्रकार स्थानीय कम्प्यूटेशनल बुनियादी सुविधाओं के लिए आवश्यकता को नष्ट करने, छोटे प्रयोगों के लिए पर्याप्त है. आरएनए Seq डेटा विश्लेषण छानने, संरेखण और जीन अभिव्यक्ति के quantitation / तुलना भी शामिल है. आरएनए Seq डेटा विश्लेषण के लिए सामान्य दिशानिर्देश हैं हालांकि, छानने मापदंडों अनुक्रमण की गुणवत्ता पर निर्भर बड़े पैमाने पर होगी और कच्चे डेटा की गुणवत्ता नियंत्रण विश्लेषण के बाद निर्धारित किया जाना चाहिए.
इस प्रोटोकॉल प्राप्त है और इन विवो में ट्रांसफ़ेक्ट चिकन भ्रूण रीढ़ की हड्डी डोरियों से शाही सेना Seq प्रोफाइल तुलना करने के लिए चरणों का वर्णन. एक प्रतिनिधि परिणाम के रूप में, एक खाली वेक्टर साथ ट्रांसफ़ेक्ट दो स्वतंत्र नियंत्रण के नमूनों से प्राप्त डेटासेट की तुलना विधि प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और विभिन्न एक्सप्रेशंस की पहचान की अनुमति चाहिए कि पता चलाप्रयोगात्मक नमूने में SED टेप. इसलिए, इस विधि के आवेदन बहुत एक ही प्रयोग के बाद खोजों की संख्या में वृद्धि और इस तरह बाद में जांच के लिए डेटा का एक बड़ा सेट प्रदान करने की क्षमता है.
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Protocol
1. electroporate HH12-13 चिकन भ्रूण के तंत्रिका ट्यूब ओवो में रुचि के निर्माण
अभिकर्मक के संतोषजनक स्तर के साथ व्यक्तियों की त्वरित पहचान सकें, अधिमानतः एक bicistronic प्रतिलिपि में, एक फ्लोरोसेंट संवाददाता का प्रयोग करें या एक intercalating वायरल 2A पेप्टाइड 11 के साथ ब्याज की प्रोटीन के लिए जुड़े हुए. नोट: इस स्तर के लिए विशिष्ट ऊष्मायन समय 37.8 डिग्री सेल्सियस के आसपास 48 घंटा है.
- एक 18 जी एक्स 1 1/2 सुई के लिए मिलकर एक सिरिंज के साथ एल्बुमिन की 3 मिलीलीटर हटाने के बाद अंडे में एक छोटी सी खिड़की खोलें. भ्रूण दृश्य बढ़ाने के लिए, भ्रूण 1-4 नीचे बाँझ घंटी समाधान में 01:50 पतला भारतीय स्याही की एक छोटी राशि इंजेक्षन.
- बाँझ घंटी समाधान के साथ भ्रूण कवर करने के बाद, 2.5 माइक्रोग्राम प्रति न्यूरल ट्यूब के पीछे अंत के माध्यम से डीएनए यह भरता है / जब तक μl युक्त 10 मिमी Tris-एचसीएल, पीएच 8.2 और 0.1% खाद्य डाई (एफ, डी एंड सी) समाधान इंजेक्षनपश्चमस्तिष्क क्षेत्र पर निर्भर है. बगल के साथ 4 मिमी 1 द्वारा अलग स्थिति प्लैटिनम इलेक्ट्रोड (व्यास में 0.5 मिमी) electroporate और उन्हें 4 के बीच 100 मिसे के अंतराल के साथ 5 से 50 मिसे की दाल और 20 वी देने के लिए.
- Electroporation के बाद, वे मंच HH23 तक पहुँचने तक अधिक 48 घंटे के लिए चालाकी से भ्रूण सेते हैं और एक फ्लोरोसेंट stereomicroscope के तहत पार्श्व क्षेत्र में अभिकर्मक के उच्च स्तर को पेश व्यक्तियों की पहचान.
नोट: electroporation के बाद ऊष्मायन की अवधि के प्रयोग के उद्देश्य पर निर्भर करता है. electroporated प्लास्मिड 2 घंटा 2 के बाद महत्वपूर्ण अभिव्यक्ति के स्तर उत्पन्न कर सकते हैं. ब्याज जल्दी शुरू होने के जीन में निहित है इस प्रकार, यदि बाद electroporation ऊष्मायन अवधि को कम किया जा सकता है.
2. फसल सफलतापूर्वक भ्रूण ट्रांसफ़ेक्ट और electroporated स्पाइनल कॉर्ड आधा काटना
नोट: यह प्रक्रिया प्रत्येक 10 भ्रूण और पैदावार 1 के लिए 2-3 घंटे से रहता है-2 भ्रूण प्रति माइक्रोग्राम प्रति कुल शाही सेना. न्यूरल ट्यूब का विच्छेदन ठीक आंदोलनों की आवश्यकता है और कुछ अभ्यास सत्र प्रयोगात्मक नमूने के लिए इसे लागू करने से पहले आवश्यक हो सकता है.
- RNase परिशोधन समाधान के साथ या 4 घंटे 12 के लिए 150 डिग्री सेल्सियस पर पाक द्वारा धातु विच्छेदन उपकरण शुद्ध और DEPC इलाज पीबीएस तैयार करते हैं. केवल नए प्रमाणित RNase मुक्त plasticware का प्रयोग करें.
नोट: फसल कटाई के बाद, यह विच्छेदन के दौरान RNase प्रदूषण को रोकने के लिए मानक देखभाल का पालन करने के लिए महत्वपूर्ण है. - ठीक विदारक कैंची की एक जोड़ी और एक sieved संग्रह चम्मच का उपयोग भ्रूण हार्वेस्ट. एक 100 मिमी पेट्री डिश में ठंड DEPC इलाज पीबीएस में भ्रूण रखें.
- ठीक चिमटी की एक जोड़ी के साथ, (पूर्वकाल अंग कली और पीछे अंग कली के पूर्वकाल सीमा के पीछे सीमा के बीच) पूरी पार्श्व क्षेत्र में कटौती और ठंड DEPC इलाज पीबीएस युक्त एक नई डिश के लिए इस खंड हस्तांतरण.
- तीन अलग पर छेदना को दो ठीक गिलास सुई का प्रयोग करेंन्यूरल ट्यूब और paraxial mesoderm के बीच भ्रूण के प्रत्येक dorsolateral ओर इशारा करते हैं.
- केंद्रीय छिद्र में दो गिलास सुई का परिचय और धीरे धीरे न्यूरल ट्यूब पूर्वकाल-पीछे अक्ष के साथ उनमें से एक कदम दूर. पहले आंदोलनों से नहीं पहुंचे थे कि छेद के लिए इस दोहराएँ. ठीक चिमटी की एक जोड़ी के साथ अलग paraxial mesoderm निकालें.
- बग़ल भ्रूण मुड़ें न्यूरल ट्यूब और पृष्ठदंड के बीच चिमटी के सुझावों को सम्मिलित और दो संरचनाओं को अलग करने के पूर्वकाल-पीछे अक्ष के साथ विपरीत दिशाओं में उन्हें स्लाइड.
नोट: यह भी mesoderm के अधिकांश अभी भी न्यूरल ट्यूब से जुड़ी को दूर करना चाहिए. - यदि आवश्यक हो, हल्के से चिमटी की एक और जोड़ी के साथ न्यूरल ट्यूब दबाए हुए चिमटी की एक जोड़ी के साथ खींच द्वारा संलग्न रहते कि mesodermic ऊतक के किसी भी बड़े टुकड़ों को हटा दें. जब समाप्त हो, धीरे से एक का उपयोग कर ठंड DEPC इलाज पीबीएस युक्त एक और डिश को न्यूरल ट्यूब हस्तांतरणRNase मुक्त गिलास पाश्चर पिपेट एक पुस्तिका विंदुक पंप के लिए युग्मित और सभी ट्यूबों विच्छेदित कर रहे हैं जब तक बर्फ पर रहते हैं.
- दो हिस्सों में तंत्रिका ट्यूब फूट डालो. इस के लिए, लुमेन में चिमटी की एक बंद जोड़ी के तेज टिप डालने और इसके माध्यम से चिमटी बाहर ले जाकर छत प्लेट खुला. इस के बाद, चिमटी सुझावों के साथ मंजिल की थाली काटने से आधा अलग.
- क्रमबद्ध ठंडा DEPC इलाज पीबीएस के साथ भरा एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब को एक फ्लोरोसेंट विदारक गुंजाइश और हस्तांतरण के तहत गैर electroporated हिस्सों से electroporated. यदि आवश्यक हो, प्लास्टिक की दीवारों से जुड़ी किसी भी ऊतक को रिहा करने और ट्यूबों के अवसादन बढ़ावा देने के लिए धीरे microtubes झटका.
- 3 सेकंड के लिए 100 XG पर स्पिन और एक 1 मिलीलीटर micropipette के साथ संभव के रूप में ज्यादा पीबीएस के रूप में बहुत धीरे धीरे हटा दें. किसी भी भ्रूण सामग्री पिपेट टिप को चूसा है अगर नजर रखने के लिए microtube के माध्यम से चमकता है कि एक प्रकाश स्रोत को देखकर करते समय यह; अगर ऐसा होता है, धीरे धीरे मुक्ति और centrifuga दोहरानेtion के.
- न्यूरल ट्यूब आधा प्रति शाही सेना निकासी के लिए सेल समाधान के 70 μl जोड़ें और सामग्री मिश्रण करने के लिए ट्यूब झटका. सख्ती से 5 मिनट और भंवर के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं. 5 मिनट ऊष्मायन और vortexing दो बार दोहराएँ. -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
- अगले कदम के लिए एक पर्याप्त उपज सुनिश्चित करने के लिए नमूना प्रति कम से कम आठ न्यूरल ट्यूब आधा लीजिए. कई electroporation / विच्छेदन सत्र तंत्रिका ट्यूबों के लिए पर्याप्त संख्या में एकत्र करने के लिए आवश्यक हैं अगर छोटे नमूने पूल. हर हालत के लिए डुप्लिकेट या triplicates के लिए पर्याप्त नमूने संग्रहित करें.
3. शुद्ध शाही सेना और Illumina अनुक्रमण के लिए पुस्तकालय की तैयारी
- -80 डिग्री सेल्सियस भंडारण से नमूने निकालें और 15-30 मिनट के लिए बर्फ पर जगह है. पूरा जब तक कमरे के तापमान पर विगलन फिर से शुरू करें.
- भंवर अच्छी तरह से और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ दें. 1 मिनट के लिए 15,000 XG पर फिर भंवर और अपकेंद्रित्र अघुलनशील सामग्री गोली.
- एक नया ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवालाऔर कुल शाही सेना अलगाव किट पुस्तिका निर्देशों के अनुसार शाही सेना निकासी के लिए आगे बढ़ें. एकाग्रता बढ़ाने के लिए न्यूनतम सिफारिश की मात्रा में elute.
नोट: सफाई के बाद DNase उपचार आरएनए Seq डेटासेट में जीनोमिक डीएनए दृश्यों के संभावित संक्रमण से बचने के क्रम में सिफारिश की है. - सामग्री मिश्रण और गुणवत्ता नियंत्रण के विश्लेषण के लिए 5 μl दूर करने के लिए ट्यूब झटका. पुस्तकालय तैयारी तक डिग्री सेल्सियस -80 पर शेष नमूना स्टोर; इन नमूनों आरएनए गिरावट से बचने के लिए केवल एक बार thawed किया जाना चाहिए.
- शाही सेना 6000 नैनो किट का उपयोग कर एक Bioanalyzer साधन में शुद्ध शाही सेना से चलाएँ; RIN के मूल्य कम से कम 7 से ऊपर आगे बढ़ने के लिए होना चाहिए.
- एक Illumina संगत आरएनए Seq पुस्तकालय तैयारी किट का उपयोग पुस्तकालयों पैदा करते हैं और एकल पढ़ता 100 बीपी उत्पन्न करने के लिए सेट एक HiSeq साधन की एक गली में 4 पुस्तकालयों के लिए ऊपर मल्टीप्लेक्स. यदि संभव हो तो, संभावित तकनीकी कलाकृतियों को कम करने के लिए एक ही समय में सभी नमूने शामिल हैं.
नोट: यह 50 लाख अनुसंधान के लिए ऊपर उपज चाहिएसबसे जीन 13 के लिए कवरेज प्राप्त करने के लिए पर्याप्त से अधिक है जो नमूना, प्रति ईएडीएस.
4. आकाशगंगा सार्वजनिक सर्वर 10 में शाही सेना Seq डेटासेट्स की तुलना करें.
नोट: सर्वर भंडारण स्थान सीमित है और कई नमूने की तुलना प्रयोगों को छानने चरणों में उत्पन्न मध्यवर्ती फ़ाइलों का विलोपन आवश्यकता हो सकती है.
- (आकाशगंगा सार्वजनिक सर्वर में एक उपयोगकर्ता खाता बनाने https://usegalaxy.org ) और FTP fastq प्रारूप में Illumina डेटासेट अपलोड करें.
- NGS तहत FastqGroomer 14 उपकरण के साथ अपलोड फाइल तैयार: QC और हेरफेर मेनू; गुणवत्ता स्कोर पहले से ही Phred + 33 (सेंगर) में इनकोड हैं, बस प्रत्येक डाटासेट लिए गुण तहत fastqsanger के लिए फ़ाइल प्रकार बदलने के द्वारा इस कदम को छोड़.
- क्यूसी और हेरफेर मुझे: जनरल NGS तहत FastQC उपकरण का उपयोग कर प्रत्येक डाटासेट की गुणवत्ता का विश्लेषणपरमाणु.
नोट: इन पढ़ता की छोर trimming के लिए इस्तेमाल किया मापदंडों के लिए अनुमान प्रदान करेगा के रूप में विशेष ध्यान आधार अनुक्रम गुणवत्ता प्रति और प्रति आधार अनुक्रम सामग्री के लिए जिसके परिणामस्वरूप ग्राफिक्स को दी जानी चाहिए. - ट्रिम '3 त्यागने के लिए पढ़ता उपकरण NGS तहत FASTQ गुणवत्ता Trimmer 14 का उपयोग कम गुणवत्ता डेटा के साथ समाप्त होता है: QC और हेरफेर मेनू. केवल 3 '20 से नीचे गुणवत्ता स्कोर के लिए समाप्त हो जाती है पर कार्रवाई करने के लिए उपकरण सेट.
- क्लिप उपकरण (उपयोग कर पढ़ता से अनुकूलक दृश्यों निकालें http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ क्यूसी और हेरफेर मेनू: NGS के तहत). बाएं कम से कम 45 बीपी, इनपुट इस्तेमाल किया एडाप्टर के अनुक्रम के साथ पढ़ता त्यागने और दोनों काटा और गैर काटा दृश्यों में शामिल करने के लिए उत्पादन का चयन करने के उपकरण सेट. साथ ही, सबसे कम गुणवत्ता ठिकानों पहले ही अंतिम चरण में हटा दिया गया है के बाद से अज्ञात अड्डों के साथ दृश्यों को छोड़ना नहीं चुनते. उपकरण ट्रिम दृश्यों (का उपयोग http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ NGS के तहत): FastQC ने पता लगाया 5 'अनुक्रम पूर्वाग्रह (आमतौर पर 10) को हटाने के लिए पढ़ता की क्यूसी और हेरफेर मेनू, पहले अड्डों ट्रिम.
नोट: इस बिंदु पर, यह फिर से FastQC चलाने और डाटासेट गुणवत्ता में सुधार किया गया था, तो यह निर्धारित करने के लिए पिछले विश्लेषण के साथ तुलना करने के लिए एक अच्छा विचार है. - डाउनलोड और Illumina iGenomes से UCSC जीनोम ब्राउज़र के लिए नवीनतम चिकन जीनोम विधानसभा खोल ( http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn ) और पूरे जीनोम FASTA प्रारूप फ़ाइल और जीन एनोटेशन GTF प्रारूप फाइल अपलोड प्राप्त डेटा मेनू के तहत उपकरण अपलोड फ़ाइल का उपयोग आकाशगंगा के इतिहास को.
- मानचित्र के तहत एलाइनर TopHat2 15 का उपयोग करते हुए चिकन जीनोम को प्रत्येक नमूने के लिए पढ़ताNGS: शाही सेना विश्लेषण मेनू. इतिहास से एक जीनोम का उपयोग करने के लिए चुनें (कदम 4.7 में अपलोड FASTA फ़ाइल का चयन करें).
- शाही सेना विश्लेषण मेनू: NGS तहत कफ़लिंक 16 का उपयोग करते हुए प्रत्येक नमूने के लिए एक भविष्यवाणी की transcriptome बनाएँ. एक गाइड के रूप में संदर्भ एनोटेशन उपयोग (कदम 4.7 में अपलोड GTF फ़ाइल का चयन) और विकल्पों पर बारी (इतिहास, कदम 4.7 से FASTA फ़ाइल से) बायस सुधार प्रदर्शन और बहु-पढ़ने के सही उपयोग करने के लिए चुनें.
- शाही सेना विश्लेषण मेनू: NGS तहत Cuffmerge 16 का उपयोग करते हुए सभी नमूनों के लिए भविष्यवाणी की transcriptomes मिलाएं. (इतिहास, कदम 4.7 से FASTA फ़ाइल से) और अनुक्रम डेटा (कदम 4.7 से GTF फ़ाइल) संदर्भ एनोटेशन उपयोग करने के लिए चुनें.
- शाही सेना विश्लेषण मेनू: NGS तहत Cuffdiff 16 का उपयोग करते हुए प्रत्येक नमूने के लिए TopHat2 द्वारा उत्पन्न बेम फाइलों की तुलना करें. क्षेत्र देखिए में मुझे चयनrged transcriptome Cuffmerge द्वारा उत्पन्न और विकल्प (इतिहास, कदम 4.7 से FASTA फ़ाइल से) बायस सुधार प्रदर्शन पर बारी और बहु-पढ़ने के सही प्रयोग करें.
- क्रमबद्ध अंतर अभिव्यक्ति फ़िल्टर तहत उपकरण प्रकार का उपयोग कर संख्यानुसार स्तंभ 13 क्यू (मूल्य) में आरोही टेबल परीक्षण और मेनू तरह.
नोट: जीन / निम्नतम क्यू मूल्यों पेश करेंगे प्रयोगात्मक शर्तों के बीच महत्वपूर्ण अंतर अभिव्यक्ति दिखा टेप. - कवरेज रेखांकन के साथ नेत्रहीन परिणामों की जांच करने के लिए, पहले उपकरण BEDTools मेनू के तहत जीनोम कवरेज 17 के BedGraph बनाएं उपयोग कर bedGraph प्रारूप को बेम फ़ाइलों को परिवर्तित. कवरेज के बिना क्षेत्रों की रिपोर्टिंग अक्षम, अलग अंतराल के रूप में spliced प्रविष्टियों का इलाज और सभी डेटासेट तुलना में किया जा रहा है के लिए अनुक्रमण गहराई normalizes कि एक पहलू से कवरेज पैमाने पर करने के लिए चुनते हैं.
- का उपयोग अहम शख्स प्रारूप के परिणामस्वरूप bedGraph फ़ाइल में परिवर्तितउपकरण विग / BedGraph करने वाली अहम शख्स ( http://www.genome.ucsc.edu/ ) में परिवर्तित स्वरूप मेनू के तहत. UCSC जीनोम ब्राउज़र (कस्टम पटरियों के रूप में अहम शख्स फ़ाइलें अपलोड http://www.genome.ucsc.edu/ galGal4 विधानसभा के लिए) और डेटासेट में कवरेज कल्पना करने के लिए ब्याज की एक जीन खोज.
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Representative Results
वर्णित विधि मान्य करने के लिए, दो नियंत्रण नमूने खाली वेक्टर pMES 7 और डालने चिकन SCRT2 18 की जस्ता-उंगली डोमेन encodes जो SCRT2-ZNF, निर्माण युक्त एक ही वेक्टर साथ ट्रांसफ़ेक्ट भ्रूण से एक नमूने के साथ electroporated भ्रूण से उत्पन्न थे. प्रत्येक 11-22 माइक्रोग्राम प्रति कुल शाही सेना उपज नमूने 8 से 12 भ्रूण के पूल से प्राप्त किया गया. सभी तीन नमूने उच्च गुणवत्ता शाही सेना इस प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त किया जा सकता है कि प्रदर्शन, Bioanalyzer साधन (चित्रा 1) के साथ प्रदर्शन एक गुणवत्ता की जांच में 10 में से एक इष्टतम RIN मूल्य रन बनाए.
अनुक्रमण के बाद, वर्णित छानने प्रक्रिया पढ़ता की 83 से 91% से संरेखण दर में वृद्धि हुई (नहीं दिखाया डेटा). जैसी कि उम्मीद थी, विश्व स्तर पर एक तितर बितर साजिश में जब तुलना में दो नियंत्रण के नमूने से transcriptomes की तुलना (चित्रा 2) कोई स्पष्ट अंतर दिखाया और पियर्सन सहसंबंध गुणांक 0 था.99. इसके अतिरिक्त, SCRT2 अनुक्रम का भाग होता है कि ठिकाना साथ सभी तीन डेटासेट के लिए कवरेज के प्रदर्शन overexpression था यह दर्शाता है कि प्रयोगात्मक नमूना (चित्रा 3) में इस क्षेत्र के लिए मैप पढ़ता की संख्या में एक स्पष्ट वृद्धि देखी गई सफल और नियंत्रण और प्रयोगात्मक नमूने के बीच मतभेद यहाँ वर्णित विधि के साथ पता लगाने योग्य होना चाहिए.
चित्रा 1:. आरएनए गुणवत्ता नियंत्रण Bioanalyzer 18S और 28S ribosomal शाही सेना चोटियों ने संकेत दो नियंत्रण कुल शाही सेना के नमूने के लिए ईमानदारी का उच्च स्तर दिखा electropherograms. Insets चलाने के लिए एक आभासी जेल का प्रतिनिधित्व करते हैं.
Figu2 पुन:. आरएनए Seq quantitation के परिणामों के reproducibility सबसे जीनों के लिए कि RPKM दिखा भूखंड तितर बितर दोनों नियंत्रण नमूनों में एक ही है. वस्तुतः इस पद्धति का पालन नहीं करते कि सभी जीनों बहुत कम RPKM मूल्यों है और इस तरह आम तौर पर transcriptome तुलना से अनदेखी कर रहे हैं.
चित्रा 3: एक प्रयोगात्मक नमूने में मतभेद के दृश्य प्रोटीन डोमेन (SCRT2-ZnF) के लिए कोड ectopically में व्यक्त की है कि क्षेत्र की कवरेज में एक दृश्य वृद्धि दिखा चिकन जीनोम में SCRT2 ठिकाना (galGal4) की UCSC जीनोम ब्राउज़र प्रदर्शन. प्रयोगात्मक नमूना.
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Discussion
यहाँ हम चिकन रीढ़ की हड्डी की electroporation के बाद प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए दिशा निर्देश प्रदान करते हैं. डीएनए वैक्टर की electroporation अधिक बार ब्याज की एक जीन overexpress के लिए इस्तेमाल किया जाता है, एक भी जीन समारोह तोड़े नीचे शर्तों 19-21 उत्पन्न करने के लिए siRNAs के लिए प्रमुख नकारात्मक, quimeric प्रोटीन या व्यापारियों एन्कोडिंग निर्माणों का उपयोग कर सकते हैं. वास्तव में, gain- और नुकसान के समारोह विश्लेषण दोनों से उत्पन्न transcriptome प्रोफाइल की तुलना विभिन्न इस प्रकार संभावित अधिक विशिष्ट प्रभाव को उजागर करने वाले, हर हालत में विपरीत तरीके में व्यक्त जीनों बाहर बात कर सकते हैं.
किसी भी विधि शाही सेना निकासी के लिए नीचे की ओर लागू के रूप में, आरएनए Seq पुस्तकालयों के संश्लेषण सामग्री शुरू करने का एक न्यूनतम प्रारंभिक राशि की आवश्यकता है. इस प्रोटोकॉल के साथ, 8 भ्रूण लगभग 10 माइक्रोग्राम प्रति कुल शाही सेना की उपज के लिए पर्याप्त होना चाहिए. एक पर्याप्त काम एकाग्रता समझौता किए बिना व्यक्तियों की कम संख्या के साथ शुरू शायद हैछोटे संस्करणों में अंतिम कमजोर पड़ने की अनुमति है कि शाही सेना निकासी प्रणाली के उपयोग के साथ संभव.
यह कुछ अपनेपन की आवश्यकता है कि एक नाजुक कदम है के रूप में सभी mesoderm से न्यूरल ट्यूब के समुचित अलगाव, महत्वपूर्ण नमूनों को लागू करने से पहले एक बार कुछ अभ्यास किया जाना चाहिए. विच्छेदन चरण के दौरान अत्यधिक आरएनए गिरावट से बचने के लिए, इसके बारे में 1-2 घंटे में सब तंत्रिका ट्यूबों के लिए पूरी प्रक्रिया को पूरा करने के लिए भी महत्वपूर्ण है. फिर, अभ्यास विच्छेदन समय में सुधार करने के लिए महत्वपूर्ण होगा. एक महत्वपूर्ण अवलोकन mesoderm ऊतकों के बीच संबंध, इस प्रकार mesodermal संरचनाओं, विशेष रूप से पृष्ठदंड खींच, mesoderm और न्यूरल ट्यूब के बीच कनेक्शन की तुलना में मजबूत है अवांछित ऊतक में कटौती करने की कोशिश कर रहा से अधिक कुशल है कि है. इसके अलावा, शोधकर्ताओं ने अपने स्वयं तकनीक अपने स्वयं के विच्छेदन की स्थिति के लिए अनुकूलित विकसित करने के लिए स्वतंत्र महसूस करना चाहिए. हालांकि, देखभाल छुट्टी तो यह है कि इसी तरह विच्छेदित होने के लिए एक ही प्रयोग में की तुलना में नमूने के लिए लिया जाना चाहिएmesodermal ऊतकों के साथ संदूषण के एल नमूनों के बीच यथासंभव सजातीय है.
हमारी प्रोटोकॉल चरण HH12-13 में ट्रांसफ़ेक्ट चरण HH23 चिकन भ्रूण रीढ़ की हड्डी डोरियों से transcriptome प्रोफाइल की तुलना दर्शाता है. हालांकि, छोटे समायोजन पहले चरण में काटा भ्रूण को अपने आवेदन की अनुमति चाहिए. बाद के चरणों अंतिम परिणाम के विश्लेषण के लिए वांछित हैं अगर दूसरी ओर, उल्लेख bicistronic वैक्टर कारण विकास आय के रूप में सेल प्रति अणुओं की संख्या में निरंतर कमी करने के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता. इसलिए, इरादा अंत बिंदु अभिकर्मक के बाद 72 से अधिक घंटे के बाद हासिल की है, खासकर अगर यह 22 का इस्तेमाल किया जा रहा निर्माण के transposon मध्यस्थता जीनोमिक एकीकरण एन्कोडिंग वैक्टर का उपयोग करने के लिए आवश्यक हो सकता है.
माना जा करने के लिए एक और मुद्दा electroporation दक्षता की विविधता है. गैर ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की संख्या काफी एमो करने के लिए कुछ पर्वतमालाउदर न्यूरल ट्यूब में UNT, विशेष रूप से लोगों को. विच्छेदन के बाद सभी कोशिकाओं बहाव के विश्लेषण के अधीन कर रहे हैं, एक कम electroporation दक्षता परख की संवेदनशीलता कम हो जाएगा. Electroporated कोशिकाओं के साथ नमूना समृद्ध करने के लिए एक दृष्टिकोण अंतिम नमूना 23 से गैर ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की आबादी को कम करने के लिए छंटनी (FACS) प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल का इस्तेमाल होता है. इस तरह के एक दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया जाता है, तथापि, भ्रूण की एक बड़ी संख्या आरएनए Seq पुस्तकालय तैयारी के लिए पर्याप्त उपज प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो जाएगा.
यह अधिक व्यापक रूप से अन्य उपलब्ध प्लेटफार्मों 24 की तुलना में जब सरल है अनुक्रमण केन्द्रों द्वारा और सिलिको आरएनए Seq डेटा विश्लेषण उपलब्ध है के रूप में Illumina अनुक्रमण की सिफारिश की है. डेटा छानने चुना मंच के लिए अधिक उपयुक्त चरणों में हालांकि, अन्य विकल्प अभी भी संशोधनों के साथ पर्याप्त हैं. आरएनए Seq डेटा विश्लेषण दिशा निर्देशों अभी भी पूरी तरह से स्थापित और outputs fr की तुलना नहीं कर रहे हैंपहले से ही आकाशगंगा सार्वजनिक सर्वर में शामिल किए गए हैं, जिनमें से कुछ ओम अलग उपलब्ध उपकरणों, अत्यधिक की सिफारिश की है. फिर भी, यहां वर्णित में सिलिको विश्लेषण उच्च गुणवत्ता डेटासेट से अच्छी तुलना परिणाम प्राप्त करने के लिए उपयुक्त होना चाहिए. जीवविज्ञान में अन्य सभी क्षेत्रों में के रूप में, उच्च throughput अनुक्रमण बढ़ जाती है काफी एक ही प्रयोग से प्राप्त किया जा सकता है कि जानकारी की राशि, और यहां वर्णित विधि रीढ़ की हड्डी के विकास का अध्ययन करने के लिए इसे लागू करने का एक तरीका है.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Indian ink | Any supplier | ||
| 18G x 1 1/2 needle | BD | 305196 | |
| 3 ml syringe | BD | 309657 | |
| Tris | MP Biomedicals | 819620 | |
| F D & C Blue 1 | Spectra Colors Corporation | 5.FC.0010P0 | Food Dye used to visualize DNA injection |
| Ringer's solution (1 L) | |||
| - 7.2 g NaCl | Sigma-Aldrich | S-9888 | |
| - 0.37 g KCl | Sigma-Aldrich | P-4504 | |
| - 0.225 g CaCl2•2H2O | Fisher Scientific | 10043-52-4 | |
| - 0.217 g Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | S-9390 | |
| - 0.02 g KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| - ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.4 | |||
| - ddH2O to 1 L | |||
| - Filter and autoclave | |||
| PBS (Phosphate Buffered Solution) (1 L) | |||
| - 8 g NaCl | Sigma-Aldrich | S-9888 | |
| - 0.2 g KCl | Sigma-Aldrich | P-4504 | |
| - 1.15 g Na2HPO4•7H2O | Sigma-Aldrich | S-9390 | |
| - 0.2 g KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| - ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.2 | |||
| - ddH2O to 1 L and filter | |||
| - 1 ml DEPC (Diethylpyrocarbonate) | Sigma-Aldrich | D-5758 | |
| - Shake vigorously and let stand overnight at room temperature | |||
| - Autoclave | |||
| Sieved spoon | Any supplier | ||
| Sterile 60 x 15 mm polystirene Petri dishes | Corning Life Sciences | 351007 | |
| RNaseZap RNase decontamination solution | Life Technologies | AM9780 | |
| Fine point surgical scissors | Any supplier | ||
| Straight fine point tweezers | Any supplier | ||
| Pulled glass needle made from 1.1 x 75 mm glass capillary tubes | Kimble Chase | 40A502 | |
| 9'' glass Pasteur pipette | Any supplier | ||
| Manual pipette pump | Any supplier | ||
| Clear 1.5 ml microcentrifuge polypropilene tubes | Corning Life Sciences | MCT-150-C | |
| Microcentrifuge | Any supplier | ||
| RNAlater solution for RNA stabilization | Life Technologies | AM7020 | |
| RNAqueous total RNA isolation kit | Life Technologies | AM1912 | |
| Molecular Biology Grade Ethanol | Any supplier | ||
| RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2939AA | |
| Truseq RNA Sample Preparation Kit v2 | Illumina | RS-122-2001/RS-122-2002 |
References
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